DE2907628B1 - Sample tubes for the examination of samples in the clinical area, in particular urine samples - Google Patents

Sample tubes for the examination of samples in the clinical area, in particular urine samples

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Description

Reaktion (2):Reaction (2):

PODPOD

H2O2 + FH2H 2 O 2 + FH 2 -

reduzierter Farbstoff, farblos 2 H2O + Freduced dye, colorless 2 H 2 O + F

Farbstoff
Färbung sichtbar
dye
Color visible

Es ist nun bekannt (s. Kohl, Störungen der Glucose-Anzeige durch Ascorbinsäure bei Teststreifen, Laboratoriumsblätter 27 (1977), S. 103-108), daß die Anwesenheit von Ascorbinsäure in der Urinprobe zu falsch-negativen Reaktionen führt, da das bei der Oxidation von Glucose zu ό-Gluconolacton frei werdende Wasserstoffperoxid, dessen Menge ja nach Reaktion (2) das Ausmaß der Färbung des Teststreifens bestimmt, mit der Ascorbinsäure reagiert und diese zu Dehydro-ascorbinsäure oxidiert. Dies ist eine farblose Substanz. Die Reaktion läuft wie folgt ab:It is now known (see Kohl, glucose display disorders due to ascorbic acid in test strips, Laboratoriumsblätter 27 (1977), pp. 103-108) that the presence of ascorbic acid in the urine sample increases False-negative reactions result, since the oxidation of glucose to ό-gluconolactone free hydrogen peroxide, the amount of which depends on reaction (2), the extent to which the test strip is colored determined, reacts with the ascorbic acid and oxidizes it to dehydro-ascorbic acid. This is a colorless one Substance. The reaction proceeds as follows:

Reaktion (3):Response (3):

OH OH C = COH OH C = C

H-C-H-C-

-O-O

C = O + H2O2 C = O + H 2 O 2

HO—C-H
CH2OH
HIGH
CH 2 OH

L-AscurbinsäureL-ascurbic acid

O OO O

Il Il c—cIl Il c-c

C=O +2H2OC = O + 2H 2 O

H—C OH-CO

HO —C-H
CH2OH
HIGH
CH 2 OH

L-Dehydro-ascorbinsäureL-dehydroascorbic acid

Das heißt in anderen Worten: Das bei der Reaktion (I) entstehende Wasserstoffperoxid ist bereits durch die Reaktion (3) mit der Ascorbinsäure verbraucht und führt daher nicht mehr zur Farbstoffbildung und daher nicht mehr zur Anzeige der Anwesenheit von Glucose in der Urinprobe, so daß die Anwesenheit von Glucose nicht mehr bzw. nicht in einem den tatsächlichen Verhältnissen entsprechenden Ausmaß erfolgt.In other words: the hydrogen peroxide produced in reaction (I) is already through the Reaction (3) with the ascorbic acid is consumed and therefore no longer leads to dye formation and therefore does not more to indicate the presence of glucose in the urine sample, so that the presence of glucose is not more or not to an extent that corresponds to the actual circumstances.

Um bei der Feststellung von Glucose mit Teststreifen diesen Fehler auszuschalten, ist nun vorgeschlagen worden, in Teststreifen ferner einen Ascorbinsäure-Testbezirk vorzusehen (Kohl, a. a. O., S. 105), so daß die Auswertung von Proben, die Ascorbinsäure enthalten, verhindert werden kann. Diese Methode führt jedoch nur zur Erkennung von solchen Urinproben, die für die Durchführung der Schnelltestes mit Teststreifen ungeeignet sind.In order to eliminate this error when determining glucose with test strips, it is now proposed have also been to provide an ascorbic acid test area in test strips (Kohl, op. cit., p. 105), so that the Evaluation of samples that contain ascorbic acid can be prevented. However, this method works only for the detection of urine samples that are unsuitable for performing the rapid test with test strips are.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Proberöhrchen zu schaffen, in dem derartige Untersuchungen durchgeführt werden können, ohne daß in der Probe ebenfalls enthaltene Störsubstanzen, die mit dem H2O2 reagieren, die Untersuchung verfälschen. Von dieser Aufgabenstellung wird z. B. die Schaffung eines Urinproberöhrchens umfaßt, in dem der herkömmliche Glucose-Test mit Hilfe von Teststreifen auch dann fehlerfrei ablaufen soll, wenn die Urinprobe Ascorbinsäure enthält.The object of the invention is to create a test tube in which such examinations can be carried out without interfering substances also contained in the sample that react with the H2O2, falsify the investigation. From this task z. B. the creation of a urine test tube includes, in which the conventional glucose test with the help of test strips should also run without errors, if the urine sample contains ascorbic acid.

Diese Aufgabe wird bei einem Proberöhrchen der eingangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das RöhrchenThis object is achieved according to the invention in a test tube of the type mentioned at the outset solved that the tube

a) Katalasea) catalase

b) eine unter dem Einfluß von Katalase Sauerstoff abgebende Substanz, sowieb) an oxygen-releasing substance under the influence of catalase, as well as

c) eine Oxidase, die in Gegenwart des Sauerstoffs die Störungssubstanzen oxidiert,c) an oxidase that oxidizes the interfering substances in the presence of oxygen,

enthält, wobei die Katalase und die Oxidase eine Schicht 4» bilden bzw. in einer Schicht eingebettet sind, die einen Teil der Innenwandung des Röhrchens bedeckt, und daß ferner die Sauerstoff abgebende Substanz als Trockensubstanz in dem Röhrchen enthalten ist.Contains, wherein the catalase and the oxidase form a layer 4 »or are embedded in a layer, the one Part of the inner wall of the tube is covered, and that also the oxygen-releasing substance as a dry substance is contained in the tube.

Eine Ausführungsart der Erfindung betrifft einOne embodiment of the invention relates to a

4r> Urinprobenröhrchen. Bei diesem ist die unter dem Einfluß von Katalase Sauerstoff abgebende Substanz ein Peroxid, z. B. Carbamid-Peroxid; ferner ist die Oxidase die Ascorbinsäure-Oxidase. Sobald also die Urinprobe in das Röhrchen eingegeben wird, bildet die 4 r > urine sample tubes. In this case, the substance releasing oxygen under the influence of catalase is a peroxide, e.g. B. carbamide peroxide; furthermore, the oxidase is ascorbic acid oxidase. So as soon as the urine sample is entered into the tube, the

1JO Katalase aus dem Peroxid Sauerstoff und Wasser. Dies erfolgt nach folgender Reaktion: 1 JO catalase from the peroxide oxygen and water. This takes place after the following reaction:

Reaktion (4):Response (4):

KatalaseCatalase

2H2O2 >■ 2H2O+ O2 2H 2 O 2 > ■ 2H 2 O + O 2

Diese Reaktion läuft erst im Zeitpunkt des Eingehens der Urinprobe ab, da die Katalase, die mit der Ascorbinsäure-Oxidase die Schicht bildet, und das Peroxid separat trocken in dem Röhrchen vorhanden sind. Die Reaktion (4) läuft also erst ab, sobald die Urinprobe eingefüllt wird.This reaction does not take place until the urine sample is received, as the catalase, which is associated with the Ascorbic acid oxidase forms the layer, and the peroxide is present separately in the dry tube are. The reaction (4) only takes place as soon as the urine sample is filled in.

b5 Der durch die Reaktion (4) gebildete Sauerstoff oxidiert nun in Gegenwart der Ascorbinsäure-Oxidase (ASOD) nach der folgenden Reaktion die Ascorbinsäure zur Dehydro-Ascorbinsäure:b5 The oxygen formed by reaction (4) now oxidizes in the presence of ascorbic acid oxidase (ASOD) after the following reaction the ascorbic acid to dehydro-ascorbic acid:

Reaktion (5):Response (5):

OH OH
C=C
OH OH
C = C

C=OC = O

H-C OH-C O

HO —C-H
CH2OH
HIGH
CH 2 OH

L-AscorbinsäureL-ascorbic acid

ASoDASoD

+ O2 + O 2

O OO O

Il Il c—cIl Il c-c

H-C OH-C O

HO —C-H
CH2OH
HIGH
CH 2 OH

L-Dehydro-ascorbinsäureL-dehydroascorbic acid

2H2O2H 2 O

Dadurch wird die in der Urinprobe vorhandene Ascorinsäure so umgesetzt, daß das entstehende Oxidationsprodukt, nämlich die Dehydro-Ascorbinsäure nicht mehr mit dem Wasserstoffperoxid reagieren kann, das bei der Reaktion (1), die Bestandteil des Glucose-Tests ist, entsteht. Voraussetzung dafür ist freilich, daß die Katalase in dem Röhrchen in solcher Menge vorhanden ist, daß sie bei Ablauf der Reaktion (4) das gesamte Peroxid, das sich in dem Röhrchen befindet, umsetzt.As a result, the ascoric acid present in the urine sample is converted in such a way that the resulting Oxidation product, namely dehydro-ascorbic acid, no longer reacts with the hydrogen peroxide that occurs in reaction (1), which is part of the glucose test. requirement of it is of course, that the catalase is present in the tube in such an amount that it can be used at the end of the reaction (4) converts all of the peroxide that is in the tube.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird nunmehr anhand der Zeichnung beschrieben, die ein Ausführungsbeispiel darstellt. Das Röhrchen 1 ist von unten her bis zur Höhe h auf seiner Innenwandung mit einer Schicht 2 versehen, die Katalase und Ascorbin-Oxidase enthält. Das Röhrchen 1 ist mit einem Stopfen 3 verschlossen, der auf seiner der Innenseite des Röhrchens 1 zugewandten Stirnfläche 4 die Peroxidase trägt. Diese ist dort in Form einer Anhäufung 5 aufgetrocknet oder mit irgendeiner löslichen Substanz, z. B. Gelatine verklebt. Beim Einbringen einer Urinprobe löst sich zunächst die Schicht 2. Dann kann das Röhrchen gekippt werden, so daß auch die Peroxidase in die Urinprobe gelangt und sich dort löst. Dann laufen die Reaktionen (4) und (5) ab. Danach kann man dann in der bekannten Weise einen Teststreifen einbringen, auf dem die Reaktionen (1) und (2) zur Feststellung von Glucose ablaufen können, ohne daß diese durch die Störreaktion (3) beeinflußt oder negativ verfälscht wird.An embodiment of the invention will now be described with reference to the drawing, which shows an embodiment. The tube 1 is provided from below up to height h on its inner wall with a layer 2 which contains catalase and ascorbic oxidase. The tube 1 is closed with a stopper 3 which carries the peroxidase on its end face 4 facing the inside of the tube 1. This is there in the form of an accumulation 5 dried or with some soluble substance, for. B. gelatin glued. When a urine sample is introduced, layer 2 first loosens. Then the tube can be tilted so that the peroxidase also gets into the urine sample and dissolves there. Then reactions (4) and (5) take place. A test strip can then be inserted in the known manner, on which reactions (1) and (2) for the determination of glucose can take place without this being influenced or adversely affected by the interfering reaction (3).

Die Aufbringung der Schicht 2 kann z. B. folgendermaßen erfolgen. Man nimmt 75 mMol einer Pufferlösung, z. B. Tris, und löst sie in 11 Wasser. Mit Zitronensäure wird diese Lösung auf pH=5,6 gebracht. Dieser Wert hat sich als besonders günstig für die Reaktion der Ascorbinsäure-Oxidase erwiesen.The application of the layer 2 can, for. B. be done as follows. One takes 75 mmol of a buffer solution, z. B. Tris, and dissolve it in 11 water. This solution is brought to pH = 5.6 with citric acid. This value has proven to be particularly favorable for the reaction of the ascorbic acid oxidase.

In dieser Pufferlösung wird gelöst:The following is dissolved in this buffer solution:

(1) Katalase. Diese Substanz ist im Handel erhältlich. Man löst pro Liter Pufferlösung 1000 mg Katalase.(1) catalase. This substance is commercially available. 1000 mg of catalase are dissolved per liter of buffer solution.

(2) Ferner löst man in 11 Pufferlösung 500 mg Ascorbinsäure-Oxidase. Die Herstellung dieser Substanz ist bekannt (vgl. Hoppe-Seyler/Thierfelder, Handbuch der physiologisch- und pathologisch-chemischen Analyse, 10. Aufl., 1964, S. 909 ff.; s. ferner die Nachweise bei Boyer, Lardy, Myrbäck (Herausgeber), The Enzymes, 2. Aufl., Bd. 8, New York und London (1963), S. 297 ff.(2) In addition, 500 mg of ascorbic acid oxidase are dissolved in 1 l of buffer solution. The making of this Substance is known (see Hoppe-Seyler / Thierfelder, Handbook of physiological and pathological-chemical analysis, 10th edition, 1964, p. 909 ff .; See also the references in Boyer, Lardy, Myrbäck (editors), The Enzymes, 2nd ed., Vol. 8, New York and London (1963), p. 297 ff.

20 Mikroliter dieser Lösung benötigt man etwa für 15 ml einer Urinprobe. Man stellt also mit Hilfe von etwa 20 Mikroliter dieser Lösung, die durch das dargestellte Puffer/Enzym-Gemisch gebildet wird, die Schicht 2 auf der Innenwand des Röhrchens 1, dessen Volumen 15 ml Urin aufnimmt, her. Das kann z. B. mit Hilfe einer Vorrichtung erfolgen, die maschinell von oben her in das Innere des Röhrchens eingeführt wird und im Prinzip wie eine Sprühpistole arbeitet, wobei die aufgesprühte Menge der Flüssigkeit in der angegebenen Quantität begrenzt werden kann. Auf die Innenwandung des Röhrchens werden diese 20 Mikroliter des Puffer/Enzym-Gemisches aufgesprüht und das Röhrchen anschließend durch Hitzeeinwirkung getrocknet. Der feine Sprühnebel trocknet dann in der dargestellten Weise an der Innenwandung des Röhrchens 1 an.
Man muß dann noch Peroxid einbringen. Derartiges Peroxid, z. B. Carbamid-Peroxid (CO(NH2J2 · H2O2) ist im Handel erhältlich. Wie bereits erwähnt, muß die Menge derart sein, daß sie durch die Katalase vollständig umgesetzt wird. Wählt man Katalase und Ascorbin-Oxidase in den oben angegebenen Mengen, so ist etwa eine Menge von 3 mg Peroxid zu wählen. In der in der beiliegenden Figur gezeigten Form ist diese Menge in räumlich konzentrierter Form, d. h. in Form einer Anhäufung 5 auf der Unterseite des Stopfens 3 angebracht.
20 microliters of this solution are needed for about 15 ml of a urine sample. With the help of about 20 microliters of this solution, which is formed by the buffer / enzyme mixture shown, the layer 2 on the inner wall of the tube 1, the volume of which takes up 15 ml of urine, is produced. This can e.g. B. be done with the help of a device that is mechanically introduced from above into the interior of the tube and works in principle like a spray gun, the sprayed amount of liquid can be limited in the specified quantity. These 20 microliters of the buffer / enzyme mixture are sprayed onto the inner wall of the tube and the tube is then dried by the action of heat. The fine spray mist then dries on the inner wall of the tube 1 in the manner shown.
You then have to add peroxide. Such peroxide, e.g. B. Carbamide peroxide (CO (NH 2 J 2 · H 2 O 2 ) is commercially available. As already mentioned, the amount must be such that it is completely converted by the catalase. If you choose catalase and ascorbic oxidase in In the form shown in the attached figure, this amount is applied in a spatially concentrated form, ie in the form of an accumulation 5 on the underside of the stopper 3.

Grundsätzlich gibt es außer der gezeigten Ausführungsart noch verschiedene Möglichkeiten zur Einbringung des Peroxids:In addition to the embodiment shown, there are also various ways of introducing it of the peroxide:

1. Man kann das Peroxid als Pulver ganz einfach in so das Röhrchen schütten. Es bleibt dann entweder in pulveriger Form am Bodes des Röhrchens liegen oder verteilt sich etwa gleichmäßig entlang der Innenwand an dem Röhrchen, beispielsweise aufgrund elektrostatischer Haftung od. dgl. Die Menge ist auch so gering, daß im Prinzip nicht zu befürchten ist, daß das Peroxid etwa beim öffnen des Röhrchens herausfällt.1. You can simply pour the peroxide into the tube as a powder. It then either stays in powdery form at the bottom of the tube or distributed approximately evenly along the Inner wall on the tube, for example due to electrostatic adhesion or the like The amount is so small that, in principle, there is no risk of the peroxide being released when it is opened of the tube falls out.

2. Man kann aber auch das Peroxid in Wasser lösen oder in Alkohol suspendieren und als Schicht auf der Innenwandung des Röhrchens 1 oder auf der Stirnfläche 4 des Stopfens 3 aufbringen. Dabei wird diese Schicht an der Innenwandung des Röhrchens 1 vorzugsweise an einer Stelle aufgebracht, an der sich die Schicht 2 nicht befindet. Gelingt es jedoch, beide Schichten übereinander aufzubringen, ohne daß sie miteinander während des Vorgangs des Aufbringens reagieren, so ist auch das im Prinzip möglich.2. But you can also dissolve the peroxide in water or suspend it in alcohol and dissolve it as a layer the inner wall of the tube 1 or on the end face 4 of the stopper 3. It will this layer is applied to the inner wall of the tube 1, preferably at a point where Layer 2 is not located. However, if you succeed in applying both layers on top of each other without that they react with one another during the process of application, so it is in principle too possible.

3. Eine weitere Möglichkeit bestünde darin, das Peroxid in einer schnell löslichen Gelatinekapsel in das Röhrchen einzubringen oder auch auf einen Träger, also etwa ein zylindrisches Stück Röhrchen 6 aufzubringen (z. B. durch Aufsprühen und Trocknen wie oben beschrieben), welches Röhrchen 6 dann in das Innere des Röhrchens 1 eingegeben wird. Das Röhrchen 1 in der dargestell-3. Another possibility would be to put the peroxide in a quick-dissolving gelatin capsule in to bring in the tube or on a support, such as a cylindrical piece of tube 6 to apply (e.g. by spraying and drying as described above), which tube 6 is then entered into the interior of the tube 1. The tube 1 in the illustrated

ten Form, jedoch anstelle der Anhäufung 5 mit dem Röhrchen 6 versehen, bildet also eine Alternative.th shape, but provided with the tube 6 instead of the accumulation 5, thus forms an alternative.

Bringt man also das Peroxid derart ein, daß man es zunächst löst und dann an irgendeiner Stelle aufträgt oder aufsprüht und anschließend trocknen läßt, so kann man die Lösung beispielsweise so herstellen, daß man etwa in 5 Mikroliter Wasser 3 mg Peroxid löst.So if you bring in the peroxide in such a way that you first dissolve it and then apply it somewhere or sprayed on and then allowed to dry, so you can prepare the solution, for example, that you Dissolves 3 mg peroxide in about 5 microliters of water.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen1 sheet of drawings

030 122/469030 122/469

Claims (1)

Patentansprüche:Patent claims: 1. Proberöhrchen für die Untersuchung von Proben im klinischen Bereich; insbesondere von Urinproben, unter Verwendung eines ersten Reagenz, das mit einer in der Probe vorhandenen festzustellenden Substanz unter Abgabe von H2O2 reagiert, und eines zweiten Reagenz, das mit Hilfe des derart gebildeten H2O2 die Oxidation eines Farbstoffbildners zum Farbstoff bewirkt, der ein Indikator für die festzustellende Substanz ist, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ausschaltung von Störungen, die von weiteren in der Probe enthaltenen mit H2O2 reagierenden Substanzen verursacht werden, das Proberöhrchen1. Sample tubes for the examination of samples in the clinical area; especially from Urine specimens, using a first reagent that is identical to one present in the specimen to be detected substance reacts with the release of H2O2, and a second reagent that with the help of of the H2O2 formed in this way causes the oxidation of a dye former to form the dye, which is a The indicator for the substance to be determined is characterized in that it is switched off of interferences caused by other substances in the sample that react with H2O2 caused the test tube
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