DE2850047A1

DE2850047A1 - Verfahren zur herstellung von 9 alpha -hydroxy-4-androsten-3,17-dion

Info

Publication number: DE2850047A1
Application number: DE19782850047
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr Kieslich
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1978-11-15
Filing date: 1978-11-15
Publication date: 1980-10-09
Also published as: JPS6224077B2; JPS5577897A; US4237220A

Description

Verfahren zur Herstellung von 9«-Hydroxy-4-andro3ten-3^17-aion

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Die Erfindung betrifft, daß im Patentanspruch, gekennzeichnete Verfahren.

Das 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion ist eine seit langem bekannte Substanz (J. Ämer. Ghem. Soc, 80, 195ß> 6148), welche sich durch eine antiandrogene und antiöstrogene Wirksamkeit auszeichnet und welche darüberhinaus ein wertvolles Zwischenprodukt zur Herstellung von 4-,9(H)-Androstadienr-3,17-dion ist, das seinerseits mittels bekannter Methoden in zahlreiche pharmakologisch wirksame Steroide überführt werden kann.

Bei der mikrobiologischen Herstellung dieser Verbindung aus 4~Androsten-3,17-dion nach den bisher bekannten Verfahren kann man nur relativ geringe Ausbeuten an Verfahrensprodukt erzielen (Biotechnology and Bio engineering ΣΙ, 1969» H83? US-Patente 3,080,298 und 3,H6,200).

Demgegenüber ist; es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Ver-

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fahrens möglich, hohe Substratkonzentrationen von 4~ Androsten-3,17-dion mit hoher Ausbeute in 9<*-Hydroxy-4-androsten-J,17-dion zu überführen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter den Bedingungen durchgeführt, die man üblicherweise bei der mikrobiologischen Hydroxylierung von Steroiden anwendet.

Unter den üblicherweise verwendeten Kulturbedingungen werden in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften, Submerskultüren angezüchtet. Dann setzt man den Kulturen das 4—Androsten-3»17-dion (in einem Lösungsmittel gelöst oder vorzugsweise in emulgierter Form) zu und fermentiert, bis eine maximale Substratumwandlung erreicht ist.

Geeignete Substratlösungsmittel sind beispielsweise Methanol, Äthanol, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Di-

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methylsolfoxyd. Die Emulgierung des Substrats kann beispielsweise bewirkt werden, indem man dieses in mikronisierter Form oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (wie Methanol, Äthanol, Aceton, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd) gelost unter starker Turbulenz in (vorzugsweise entkalktem) Wasser, welches die üblichen Emulgationshilfen enthält, eindüst. Geeignete Emulgationshilfen sind nichtionogene Emulgatoren, wie zum Beispiel Ithylenoxyaddukte oder Fettsäureester von PoIyglykolen. Als geeignete Emulgatoren seien die handelsüb-

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lichen Netzmittel Tegin^v ', Tween^v \ und Span^v ^J beispielsmäßig genannt.

Die optimale Substratkonzentration, Substz^atzugabezeit und Ferraentationsdauer ist von den angewendeten Fermentationsbedingungen abhängig. Diese Größen müssen, wie dies bei mikrobiologischen Steroidumwandlungen allgemein erforderlich ist, im Einzelfall durch Vorversuche, wie sie dem Fachmann geläufig sind, ermittelt werden.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens. .

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Beispiel 1

500 ml eines sterilisierten Mediums in einem 2 1 Erlenmeyerkolben "bestehend aus 6 % flüssigem Stärkezucker (entsprechend 3 % fester Glucose)

1 % Gorsteep liquor

0,2 % Natriumnitrat

0,1 % Ealiumdxhydrogenphosphät

0,2 % Dikaliumhydrogenphosphat

0,05 % Magnesiumsulfat

P,002 % Eisen(Il)-sulfat

0,05 % Kaliumchlorid

werden beimpft mit einer Abschwemmung einer ein- bis zwei Wochen alten Sehrägagarkultür von Corynespora cassicola ATCC I67I8· Fach dreitägigem Wachstum auf einem Rotationsschüttler bei 30° C wird die Myc elsuspension als Inoculum für die Beimp'fung eines 3Q 1 Versuchs ferment er s verwendet, der mit 25 eines sterilisierten Mediums der gleichen Zusammensetzung beschickt ist. Die Germination wird bei 29° C, einer Belüftung von 25 1 pro Minute und einer Eührgeschwindigkeit von 220 U/Min, durchgeführt und unter gelegentlicher Zugabe von Polyol 2000 als Antischaummittel. Nach 48 Stunden werden 1,5 der Kultur unter sterilen Bedingungen in einen gleichgroßen Permenter überführt, der mit 23,5 1 einer sterilen Nährlösung der gleichen Zusammensetzung beschickt ist, und. unter gleichen technischen Bedingungen betrieben. Nach 6 Stunden wird eine sterilfiltrierte Lösung von 12,5 B 4-Androsten-3_i17-cl-ion in 100 ml Dimethylformamid zugesetzt. Diese Substratzugabe wird bei 15 Stunden und 20 Stunden wiederholt, sodaß eine Substrätkonzentration von 1,5 g/1 erreicht wird. Die Umwandlung wird durch Entnahme mehrerer Proben kontrolliert, die mit Methylisobutylketon extrahiert und

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durch. Dünnschichtchromatographie an Ki es el gelplatt en Merck 60 F-254- analysiert werden (Entwicklung Chloroform/Methanol 9+1). Nach, ca. 38 Stunden Gesamtfermentationszeit ist das Ausgangsmaterial vollständig umgewandelt.

Der Fermenter wird geerntet, indem'man das Hycel abschleudert und dreimal mit Methylisobutylketon extrahiert. Das Mycel wird ebenfalls mit Methylisobutylketon ausgewaschen. Die vereinigten Extrakte und Waschlösungen werden im Vakuum eingeengt, wobei bereits reine Produktmengen auskristallisieren, und abfiltriert werden. 13,1 g (Schmelzpunkt 217/219-221° 0).

Das Extraktkonzentrat wird zur Trockne eingeengt, der Rückstand mit Hexan von Antischaummittel freigewaschen' und aus Essigester umkristallisiert. Es werden als Erst- und Zweitkristallisate nochmals 14-,Ψ g (Schmelzpunkt 217/218-220° C) erhalten. Nach spektralen Daten besteht das Produkt einheitlich aus 9<x-Hydroxy-4— androsten^irZ-dion. Die Gesamtausbeute beträgt 69,5 °/° der Theorie.

Beispiel 2

Unter gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben, werden 13 1 gut entwickelter Kultur von Corynespora cassicola ATCO 16718 hergestellt, die bei 15 Stunden, 20 Stunden, 25 Stunden und 30 Stunden mit je 500 ml einer Substratsuspension beschickt werden. Die Substratsuspension wird hergestellt durch 2-stündiges Vermählen von je 37,5 g i je 500 ml 2 %iger Tween^ '80-lösung in einer Kugelmühle. Die Substratsuspension wird bei 100 C pasteurisiert.

Nach 92 Stunden Gesamtfermentationszeit ist das Substrat umgewandelt. Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben geerntet und aufgearbeitet. Beim Einengen der Methylisobutylketon-Extrakte werden 30 g Rohprodukt erhalten, was aus Essig-

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ester umkristallisiert wird und 25 S' Reinprodukt ergibt. ' . · Das durch Auswaschen des Mycels erhaltene Rohprodukt von 50g ■liefert aus Essigester umkristallisiert weitere A-I g Reinprodukt. Schmelzpunkt 218/219-221° G.· Gesamtausbeute 70% der Theorie. Durch chromatographische Aufreinigung der Mutterlaugen sind weitere Produktmengen gewinnbar.

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Claims

Pat entanspruch

"Verfahren zur Herst elltmg von 9«-Hydroxy-4-androsten-3,17" dion, dadurch gekennzeichnet, daß man 4—Androsten-3,17-dion mit einer Kultur von Corynespora cassicola ATCO 16^; 7I8 fermentiert.

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