DE2828525A1 - CHEMICAL ANALYSIS METHOD AND DEVICE FOR IMPLEMENTING IT - Google Patents
CHEMICAL ANALYSIS METHOD AND DEVICE FOR IMPLEMENTING ITInfo
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Description
DR. HEINRICH HERMELINKDR. HEINRICH HERMELINK
9f 8000 Mündien 60, Tel. 81145709 f 8000 Mündien 60, Tel. 8114570
München, den * * · J(Jf)J fQJo Munich, the * * · J (Jf) J fQJo
101/037101/037
Dr. Eduard Fresenius Chemisch-pharmazeutische Industrie KGDr. Eduard Fresenius Chemical-Pharmaceutical Industry KG
Apparatebau KG., 6380 Bad Homburg v.d.H,Apparatebau KG., 6380 Bad Homburg v.d.H,
Chemisches Analyseverfahren und Vorrichtung zu dessen AusführungChemical analysis method and device for its execution
Die im Anspruch 1 gekennzeichnete Erfindung dient zur quantitativen chemischen Analyse, und zwar einerseits zur Bestimmung von Substanzen, die durch die katalytische Wirkung bestimmter Enzyme umgesetzt werden, andererseits zur Bestimmung von Enzymaktivitäten unter Anwendung entsprechender Substrate.·The invention characterized in claim 1 is used for quantitative chemical analysis, on the one hand for the determination of substances by the catalytic effect certain enzymes are converted, on the other hand for the determination of enzyme activities using appropriate Substrates.
In der biochemischen Analytik werden häufig Enzyme benutzt, um Substanzen, deren Umsetzung durch das entsprechende Enzym hochselektiv katalysiert wird, quantitativ zu bestimmen. Dies geschieht normalerweise in der Form, daß dem zu analysierenden Substanzgemisch das Enzym hinzugefügt wird, um ein leicht nachweisbares Reaktionsprodukt zu erhalten, das nachfolgend, z. B. unter Ausnutzung einer Farbreaktion, mit bekannten Methoden quantitativ bestimmt werden kann.Enzymes are often used in biochemical analysis, to quantitatively determine substances whose conversion is catalyzed in a highly selective manner by the corresponding enzyme. This is usually done in the form that is to be analyzed Mixture of substances the enzyme is added to obtain an easily detectable reaction product that below, e.g. B. using a color reaction, can be determined quantitatively with known methods.
Bei diesem Verfahren wird jedesmal eine gewisse Menge Enzym verbraucht. Um diesen Nachteil zu vermeiden, sind Enzyme in immobilisierter, z. B. an geeignete Polymere gebundenerThis process uses a certain amount of enzyme each time. To avoid this disadvantage are enzymes in immobilized, e.g. B. bound to suitable polymers
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und dadurch unlöslich gemachter Form entwickelt worden, die eine Daueranwendung, zumindest über eine gewisse Zeit, möglich machen. Mit einer Reaktionspatrone, die solche immobilisierten Enzyme enthält, kann im Prinzip aufeinanderfolgend eine Vielzahl von Probenumsetzungen durchgeführt werden. In der praktischenAnwendung zeigen sich jedoch auch hier Nachteile, vor allem derart, daß auch die immobilisierten Enzyme durch den Kontakt mit dem Meßmedium relativ rasch unbrauchbar werden können, wenn dieses bestimmte hochmolekulare Beimengungen, z. B. Eiweißsubstanzen, enthält. Außerdem stehen nur wenige Enzyme in immobilisierter Form zur Verfügung, so daß das Verfahren nicht allgemein anwendbar ist. Eine Einschränkung ergibt sich ferner dadurch, daß die immobilisierten Enzyme eine zum Teil drastisch verminderte Aktivität gegenüber der entsprechenden löslichen Enzymform haben.and thus a form made insoluble has been developed, which can be used continuously, at least over a certain period of time, make possible. With a reaction cartridge that contains such immobilized enzymes, in principle, one after the other a variety of sample conversions can be performed. In practical application, however, they also show Disadvantages here, especially such that the immobilized enzymes are also relatively can quickly become unusable if this certain high molecular weight admixtures such. B. protein substances contains. In addition, only a few enzymes are available in immobilized form, so that the method is not general is applicable. Another limitation arises from the fact that the immobilized enzymes are sometimes drastic have decreased activity towards the corresponding soluble enzyme form.
Die Erfindung ermöglicht es nun, Enzyme in der normalen löslichen Form für den beschriebenen Zweck uneingeschränkt über längere Zeit anzuwenden, so daß die genannten Nachteile entfallen. Das erfindungsgemäße Verfahren und die entsprechenden Vorrichtungen können umgekehrt auch zur Bestimmung von Enzymaktivitäten in einem Meßmedium benutzt werden. Die Erfindung ist außerdem geeignet, im Falle der Anwendung immobilisierter Enzyme die Brauchbarkeitsdauer dieser Enzyme wesentlich zu verlängern. Einzelheiten ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.The invention now makes it possible to use enzymes in the normal soluble form for the described purpose without restriction to be used for a longer period of time, so that the disadvantages mentioned do not apply. The inventive method and the Conversely, corresponding devices can also be used to determine enzyme activities in a measuring medium will. The invention is also suitable, in the case of the use of immobilized enzymes, the useful life these enzymes extend significantly. Details can be found in the following description.
Die Figur zeigt ein Ausführungsbeispiel in rein schematischer Darstellung der Erfindung. Die Anordnung besteht aus einer Kammer la, Ib, die in einem gegen die in Frage kommenden Reagentien neutralen Werkstoff ausgearbeitet und durch eine semipermeable Membran 2 in zwei Hälften unter-The figure shows an embodiment in a purely schematic representation of the invention. The arrangement consists of a chamber la, Ib, which is worked out in a material neutral to the reagents in question and divided into two halves by a semi-permeable membrane 2
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teilt ist.Die erste Kammerhälfte la wird von dem zu analysierenden Medium durchströmt, das durch die Leitung 3 zufließt und über die Leitung 4 abfließt. Die zweite Kaminerhälfte Ib ist mit dem Enzym, z. B. in Form einer Enzymlösung, gefüllt. Das Einfüllen der Enzymlösung erfolgt durch die Leitung 5, während die Leitung 6 zur Entlüftung dient. Zum Absperren dieser beiden Leitungswege nach dem Füllen dienen Absperrvorrichtungen 7 und 8.The first half of the chamber la is to be analyzed by the Medium flows through it, which flows in through line 3 and flows out via line 4. The second half of the fireplace Ib is associated with the enzyme, e.g. B. in the form of an enzyme solution filled. The enzyme solution is filled in through line 5, while line 6 is used for venting. To shut off these two lines after the Shut-off devices 7 and 8 are used for filling.
Die Membran 2 ist für den interessierenden niedermolekularen Substanzanteil des zu analysierenden Mediums durchlässig, für das Enzym jedoch undurchlässig. Wegen des hohen Molekulargewichts der Enzyme (typische 100.000) ist diese Bedingung leicht zu erfüllen. Beispielsweise besteht die Membran aus einem Cellulosederivat, Polyacrylnitril, PoIysulfon oder Polycarbonat. Anteile der Meßsubstanz diffundieren demzufolge aus der Kammerhalfte la durch die Membran in die Kammerhalfte Ib, werden dort durch das Enzym zur Reaktion gebracht, und die ebenfalls niedermolekularen Reaktionsprodukte diffundieren teilweise in die Kammerhälfte la zurück. Es stellt sich ein Fließgleichgewicht ein, das durch Konzentrationsdifferenzen sowohl der an der Reaktion beteiligten Komponenten als auch der Reaktionsprodukte zwischen der Zuleitung 2 und der Ableitung 4 der Kammerhälfte la gekennzeichnet ist. Nach entsprechender Eichung kann somit durch Messung einer der Reaktionskomponenten oder eines der Reaktionsprodukte am Ausgang und Vergleich mit dem entsprechenden Wert am Eingang auf die Anfangskonzentration eines der Reaktionspartner rückgeschlossen werden. Hierzu sind in der Figur zwei Meßfühler 9 und 10 vorgesehen, die mit einem Meßgerät 11 verbunden sind.The membrane 2 is permeable to the low molecular weight substance fraction of interest in the medium to be analyzed, however, impermeable to the enzyme. Because of the high molecular weight of the enzymes (typically 100,000) this is Condition easy to meet. For example, the membrane consists of a cellulose derivative, polyacrylonitrile, polysulfone or polycarbonate. Accordingly, portions of the substance to be measured diffuse from the chamber half la through the membrane in the chamber half Ib, are there by the enzyme brought to reaction, and the likewise low molecular weight reaction products diffuse partially into the chamber half la back. A steady state is established, which is caused by differences in concentration in both the Reaction involved components as well as the reaction products between the inlet 2 and the outlet 4 of the Chamber half la is marked. After appropriate calibration, one of the reaction components can thus be measured or one of the reaction products at the output and comparison with the corresponding value at the input to the Initial concentration of one of the reactants can be deduced. For this purpose, there are two sensors in the figure 9 and 10 are provided, which are connected to a measuring device 11.
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um beispielsweise den Glucosegehalt in einem Blutserum zu bestimmen, wird die Kammerhälfte Ib mit dem Enzym Glucoseoxidase beschickt, das die Eigenschaft hat, Glucose unter Sauerstoffverbrauch zu Gluconsäure umzusetzen. Durch Messung der Sauerstoffgehalte am Eingang und am Ausgang mit geeigneten Meßfühlern 9 und 10 kann der Sauerstoffverbrauch bestimmt und somit auf den ursprünglichen Glucosegehalt des Serums rückgeschlossen werden. Der Meßfühler 9 kann eventuell entfallen, sofern der anfängliche Sauerstoffgehalt des Meßmediums genügend genau bekannt ist.for example the glucose content in a blood serum To determine, the chamber half Ib is charged with the enzyme glucose oxidase, which has the property of glucose to convert to gluconic acid with consumption of oxygen. By Measurement of the oxygen content at the inlet and at the outlet with suitable sensors 9 and 10 can determine the oxygen consumption determined and thus inferred from the original glucose content of the serum. The probe 9 may be omitted if the initial oxygen content of the medium to be measured is known with sufficient accuracy.
Ein anderes Beispiel ist die Bestimmung des Harnstoffgehaltes einer Meßlösung. Als Enzym zur Umsetzung des Harnstoffes ist in diesem Falle Urease geeignet, die den Harnstoff unter Freisetzung von Ammoniumionen spaltet. Als Meßfühler 9 und 10 sind in diesem Falle z. B. ionenselektive Ammonium-Elektroden verwendbar.Another example is the determination of the urea content of a measurement solution. As an enzyme for converting urea In this case, urease is suitable, which cleaves the urea with the release of ammonium ions. as Sensors 9 and 10 are in this case, for. B. ion-selective ammonium electrodes can be used.
Die Meßfühler 9 und 10 können grundsätzlich nach den verschiedenen bekannten Meßprinzipien arbeiten. Außer den bereits erwähnten gassensitiven und ionenselekttiven Elektroden kommen Enzymelektroden, thermische Meßfühler und insbesondere auch photometrische Meßeinrichtungen in Betracht. Durch die Möglichkeit, ein Differenzmeßverfahren anzuwenden, u. U. in Verbindung mit einer Umkehr der Strömungsrichtung in der Kammerhälfte la oder einem Vertauschen der beiden Meßfühler 9 und 10, bei zwei aufeinanderfolgenden Messungen der gleichen Probe, können bestimmte Fehlereinflüsse zusätzlich stark reduziert werden.The sensors 9 and 10 can basically according to the different known measuring principles work. Except for the gas-sensitive and ion-selective electrodes already mentioned Enzyme electrodes, thermal sensors and, in particular, photometric measuring devices come into consideration. The possibility of using a differential measurement method, possibly in connection with a reversal of the direction of flow in the chamber half la or an interchange of the two sensors 9 and 10, in the case of two successive ones Measurements of the same sample, certain error influences can also be greatly reduced.
Bei bestimmten Messungen ist es zweckmäßig oder notwendig, dem Meßgut Indikatoren beizufügen, die entweder an der enzymatischen Reaktion als Reaktionspartner beteiligt sind oder durch eine Hilfsreaktion mit einem oder mehreren derIn the case of certain measurements, it is useful or necessary to add indicators to the material to be measured, which are either based on the enzymatic reaction are involved as a reactant or by an auxiliary reaction with one or more of the
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Reaktionsprodukte eine einfache quantitative Bestimmung gestatten. Ein Beispiel hierfür ist die Zugabe von Farbindikatoren bei photometrischer Auswertung.Reaction products a simple quantitative determination allow. An example of this is the addition of color indicators during photometric evaluation.
Es kann außerdem zweckmäßig sein, dem Meßgut Pufferlösungen zuzumischen, um die Enzymaktivität in einem optimalen Bereich zu halten.It can also be useful to add buffer solutions to the material to be measured in order to keep the enzyme activity in an optimal range to keep.
In bestimmten Fällen ist eine mehrstufige enzymatische Umsetzung notwendig, um ein quantitativ leicht nachweisbares Reaktionsprodukt zu erhalten. In diesem Falle kann die Kammerhälfte Ib ein Gemisch von zwei oder mehreren Enzymen enthalten. Alternativ oder in Kombination damit besteht die Möglichkeit, den Ausgang 4 der in der Figur gezeigten Anordnung mit dem Eingang einer gleichartig gestalteten Anordnung zu verbinden, um in der zweiten Anordnung eine weitere Umsetzung mit einem anderen Enzym vorzunehmen. In certain cases it is a multistage enzymatic Implementation necessary in order to obtain a quantitatively easily detectable reaction product. In this case it can the chamber half Ib contain a mixture of two or more enzymes. Alternatively or in combination with it there is the possibility of the output 4 of the arrangement shown in the figure with the input of a similarly designed To connect arrangement in order to carry out a further reaction with another enzyme in the second arrangement.
Bei Anwendung immobilisierter Enzyme anstelle löslicher Enzyme bringt die beschriebene Anordnung gegenüber der direkten Anwendung immobilisierter Enzyme den Vorteil, daß eine Kontamination durch hochmolekulare Bestandteile des Meßgutes vermieden wird, weil die semipermeable Membran 2 den Durchtritt dieser Substanzen verhindert. Dadurch kann die Dauer der Brauchbarkeit des immobilisierten Enzyms wesentlich verlängert werden.When using immobilized enzymes instead of soluble enzymes, the arrangement described brings about the direct application of immobilized enzymes has the advantage that contamination by high molecular weight components of the material to be measured is avoided because the semipermeable membrane 2 prevents the passage of these substances. This can the useful life of the immobilized enzyme can be extended significantly.
Die in der Figur schematisch dargestellte Vorrichtung ist umgekehrt auch geeignet, Enzymaktivitäten in einer Meßlösung zu bestimmen. Zu diesem Zweck wird die Kammerhälfte Ib mit der Meßlösung beschickt. Durch die Kammerhälfte la fließt eine Normallösung, die ein Substrat des betreffenden EnzymsConversely, the device shown schematically in the figure is also suitable for enzyme activities in a measurement solution to determine. For this purpose, the chamber half Ib with loaded with the measurement solution. A normal solution, which is a substrate of the enzyme in question, flows through the chamber half la
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und evtl. weitere notwendige Reaktionskomponenten in definierter Konzentration sowie evtl.'Indikatoren, Puffer usw. enthält. Auf Grund der mit Hilfe der Meßfühler 9 und 10 erhaltenen Anzeige kann dann auf den Substratumsatz und somit auf die Enzymaktivität geschlossen werden.and possibly other necessary reaction components in defined concentration as well as any indicators, buffers etc. contains. On the basis of the display obtained with the aid of the measuring sensors 9 and 10, the substrate turnover can then be viewed and thus conclusions can be drawn about the enzyme activity.
ORIGINAL INSPECTED 909883/01 17 ORIGINAL INSPECTED 909883/01 17
Claims (1)
einem optimalen Bereich zu halten.6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the material to be measured is supplied with a buffer solution to the enzyme activity in
to keep it in an optimal range.
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Legal Events
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Owner name: FRESENIUS AG, 6380 BAD HOMBURG, DE |
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