DE2908054A1

DE2908054A1 - METHOD AND REAGENT FOR DETERMINING CREATINE KINASE

Info

Publication number: DE2908054A1
Application number: DE19792908054
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr Phil Gruber; Fritz Dr Med Staehler; Karl Dr Rer Nat Wulff
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1979-03-02
Filing date: 1979-03-02
Publication date: 1980-09-11
Also published as: JPS585678B2; US4286057A; FI800578A; ATE435T1; JPS55120796A; JPS57105199A; EP0015437A1; FI69641B; JPS615720B2; EP0015437B1; DE3060087D1; FI69641C

Abstract

Creatine kinase is determined by the reaction of creatine phosphate with adenosine diphosphate with the formation of adenosine triphosphate, reaction of the latter with luciferin and oxygen in the presence of luciferase and diadenosine pentaphosphate with the formation of oxyluciferin and adenosine monophosphate, and measurement of the light thereupon emitted, the reaction being performed with a saturated concentration of adenosine diphosphate and substrate, in the presence of 1 to 10 millimoles per liter of AMP at pH values of 5.8 to 7.5, with at least 50 units of luciferase per test. It is desirable to operate in the presence of diadenosine pentaphosphate or sodium fluoride and a sequestering agent.

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing, H. Weickmajstn,. Dipl.-Phys. Dr. K. FinckePatent Attorneys Dipl.-Ing, H. Weickmajstn ,. Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke

Dipl-Ing.'E A-Vkickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr. Ing. H. Liska _— Dipl-Ing.'E A-Vkickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr. Ing.H. Liska _-

8000 MÖNCHEN 86, DEN __e ·■ ., , _U-. POSTFACH 860820 *" "~*~ ^|S"8000 MONKS 86, DEN _ _e · ■ . _{,, U} -. POST BOX 860820 * " " ~ * ~ ^{| S} "

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22 HCHMÖHLSTRASSE 22, CALL NUMBER 98 39 21/22 HCH

22922292

BOEHRINGER MÄNNHEIM GMBH
Sandhofer Straße 112-132, 6800 Mannheim-WaldhofBOEHRINGER MÄNNHEIM GMBH
Sandhofer Strasse 112-132, 6800 Mannheim-Waldhof

Verfahren \ind Reagenz zur Bestimmung der Creatinkinase.Procedure \ ind reagent for the determination of creatine kinase.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Reagenz zur
photometrischen Äktivitätsbestimmung von Creatinphosphokinase (E.C. 2.7.3.2), im folgenden CK genannt, mit Hilfe
des Biolumineszenz-Systems aus Leuchtkäfern«,The invention relates to a method and a reagent for
photometric activity determination of creatine phosphokinase (EC 2.7.3.2), hereinafter referred to as CK, with the help
of the bioluminescence system from fireflies «,

Die CK katalysiert die folgende Reaktion:The CK catalyzes the following reaction:

CK
1) ÄDP + Creatinphosphat ATP + CreatinCK
1) ÄDP + creatine phosphate ATP + creatine

Im menschlichen Körper kommen zwei verschiedene Arten von
Untereinheiten dieses Enzyms vor, die Untereinheiten M und B. Da das aktive Enzym aus jeweils zwei Untereinheiten zusammengesetzt ist, und da die beiden Untereinheiten frei
miteinander kombinieren können, sind drei Enzymtypen mög-Two different types of occur in the human body
Subunits of this enzyme, the subunits M and B. Since the active enzyme is composed of two subunits each, and since the two subunits are free
can combine with each other, three enzyme types are possible.

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lieh, der Muskeltyp (CK-MM), der Gehirntyp (CK-BB) und der Hybridtyp (CK-MB), der praktisch nur im Myokard vorkommt, beim Herzinfarkt ins Serum austritt und dort in erhöhter Konzentration zu messen ist. Die Aktivität dieses Isoenzyms ist neben der Gesamtaktivität der CK im Serum für die Diagnose des Herzinfarkts von großer Bedeutung. borrowed, the muscle type (CK-MM), the brain type (CK-BB) and the hybrid type (CK-MB), which occurs practically only in the myocardium, escapes into the serum during myocardial infarction and there in increased concentration is to be measured. The activity of this isoenzyme is in addition to the total activity of the CK in the serum of great importance for the diagnosis of myocardial infarction.

Die CK-Aktivität wird üblicherweise nach einem absorptions photometrischen Verfahren über die Messung der ATP-Bildung (vgl. Gleichung I)) wie folgt bestimmt:The CK activity is usually determined after an absorption photometric method by measuring the formation of ATP (see Equation I)) is determined as follows:

2) ATP + D-Glucose ADP + D-Glucose-6-phosphat2) ATP + D-glucose ADP + D-glucose-6-phosphate

3) D-Glucose-6-phosphat + NADP⁺ D-Gluconat-6-phosphat + NADPH + H⁺ 3) D-glucose-6-phosphate + NADP ⁺ D-gluconate-6-phosphate + NADPH + H ⁺

Bei dieser Bestimmung der CK-Aktivität über das gebildete ATP stören die Adenylatkinasen (E.C.2.7.4.3 "Myokinasen") des Serums (aus Leber, Muskel oder Erythrozyten stammend), die die folgende Reaktion katalysieren:In this determination of the CK activity via the formed ATP disrupt the adenylate kinases (E.C.2.7.4.3 "Myokinases") of the serum (derived from liver, muscle or erythrocytes), which catalyze the following reaction:

4) 2 ADP ^Mydfcinaae, _{ATp +} 4) 2 ADP ^ Mydfcinaae, _{ATp +}

Ihre Aktivität läßt sich am wirksamsten durch Zugabe von 5 bis 1o mMol/1 Adenosin-5'-monophosphat (AMP) und 1o,uMol/l Diadenosinpentaphosphat (Ap5A) hemmen, wodurch die Störung des absorptions-photometrischen Tests beseitigt wird.Their activity can be most effectively achieved by adding 5 to 10 mmol / l adenosine-5'-monophosphate (AMP) and 1o, µmol / l Inhibit diadenosine pentaphosphate (Ap5A), thereby eliminating the interference with the absorption photometric test.

Ein wesentlicher Nachteil dieser Methoden ist eine lag-Phase, die sich nicht unter 9o Sekunden verringern läßt. Ein weiterer wesentlicher Nachteil der absorptions-photometrischen Methode liegt in ihrer geringen Empfindlichkeit die nur eine Messung von Aktivitäten über 1o y/1 erlaubt, und daher insbesondere eine Messung der CK-MB-Aktivität im unteren pathologischen Bereich sowie im NormalbereichA major disadvantage of these methods is a lag phase that cannot be reduced to less than 90 seconds. Another major disadvantage of the absorption-photometric method is its low sensitivity which only allows a measurement of activities above 1o y / 1, and therefore in particular a measurement of CK-MB activity in the lower pathological range as well as in the normal range

0SOÖ3-7/01120SOÖ3-7 / 0112

2!2!

praktisch unmöglich macht.makes practically impossible.

Es sind daher verschiedentlich Versuche unternommen worden, die ÄTP-Bildung der CK über die firefly-Luciferase-Biolumineszenz zu verfolgen. Diese Methode hat den Vorteil größerer Empfindlichkeit und fehlender lag-Phase. Various attempts have therefore been made to the ÄTP formation of the CK via the firefly luciferase bioluminescence to pursue. This method has the advantage of greater sensitivity and no lag phase.

Die Luciferase aus der firefly (Photinus pyralis u.a.) katalysiert die folgende Reaktion:The luciferase from the firefly (Photinus pyralis etc.) catalyzes the following reaction:

5) ÄTP + Luciferin + O₂ Oxyluciferin + CO₂ +5) ETP + luciferin + O ₂ oxyluciferin + CO ₂ +

AMP + PP. + LichtAMP + PP. + Light

Das bei dieser Reaktion entstehende Licht wird mit einer Ausbeute von nahezu 1 Einstein/Mol ATP emittiert. Es hat eine Wellenlänge im Maximum von 562 nm. Die Reaktion ist extrem empfindlich und erlaubt die quantitative BestimmungThe light generated by this reaction is with a Yield of nearly 1 Einstein / mole of ATP emitted. It has a maximum wavelength of 562 nm. The response is extremely sensitive and allows quantitative determination

— 1 3 von ATP-Konzentrationen bis herab zu 1o Mol/l.- 1 3 of ATP concentrations down to 1o mol / l.

Es ist jedoch bekannt, daß die firefIy-Reaktion 5) durch AMP so stark inhibiert wird (Arch. Biochem. Biophys. 141, 49, 197o), daß eine praktische Anwendung dieser Reaktion für die Messung von CK-Aktivitäten gemäß Gleichung 1) im Serum sehr problematisch ist, da sie die Verwendung von AMP als Inhibitor der Adenylatkinase in Reaktion 4) verhindert (Proc. Nat. Acad. Sei. TJ_ ^{1384 bis 1387} (1974)). Es ist weiter bekannt, die Notwendigkeit der Hemmung der Ädenylatkinase dadurch teilweise zu vermeiden, daß man die Reaktion 1) bei suboptimaler ADP-Konzentration, das heißt, ohne Substratsättigung, durchführt und so bei einer Substratkonzentration arbeitet, die der aufgrund der steileren Aktivitäts-Substratkonzentrations-Kurve der Adenylatkinase die Aktivität der Adenylatkinase gegenüber der der CK vernachlässigbar klein ist. Auf diese Weise läßt sich zwar die CK im Serum noch neben Adenylatkinase mit der Biolumineszenzmethode messen (Clin. Chim. Acta JT7, 199 bis 2o9 (1978)), je-However, it is known that the fire reaction 5) is so strongly inhibited by AMP (Arch. Biochem. Biophys. 141 , 49, 197o) that a practical application of this reaction for the measurement of CK activities according to equation 1) in serum is very problematic, as it prevents the use of AMP as an inhibitor of adenylate kinase in reaction 4) (Proc. Nat. Acad. Sci. TJ_ ^1384-1387 (1974)). It is also known that the need to inhibit adenylate kinase can be partially avoided by carrying out reaction 1) at a suboptimal ADP concentration, i.e. without substrate saturation, and thus working at a substrate concentration which is due to the steeper activity substrate concentration -Curve of the adenylate kinase the activity of the adenylate kinase compared to that of the CK is negligibly small. In this way, the CK in the serum can be measured in addition to adenylate kinase with the bioluminescence method (Clin. Chim. Acta JT7, 199 to 2o9 (1978)), each

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doch mu& man bekanntlich dabei erhebliche Nachteile in Kauf nehmen:however, as is well known, one has to have considerable disadvantages Take purchase:

1. Die CK-Reaktion läuft nicht mehr nach pseudonullter Ordnung ab. . ·1. The CK reaction no longer runs according to pseudo zeroer Okay. . ·

2. Die wiedergefundene CK-Aktivität, bezogen auf eine interne Eichung rait ATP, beträgt nur etwa 11 % der im absorptions-photometrischen Test gemessenen Werte.2. The recovered CK activity based on a internal calibration rait ATP, is only about 11% of the im values measured by absorption-photometric test.

3. Geringfügige üngenauigkeiten in der ADP-Konzentration gehen sehr stark in das Ergebnis ein.3. Minor inaccuracies in ADP concentration go very much into the result.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Biolumineszenz-Testverfahren zur Bestimmung der CK-Aktivität zu schaffen, das diese Nachteile" nicht aufweist und bei dem insbesondereThe present invention is therefore based on the object of a bioluminescence test method for determining the CK activity to create that "does not have these disadvantages and where in particular."

1. die Adenylatkinasen voll hemmbar sind,1. the adenylate kinases are fully inhibitable,

2. die über Biolumineszenz gemessene Aktivität, ausge*- drückt in I.U. ( ,uMol Substratumsatz/Minute), gleich der im absorptions-photometrischen Ansatz gemessenen Aktivität ist und2. the activity measured via bioluminescence, ex * presses in I.U. (, µmol substrate turnover / minute), the same is the activity measured in the absorption-photometric approach and

3. unter Bedingungen der Substratsättigung der CK gearbeitet werden kann.3. it is possible to work under conditions of substrate saturation of the CK.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Creatinkinase durch Reaktion von Creatinphosphat mit Adenosindiphosphat unter Bildung von Adenosintriphosphat, Umsetzung des letzteren mit Luciferin und Sauerstoff in Gegenwart von Luciferase und Diadenosinpentaphosphat unter Bildung von Oxyluciferin und Adenosinmonophosphat, und Messung des dabei emittierten Lichts ist dadurch gekennzeichnet.The method according to the invention for determining creatine kinase by reacting creatine phosphate with adenosine diphosphate with the formation of adenosine triphosphate, reaction of the latter with luciferin and oxygen in the presence of luciferase and diadenosine pentaphosphate to form oxyluciferine and adenosine monophosphate, and measurement of the light emitted in the process is characterized by this.

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-S--S-

daß man die Umsetzung bei Adenosindiphosphat-Substrat-Sättigungskonzentration in Gegenwart von 1 bis 1o mMol/1 AMP bei pH-iierten von 5_f8 bis 7,5 mit mindestens 5o Ü/Test Luciferase durchführt.that the reaction is carried out at adenosine diphosphate substrate saturation concentration in the presence of 1 to 10 mmol / 1 AMP at a pH of 5 _f 8 to 7.5 with at least 5 o / test luciferase.

überraschenderweise werden unter den oben angegebenen Bedingungen nicht nur die Adenylatkinasen vollständig gehemmt, sondern die Luciferasereaktion läuft nach pseudonullter Ordnung ab, ohne daß sich eine Hemmung durch . AMP nachteilig bemerkbar macht»Surprisingly, not only the adenylate kinases become complete under the conditions given above inhibited, but the luciferase reaction runs according to pseudonullter Order off without any inhibition. AMP makes a disadvantageous noticeable »

Vorzugsweise wird das Verfahren der Erfindung bei einempH-Wert zwischen 6,3 und 7,2 durchgeführt, besonders bevorzugt zwischen pH 6,5 und 6,9. Die ADP-Konzentration je Test beträgt vorzugsweise o,1 bis 1ο mMol/1, die Konzentration an Diadenosinpentaphosphat (Ap^A) beträgt vorzugsweise 1 bis 1oo .uMol/1.Preferably, the method of the invention is carried out at a pH between 6.3 and 7.2, particularly preferred between pH 6.5 and 6.9. The ADP concentration depending Test is preferably 0.1 to 10 mmol / l, the concentration of diadenosine pentaphosphate (Ap ^ A) is preferably 1 to 100 μmol / 1.

Im oben angegebenen bevorzugten pH-Wertbereich erhält man die besten Ergebnisse in Gegenwart von o,5 bis 2 mMol/1 ADP, 5 bis 50,UMoI/! Ap₅A und 5 bis 1o mMol/1 AMP.In the preferred pH range given above, the best results are obtained in the presence of 0.5 to 2 mmol / 1 ADP, 5 to 50, UMoI /! Ap ₅ A and 5 to 10 mmol / 1 AMP.

Außer den oben schon angegebenen Reagenzien wird beim erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise auch eine organische Sulfhydrylverbindung zugesetzt. Geeignete Sulfhydrylverbindungen sind beispielsweise N-Acetylcystein, Dithiothreit, Dithioerythrit und reduziertes Glutathion. Bevorzugt wird N-Acetylcystein verwendet. Des weiteren wird zweckmäßig ein Sequestrierungsmittel zugesetzt, wie Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA), Trilone„ Komplexone, Sequestrene und dergleichen. Auch Stabilisierungsmittel, wie Serumalbuioin, werden zweckmäßigerweise in dem Fachmann für die Stabilisierung enzymatischer Reagenzien bekannten Mengen zugesetzt.In addition to the reagents already specified above, in the case of the invention Process preferably also added an organic sulfhydryl compound. Suitable sulfhydryl compounds are for example N-acetylcysteine, dithiothreitol, dithioerythritol and reduced glutathione. Preferred N-acetylcysteine is used. In addition, a sequestering agent such as ethylenediaminetetraacetic acid is expediently added (EDTA), Trilone, Complexone, Sequestrene and the like. Also stabilizers, such as Serumalbuioin, are conveniently known to those skilled in the art amounts known for the stabilization of enzymatic reagents added.

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Bei der Firefly-Reaktion ist die Intensität des emittierten Lichtes der ATP-Konzentration direkt proportional. Die Meßgröße hat die Dimension einer Reaktionsgeschwindigkeit. Für eine Reaktion pseudoerster Ordnung ⁽⁰ATP^ ^Km⁵ 9^ilt: In the Firefly reaction, the intensity of the light emitted is directly proportional to the ATP concentration. The measured variable has the dimension of a reaction rate. For a pseudo first order reaction ⁽⁰ ATP ^ ^K m ⁵ 9 ^ilt:

τ = ^(h.v) ₌ max ρτ = ^ (hv) ₌ max ρ

dt K ATP mdt K ATP m

Wird dieser Reaktion eine ATP-liefernde Reaktion, wie z. B. die CK-Reaktion vorgeschaltet, so giltWill this reaction be an ATP-supplying reaction, like z. B. the CK reaction upstream, then applies

^{d C}ATP ^{d C} ATP

dtGerman

d. h., es resultiert ein linearer Anstieg der Lichtintensität, dessen Steigung der Aktivität der eingesetzten CK proportional sein sollte.d. This means that the result is a linear increase in the light intensity, the increase in the activity of the CK used should be proportional.

Diese enzymkinetischen Überlegungen setzen voraus, daß sich die Aktivität der Luciferase innerhalb des Beobachtungszeitraums nicht ändert. Dies ist jedoch normalerweise nicht der Fall, da die Firefly-Reaktion einer Produktinhibierung durch Oxyluciferin unterliegt, die bei der Messung einer definierten ATP-Konzentration zu einem starken zeitlichen Signalabfall und so zu einem eher blitzartigen Signal-Zeit-Verlauf führt, der höchstens einige Sekunden lang konstant verläuft.These enzyme kinetic considerations assume that the activity of the luciferase within the observation period does not change. However, this is usually not the case because the Firefly reaction is a product inhibition by oxyluciferin, which is subject to the Measurement of a defined ATP concentration at a strong temporal signal drop and thus at a lightning-fast one Signal-time curve leads to a maximum of a few seconds is constant for a long time.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß das erfindungsgemäß zur Inhibierung der Adenylatkinasen zugesetzte AMP unter den angegebenen Bedingungen die Eigenschaften der Firefly-Luciferase so ändert, daß die im Verlauf der Reaktion üblicherweise auftretende Produktinhibierung durch Oxyluciferin beseitigt wird. Dies führt dazu, daß bei Messung einer de-It has now surprisingly been found that the invention AMP added to inhibit the adenylate kinases under the specified conditions the properties the firefly luciferase changes in such a way that the in the course of Reaction commonly occurring product inhibition by oxyluciferin is eliminated. This leads to when measuring a de-

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finierten ÄTP-Konzentration anstelle eines blitzartigen Signal-Zeit-Verlaufs wie bisher eine weitgehende Signalkonstanz über mehr als 15 Minuten erreicht wird.defined ÄTP concentration instead of a flash-like one Signal-time curve, as before, an extensive signal constancy is reached over more than 15 minutes.

In der beigefügten Zeichnung zeigt Fig. 1 die erfindungsgemäß erzielte Signalkonstanz. Sie wurde mit folgendem Testansatz erstellt:In the accompanying drawing, FIG. 1 shows the signal constancy achieved according to the invention. She was with the following Test approach created:

Komponentecomponent 35,UMoI/!35, UMoI /! D-LuciferinD-luciferin 4oo Einheiten4oo units LuciferaseLuciferase (Einheiten pro Test)(Units per test) pH 7,75, 1oo mMol/1pH 7.75, 100 mmol / l Tris-Äcetat-PufferTris-acetate buffer 2 mMol/12 mmol / l EDTAEDTA 1o mMol/110 mmol / 1 MgMg 1o"⁸ Mol/l10 " ⁸ mol / l ATPATP o,1 %o, 1% RSARSA 5 mMol/15 mmol / l AMPAMP

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Bestimmung der Creatinkinase. Dieses ist dadurch gekennzeichnet, daß es 1o bis 5oo ,uM Luciferin, mindestens 5o U Luciferase, 5 bis 25o mM Puffer, pH 5,8 bis 7,5, 1 bis Io nt AMP, o,1 bis 1o mM ADP, 1 bis 1oo,uM Diadenosinpentaphosphat, 5 bis 5o mM Creatinphosphat, 1 bis 1oo mM organische Sulfhydrylverbindung, o,1 bis 5 mM Sequestrierungsmittel, o,o5 bis 1 Gew.-% Rinderserumalbumin und 1 bis 1oo mM Magnesiumionen für je 1 Liter Testlösung enthält. Es kann in fester oder gelöster Form vorliegen.Another object of the invention is a reagent for Determination of creatine kinase. This is characterized in that it contains 1o to 500 .mu.M luciferin, at least 50U Luciferase, 5 to 250 mM buffer, pH 5.8 to 7.5, 1 to Io nt AMP, 0.1 to 10 mM ADP, 1 to 100 µM diadenosine pentaphosphate, 5 to 50 mM creatine phosphate, 1 to 100 mM organic sulfhydryl compound, 0.1 to 5 mM sequestering agent, 0.05 to 1% by weight bovine serum albumin and 1 contains up to 100 mM magnesium ions for every 1 liter of test solution. It can be in solid or dissolved form.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Reagenz 15 bis 5o,uM Luciferin, 1oo bisIn a preferred embodiment, the reagent according to the invention contains 15 to 50 μM luciferin, 100 to

4
5 χ 1o ü Luciferase, 6o bis 12o mM Puffersubstanz, pH 6,3 bis 7,2, 5 bis 1o mM AMP, o,5 bis 2 mM ADP₁, 5 bis ,uM Diadenosinpentaphosphat, 2o bis 4o mM Greatinphos-4th
5 χ 1o ü luciferase, 6o to 12o mM buffer substance, pH 6.3 to 7.2, 5 to 1o mM AMP, O, 5 to 2 mM ADP _1, 5 bis, uM diadenosine pentaphosphate, 2o to 4o mM Greatinphos-

eS0037/(H12eS0037 / (H12

phat, 2 bis 5o itiM organische Sulfhydrylverbindung, ο, 5 bis 3 mM Sequestrierungsmittel, o,o5 bis ο,2 Gew.-% Rinderseruinalbumin und 5 bis 2o mM Magnesium!onen für je 1 Liter Testlösung.phate, 2 to 5o itiM organic sulfhydryl compound, ο, 5 to 3 mM sequestering agent, 0.05 to 0.2 wt% bovine serum albumin and 5 to 20 mM magnesium ions for 1 liter each Test solution.

Als Sequestrierungsmittel enthält das erfindungsgeraäße Reagenz vorzugsweise EDTA, als SuIfhydrylverbindung N-Acetylcystein. As a sequestering agent contains according to the invention Reagent preferably EDTA, as sulfhydryl compound N-acetylcysteine.

Beispiele für geeignete Puffersubstanzen sind Tris-Acetat, Imidazolacetat, Hepesacetat, Tris-, Iitiidazol-, TRA-, Hepesals Sulfat oder Chlorid, Arsenat- oder Phosphat-Puffer. Auch Glycinpuffer im genannten Bereich ist geeignet. Bevorzugt werden Imidazolacetat und Hepesacetat verwendet.Examples of suitable buffer substances are Tris acetate, Imidazole acetate, Hepes acetate, Tris-, Iitiidazole-, TRA-, Hepesals Sulphate or chloride, arsenate or phosphate buffer. Glycine buffer in the range mentioned is also suitable. Preferred Imidazole acetate and Hepes acetate are used.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Konzentrationsangaben beziehen sich auf fertige Reagenzlösung im Test, Mengenangaben auf die zur Herstellung von 1 Liter Testlösung benötigte Menge. In den Beispielen wurde eine nach dem Verfahren von FEBS-Lett. 7_o, 167 bis 17o (1976) isolierte Firefly-Luciferase verwendet. Als Luciferin wurden kommerziell erhältliche Produkte des jeweils höchsten erhältlichen Reinheitsgrades, beispielsweise die Chargen Sigma 58C-o349 und 98C-3942 oder Calbiochem Charge 54oo22 verwendet. In gleicher Weise eignen sich auch andere Luciferinpräparate vergleichbarer Reinheit.The following examples further illustrate the invention. Concentration data relate to the finished reagent solution in the test, quantitative information on the amount required to produce 1 liter of test solution. In the examples, one according to the method of FEBS-Lett. 7_o, 167 to 17o (1976) used isolated firefly luciferase. As a luciferin commercially available products of the highest available degree of purity, for example the Lots Sigma 58C-o349 and 98C-3942 or Calbiochem Lot 54oo22 used. In the same way are also suitable other luciferin preparations of comparable purity.

Die im folgenden angegebenen Luciferase-Einheiten wurden wie folgt ermittelt:The luciferase units indicated below were determined as follows:

TestansatzTest approach

D-Luciferin Tris-Acetat, pH 7,75 EDTA
RSAD-Luciferin Tris Acetate, pH 7.75 EDTA
RSA

Endkonzentration im TestFinal concentration in the test

35-uMol/l 1oo mMol/1 2 mMol/135 µmoles / l 100 mmoles / l 2 mmol / l

030037/0112030037/0112

/11/ 11

MgMg

Luciferase ATP (als Start)Luciferase ATP (as start)

1o mMol/110 mmol / 1

variabelvariable

2,5.1o~⁷ Mol/12.5.10 ~ ⁷ moles / 1

Die Messung wurde an einem handelsüblichen ATP-Photometer (Firma SAI, San Diego, Calif„, USA) durchgeführt.The measurement was made on a commercially available ATP photometer (SAI Company, San Diego, California, USA).

Als Enzymeinheit gilt diejenige Menge, die unter den oben angegebenen Bedingungen ein Signal von 37 Impulsen/1ο Sekunden gibt. Hierbei war die Potentiometer-Empfindlichkeit am obiger Gerät auf 6,7 eingestellt. As an enzyme unit is that amount which is under the above conditions, a signal of 37 pulses / 1ο seconds applies. The potentiometer sensitivity on the above device was set to 6.7.

Beispiel!Example!

Lösungensolutions

Konz. in Lösung Konz. im TestConc. In solution Conc. In the test

Lösung_1_Solution_1_

EDTAEDTA

Mg-Äcetat D-Luciferin Luciferase RSAMg-acetate D-luciferin luciferase RSA

Imidazol-Acetat, pH 6,7Imidazole acetate, pH 6.7

4 mMol/1
2ο mMol/1
7o,uMol/l
4oo Einh./ml4 mmol / l
2ο mmol / 1
7o, µmoles / l
4oo units / ml

2 g/l
ο mMol/12 g / l
ο mmol / 1

2 mMol/1 1o mMol/1 35 ,uMol/1 4oo Einh./Test2 mmoles / 1 10 mmoles / 1 35 µmoles / 1 4oo units / test

1oo mMol/1100 mmol / l

Lösung_2Solution_2

AMPAMP

N-Acetylcystein (NAC) Ap₅AN-acetylcysteine (NAC) Ap ₅ A

ADPADP

Imidazol-Äcetat, pH 6,7Imidazole acetate, pH 6.7

33 mMol/1
33 mMol/1
33 ,uMol/1
3,3 mMol/1
11o mMol/133 mmol / l
33 mmol / l
33, µmoles / 1
3.3 mmol / l
11o mmol / l

1o mMol/110 mmol / 1

1o mltol/l1o mltol / l

1o,uMol/l1o, µmoles / l

1 mMol/11 mmol / 1

1oo mMol/1100 mmol / l

Creatinphosphat Imidazol-AcetatCreatine Phosphate Imidazole Acetate

3oo mMol/1
11o mMol/1300 mmol / l
11o mmol / l

3o mMol/1 1oo mMol/130 mmol / 1 100 mmol / 1

Lösung_4
ATPSolution_4
ATP

5 χ 1o~⁴ MoI/1 5 χ 10~⁶ MoI/15 χ 1o ~ ⁴ MoI / 1 5 χ 10 ~ ⁶ MoI / 1

Testtest

Es werden zusammengegeben:
1ooo,ul Lösung 1The following are put together:
1ooo, ul solution 1

600 ,ul Lösung 2 2oo ,ul Serumprobe600 μl solution 2 2oo μl serum sample

Das Gemisch wird bei 25°C 5 Minuten vorinkubiert, dann wird das Testglas in das Meßgerät (SAI-Photometer) gestellt und die Reaktion durch Zugabe von 2oo,ul Lösung 3, die auch auf 25°C vorinkubiert war, gestartet. Der Kurvenverlauf wird auf einen Schreiber gegeben und nach ca. 2 Minuten wird mit 2o ,ul Lösung 4 die interne Eichung in ,uMol Substratumsatz/Minute vorgenommen. Die Ergebnisse werden von einem Schreiben automatisch aufgezeichnet. Der Kurvenverlauf wird weitere 2 bis 3 Minuten aufgezeichnet, um ein graphisch gut auswertbares Bild zu erhalten, welches in Fig. 2 der beigefügten Zeichnung dargestellt ist.The mixture is preincubated at 25 ° C. for 5 minutes, then the test tube is placed in the measuring device (SAI photometer) and the reaction was started by adding 200 μl of solution 3, which had also been preincubated to 25 ° C. The course of the curve is put on a recorder and after approx. 2 minutes the internal calibration is carried out with 2o, ul solution 4 in , µmol substrate turnover / minute. The results are automatically recorded of a letter. The course of the curve is recorded for a further 2 to 3 minutes, in order to obtain a graphically easily evaluable image, which is shown in FIG. 2 of the accompanying drawing.

Die linear ansteigende Kurve gibt die Steigung in willkürlichen Skalenteilen/Minute an und die Eichstufe ermöglicht die Umrechnung von Skalenteilen (alsΔ mV eingetragen) in ,uMol ATP. Die bei der Umrechnung erhaltene Kurve ist in Fig. 3 der Zeichnung dargestellt.The linearly rising curve indicates the slope in arbitrary scale units / minute and enables the calibration level the conversion of scale divisions (entered as Δ mV) in, µmol ATP. The curve obtained during the conversion is shown in FIG. 3 of the drawing.

Beispiel 2 Testkit für I00 TestsExample 2 test kit for 100 tests

Ö30037/0112Ö30037 / 0112

/3/ 3

Flasche 1 enthältBottle 1 contains

o,4 mMol EDTA 2 mMol Magnesiumacetat 7 ,uMol Luciferin0.4 mmol EDTA, 2 mmol magnesium acetate 7, µmol luciferin

4
4 χ 1o Einheiten Luciferase 200 mg Rinderserumalbumin 11 mMol Imidazol-Puffer, pH 6,7 als Lyophilisat.4th
4 × 10 units of luciferase 200 mg bovine serum albumin 11 mmol imidazole buffer, pH 6.7 as a lyophilisate.

Flasche 2 enthältBottle 2 contains

2 mMol Adenosin-5'-monophosphat 2 mMol N-Acety!cystein 2,uMol Diadenosinpentaphosphat o,2 mMol Ädenosin-5'-diphosphat 6,5 mMol Imidazolacetat-Puffer, pH .6,7 als Lyophilisat.2 mmoles of adenosine 5'-monophosphate 2 mmoles of N-acetyl cysteine 2, µmoles of diadenosine pentaphosphate 0.2 mmol adenosine 5'-diphosphate 6.5 mmol imidazole acetate buffer, pH 6.7 as a lyophilisate.

Flasche 3 enthält Bottle 3 contains

6 mMol Creatinphosphat 2,2 mMol Imidazoiacetat-Puffer,pH 6,7 als Lyophilisat.6 mmoles of creatine phosphate 2.2 mmol imidazoiacetate buffer, pH 6.7 as a lyophilisate.

Flasche 4 enthält 1o~⁶ Mol ATP als Lyophilisat. Bottle 4 contains 10 ~ ⁶ mol of ATP as lyophilisate.

Der Inhalt von Flasche 1 wird in I00 ml Wasser, der Inhalt von Flasche 2 in 60 ml Wasser, der Inhalt von Flasche 3 in 2o ml Wasser und der Inhalt von Flasche 4 in 2 ml Wasser aufgenommen zur Herstellung von gebrauchsfertigen Lösungen. Die Testdurchführung selbst erfolgt analog Beispiel 1 unter Verwendung der in Beispiel 1 angegebenen Mengen der einzelnen Lösungen.The contents of bottle 1 are dissolved in 100 ml of water, the contents of bottle 2 in 60 ml of water, the contents of bottle 3 in 2o ml of water and the contents of bottle 4 in 2 ml of water added for the preparation of ready-to-use solutions. The test itself is carried out analogously to Example 1 using the amounts of the individual solutions given in Example 1.

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Claims

Patentan sprächePatent application

1.Λ Verfahren zur Bestimmung von Creatinkinase durch Reaktion von Creatinphosphat mit Adenosindiphosphat unter Bildung von Adenosintriphosphat, Umsetzung des letzteren mit Luciferin und Sauerstoff in Gegenwart von Luciferase und Diadenosinpentaphosphat unter Bildung von Oxyluciferin und Ädenosinmonophosphat, und Messung des dabei emittierten Lichts, dadurch gekennzeichnet , daß man die umsetzung bei Adenosindiphosphat-Substrat-Sätti^ungskonzentration in Gegenwart von 1 bis Ίο mMol/1 AMP bei-pH-Werten von 5,8 bis 7,5 mit mindestens 5o U/Test Luciferase durchführt.1. Λ Method for the determination of creatine kinase by reaction of creatine phosphate with adenosine diphosphate to form adenosine triphosphate, reaction of the latter with luciferin and oxygen in the presence of luciferase and diadenosine pentaphosphate to form oxyluciferine and adenosine monophosphate, and measurement of the light emitted thereby, characterized in that the reaction is carried out at adenosine diphosphate substrate saturation concentration in the presence of 1 to Ίο mmol / 1 AMP at pH values of 5.8 to 7.5 with at least 50 U / test luciferase.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeich-net , daß man o,1 bis 1o mMol/1 ADP und 1 bis Ι00Λ1Μ0Ι/Ι Diadenosinpentaphosphat zusetzt. 2. The method according to claim 1, characterized geke η η drawings-net that 0.1 to 1o mmol / 1 ADP and 1 to Ι00Λ1Μ0Ι / Ι diadenosine pentaphosphate are added.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadu-rch gekennzeichnet , daß man bei pH 6,2 bis 7,2 in Gegenwart von o,5 bis 2 mMol/1 ADP, 5 bis 5o,uMol/l Diadenosinpentaphosphat und 5 bis 1o mMol/1 AMP arbeitet.3. The method according to claim 2, characterized in that at pH 6.2 to 7.2 in the presence of 0.5 to 2 mmol / 1 ADP, 5 to 5o, µmol / l diadenosine pentaphosphate and 5 to 1o mmol / 1 AMP is working.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung in Gegenwart eines Sequestrierungsmittels, wie Äthylendiamintetraessigsäure, einer organischen Sulfhydrylverbindung, wie N-Äcetylcystein, und von Serumalbumin durchführt.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that that the determination in the presence of a sequestering agent, such as ethylenediaminetetraacetic acid, an organic sulfhydryl compound, such as N-acetylcysteine, and from serum albumin.

5. Reagenz zur Bestimmung der Creatinkinase, dadurch gekennzeichnet , daß es 1o bis 5oo,uM Luciferin , mindestens 5o U Luciferase, 5 bis 25o mM Puffer, pH 5,8 bis 7,5, 1 bis 1o mM AMP, o,1 bis Ίο mM ADP, 1 bis I00 ,uM Diadenosinpentaphosphat, 5 bis 5o mM Crea-5. Reagent for the determination of creatine kinase, characterized in that it contains 1o to 5oo μM luciferin , at least 5o U luciferase, 5 to 250 mM buffer, pH 5.8 to 7.5, 1 to 1o mM AMP, 0.1 to Ίο mM ADP, 1 to 100, uM diadenosine pentaphosphate, 5 to 50 mM Crea-

'630037/0111'630037/0111

tinphosphat, 1 bis 1oo irtM organische SuIfhydry!verbindung, o,1 bis 5 mM Sequestrierungsmittel, o_ro5 bis 1 Gew.-% Rinderserumalbumin und 1 bis 1oo mM Magnesiumionen für je 1 Liter Testlösung enthält.tinphosphat, 1 to 1oo irtM organic SuIfhydry! connection, o, 1 to 5 mM sequestrants, o _r o5 contains to 1 wt .-% bovine serum albumin and 1 to 1oo mM magnesium ions for each 1 liter of test solution.

6. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es 15 bis 5o,uM Luciferin, 1oo bis 6. Reagent according to claim 4, characterized in that it is 15 to 5o, uM luciferin, 1oo to

4
5 χ Io U Luciferase, 6o bis 12o mM Puffersubstanz, pH 6,3 bis 7,2, 5 bis 1o mM AMP, ο,5 bis 2 mM ADP, 5 bis 5o,uM Diadenosinpentaphosphat, 2o bis 4o mM Creatinphosphat, 2 bis 5o mM organische SuIfhydrylverbindung, o,5 bis 3 mM Sequestrierungsmittel, o,o5 bis o,2 Gew.-% 'Rinderserumalbumin und 5 bis 2o· mM Magnesiumionen für je 1 Liter Testlösung enthält.4th
5 χ Io U luciferase, 6o to 12o mM buffer substance, pH 6.3 to 7.2, 5 to 1o mM AMP, ο, 5 to 2 mM ADP, 5 to 5o, uM diadenosine pentaphosphate, 2o to 4o mM creatine phosphate, 2 to Contains 50 mM organic sulfhydryl compound, 0.5 to 3 mM sequestering agent, 0.05 to 0.2% by weight of bovine serum albumin and 5 to 20 mM magnesium ions for each 1 liter of test solution.

7. Reagenz nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es als Sequestrierungsmittel Äthylendiamintetraessigsäure enthält.7. Reagent according to claim 4 or 5, characterized in that it is ethylenediaminetetraacetic acid as a sequestering agent contains.

8. Reagenz nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es als Sulfhydrylverbindung N-AcetyIcystein enthält.8. Reagent according to one of claims 4 to 6, characterized in that it is used as a sulfhydryl compound Contains N-acetylcysteine.

9. Reagenz nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß es als Puffersubstanz Imidazolacetat oder Hepesacetat enthält.9. Reagent according to one of claims 4 to 7, characterized in that it is used as a buffer substance Contains imidazole acetate or hepes acetate.