DE2855698A1 - Antithrombotic agent contg. urokinase - produced by maintaining pH neutral or weakly alkaline during each processing step for urokinase prodn. - Google Patents

Abstract

The agent contains urokinase of mol. wt. 54,000 plus-or-minus 10000 as main component. It is produced by maintaining pH at neutrality or weakly alkaline on each processing step for prodn. of urokinase. Pref. pH is 5.5-12 during prodn. and dialkysis.

Description

Die im menschlichen Urin auftretende Urokinase katalysiertThe urokinase found in human urine catalyzes

die Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin. Plasmin seinerseits bewirkt die Proteolyse des Fibrins und vermindert die Faktor-V- und -VIII-Aktivität. Urokinase wird aus menschlichem Urin oder Nierenzellenkulturen isoliert und nach üblichen Methoden gereinigt; vgl. DT-AS 2 502 095. Gereinigte Urokinase wird klinisch in großem Umfang zur Therapie von peripheren arteriellen und venösen Thrombosen und in Kombination mit Karzinostatika zur unterstützenden Behandlung maligner Neoplasien verwendet.the conversion of plasminogen to plasmin. Plasmin in turn causes proteolysis of fibrin and reduces factor V and VIII activity. Urokinase is isolated from human urine or kidney cell cultures and according to customary Methods cleaned; see DT-AS 2 502 095. Purified urokinase is clinically used in for the therapy of peripheral arterial and venous thromboses and in combination with carcinostatic agents for the supportive treatment of malignant neoplasms used.

Die zur Zeit eingesetzten Urokinasepräparate enthalten Urokinasen unterschiedlichen Molekulargewichts, Es sind zwei Arten von Urokinase bekannt, nämlich eine Urokinase mit einem Molekulargewicht von etwa 33 000 + 10 000 und eine höhermolekulare Urokinase mit einem Molekulargewicht von etwa 54 000 zeigen + 10 000. Diese Urokinasen liegen normalerweise im Gemisch vor undl eine bestimmte Aktivität. Die Existenz von Urokinasen unterschiedlichen Molekulargewichtsin den bekannten Urokinasepräparaten ist vermutlich der Gegenwart von Isoenzymen, der Transformation zu Untereinheiten unter der Einwirkung von proteolytischen Enzymen im Urin oder anderen Substanzen oder der Zersetzung und Modifizierung während der Gewinnung aus Urin zuzuschreiben.The urokinase preparations currently in use contain urokinases different molecular weight, two types of urokinase are known, viz a urokinase with a molecular weight of about 33,000 + 10,000 and a higher molecular weight Urokinases with a molecular weight of about 54,000 show +10,000. These urokinases are usually present in a mixture and have a certain activity. The existence of urokinases of different molecular weights in the known urokinase preparations is believed to be the presence of isoenzymes that transform into subunits under the action of proteolytic enzymes in the urine or others Substances or decomposition and modification during recovery from urine attributable to.

Vermutlich besitzen Urokinasepräparate mit unterschiedlichem Molekulargewicht auch unterschiedliche physiologische Eigenschaften und Wirkungen. Bis jetzt gibt es jedoch nur wenige Veröffentlichungen über signifikante Unterschiede in der Wirkung bei in-vitro-Tests nach der Fibrinplattenmethode oder der Zweistufeninethode (vgl. Pharmaceuticals Research, Bd. 5 (1974), 5. 295 bis 308), die allgemein zur Standardisierung der enzymatischen Aktivität von Urokinasepräparaten angewendet werden. Bei der Verabfolgung von Urokinasepräparaten erfolgte deshalb die Standardisierung durch Einstellung der Gesamtaktivität nach dem invitro-Test. Mit anderen Worten, Urokinase wurde trotz der Unterschiede im Molekulargewicht unter der Annahme gegeben, daß seine physiologische Wirkung die gleiche ist, wenn die enzymatische Aktivität in vitro die gleiche ist.Presumably have urokinase preparations with different molecular weights also different physiological properties and effects. Until now there However, there are only a few publications about significant differences in the effect for in-vitro tests using the fibrin plate method or the two-step method (cf. Pharmaceuticals Research, Vol. 5 (1974), pp. 295-308), which are generally used for standardization the enzymatic activity of urokinase preparations. At the administration urokinase preparations were therefore standardized through discontinuation the total activity according to the in vitro test. In other words, urokinase was defeated given the differences in molecular weight assuming that its physiological Effect is the same when the enzymatic activity in vitro is the same.

Der vorliegenden Erfindung vorausgehende Arbeiten haben gezeigt, daß ein signifikanter Unterschied zwischen der Aktivität der Urokinase in vitro und dem in vivo-Verhalten je nach dem Molekulargewicht besteht. Es wurde ferner untersucht, ob die enzymatische Aktivität in vitro genau der enzymatischen Aktivität in vivo entspricht, ob Urokinase unterschiedlichen Molekulargewichts die gleiche biologische Wirkung in vivo zeigt, und ob ein anderer enzymologischer Unterschied je nach dem Molekulargewicht besteht. Diese Untersuchungen führten zu dem überraschendem Befund, daß ein ziemlich großer Unterschied hinsichtlich der thrombolytischen Aktivität zwischen Urokinaseproben die auf die gleiche Aktivität eingestellt worden sind, bezogen auf die nach der Zweistufenmethode oder anderen in-vitro-Tests bestimmten enzymatischen Aktivität, und daß eine bestimmte Beziehung zwischen dem Molekulargewicht und der thrombolytischen Aktivität der Urokinase besteht. Urokinase mit dem höheren Molekulargewicht zeigt eine höhere thrombolytische Wirkung, selbst wenn die nach der Zweistufenmethode oder anderen in vitro-Methodenbestimmte Aktivität die gleiche ist. Es wurde ferner festgestellt, daß die Urokinase mit höherem Molekulargewicht auch eine bessere Haltbarkeit besitzt.Work preceding the present invention has shown that a significant difference between the activity of urokinase in vitro and the in vivo behavior depending on the molecular weight. It was also investigated whether the enzymatic activity in vitro is exactly the same as the enzymatic activity in vivo corresponds to whether urokinase different molecular weight the same biological Shows effect in vivo and whether another enzymological difference depending on the Molecular weight. These investigations led to the surprising finding, that quite a big difference in thrombolytic activity between urokinase samples that have been set to the same activity, based on those determined by the two-step method or other in vitro tests enzymatic activity, and that one certain relationship between the molecular weight and the thrombolytic activity of urokinase. Urokinase with the higher molecular weight shows a higher thrombolytic effect, even if the activity determined by the two-step method or other in vitro methods is the same. It was also found that the higher molecular weight urokinase also has a better shelf life.

Zu diesem Zweck wurden u.a. folgende Versuche durchgeführt: Gruppen von Beagle-Hunden wird intravenös Urokinase mit höherem Molekulargewicht (54 000) und Urokinase mit niederigerem Molekulargewicht (33 OOp) gegeben. Die Urokinasepräparate sind jeweils mit 125J markiert. Sodann wird der Abfall der Aktivität jeder Urokinase im Blut bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die Urokinase mit höherem Molekulargewicht länger im Blut verbleibt und ihre Halbwertszeit etwa doppelt so groß ist wie die der Urokinase mit niedrigerem Molekulargewicht.For this purpose, the following experiments were carried out, among others: Groups Beagle dogs are given intravenous urokinase of higher molecular weight (54,000) and lower molecular weight urokinase (3300p) given. The urokinase preparations are each marked with 125J. Then the decrease in the activity of each urokinase becomes determined in the blood. The urokinase was found to have higher molecular weight remains in the blood longer and its half-life is about twice as long as that the lower molecular weight urokinase.

In Figur 1 ist die Beziehung zwischen dem pH-Wert einer wäßrigen Urokinaselösung und dem Verhältnis der verbleibenden Aktivität wiedergegeben. Figur 2 zeigt die Abnahme der mit 125J markierten Urokinasen mit unterschiedlichem Molekulargewicht im Blut von Beagle-Hunden nach intravenöser Injektion.In Fig. 1 is the relationship between the pH of an aqueous urokinase solution and the ratio of the remaining activity. Figure 2 shows the Decrease in urokinases labeled with 125I with different molecular weights in the blood of beagle dogs after intravenous injection.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Urokinase-Präparat zur Verfügung zu stellen, das als Hauptbestandteil eine Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 + 10 000 enthält, und das als wirksames Fibrinolytikum und Thrombolytikum eingesetzt werden kann. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst.The invention is therefore based on the object of a urokinase preparation to provide the main component of a urokinase with a molecular weight of 54,000 + 10,000, and that as an effective fibrinolytic and thrombolytic can be used. This object is achieved according to the invention.

Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.The invention thus relates to what is characterized in the claims Object.

Das Verfahren zur Gewinnung von Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 + 10 000 ist nicht auf ein spezielles Verfahren beschränkt, wenn es nicht auf die Ausbeute ankommt. Urokinase kann in üblicher Weise in einem mehrstufigen Verfahren isoliert werden, angefangen von der Abtrennung aus Urin, der Konzentrierung und der Reinigung. Die gereinigte Urokinase wird einer Behandlung unterworfen, um ein Enzym mit dem vorgeschriebenen Molekulargewicht abzutrennen und zu isolieren, beispielsweise der Fraktionierung durch Gelfiltration, der Chromatographie an Ionenaustauschern, der Affinitätschromatographie oder fraktionierenden Fällung.The method of obtaining urokinase having a molecular weight from 54 000 + 10 000 is not limited to a specific procedure if it is not it depends on the yield. Urokinase can be used in the usual way in a multi-step process Procedures can be isolated, starting with the separation from urine, the concentration and cleaning. The purified urokinase is subjected to treatment to to separate and isolate an enzyme with the prescribed molecular weight, for example fractionation by gel filtration, chromatography on ion exchangers, affinity chromatography or fractional precipitation.

In der Praxis wird die Gelfiltration bevorzugt. Beispiele für geeignete Adsorptionsmittel zur Gelfiltration sind vernetzte Dextrangele, Polyacrylamidgele und Agarosegele, die zur Behandlung von Substanzen von einem Molekulargewicht von 1000 bis 150 000 geeignet sind. Das Filtermaterial wird in eine Säule eingefüllt und mit einer Pufferlösung mit niedrigem Salzgehalt und einem pH-Wert von 5,5 bis 9,5 äquilibriert. Aus der Säule wird Urokinase mit einer wäßrigen Lösung eluiert, und die Urokinasefraktion mit einem Molekulargewicht von 54 000 + 10 000 wird aufgefangen. Zur Verbesserung der Ausbeute wird in jeder Behandlungsstufe der pH-Wert der wäßrigen Urokinaselösung um den Neutralpunkt oder im schwach alkalischen Bereich, vorzugsweise im Bereich von 5,5 bis 12 gehalten, insbesondere während der Dialysestufe zur Abtrennung von Salzen. Unter diesen Bedingungen wird eine Urokinase mit guter Stabilität und einem Molekulargewicht von 54 000 + 10 000 erhalten. Dies geht aus dem nachstehenden Versuchsbeispiel 1 hervor.In practice, gel filtration is preferred. Examples of suitable Adsorbents for gel filtration are cross-linked dextran gels, polyacrylamide gels and agarose gels, which are used to treat substances with a molecular weight of 1,000 to 150,000 are suitable. The filter material is filled into a column and with a low salt buffer solution, pH 5.5 to 9.5 equilibrated. Urokinase is eluted from the column with an aqueous solution, and the urokinase fraction with a molecular weight of 54,000 + 10,000 is collected. To improve the yield, the pH of the aqueous is in each treatment stage Urokinase solution around the neutral point or in the weakly alkaline range, preferably kept in the range of 5.5 to 12, especially during the dialysis step for separation of salts. Under these conditions, a urokinase with good stability and a molecular weight of 54,000 + 10,000. This is evident from the following Experimental example 1 emerges.

Versuchs beispiel 1 Beziehung zwischen pH-Wert und Verhältnis der verbleibenden Urokinaseaktivität sowie der Moleku largewichtsverteilung.Experimental example 1 Relationship between pH and ratio of the remaining urokinase activity and the molecular weight distribution.

Urokinase, die aus menschlichem Urin durch Adsorption an Kieselgel isoliert worden ist, wird mit Ammoniumsulfat fraktioniert. Die Extraktlösung wird auf eine Urokinaseaktivität von 9 800 IE eingestellt. Die erhaltene Lösung wird 40 Stunden bei 40C gegen Wasser, eine 1 molare Natriumacetat-Pufferlösung vom pH-Wert 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 11,0 oder 12,0 oder eine 1/15 molare Phosphatpufferlösung dialysiert. Die äußere Flüssigkeit wird in Zeitabständen von 8 Stunden erneuert. Nach beendeter Dialyse wird das Verhältnis der verbleibenden Aktivität und die Molekulargewichtsverteilung durch Gelfiltration bestimmt. Das Verhältnis der verbleibenden Aktivität und die Molekulargewichtsverteilung der Urokinase-Fraktionen, bezogen auf Standardproben mit bekanntem Molekulargewicht, sind in Tabelle I zusammengefaßt.Urokinase, obtained from human urine by adsorption on silica gel has been isolated is with ammonium sulfate fractionated. The extract solution is adjusted to a urokinase activity of 9,800 IU. The solution obtained is 40 hours at 40C against water, a 1 molar sodium acetate buffer solution from pH 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 11.0 or 12.0 or a 1/15 molar Dialyzed phosphate buffer solution. The external fluid is at intervals of Renewed 8 hours. After dialysis is finished, the ratio of the remaining Activity and molecular weight distribution determined by gel filtration. That Ratio of the remaining activity and the molecular weight distribution of the urokinase fractions, based on standard samples of known molecular weight are summarized in Table I.

Tabelle I Versuch- ph-Wert der Aktivität Verhältnis der Molekulargewichtsverteilung Nr. äußeren Flüs- nach der verbleibenden sigkeit Dialyse Aktivität 33 000 54 000 # 10 000 # 10 000 Vergleich Extraktlösung 9 800 100 - ++ " H2O 8 514 86 # # 1 3 6 324 65 - - 2 4 6 314 64 ++ - 3 5 6 426 66 ++ + 4 6 7 252 74 + + 5 7 8 296 85 - ++ 6 8 10 290 105 - ++ 7 9 9 672 99 - ++ 8 11 9 016 92 - ++ 9 12 8 722 89 - ++ Anm.: - = nicht nachweisbar # = nachweisbar # = gut nachweisbar ++ = sehr gut nachweisbar Urokinasepräparate aus menschlichem Urin können durch pathogene Viren verunreinigt sein. Deshalb muß Urokinase in an sich bekannter Weise 8 bis 12 Stunden auf 50 bis 700C erhitzt werden, um Viren zu inaktivieren. Während dieser Wärmebehandlung ist es zweckmäßig, die wäßrige Urokinaselösung mit einer Pufferlösung mit einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,3 molar auf einen pH-Wert von 6 bis 8 einzustellen, um.die Urokinase zu stabilisieren. Eine besonders gute Stabilisierung gegen Wärme wird durch Zusatz eines Proteins, einer Aminosäure, eines Saccharids oder eines Neutralsalzes zusätzlich zur pH-Werteinstellung erreicht.Table I. Experimental pH of activity Ratio of molecular weight distribution No outer river after the remaining fluid dialysis activity 33,000 54,000 # 10 000 # 10 000 Comparison of extract solution 9 800 100 - ++ "H2O 8 514 86 # # 1 3 6 324 65 - - 2 4 6 314 64 ++ - 3 5 6 426 66 ++ + 4 6 7 252 74 ++ 5 7 8 296 85 - ++ 6 8 10 290 105 - ++ 7 9 9 672 99 - ++ 8 11 9 016 92 - ++ 9 12 8 722 89 - ++ Note: - = not detectable # = detectable # = good detectable ++ = very good detectable Urokinase preparations from human urine can be contaminated by pathogenic viruses. Therefore, urokinase has to be heated to 50 to 70 ° C. for 8 to 12 hours in a manner known per se in order to inactivate viruses. During this heat treatment, it is advisable to adjust the aqueous urokinase solution to a pH of 6 to 8 with a buffer solution with a salt concentration of 0.01 to 0.3 molar in order to stabilize the urokinase. A particularly good stabilization against heat is achieved by adding a protein, an amino acid, a saccharide or a neutral salt in addition to adjusting the pH value.

Die spezifische Aktivität der Urokinase beträgt vorzugsweise mindestens 200, insbesondere mindestens 1000 IE/mg.The specific activity of the urokinase is preferably at least 200, in particular at least 1000 IU / mg.

Diese Werte sind allerdings nicht kritisch. Der Anteil an der Urokinase in der zu erhitzenden Lösung liegt im allgemeinen im Bereich von 0,001 bis 5 Gewichtsprozent/Volumen, vorzugsweise 0,01 bis 1 Gewichtsprozent/Volumen, ausgedrückt durch den Proteingehalt. Vorzugsweise wird der pH-Wert der zu erhitzenden Lösung mit einer Phosphatpufferlösung einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,3 molar auf den pH-Wert von 6 bis 8 eingestellt.However, these values are not critical. The proportion of urokinase in the solution to be heated is generally in the range from 0.001 to 5 percent by weight / volume, preferably 0.01 to 1 weight percent / volume, expressed by the protein content. Preferably, the pH of the solution to be heated is adjusted with a phosphate buffer solution adjusted to a salt concentration of 0.01 to 0.3 molar to a pH of 6 to 8.

Spezielle Beispiele für Wärmestabilisatoren sind Aminosäuren, wie Glykokoll, Lysin und Arginin, Saccharide, wie Sucrose, und Mannit, Neutralsalze, wie Natriumchlorid, und Proteine, wie Albumin und Gelatine.Specific examples of heat stabilizers are amino acids such as Glycocolla, lysine and arginine, saccharides such as sucrose and mannitol, neutral salts, such as sodium chloride, and proteins such as albumin and gelatin.

Die Wärmestabilisatoren werden im allgemeinen in folgenden Mindestmengen verwendet: 5 % bei Glucose, Sucrose und Mannit; 0,1 molar bei Lysin und Arginin; 0,15 molar bei Natriumchlorid und 0,1 % bei Albumin und Gelatine.The heat stabilizers are generally used in the following minimum amounts used: 5% for glucose, sucrose and mannitol; 0.1 molar for lysine and arginine; 0.15 molar for sodium chloride and 0.1% for albumin and gelatin.

Bei Verwendung geringerer Mengen an Wärmestabilisator geht die Wirkung allmählich verloren. Hinsichtlich der Höchstmenge der zu verwendenden Wärmestabilisatoren bestehen keine Be- schränkungen, abgesehen von dem erhöhten Aufwand der Abtrennung des Stabilisators aus dem Präparat.The effect is less when using smaller amounts of heat stabilizer gradually lost. Regarding the maximum amount of heat stabilizers to be used there are no restrictions, apart from the increased effort the separation of the stabilizer from the preparation.

Die Temperatur der Wärmebehandlung zur Inaktivierung von Viren liegt bei 50 bis 700C, vorzugsweise 55 bis 650C, und die Erhitzungszeit beträgt 8 bis 12, vorzugsweise 9 bis 11 Stunden. Die hitzebehandelte Urokinase kann durch Dialyse von Salzen und Warmestabilisatoren befreit werden. Die erhaltene hochgereinigte Urokinase wird zur Herstellung von Arzneipräparaten in Ampullen abgefüllt und gefriergetrocknet.Rohe Urokinase wird zur Herstellung von Arzneimitteln zunächst nach üblichen Methoden durch Behandlung mit lonenaustauschern, speziellen Adsorptionsmitteln oder Sepharose 4B stark gereinigt.The temperature of the heat treatment to inactivate viruses is at 50 to 700C, preferably 55 to 650C, and the heating time is 8 to 12, preferably 9 to 11 hours. The heat-treated urokinase can be obtained through dialysis be freed from salts and heat stabilizers. The highly purified Urokinase is filled into ampoules and freeze-dried for the production of medicinal products Urokinase is used for the manufacture of drugs initially by conventional methods by treatment with ion exchangers, special adsorbents or Sepharose 4B heavily cleaned.

Zur Bestimmung der Wirkung des Erhitzens auf die Infektiosität von Viren, die möglicnerweise in Urokinasepräparaten vorliegen können, werden Versuche in Gegenwart und Abwesenheit von Wärmestabilisatoren durchgeführt. Der wäßrigen Urokinaselösung werden Pockenvirus, Mumpsvirus, Masernvirus, vesikuläres Stomatitisvirus, Chikungunyavirus, japanisches Encephalitisvirus, Hepatitis B-Virus, Rötelnvirus, Poliovirus, Coxsackievirus und Echovirus zugegeben. Die Wärmebehandlung wird 10 Stunden bei 60"C durchgeführt. In regelmäßigen Abständen wird dieverbleibendelnfektiosität bestimmt. Innerhalb 10 Stunden geht die Infektiosität vollständig verloren, gleichgültig, ob ein Wärmestabilisator vorliegt oder nicht. Aufgrund dieser Ergebnisse ist zu vermuten, daß die Wärmebehandlung auch andere Viren als die vorgenannten Viren inaktiviert.To determine the effect of heating on the infectivity of Viruses that may be present in urokinase preparations are experiments carried out in the presence and absence of heat stabilizers. The aqueous Urokinase solution will be smallpox virus, mumps virus, measles virus, vesicular stomatitis virus, Chikungunyavirus, Japanese Encephalitis Virus, Hepatitis B Virus, Rubella Virus, Poliovirus, Coxsackievirus and Echovirus added. The heat treatment turns 10 Hours at 60 ° C. The remaining fectivity is checked at regular intervals certainly. Infectivity is completely lost within 10 hours, no matter whether or not there is a heat stabilizer. Because of these results, too suspect that the heat treatment also inactivates viruses other than the aforementioned viruses.

Versuchsbeispiel 2 Abhängigkeit der Stabilität der Urokinase bei der Wärmebehandlung vom pH-Wert Eine wäßrige Urokinaselösung (spezifische Aktivität 15 000 IE/mg ; Proteinkonzentration 0,02 Gewichtsprozent/ Volumen) wird in verschiedenen Konzentrationen mit einer Phosphatpufferlösung versetzt. Es werden auf diese Weise Pro- ben von Urokinaselösungen mit einem pH-Wert von 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 hergestellt. Jede Probe wird 10 Stunden auf 60"C erhitzt. Sodann wird die verbleibende Aktivität gemessen.Experimental Example 2 Dependence of the stability of the urokinase in the Heat treatment from pH An aqueous urokinase solution (specific activity 15,000 IU / mg; Protein concentration 0.02 weight percent / volume) is available in different Concentrations mixed with a phosphate buffer solution. It'll be that way Per- Ben of urokinase solutions with a pH of 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 made. Each sample is heated to 60 ° C. for 10 hours the remaining activity measured.

Nach der Wärmebehandlung wird der Wärmestabilisator durch Dialyse abgetrennt und die Urokinaseaktivität gemessen, um das Verhältnis der verbleibenden Aktivität zu bestimmen. Die spezifische Aktivität vor dem Erhitzen wird zu 100 % angenommen. Aus Figur 1 ist ersichtlich, daß die Urokinaselösungen bei einem pH-Wert von 6, 7 und 8 52 %, 65 % bzw. 50 % der anfänglichen Aktivität aufweisen. Dies zeigt, daß die Einstellung der wäßrigen Urokinaselösung auf einen pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 besonders günstig ist.After the heat treatment, the heat stabilizer is dialysis separated and measured the urokinase activity to the ratio of the remaining Determine activity. The specific activity before heating becomes 100% accepted. From Figure 1 it can be seen that the urokinase solutions at pH of 6, 7 and 8 have 52%, 65% and 50% of the initial activity, respectively. This shows, that the adjustment of the aqueous urokinase solution to a pH in the range of 6 to 8 is particularly favorable.

Versuchsbeispiel 3 Wirkung von Wärmestabilisatoren In diesem Beispiel wird die Wirkung verschiedener Wärmestabilisatoren bestimmt. Nach der Wärmebehandlung wird der Wärmestabilisator durch Dialyse abgetrennt und das Verhältnis derverbleibenden Aktivität bestimmt, wobei die spezifische Aktivität vor der Wärmebehandlung zu 100 % angenommen wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt. Als Viren werden ebenso wie in Versuchsbeispiel 1 die vorstehend genannten Viren verwendet.Experimental example 3 Effect of heat stabilizers In this example the effect of various heat stabilizers is determined. After the heat treatment the heat stabilizer is separated by dialysis and the ratio of the remaining Activity determined, the specific activity before the heat treatment being 100 % Is accepted. The results are summarized in Table II. As viruses are just as in experimental example 1, the viruses mentioned above were used.

Im Kontrollversuch.(1) wird kein Wärmestabilisator verwendet und der pH-Wert der wäßrigen Urokinaselösung wird mit 0,1 molarer Phosphatpufferlösung auf 6,8 eingestellt, Im Kontrollversuch (2) wird die wäßrige Urokinaselösung nicht mit Phosphatpufferlösung versetzt. Deshalb ist der pH-Wert der Lösung nicht auf einen bestimmten Wert eingestellt. Die verbleibendeUrokinaseaktivität beträgt 65 bis 75 %, 78 % bzw.In the control experiment (1) no heat stabilizer is used and the The pH of the aqueous urokinase solution is increased with 0.1 molar phosphate buffer solution 6.8. In the control experiment (2), the aqueous urokinase solution is not with Phosphate buffer solution added. Therefore the pH of the solution is not on one set certain value. The remaining urokinase activity is 65 to 75 %, 78% and

79 % bei Verwendung von Glykokoll1 Lysin bzw. Arginin, 75 bis 78 %, 78 % und 71 bis 75 % bei Verwendung von Sucrose, Mannit bzw. Natriumchlorid und 88 bis 100 % bei Verwendung von Gelatine. Dies zeigt, daß sämtliche Substanzen wirksame folgt S. 12 d.79% when using glycocoll1 lysine or arginine, 75 to 78%, 78% and 71 to 75% when using sucrose, mannitol or sodium chloride and 88 to 100% when using gelatin. This shows that all substances are effective follows p. 12 d.

Wärmestabilisatoren sind. Eine auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellte wäßrige Urokinaselösung behält 65 % der anfänglichen Aktivität in Abwesenheit eines Wärmestabilisators bei. Dies zeigt, daß die Einstellung der wäßrigen Urokinaselösung auf einen pH-Wert von 6 bis 8 eine günstige Wirkung auf die Stabilisierung der Aktivität hat.Are heat stabilizers. One adjusted to a pH of 6.8 aqueous urokinase solution retains 65% of the initial activity in the absence of one Heat stabilizer. This shows that the adjustment of the urokinase aqueous solution at a pH of 6 to 8 a beneficial effect on the stabilization of the activity Has.

Tabelle II Konzen- Verhältnis Infektio- tration, % der verbleiben- sität den Urokinase- aktivität, % 5 65 Glykokoll 10 70 keine 15 75 Lysin 0,1 M 78 " Arginin 0,1 M 79 " 5 75 Sucrose 10 78 " 15 78 Mannit 5 73 " 10 73 0,15 M 71 Natriumchlorid " 0,3 M 75 0,5 88 Gelatine 1,0 91 " 3,0 89 Kontrollversuch (1) (Urokinase allein) - 65 " Kontrollversuch (2) (keine Pufferlösung) - 0 " EDTA 0,1 23 " Mit Urokinase eines Molekulargewichts von 54 000 + 10 000 werden Untersuchungen zur Bestimmung der thrombolytischen Aktivität, der Halbwertszeit im Blut nach intravenöser Gabe, Stabilität, Toxizität, Dosis und Verabreichungsart in vitro' und in vivo durchgefi-ihrt . Die Versuchsmethodik und die Ergebnisse sind nachstehend beschrieben.Table II Concentration ratio of infection tration,% of remaining the urokinase activity,% 5 65 Glycocolla 10 70 none 15 75 Lysine 0.1 M 78 " Arginine 0.1 M 79 " 5 75 Sucrose 10 78 " 15 78 Mannitol 5 73 " 10 73 0.15 M 71 Sodium chloride " 0.3 M 75 0.5 88 Gelatin 1.0 91 " 3.0 89 Control test (1) (Urokinase alone) - 65 " Control test (2) (no buffer solution) - 0 " EDTA 0.1 23 " Investigations to determine the thrombolytic activity, the half-life in the blood after intravenous administration, stability, toxicity, dose and type of administration in vitro and in vivo are carried out with urokinase with a molecular weight of 54,000 + 10,000. The experimental methodology and results are described below.

Versuchsbeispiel 4 Bestimmung der thrombolytischen Aktivität nach der Methode von Chandler Gereinigte Urokinase wird zu Fraktionen mit Molekulargewichten von 33 000 + 10 000 (hauptsäthlich 33 000), 54 000 + 10 000 (hauptsächlich 54 000) un'd etwa 100 000 fraktioniert.Experimental Example 4 Determination of the thrombolytic activity Chandler's method Purified urokinase becomes fractions with molecular weights from 33,000 + 10,000 (mainly 33,000), 54,000 + 10,000 (mainly 54,000) un'd about 100,000 fractionated.

Die Fraktion mit einem Molekulargewicht von etwa 100 000 wird nur in sehr geringer Menge gefunden. Sie scheint aus einem Assoziat von Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 zu bestehen. Die Gewinnung dieser Fraktion aus Urin ist technisch zu aufwendig. Jede Fraktion wird in physiologischer Kochsalz lösung zu Proben unterschiedlicher Aktivität gelöst: Probe (1) ,.18,75 IE/ml; Probe (2) 37,5 IE/ml; Probe (3) 75,0 IE/ml; Probe (4) 150 IE/ml; Probe (5) 300 IE/ml, Kontrollprobe mit physiologischer Kochsalzlösung.The fraction with a molecular weight of about 100,000 will only found in very small quantities. It appears to be from an association of urokinase with a molecular weight of 54,000. Obtaining this faction from Urine is technically too complex. Each fraction is in physiological table salt solution dissolved into samples of different activity: sample (1), .18.75 IU / ml; sample (2) 37.5 IU / ml; Sample (3) 75.0 IU / ml; Sample (4) 150 IU / ml; Sample (5) 300 IU / ml, Control sample with physiological saline solution.

Die Aktivität in Internationale Einheiten wird nach der Zweistufen-Methode in vitro bestimmt. Das zu untersuchende Urokinasepräparat wird mit gereinigtem Plasminogen als Substrat unter Bildung von Plasmin umgesetzt. Sodann wird als sekundäres Substrat Fibrin durch das Plasmin abgebaut.The activity in international units is carried out according to the two-step method determined in vitro. The urokinase preparation to be examined is purified with plasminogen implemented as a substrate with the formation of plasmin. Then it is used as a secondary substrate Fibrin is broken down by the plasmin.

Die Aktivität wird aus der Auflösungszeit des Fibrins bestimmt; vgl. Pharmaceuticals Research, Bd. 5 (1974), S. 295 bis 308. Die Beziehung zwischen Internationale Einheiten und den üblichenrlouüUnits (vgl. B.B.A., Bd. 24 (1975), S. 278 bis 282) ist wie folgt: 5000 Ploug Units = 6000 IE.The activity is determined from the dissolution time of the fibrin; see. Pharmaceuticals Research, Vol. 5 (1974), pp. 295-308. The relationship between Internationale Units and the usual rlouüUnits (see B.B.A., Vol. 24 (1975), pp. 278 to 282) is as follows: 5000 Ploug Units = 6000 IU.

folqen S. 14-21 d. ursprünglichen Unterlagen Die Bildung des Thrombus und die Bestimmung des Auflösungsverhältnisses werden folgendermaßen durchgeführt: In einen Plastikschlauch mit einem Innendurchmesser von 3 mm und einer Länge von 270 mm werden 1 ml frisches Blut abgefüllt, das 3,8 % eines Citrats und 0,1 ml 0,25 molare Calciumchloridlösung enthält, und es wird eine endlose Schleife gebildet. Durch 30minütiges Drehen der Schleife bei 37 0C und 12 U/min entsteht ein Thrombus.follow pp. 14-21 d. original documents the Formation of the thrombus and the determination of the dissolution ratio are as follows performed: In a plastic tube with an inner diameter of 3 mm and one Length of 270 mm, 1 ml of fresh blood is filled which contains 3.8% of a citrate and Contains 0.1 ml of 0.25 molar calcium chloride solution and it becomes an endless loop educated. Turn the loop for 30 minutes at 37 ° C and 12 rpm a thrombus.

In die Schleife wird eine Probe der-Urokinaselösungen bzw. die Kontrollprobe injiziert. Sodann wird die Schleife erneut 4 Stunden bei 370C und 12 U/min gedreht Danach wird der restliche Thrombus aus dem Schlauch entnommen und während 15 bis 18 Stunden mit Bovin1Lösung fixiert. Diese Lösung wird durch Vermischen von 75 ml einer gesättigten wäßrigen Pikrinsäurelösung mit 25 ml technischer Formaldehydlösung und 5 ml Eisessig hergestellt. Es wird das Gewicht des Thrombus bestimmt, um die Beziehung zwischen dem IE-Wert, dem Molekulargewicht und der thrombolytischen Aktivität zu untersuchen. Die thrombolytische Aktivität der Urokinase wird ausgedrückt durch das Gewichtsverhältnis des durchschnittlichen Thrombusgewichk der Urokinase enthaltenden Gruppe zum durchschnittlichen Thrombusgewicht der Kontrollgruppe (physiologische Kochsalzlösung). Dieses Verhältnis wird nachstehend als das thrombolytische Verhältnis (in %) bezeichnet.A sample of the urokinase solutions or the control sample is placed in the loop injected. The loop is then rotated again for 4 hours at 37 ° C. and 12 rpm Then the remaining thrombus is removed from the tube and during 15 to Fixed with Bovin1 solution for 18 hours. This solution is made by mixing 75 ml a saturated aqueous picric acid solution with 25 ml of technical formaldehyde solution and 5 ml of glacial acetic acid. It is determined by the weight of the thrombus Relationship between IE value, molecular weight and thrombolytic activity to investigate. The thrombolytic activity of urokinase is expressed by containing the weight ratio of the average thrombus weight of urokinase Group for the mean thrombus weight of the control group (physiological Saline solution). This ratio is hereinafter referred to as the thrombolytic ratio (in%).

Die erhaltenen Werte sind in Tabelle III zusammengefaßt.The values obtained are summarized in Table III.

Tabelle III Mgw. der Probe Probe Probe Probe Probe Urokinase (1) (2) (3) (4) (5) 100 000 1 0 # 2 i 62 82 80 54 000 0 1 63 83 81 33 000 0 1 13 65 72 Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 eine ausgezeichnete thrombolytische Aktivität besitzt, während Urokinase mit einem Molekulargewicht von 33 000 eine wesentlich niedrigere thrombolytische Aktivität aufweist. Die Bestimmung der thrombolytischen Aktivität nach der Methode von Chandler wird zwar in vitro durchgeführt, doch ist sie als einfaches und zweckmäßiges Bestimmungsverfahren anerkannt, die einem in vivo Test nahekommt; vgl. J. Exp. Physiol., Bd. 44 (1959), S. 377 bis 384.Table III Mgw. the sample sample sample sample sample Urokinase (1) (2) (3) (4) (5) 100 000 1 0 # 2 i 62 82 80 54 000 0 1 63 83 81 33 000 0 1 13 65 72 It can be seen from Table III that urokinase with a molecular weight of 54,000 has excellent thrombolytic activity, while urokinase with a molecular weight of 33,000 has much lower thrombolytic activity. The determination of the thrombolytic activity according to the Chandler method is carried out in vitro, but it is recognized as a simple and convenient method of determination, which comes close to an in vivo test; See J. Exp. Physiol., Vol. 44 (1959), pp. 377 to 384.

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen die überraschende Tatsache, daß Urokinase-Präparate, die nach den herkömmlichen Bestimmungsmethoden die gleiche Aktivität aufweisen, je nach dem Molekulargewicht der Urokinase eine unterschiedliche thrombolytische Aktivität zeigen.The above results show the surprising fact that Urokinase preparations made according to the conventional methods of determination the same Have activity, depending on the molecular weight of the urokinase, a different one show thrombolytic activity.

Versuchsbeispiel 5 Thrombolytische Wirkung bei Ratten Nach der Methode von Y. Sasaki (Thrombosis Res., Bd. 9 (1976), S. 513) und R.N. Chakravart (Atherosclerosis, Bd. 21 (1975), S. 349) wird die fibrinolytische Wirkung von Urokinase an Ratten bestimmt.Experimental Example 5 Thrombolytic Effect in Rats According to the method by Y. Sasaki (Thrombosis Res., 9: 513 (1976)) and R.N. Chakravart (atherosclerosis, Vol. 21 (1975), p. 349) is the fibrinolytic effect of urokinase on rats certainly.

Nach der Methode von Greenwood et al. Biochem. J., Bd. 89 (1963), S. 114, wird menschliches Fibrinogen mit 125J mar-125 kiert. 4 ml einer 0,4prozentigen 1 J-Fibrinogenlösung werden mit 200 IE humanem Thrombin vermischt und etwa 60 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Es bildet sich Fibrin. Nach ausreichendem Entfernen des Wassers mit Filterpapier wird das Fibrin gründlich mit physiologischer Kochsalzlösung auf einem Filterpapier gewaschen. Das Filterpaper mit dem Fibrin wird in kleine Stücke zerschnitten, mit 4 ml physiologischer Kochsalz lösung vermischt und zu einer Dispersion von 125J-Fibrin mit einem Teilchendurchmesser von 5 bis 10 ß zerkleinert. Der Fibringehalt der Dispersion beträgt 12 mg/ml auf feuchter Basis, und die J-Radioaktivität hat eine ZäBrate von 2,93 x 106/min.According to the method of Greenwood et al. Biochem. J., Vol. 89 (1963), P. 114, human fibrinogen is labeled with 125J-125. 4 ml of a 0.4 percent 1 J-fibrinogen solution is mixed with 200 IU human thrombin and about 60 minutes left to stand at room temperature. Fibrin is formed. After sufficient removal of the water with filter paper is the fibrin thoroughly with physiological saline solution washed on a filter paper. The filter paper with the fibrin is divided into small Cut pieces, mixed with 4 ml of physiological saline solution and form a Comminuted dispersion of 125J-fibrin with a particle diameter of 5 to 10 ß. The fibrin content of the dispersion is 12 mg / ml on a wet basis, and the J radioactivity has a cutting rate of 2.93 x 106 / min.

Männlichen Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 250 g wird durch die Schwanzvene 1 ml der erhaltenen Dispersion und sodann 30 000 IE Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 bzw. 33 000 injiziert. Sodann werden in regelmäßigen Zeitabständen jeweils 0,3 bis 0,5 ml Blut aus der Carotisarterie in ein Reagensglas entnommen, das einen Tropfen Aprotininlösung (15 000 KIE/ml; ein Antiplasmin) enthält. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Eine Menge von 0,05 ml des abgetrennten Serums wird auf Fibrinzersetzungsprodukte (FDP) durch Bestimmung der Radioaktivität untersucht. Die prozentuale Bildung von 125J-FDP im Blut wird in Abhängigkeit von der Zeit aus dem Wert der Radioaktivität/ml Serum und der Gesamtmenge des kreisenden Serums (31,1 ml/kg) bestimmt, wobei die Radioaktivität des verabfolgten Fibrins zu 100 % angenommen wird.Male Wistar rats weighing 250 g are subjected to the tail vein 1 ml of the dispersion obtained and then 30,000 IU urokinase with a molecular weight of 54,000 and 33,000, respectively. Then be on a regular basis At intervals of 0.3-0.5 ml of blood from the carotid artery into a test tube taken, which contains one drop of aprotinin solution (15,000 KIU / ml; an antiplasmin). The mixture is left to stand at room temperature for 2 hours. A lot of 0.05 ml of the separated serum is determined for fibrin decomposition products (FDP) the radioactivity investigated. The percentage formation of 125J-FDP in the blood will be as a function of time from the value of the radioactivity / ml serum and the total amount of the circulating serum (31.1 ml / kg) determined, the radioactivity of the administered Fibrin is 100% accepted.

Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.The results are summarized in Table IV.

Tabelle IV Zeit nach Verab- Urokinase, Urokinase, Physiologische folgung, mit Mgw. 54 000 Mgw. 33 000 Kochsalzlösung 0 2,5 2,4 2,4 15 27,5 15,6 5,3 30 38,3 23,2 6,8 45 18,2 16,1 9,7 60 20,7 13,2 15,2 75 16,5 16,9 1,0 Aus Tabelle IV ist ersichtlich, daß die hochmolekulare Urokinase FDP früher bildet als die Urokinase vom Molekulargewicht 33 000. Sowohl die Fibrinzersetzungsgeschwindigkeit als auch die Menge an FDP ist bei Verwendung von Urokinase vom Molekulargewicht 54 000 höher.Table IV Time after administration- Urokinase, Urokinase, Physiological following, with Mgw. 54,000 Mgw. 33,000 saline solution 0 2.5 2.4 2.4 15 27.5 15.6 5.3 30 38.3 23.2 6.8 45 18.2 16.1 9.7 60 20.7 13.2 15.2 75 16.5 16.9 1.0 It can be seen from Table IV that the high molecular weight urokinase forms FDP earlier than the urokinase with a molecular weight of 33,000. Both the rate of fibrin decomposition and the amount of FDP are higher when urokinase with a molecular weight of 54,000 is used.

Die Ergebnisse zeigen, daß Urokinase vom Molekulargewicht 54 000 in vivo eine höhere fibrinolytische und thrombolytische Aktivität zeigt.The results show that urokinase of molecular weight 54,000 in shows higher fibrinolytic and thrombolytic activity in vivo.

Versuchsbeispiel 6 Einfluß des Molekulargewichts auf das Abklingen der Aktivität der Urokinase im Blut.Experimental Example 6 Influence of Molecular Weight on Decay the activity of urokinase in the blood.

Urokinasepräparate unterschiedlichen. Molekulargewichts werden nach Greenwood et al. a.a.0.lmit 125j markiert. Die markierten Urokinasepräparate werden Gruppen von Versuchstieren intravenös injiziert, und das Abklingen der Urokinaseaktivität im Blut wird verglichen.Different urokinase preparations. Molecular weight will be according to Greenwood et al. a.a.0.l marked with 125j. The labeled urokinase preparations are Groups of test animals injected intravenously, and the urokinase activity subsided in the blood is compared.

Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 und einer spezifischen Aktivität von 100 000 IE/mg Protein sowie einem Molekulargewicht von 33 000 und einer spezifischen Aktivi-125 tät von 160 000 IE/mg Protein werden mit J nach der Chloramin T-Methode markiert; vgl. Biochem. J., Bd. 89 (1963), S. 114. Die markierte höhermolekulare Urokinase hat eine spezifische Radioaktivität (Zählrate) von 1,28 x 107/min'und pro mg Protein und die markierte Urokinase vom Molekulargewicht 33 000 hat eine spezifische Radioaktivität+ (Zählrate) von 2,24 x 107/min und pro wg Protein Als Versuchstiere werden pro Gruppe drei männliche Beagle-Hunde mit einem Körpergewicht von 12 bis 15 kg verwendet.Urokinase with a molecular weight of 54,000 and a specific Activity of 100,000 IU / mg protein and a molecular weight of 33,000 and a specific activity of 160,000 IU / mg protein are given with J after the Chloramine T-method marked; see Biochem. J., 89, 114 (1963). The marked higher molecular weight urokinase has a specific radioactivity (count rate) of 1.28 x 107 / min 'and per mg protein and the labeled urokinase with a molecular weight of 33 000 has a specific radioactivity + (count rate) of 2.24 x 107 / min and per wg Protein Three male beagle dogs per group are used as test animals with one Body weight from 12 to 15 kg used.

Die markierten Urokinasen werden in einer Dosis von 1000 IE/kg durch die Parotisvene injiziert. In regelmäßigen Zeitabständen werden jeweils 5 ml Blut aus der Vene der Vorderpfote mittels einer Spritze entnommen, die 0,5 ml einer 3,8prozentigen Natriumcitratlösung enthält. Das Plasma wird vom Blut durch Zentrifugieren abgetrennt und auf seine Radioaktivität mit einem Scintillationszähler untersucht.The labeled urokinases are administered in a dose of 1000 IU / kg injected into the parotid vein. 5 ml of blood are drawn in at regular intervals taken from the vein of the front paw by means of a syringe, the 0.5 ml of a 3.8 percent Contains sodium citrate solution. The plasma is separated from the blood by centrifugation and examined for its radioactivity with a scintillation counter.

Die Ergebnisse sind in Figur 2 zusammengefaßt. Die Abklingkurve H der Urokinase vom Molekulargewicht 54 000 im Blut verläuft flacher als die Kurve L der Urokinase vom Molekulargewicht 33 000. Die Halbwertszeit der Urokinase vom Molekulargewicht 54 000 ist doppelt so groß wie die der Urokinase vom Molekulargewicht 33 000 Versuchsbeispiel 7 Molekulargewicht und Stabilität der enzymatischen Aktivität.The results are summarized in FIG. The decay curve H urokinase with a molecular weight of 54,000 in the blood is flatter than the curve L of urokinase with a molecular weight of 33,000. The half-life of urokinase from Molecular weight 54,000 is twice that of urokinase in molecular weight 33,000 Experimental Example 7 Molecular weight and stability of the enzymatic Activity.

Unter Verwendung technischer Urokinase wird die Beziehung zwischen Molekulargewicht und der Stabilität der enzymatischen Aktivität untersucht. Die technische Urokinase wird zu Fraktionen vom Molekulargewicht 20 000, 33 000, 54 000 und 100 000 durch Gelfiltration an Sephadex G-75 unter Verwendung einer 70 millimolaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 8,0 fraktioniert. Die Säule hat die Abmessungen 2,6 x 80 cm. Jede Fraktion wird auf 10 000 IE/ml eingestellt (wäßrige Lösung), bei 40C oder -100C aufbewahrt, und die Änderung der Aktivität mit der Zeit wird bestimmt.Using technical urokinase, the relationship between Molecular weight and the stability of the enzymatic activity were investigated. the technical urokinase becomes fractions with a molecular weight of 20,000, 33,000, 54 000 and 100,000 by gel filtration on Sephadex G-75 using a 70 millimolar Fractionated phosphate buffer solution of pH 8.0. The column has the dimensions 2.6 x 80 cm. Each fraction is adjusted to 10,000 IU / ml (aqueous solution) at 40C or -100C and the change in activity with time is determined.

In Tabelle V ist die Zeit angegeben, bis die Aktivität auf 50 % abgesunken ist.Table V shows the time taken for the activity to drop to 50% is.

Tabelle V Molekular- gewicht 20 000 33 000 54 000 100 000 Aufbewah- rungstempe- ratur 40C <1 Tag 5 Tage 15 Tage 11,5 Tage -10°C 2,5 Tage 6 Tage >10 Tage >20 Tage Aus Tabelle V ist ersichtlich, daß die Urokinase vom Molekulargewicht 54 000 eine etwa dreimal größere Stabilität hat, wie die Urokinase vom Molekulargewicht 33 000.Table V molecular weight 20,000 33,000 54,000 100,000 Storage temperature rature 40C <1 day 5 days 15 days 11.5 days -10 ° C 2.5 days 6 days> 10 days> 20 days It can be seen from Table V that the urokinase with a molecular weight of 54,000 is about three times more stable than the urokinase with a molecular weight of 33,000.

Versuchsbeispiel 8 Toxizität Zur Bestimmung der Toxizität werden pro Versuchs gruppe 5 Mäuse bzw. 5 Meerschweinchen verwendet. Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 und einer Aktivität von 15 000 IE wird in 25 ml destilliertem Wasser gelöst. Jeder Maus bzw. jedem Meerschweinchen werden subkutan 0,5 bzw.Experimental Example 8 Toxicity To determine the toxicity, pro Test group used 5 mice or 5 guinea pigs. Molecular weight urokinase of 54,000 and an activity of 15,000 IU is in 25 ml of distilled water solved. Everyone Mouse or each guinea pig are 0.5 subcutaneously respectively.

5 ml der Urokinaselösung injiziert. 7 Tage nach der Urokinasegabe sind noch keine Todesfälle zu beobachten. In diesem Fall beträgt die Urokinasemenge/Maus 300 IE und 3000 IE pro Meerschweinchen.5 ml of the urokinase solution is injected. 7 days after administration of urokinase no deaths have been observed yet. In this case, the amount of urokinase is / mouse 300 IU and 3000 IU per guinea pig.

Zur klinischen Verwendung werden 50 bis 30 000 IE des erfindungsgemäßen Urokinasepräparats in 0,5 bis 5 ml destilliertem Wasser gelöst und intravenös oder beispielsweise durch Tropfinfusion, subkonjunktivale abfolgt.For clinical use, 50 to 30,000 IU of the invention Urokinase preparation dissolved in 0.5 to 5 ml of distilled water and given intravenously or for example, by drip, subconjunctival follows.

Das erfindungsgemäß hergestellte Urokinasepräparat enthält Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 + 10 000 als Hauptbestandteil mit gleichmäßigem Molekulargewicht, ausgezeichneter Haltbarkeit und hoher thrombolytischer und fibrinolytischer Aktivität.The urokinase preparation produced according to the invention contains urokinase with a molecular weight of 54,000 + 10,000 as the main component with uniform Molecular weight, excellent shelf life, and high thrombolytic and fibrinolytic Activity.

Die Erfindung wird durch die Beispiele weiter erläutert.The invention is further illustrated by the examples.

Beispiel 1 Frischer Urin von Männern wird auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. 5 Liter des erhaltenen Urins werden auf den Kopf einer Säule gegeben, die mit 50 ml L-Argininargarose gefüllt ist. Das Adsorptionsmittel ist vorher mit einer 2prozentigen Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 äquilibriert worden. Die Urokinase wird an dem Adsorptionsmittel adsorbiert. Sodann wird die Säule mit 100 ml einer 2prozentigen Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,5 gewaschen. Hierauf wird die Urokinase mit 50 ml einer 1 molaren Kochsalzlösung vom pH-Wert 6,0 eluiert. Das Eluat wird auf etwa 10 ml eingeengt und sodann auf eine Säule mit den Abmessungen 2,6 x 80 cm gegeben, die mit Sephadex G-75 gefüllt ist. Example 1 Fresh male urine is adjusted to a pH of 7.2 set. 5 liters of the obtained urine is placed on the top of a column, which is filled with 50 ml of L-arginine rose. The adsorbent is previously with equilibrated with a 2 percent saline solution of pH 7.2. The urokinase is adsorbed on the adsorbent. Then the column with 100 ml of a Washed 2 percent saline solution of pH 7.5. Then urokinase eluted with 50 ml of a 1 molar saline solution of pH 6.0. The eluate will concentrated to about 10 ml and then on a column measuring 2.6 x 80 cm filled with Sephadex G-75.

Das Adsorptionsmittel ist vorher mit einer 70 millimolaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 8,0 äquilibriert worden.The adsorbent is previously with a 70 millimolar phosphate buffer solution equilibrated from pH 8.0.

Die Gelfiltration wird in einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml/Std. mit der gleichen Pufferlösung durchgeführt, wie sie zur Äquilibrierung verwendet wird. Das Filtrat wird in 0,5 ml Fraktionen aufgefangen. Es werden die Fraktionen gesammelt, die Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 + 10 000 enthalten. Die Fraktionen werden vereinigt, und das Molekulargewicht der Urokinase wird nach der vereinfachten Methode durch SDS-Elektrophorese an Polyacrylamidgel bestimmt; vgl. Colowick-Kaplan, Methods in Enzymology, Bd. 26 (1972), S. 3. Bei der Elektrophorese zeigt sich ein einziger Peak, der dem Peak einer Standard-Urokinaseprobe mit einem Molekulargewicht von etwa 54 000 entspricht.The gel filtration is carried out at a flow rate of 20 ml / hour. carried out with the same buffer solution as used for equilibration will. The filtrate will collected in 0.5 ml fractions. It will the fractions collected, the urokinase with a molecular weight of 54,000+ 10,000 included. The fractions are combined, and the molecular weight of the Urokinase is determined according to the simplified method by SDS electrophoresis on polyacrylamide gel certainly; see Colowick-Kaplan, Methods in Enzymology, 26 (1972), p electrophoresis shows a single peak, which is the peak of a standard urokinase sample with a molecular weight of about 54,000.

Die wäßrige Lösung wird gegen physiologische Kochsalz lösung dialysiert und das Retentat gefriergetrocknet. Es wird ein Urokinasepräparat mit einer spezifischen Aktivität von 17 000 IE/mg erhalten.The aqueous solution is dialyzed against physiological saline solution and the retentate freeze-dried. It will be a urokinase preparation with a specific Activity of 17,000 IU / mg obtained.

Beispiel 2 Das im Beispiel 1 erhaltene Urokinasepräparat (17 000 IE/mg) wird in 0,05 molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst. Es werden 20 Liter einer wäßrigen Urokinaselösung (3000 IE/ml; Proteingehalt 0,02 Gewichtsprozent/Volumen) erhalten. Die Lösung wird 10 Stunden auf 600C erhitzt, sodann in Eiswasser abgekühlt und durch ein Bakterienfilter filtriert. Das Filtrat wird in 2 ml Anteile unterteilt und gefriertrocknet. Es wird ein nicht-infektiöses Urokinasepräparat erhalten. Example 2 The urokinase preparation obtained in Example 1 (17,000 IU / mg) is dissolved in 0.05 molar phosphate buffer solution with a pH of 7.0. It will 20 liters of an aqueous urokinase solution (3000 IU / ml; protein content 0.02 percent by weight / volume) obtain. The solution is heated to 60 ° C. for 10 hours, then cooled in ice water and filtered through a bacterial filter. The filtrate is divided into 2 ml portions and freeze-dried. A non-infectious urokinase preparation is obtained.

Beispiel 3 5 Liter einer wäßrigen Urokinaselösung (10 000 IE/ml; Proteingehalt 2,5 Gewichtsprozent/Volumen) werden durch Auflösen von roher Urokinase (spezifische Aktivität 400 IE/mg) in einem 0,1 molaren Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 hergestellt. Die Lösung wird mit 0,3 Mol Natriumchlorid, gelöst in der gleichen Pufferlösung,versetzt. Die erhaltene Lösung wird gerührt und 10 Stunden auf 60°C erhitzt. Danach wird die Lösung abgekühlt und gegen 0,0075 molare Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,0 durch einen Dialyseschlauch dialysiert. Das erhaltene Retentat mit der rohen Urokinase wird auf eine Säule gegeben, die mit 1 kg pulverisiertem Bentonit gefüllt ist. Die Säule wird vorher mit einer 0,0075 molaren wäßrigen Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert. Die Urokinase wird an Bentonit adsorbiert, während Verunreinigungen die Säule passieren. Die am Bentonit anhaftenden Verunreinigungen werden mit 0,1 molarer Kochsalzlösung vom pH-Wert 9,0 eluiert. Sodann wird die Urokinase mit einer 2,0 Gewichtsprozent/Volumen wäßrigen Lösung von 6, 9-Diamino-2-äthoxyacridin-lactat-hydrat eluiert. Example 3 5 liters of an aqueous urokinase solution (10,000 IU / ml; Protein content 2.5 weight percent / volume) by dissolving crude urokinase (specific activity 400 IU / mg) in a 0.1 molar phosphate buffer at pH 6.8 produced. The solution is dissolved in the same with 0.3 mol of sodium chloride Buffer solution, added. The resulting solution is stirred and at 60 ° C. for 10 hours heated. The solution is then cooled and against 0.0075 molar saline solution dialyzed from pH 7.0 through a dialysis tube. The retentate obtained with the crude urokinase will placed on a column containing 1 kg of powdered Bentonite is filled. The column is previously filled with a 0.0075 molar aqueous saline solution equilibrated from pH 7.0. The urokinase is adsorbed on bentonite while Contaminants pass through the column. The impurities adhering to the bentonite are eluted with 0.1 molar saline solution of pH 9.0. Then urokinase with a 2.0 weight percent / volume aqueous solution of 6,9-diamino-2-ethoxyacridine lactate hydrate eluted.

Die erhaltene Urokinaselösung enthält etwa 70 % der ursprünglich im Ausgangsmaterial voFliegenden Urokinase, und sie hat eine Reinheit von 11 000 IE/mg. Nach Dialyse gegen physiologische Kochsalz lösung wird die Urokinaselösung durch ein Bakterienfilter filtriert, in 2 ml Anteile unterteilt und gefriergetrocknet. Es wird ein nichtinfektiöses Urokinasepräparat erhalten.The urokinase solution obtained contains about 70% of the original im Starting material of flying urokinase, and it has a purity of 11,000 IU / mg. After dialysis against physiological saline solution, the urokinase solution is through filtered through a bacterial filter, divided into 2 ml portions and freeze-dried. A non-infectious urokinase preparation is obtained.

Die auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltene wäßrige Urokinaselösung wird nach der vereinfachten Methode zur Molekulargewichtsbestimmung durch SDS-Elektrophorese an Polyacrylamidgel analysiert; vgl. Colowick-Kaplan, a.a.0.The urokinase aqueous solution obtained in the manner described above is based on the simplified method of determining molecular weight by SDS electrophoresis analyzed on polyacrylamide gel; see Colowick-Kaplan, op.

Es zeigt sich ein einzi.ger Peak, der dem einer Standard-Urokinaseprobe mit einem Molekulargewicht von etwa 54 000 entspricht.There is a single peak, that of a standard urokinase sample with a molecular weight of about 54,000.

Claims (8)

Verfahren zur Herstellung eines Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 + 10 000 enthaltenden Präparats und seine Verwendung als Fibriholytikum und Thrombolytikum Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung eines Urokinase mit einem Molekulargewicht von 54 000 ~ 10 000 enthaltenden Präparats, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man unter den Arbeitsbedingungen der Urokinaseherstellung während jeder Behandlungsstufe den pH-Wert um den Neutralpunkt oder im schwach alkalischen Bereich hält. Method of producing a urokinase having a molecular weight of 54,000 + 10,000 containing preparation and its use as a fibriholytic and thrombolytic patent claims 1. Process for the production of a urokinase with a molecular weight of 54,000 ~ 10,000 containing preparation, d a d u r c h e k e k e n n n n n n e i n e t that one is under the working conditions of urokinase production during each treatment stage the pH value around the neutral point or in the weakly alkaline Area holds. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert während der Behandlungsstufen im Bereich von 5,5 bis 12 hält.2. The method according to claim 1, characterized in that the Maintains pH in the range of 5.5 to 12 during treatment stages. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man während der Behandlungsbedingungen in der Dialysestufe zur Abtrennung von Salzen den pH-Wert im Bereich von 5,5 bis 12 hält.3. The method according to claim 1, characterized in that one during the treatment conditions in the dialysis stage for the separation of salts the pH value in the range of 5.5 to 12 holds. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Wärmebehandlungsstufe die wäßrige, Urokinase enthaltende Lösung mit einer Pufferlösung auf einen pH-Wert von 6 bis 8 einstellt und sodann zur Inaktivierung von Viren erhitzt.4. The method according to claim 1, characterized in that one in the Heat treatment step the aqueous, urokinase-containing solution with a buffer solution to a pH of 6 to 8 and then for inactivation heated by viruses. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man der wäßrigen, Urokinase enthaltenden Lösung einen Wärmestabilisator für Urokinase zusetzt.5. The method according to claim 4, characterized in that one of the aqueous, urokinase-containing solution adds a heat stabilizer for urokinase. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wärmestabilisator eine Aminosäure, ein Saccharid, ein Neutralsalz oder ein Protein verwendet.6. The method according to claim 5, characterized in that as Heat stabilizer is an amino acid, a saccharide, a neutral salt or a protein used. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wärmestabilisator Glykokoll.3 Lysin, Arginin, Sucrose, Mannit, Natriumchlorid,Älbumin oder Gelatine, verwendet.7. The method according to claim 6, characterized in that as Thermal stabilizer glycocolla. 3 lysine, arginine, sucrose, mannitol, sodium chloride, albumin or gelatin is used. 8. Verwendung des gemäß Anspruch 1 hergestellten Präparats als Fibrinolytikum und Thrombolytikum.8. Use of the preparation prepared according to claim 1 as a fibrinolytic and thrombolytic agent.