DE2821889A1 - Verfahren zur immobilisierung von enzymen und verwendung der enzym- immobilisate - Google Patents

Description

• Verfahren zur Immobilisierung von Enz-ymen und Verwendung der
• Enzym-Immobilisate ( Zusatz zu Patentanmeldung P 27 49 317.0 ) Gegenstand der Hauptanmeldung ist ein Verfahren zur Immbolisierung von Enzymen dadurch, daß im wesentlichen aus amorphem SiO2 bestehende Formkörper einstufig durch Behandlung mit Silanen modifiziert und mit einer Enzymlösung in Kontakt gebracht werden.
• Bevorzugt wird als Enzym AMANO-Acylase verwendet.
• Die Enzym-Immobilisate können u.a. zur selektiven enzymatischen Hydrolyse von N-Acyl-aminosäuren Verwendung finden.
• Es ist der besondere Vorteil der nach dem Verfahren hergestellten Enzym-Immobilisate, daß lediglich eine einstufige Modifizierung notwendig ist, bei der nach Aufbringung der Silane direkt ein für die Aufbringung der Enzyme bereiteter Träger vorliegt, ohne daß Gruppen der Silane umgewandelt, aktiviert oder modifiziert werden müssen.
• Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß der Vorteil der einstufigen Modifizierung mit weiteren Silanen erreichbar ist.
• Solche Silane enthalten eine oder mehrere Gruppen, welche i,m fertigen Enzym-Immobilisat dem Enzym zugeordnet und offenbar als das Enzym gerichtet sind, ohne daß diese Gruppen eine kovalente Bindung z1lm Enzym auszubilden in der Lage sind. Als Kriterium solcher Silane und der hergestellten Enzym-Immobil ate von hoher und gleichbleibender Aktivitbt wird die Refeniererbarkeit der Immobilisate mit Salzlösungen, insbesondere Pufferlösungen, und anschließender Behandlung mit frische Enzymlösung angesehen.
• Diese weitere Silane entsprechen insbesondere der Formel worin n = 0, 1 oder 2, R einen Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen, der gegebenenfalls durch ein Sauerstoffatom unterbrochen sein kann, R n einen Alkylrest mit 1 bis 8 C-Atomen, einen ein- oder mehrkernigen Arylrest oder A, A die Reste worin R' ein Alkylen mit 2 bis 4 C-htomen oder den Phenylenrest und der Rest Y den Rest R ( in der genannten Bedeutung ), oder der Rest Y'die Reste Y oder H, oder die Reste Y und Y' gemiensam mit dem daran gebundenen Stickstoff Ringe von fünf oder sechs Gliedern mit 1 oder 2 N-Atomen, bevorzugt oder ( m = 4 oder 5 ), bedeuten.
• Bevorzugt sind Silane der Formel mit n = 0 oder 1.
• Entsprechende Silane sind u.a..
• Y-Dimethylaminopropyl-trimethoxisilan γ-Dimethylaminopropyl-triäthoxysilan γ-Methyl-γ(ß-Aminoäthyl)-aminopropyl-trimethoxysilan γ-Methyl-γ(ß-Aminoäthyl)-aminopropyl-triäthoxisilan γ-Äthylaminopropyl-trimethoxysilan γ-Methylaminopropyl-trimethoxisilan γ-Dimethylaminorpropyl-methyl-dimetoxysilan γ-Dimethioxyaminopropyl-phenyl-dimethoxisilan γ-(ß-Dimethylaminoäthyl)-aminopropyl-trimethoxisilan 3v-(ß-Dimethylaminopropyl)-aminopropyl-trimethoxisilaR γ-(1,3 Diazacyklopentyl-2)-propyl-trimethoxysilan.
• Beispiel 1 a) 100 g eines im wesentlichen aus amorphem Si02 bestehenden, durch Waschen, Verformen und Hitzebehandlung hergestellten Trägermittels in Kugelform werden mit einer Lösung von 20 g - Dimethylaminopropyltrimethoxisilan in 100 ml Äthanol 2 Stunden am Rückfluß gekocht. Man wäscht zunächst mit Äthanol, dann mit Wasser neutral. Die so modifizierten Kugeln werden getrocknet (1200C, 20 Std. ). Der Gehalt an Stickstoff beträgt 0,7 Gew.-%.
• b) 5,6 g mit nach a) modifizierten Katalysatorkugeln werden mit 8 ml einer 10 Gew.-%igen Lösung von AMANO-Acylase in Standard Phosphatpuffer, pH 7, 3 Tage bei 100C stehengelassen. Man wäscht mit Pufferlösung.
• c) Das Enzym-Immobilisat wird mit 50 g 10 Gew.-%iger F-Acetyl-D, L-Phenylalanin-Lösung ( in wässriger NaOH, auf pH 7 eingestellt ) 24 Stunden bei 370C inkubiert. Nach jeweils 24 Stunden wird die enzymatisch gespaltene Substratlösung gegen frische Substratlösung ausgetauscht. In 24 Stunden werden 0,15 bis 0,2 g L-Phenylalanin pro 1 g feuchtes Enzym-iinmobilisat gebildet. Überraschend ist die enzymatische Aktivität nach 8 bis 10 Wochen des Gebrauchs noch so hoch wie nach 1 bis 2 Wochen, Beispiel 2 Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch die enzymatische Hydrolyse entsprechend 1 c) mit Teilmengen des Immobilisats mit einerseits N-Acetyl-D,L-Phenylglycin und andererseits mit N-Acetyl-D,L-Tryptophan ausgeführt wurden. Beide L-Aminosäuren wurden in guter und gleichbleibend hoher Ausbeute durch 6 Wochen hergestellt.
• Beispiel 3 Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch erfolgt die Modifizierung mit 3-Diazacylopentyl-2)-propyl-triäthoxisilan anstelle von γ-Dimethylaminopropyltrimethoxysilan. Die Aktivität der entsprechend 1 b) aufgebrachten AMANO-Acylase; gemessen an der Bildung von L-Phenyalanin aus N-Acetyl-D,L-phenylalanin, ist die gleiche wie in -Beispiel 1 c).

Claims (5)

1. Patentansprüche 1. Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen dadurch, daß im wesentlichen aus amorphen SiO2 bestehenden Formkörper einstufig durch Behandlung mit Silanen modifiziert und mit einer Enzym-Lösung in Kontakt gebracht werden nach Patent (Patenanmeldung P P 27 49 317.0 ) dadurch gekennzeichraet. daß die Silane der Formel worin n = 0, 1; oder 2, R einen Alylrest mit 1 bis 4 C-Atom der gegenüberfalls durch ein Suaerstoffatom unterbrochen kann, "R" einen Alkyrest mit 1 bis 8 C-Atomen, einen ein- oder mehrkernigen Arylrest oder A, A den Rest worin R' ein Alkylen mit 2 bis 4 C-Atomen oder den Phenylrest und der Rest Y den Rest R (in der genannten Bedeutung) oder der Rest Y'die Reste Y oder H, oder die Reste Y und Y' gemeinsam mit dem daran gebundenen Stickstoff Ringe von fünf oder sechs Gliedern mit 1 oder 2 N-Atomen, bevorzugt od.er ( m = 4- oder 5 ), bedeuten. 2. Verfahren nsch Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymlösung als 2 bis 20 Gew.-% ige, vorzugsweise 5 bs 15.
2. Gew.-% ige, Lösung des Enzyms verwendet wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymlösung bei 0 bis 4-0°C mit den modifizierten Träger In Kontakt gebracht wird.
4. 4. Verfahren nach einem der Anspruche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym AMANO-Acylase verwendet wird.
5. 5. Verwendung der Enzym-Immobilisate nach einem der Anspriiche 1 bis 4 zur selektiven enzymatischen Hydrolyse von N-Acylaminosäuren.