DE2812989A1 - METHOD OF MANUFACTURING INTERFERON AND THE PRODUCT OBTAINED THEREOF - Google Patents

Description

e Dip!.-!ng. Curt Wallach Dipl.-ing. Günther Koch 819989 Dipl.-Phys. Dr.Tino Haibach Dipl.-Ing. Rainer Feldkamp e Dip! .-! ng. Curt Wallach Dipl.-Ing. Günther Koch 819989 Dipl.-Phys. Dr Tino Haibach Dipl.-Ing. Rainer Feldkamp

D-8000 München 2 · Kaufingerstraße 8 · Telefon (0 89) 24 02 75 · Telex 5 29 513 wakai d D-8000 Munich 2 Kaufingerstraße 8 Telephone (0 89) 24 02 75 Telex 5 29 513 wakai d

^{Datum: 23}· ^{März 1978 Date: March 23, 1978}

Unser Zeichen: I6l86 H/Bu Our reference: I6l86 H / Bu

Stichting Rega V.Z.W., Krakenstraat 3, B-3OOO Leuven,Stichting Rega V.Z.W., Krakenstraat 3, B-3OOO Leuven,

BelgienBelgium

Verfahren zur Herstellung von Interferon und das dabeiProcess for the production of interferon and that thereby

erhaltene Produktreceived product

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Beschreibungdescription

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Interferon und das dabei erhaltene Produkt.The invention relates to a process for the production of interferon and the product obtained thereby.

Interferon ist ein Glycoprotein, das von lebenden Zellen zur Abwehr einer Virusinfektion gebildet wird. Die chemise he Struktur kann in Abhängigkeit von dem Typ der für seine Bildung verwendeten Zelle geringfügig variieren. Dieses Interferon weist verschiedene biochemische Wirkungen auf, beispielsweise eine Antiviren-, Ant!protozoen-, eine Zellenwachstumshemmungs- und eine immununterdrückende Wirkung, und deshalb kann es mit Erfolg in der Medizin angewendet werden. Bezüglich eines allgemeinen Überblicks über den derzeitigen Wissensstand über Interferon darf auf das Buch "Interferon and Interferon inducers" von N.B. Finter, North-Holland-American Elsevier, Amsterdam, London, New York, 1973, verwiesen werden.Interferon is a glycoprotein made by living cells to fight off a viral infection. The chemical structure may vary slightly depending on the type of cell used for its formation vary. This interferon has various biochemical effects, such as an antiviral, Ant! Protozoan, one cell growth inhibitor and one immunosuppressive effect, and therefore it can be used successfully in medicine. Regarding one general overview of the current state of knowledge about interferon may refer to the book "Interferon and Interferon inducers "by N.B. Finter, North-Holland-American Elsevier, Amsterdam, London, New York, 1973, to get expelled.

Für die medizinische Anwendung bei Humanpatienten sollte das Interferon aus Human-ZeIlen hergestellt werden« Derzeit werden die folgenden Herstellungsverfahren angewendet: For medical use in human patients, the interferon should be made from human cells « The following manufacturing processes are currently used:

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1) Die Herstellung durch Infektion von frisch gesammelten Leukozyten aus Humanblutdonatoren mit dem Sendai-Virus; dabei erhält man das sogenannte Leukozyten-Interferon (vgl. Cantell et al, "In Vitro", 3, 35 - 38 (1974»1) Production by infection of freshly collected leukocytes from human blood donors with the Sendai virus; you get the so-called Leukocyte interferon (cf. Cantell et al, "In Vitro", 3, 35 - 38 (1974 »

2) die Herstellung von kultivierten Dip Io id-Human·* Fibroblast - Zellen unter Anwendung des sogenannten "Poly-ItC-Superinduktions-Programms". Das dabei erhaltene Fibroblast - Interferon unterscheidet sich von dem Leukozyten-Interferon durch mehrere biologische und physikalisch-chemische Kriterien (vgl.2) the production of cultured Dip Io id-Human * Fibroblast cells using the so-called "Poly-ItC superinduction program". The thereby obtained Fibroblast - interferon differs from the leukocyte interferon in several biological ways and physico-chemical criteria (cf.

A. Billiau et al, "J. Gen. Virol", 19, 1 - 8 (1973));A. Billiau et al, J. Gen. Virol, 19, 1-8 (1973));

3) die Herstellung in Lymphoblastoid-Zellformen unter Verwendung eines viralen Interferon-Bildners; das dabei erhaltene Interferon ähnelt stark dem Leukozyten-Interferon (vgl. Strander et al, "J. Clin. Microbiol", 1, 116 - 117 (1975)).3) manufacture in lymphoblastoid cell forms using a viral interferon generator; the interferon obtained in this way is very similar to leukocyte interferon (cf. Strander et al, "J. Clin. Microbiol ", 1, 116-117 (1975)).

Die vorliegende Erfindung befasst sich insbesondere mit dem zuletzt genannten Verfahren. Lymphoblastoidzellformen können aus den Lymphozyten von Personen entwickelt werden, die kein Krankheitssymptom aufweisen. Es wird jedoch angenommen, daß sie nur aus Lymphozyten vonThe present invention is particularly concerned with the last-mentioned method. Lymphoblastoid cell forms can be developed from the lymphocytes of people who have no symptom of disease. It is believed, however, that they only consist of lymphocytes

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Personen stammen, die einmal mit dem Epstein-Barr-Virus infiziert worden sind. Dieses Agens verursacht wahrscheinlich bei einer Minderheit von infizierten Personen, insbesondere in bestimmten Teilen Afrikas, Mononukleose-Infektionen. Deshalb werden alle Lymphoblast - Zellformen als Tumorzellformen angesehen.Individuals have come from once with the Epstein-Barr virus have been infected. This agent is likely to cause, in a minority of infected people, especially in certain parts of Africa, mononucleosis infections. This is why all lymphoblast cell forms regarded as tumor cell forms.

Bestimmte Lymphoblast-Formen bilden spontan eine geringe Menge Interferon, z.B. 0,01 ^fergleichseinheiten pro 1000 Zellen Durch Infektion der Zellen mit dem Sendai-Virus kann jedoch die Bildung auf das 100- bis 1000-fache gesteigert werden, so daß das Herstellungsverfahren darauf beruht. Dieses Verfahren besteht darin, daß die Lymphoblast-Zellen nach dem Inokulieren (Impfen) mit dem Sendai-Virus in einem flüssigen bzw. fließfähigen Medium weiter kultiviert werden für die Bildung einer ausreichenden Menge an Interferon, wonach das dabei erhaltene Interferon aus dem Kulturmedium gewonnen wird.Certain forms of lymphoblast form a minor one spontaneously Amount of interferon, e.g. 0.01 ^ equivalent units per 1000 cells By infecting the cells with the Sendai virus, however, the formation can be increased 100 to 1000 times so that the manufacturing process is based on it. This procedure consists in removing the lymphoblast cells cultivated further in a liquid or flowable medium after inoculation (vaccination) with the Sendai virus are responsible for the formation of a sufficient amount of interferon, after which the interferon obtained in the process is obtained from the culture medium.

Lymphoblast-Zellen haben gegenüber anderen Substraten den Vorteil, daß sie sich leicht vermehren können. Sie wachsen gut in Suspension und können deshalb in großtechnischem Maßstabe angewendet werden. Sogar eine mehr oder weniger kontinuierliche Interferon-Bildung ist möglich durch erneute Inokulierung (Impfung) der Zellen mit Sendai-Virus nach der Abtrennung des Interferons und nach der Zufuhr von frischen Zellen undLymphoblast cells have the advantage over other substrates that they can multiply easily. she grow well in suspension and can therefore be used on an industrial scale. Even one more or less continuous interferon formation is possible by re-inoculating (vaccinating) the Cells with Sendai virus after the separation of the interferon and after the supply of fresh cells and

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einer weiteren Kultivierung der Zellen. Dadurch werden die Herstellungskosten für das Interferon beträchtlich herabgesetzt. Ein Problem besteht jedoch darin, daß der Sendai-Virus, der als Mittel zum Einleiten der Interferon-Bildung dient, sich in den Lymphoblast-Zellen nicbt vermehrt, so daß stets für die weitere Infektion frischer Sendai-Virus erforderlich ist, der in einer getrennten Herstellungsanlage kultiviert und aufbewahrt werden muß.a further cultivation of the cells. This makes the manufacturing costs for the interferon considerable degraded. One problem, however, is that Sendai virus, used as a means of inducing interferon formation serves, does not multiply in the lymphoblast cells, so that fresh Sendai virus is always required for further infection, which is in a separate Manufacturing plant must be cultivated and preserved.

Nach umfangreichen Untersuchungen wurde jedoch gefunden, daß die Interferon-Bildung in Lymphoblast-Zellen auch durch den Masern-Mrus induziert werden kann,und daß dieser Masern-Virus im Gegensatz zu dem Sendai-Virus in seiner Vermehrung nicht gehindert (gehemmt) wird, so daß nach Beendigung des KultivierungsZeitraumes er noch in den dann verbleibenden Zellen enthalten ist und als Zusatz zu frischen Lymphoblast-Zellen verwendet werden kann. Tatsächlich werden i» ch der Beendigung eines Kultivierungszeitraumes und nach der Gewinnung des Interferons frische Lymphoblastzellen den restlichen (zurückbleibenden) Zellen zugesetzt und wenn diese Zellenmischung auf normale. Weise vermehrt wird, so wird, wie gefunden wurde, die erneute Bildung von Interferon induziert, ohne daß eine weitere Inokulierung (Impfung) mit einem Virus erforderlich ist. Diese Stufen können beliebig oft wiederholt werden. Das Ganze stellt dann ein halbkontinuierliches VerfahrenAfter extensive investigations, however, it has been found that the interferon formation in lymphoblast cells can also be induced by measles merrus, and that this measles virus, in contrast to the Sendai virus, is not hindered (inhibited) in its reproduction, see above that after the end of the cultivation period it is still contained in the remaining cells and can be used as an additive to fresh lymphoblast cells. In fact, at the end of a cultivation period and after the interferon has been obtained, fresh lymphoblast cells are added to the remaining (remaining) cells and when this cell mixture is normalized. If it is multiplied in a manner that has been found to induce the formation of new interferon without the need for further inoculation (vaccination) with a virus. These steps can be repeated as often as you like. The whole thing then represents a semi-continuous process

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dar, bei dem eine getrennte Herstellungsanlage für den Virus nicht mehr erforderlich ist, da eine einzige Infektion mit dem Virus zu Beginn der Herstellung ausreicht. Darüber hinaus wurde gefunden, daß im Verlaufe des Verfahrens eine 100-fache Zunahme der Interferon-Bildung auftritt im Vergleich zu der Bildung am Beginn, was eine vorteilhafte Änderung in der Art des Virus anzeigt und zu einer beträchtlichen Senkung der Herstellungskosten führt.in which a separate manufacturing facility for the virus is no longer required as a single one Infection with the virus at the beginning of the manufacture is sufficient. In addition, it was found that in the course of of the procedure there is a 100-fold increase in interferon formation compared to the formation at the beginning, indicating a beneficial change in the nature of the virus, and a sizable one Lowering the manufacturing costs leads.

Neben dem Masern-Virus zeigen auch verschiedene andere, die Interferon-Bildung induzierende Microorganismen der Paramyxo- und Pseudomyxo-Gruppe sowie Viren der Toga-Gruppe das gleiche Phänomen und sie eigenen sich daher für die Durchführung des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens. Darauf beruht die vorliegende Erfindung.In addition to the measles virus, various other microorganisms of the paramyxo and pseudomyxo groups and viruses of the Toga group have the same phenomenon and are therefore suitable for carrying out the production process according to the invention. The present invention is based on this.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Interferon durch Kultivieren (Züchten) von Lymphoblast-Zellen, die mit einem die Interferon-Bildung induzierenden Virus inokuliert (geimpft) sind, das dadurch gekennzeichnet ist, daß in einer Anfangsetufe Lymphoblast-Zellen in einem flüssigen bzw. fließfähigen Medium mit einem geeigneten, die Interferon-Bildung induzierenden Virus inokuliert (geimpft) werden,The invention relates to a process for the production of interferon by culturing (growing) of lymphoblast cells inoculated (vaccinated) with a virus that induces interferon production, which is characterized in that in an initial stage lymphoblast cells in a liquid or flowable Medium are inoculated (inoculated) with a suitable virus which induces interferon formation,

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der an der Vermehrung nicht gehindert ist, und daß die auf diese Weise infizierten Zellen eine für die Bildung von Interferon geeignete Zeitspanne vermehrt werden, daß anschließend in einer Produktionsstufe das flüssige bzw. fließfähige Kulturmedium von den Zellen getrennt, das gebildete Interferon aus dem abgetrennten Kulturmedium gewonnen, eine Menge an frischen Lymphoblast-Zellen den restlichen infizierten Zellen zugesetzt und die Mischung aus den frischen und den restlichen (zurückbleibenden) Zellen während eines für die Bildung von Interferon geeigneten Zeitraumes vermehrt wird, und daß die Produktionsstufe beliebig oft wiederholt wird. which is not prevented from multiplying, and that the cells infected in this way are one for the Formation of interferon can be increased in a suitable period of time that subsequently in a production stage the liquid or flowable culture medium from the Cells separated, the interferon formed obtained from the separated culture medium, a lot of fresh lymphoblast cells the remaining infected Cells are added and the mixture of the fresh and the remaining (remaining) cells during a period suitable for the formation of interferon is increased, and that the production stage is repeated as often as desired.

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erzielten Vorteile liegen in der bereits erwähnten Tatsache, daß eine getrennte Herstellungsanlage für den Virus nicht mehr erforderlich ist und daß während des Verlaufes des Verfahrens eine 100-fache Zunahme der Bildung an Interferon im Vergleich zu der Anfangsstufe auftritt. The achieved by the method according to the invention Advantages lie in the fact already mentioned that a separate production facility for the virus is no longer required and that during the course of the process a 100-fold increase in Formation of interferon occurs compared to the initial stage.

Es sei darauf hingewiesen, daß die Fähigkeit von Masern-Viren, die Interferon-Bildung zu induzieren, als solche bereits bekannt war (vgl.z.B. E. De Maeyer et"al, Proc.Soc.Exp.Biol.Med." 107, 573 - 578 (1961)), daß diese bisher jedoch nicht auf Lymphoblast-ZellenIt should be pointed out that the ability of measles viruses to induce interferon formation was already known as such (cf., for example, E. De Maeyer et "al, Proc.Soc.Exp.Biol.Med." 107, 573-578 (1961)) that this has so far not been due to lymphoblast cells

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angwendet worden ist. Andererseits war es bereits bekannt, daß bestimmte Stämme des Masern-Virus in Lymphoblastoid-Zellenformen vermehrt werden können (vgl. z.B.M.R. Gallagher et al, "J.Immunol."116, 1084 - 1088 (1976)), daß daraus jedoch keine Schlußfolgerungen in bezug auf die Möglichkeit einer Interferon-Herstellung auf halbkontinuierlichem Wege gezogen wurden.has been applied. On the other hand, it was already known that certain strains of the measles virus can be propagated in lymphoblastoid cell forms (see, for example, MR Gallagher et al, "J. Immunol." 116 , 1084-1088 (1976)), but that no conclusions can be drawn from this in in relation to the possibility of interferon production on a semi-continuous route.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man von jeder beliebigen Lymphoblastoid Zellenform ausgehen, obgleich diejenige vom Namalva CL-8-Typ bevorzugt ist. Solche Zellen können leicht in Suspension vermehrt werden, wobei zu diesem Zweck irgendein geeignetes flüssiges bzw. fließfähiges Medium, wie z.B. das Eagle-Medium (vgl. "Science", 130, 432 (1959)), das als Kulturmedium besonders geeignet ist, verwendet werden kann. Für die Kultivierung der Zellen kann eine übliche Vorrichtung verwendet werden.When carrying out the method according to the invention, any lymphoblastoid cell shape can be assumed, although that of the Namalva CL-8 type is preferred. Such cells can easily be multiplied in suspension, any suitable liquid or flowable medium, such as, for example, Eagle medium (cf. "Science", 130 , 432 (1959)), which is particularly suitable as a culture medium, being used for this purpose can be. A conventional device can be used for culturing the cells.

Als Virus kann der Masern-Virus bevorzugt verwendet werden, geeignet sind aber auch der Parainfluenza-Virus I, II und III, der Mumps-Virus, andere Viren der Paramyxo- und Pseudomyxo-Gruppe, der Semliki
Forest-Virus und andere Viren der Toga-Gruppe. WieThe measles virus can preferably be used as the virus, but the parainfluenza virus I, II and III, the mumps virus, other viruses of the paramyxo and pseudomyxo group, the semliki, are also suitable
Forest virus and other toga group viruses. As

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angegeben, muß mit diesem Virus nur einmal eine Inokuluierung (Impfung) in der Anfangsstufe durchgeführt werden, danach vermehrt sich der Virus jeweils in den Zellen selbst und er wird von den bereits vorhandenen Zellen auf die während jeder Produktionsperiode zugesetzten frischen Zellen übertragen.indicated, an inoculation (vaccination) with this virus only needs to be carried out once in the initial stage afterwards the virus multiplies in the cells themselves and it is removed from the already existing ones Cells transferred to the fresh cells added during each production period.

In der Anfangsstufe des Verfihrens werden die Lymphoblast-Zellen in dem flüssigen bzw. fließfähigen Medium mit dem Virus inokuliert (geimpft). Die Menge des Virus kann genau gleich der Dosis sein, die zum Infizieren aller Zellen erforderlich ist, sie kann aber auch um den Faktor 10 höher oder geringer sein. Dann werden die so infizierten Zellen eine gewisse Zeit lang vermehrt zur Bildung von Interferon. Die Dauer der Kultivierungsperiode kann stark variieren, beispielsweise 3 bis 5 Tage betragen, im Falle des Masern-Virus wird jedoch vorzugsweise eine Dauer von 3 Tagen angewendet.In the initial stage of the procedure, the lymphoblast cells become in the liquid or flowable medium with the Virus inoculated (vaccinated). The amount of virus can be exactly the same as the dose needed to infect all cells is required, but it can also be higher or lower by a factor of 10. Then the so infected Cells proliferate for a period of time to produce interferon. The length of the cultivation period can be strong vary, for example 3 to 5 days, in the case of the measles virus, however, a duration of Applied for 3 days.

In der darauffolgenden Produktionsstufe wird zuerst das Kultivierungsmedium von den Zellen getrennt, was einfach durch Sedimentation der Zellen und Absaugen der Flüssigkeit erfolgen kann. Aus dem abgetrennten Kultivierungsmedium kann dann das gdildete Interferon gewonnen (isoliert) werden. Anschließend werden frische Lymphoblast-Zellen in einemIn the subsequent production stage, the Culture medium is separated from the cells, which can be done simply by sedimentation of the cells and aspiration of the liquid can be done. The interferon formed can then be obtained (isolated) from the separated cultivation medium. It then turns fresh lymphoblast cells into one

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• II».• II ».

flüssigen bzw. fließfähigen Medium den restlichen (zurückbleibenden) infizierten Zellen zugesetzt, um so die im Verlaufe der Kultivierung abgestorbenen Zellen zu ersetzen. Die Menge der frischen Zellen ist im allgemeinen etwas geringer als die Menge der in der Anfangsstufe verwendeten Zellen, in einigen Fällen kann sie aber auch etwas höher sein. Die Mischung aus den frischen und restlichen Zellen wird dann in dem flüssigen bzw. fließfähigen Medium eine gewisse Zeit lang kultiviert (vermehrt), wobei erneut Interferon gebildet wird. Die Dauer dieser Kultivierungsperiode kann wiederum 3 bis 5, vorzugsweise 3 Tage betragen.liquid or flowable medium the remaining (remaining) infected cells are added to the cells that have died in the course of cultivation to replace. The amount of fresh cells is generally somewhat less than the amount of cells used in the initial stage, in some cases it may be but also be a little higher. The mixture of the fresh and remaining cells is then placed in the liquid or The flowable medium is cultured (increased) for a certain period of time, whereby interferon is formed again. the The duration of this cultivation period can again be 3 to 5, preferably 3 days.

Dann werden die verschiedenen Schritte der Herstellungsstufe (die Abtrennung des flüssigen bzw. fließfähigen Kultivierungsmediums, die Zugabe von frischen Zellen und die Kultivierung des Zellengemisches) beliebig oft wiederholt. Then the various steps of the manufacturing stage (the separation of the liquid or flowable Culture medium, the addition of fresh cells and the cultivation of the cell mixture) repeated as often as desired.

Im Verlaufe jeder Produktionsstufe wird wiederum Interferon von den Zellen gebildet, ohne daß eine weitere Inokulierung (impfung) mit dem Virus erforderlich ist. Darüber hinaus steigt die Interferon-Bildung schnell auf das 100-fache der Bildung in der Anfangsstufe an. Dies zeigt an, daß der Virus jedes Mal durch die restlichen (zurückbleibenden) Zellen auf die frischen Zellen übertragen wird und daß auch eine vorteilhafte Änderung der Eigenschaften des Virus auftritt.In the course of each production stage, interferon is used again formed by the cells without the need for further inoculation (vaccination) with the virus. About that In addition, the interferon production increases rapidly to 100 times that in the initial stage. this shows indicated that the virus was transferred to the fresh cells each time through the remaining (remaining) cells and that there is also a beneficial change in the properties of the virus.

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. /15-. / 15-

Das in jeder Stufe abgetrennte Kultivierungsmedium kann dann aufgearbeitet werden, indem man zuerst den darin enthaltenen Virus inaktiviert. Dies kann beispielsweise durch Inkubieren bei einem stark sauren pH-Wert für einen Zeitraum von einigen Tagen erfolgen. Die dabei erhaltene Flüssigkeit kann als solche als Interferon-Lösung verwendet werden und erforderlichenfalls kann sie konzentriert (eingeengt) werden. Ihr Gehalt an Interferon kann auf übliche Weise bestimmt werden.The culture medium separated in each stage can then be worked up by first inactivates the virus it contains. This can be done, for example, by incubating at a strong acidic pH for a period of several days. The resulting liquid can be used as such as an interferon solution and if necessary it can be concentrated (concentrated) will. Your interferon content can be determined in the usual way.

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. The invention is illustrated in more detail by the following example, without, however, being restricted thereto.

Beispiel AusgangsmaterialienExample raw materials

Zur Herstellung der Lymphoblast-Zellen wurde die Namalva CL-8- Form der Firma Karolinska Sjukhuset, Stockholm, Schweden, verwendet. Sie wurden in einem Eagle-Medium in Suspensioiygehalten mit nicht-essentiellen Aminosäuren und Antibiotika und darüber hinaus mit 2 Millimol Glutamin, 10% fötalem Rinderserum, das durch Wärme inaktiviert worden war (30 Minuten bei 56°CX 7,5 Millimol N-<Hydroxyäthyl)piperazin-N'-2-Äthansulfonsäure (HEPES), 5 Millimol N-(Trishydroxymethyl)methyl-2-aminoäthansulfonsSure (TES) und 5 Millimol 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS),The Namalva CL-8 form from Karolinska Sjukhuset, Stockholm, Sweden, was used to produce the lymphoblast cells. They were suspended in an Eagle medium with non-essential amino acids and antibiotics and in addition with 2 millimoles of glutamine, 10% fetal bovine serum which had been inactivated by heat (30 minutes at 56 ° CX 7.5 millimoles of N- <hydroxyethyl ) piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES), 5 millimoles of N- (trishydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid (TES) and 5 millimoles of 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS),

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und mit 8 M NaOH wurde der pH-Wert auf 7,2 erhöht. Die Kultivierung der Zelle erfolgte in stationären Flaschen vom T75-Typ (Falcon Hastics, Oxnard, Kalifornien/USA) oder in 1,9 1-Flachen, die mit einer Geschwindigkeit einer halben Umdrehung pro Minute auf einer Rollacel-Apparatur (New Brunswick Scientific Corporation, New Brunswick, N.J./USA) gedreht wurden.and with 8 M NaOH the pH was raised to 7.2. The cell was cultivated in stationary bottles of the T75 type (Falcon Hastics, Oxnard, California / USA) or in 1.9 1 areas with a Speed of half a revolution per minute on a Rollacel apparatus (New Brunswick Scientific Corporation, New Brunswick, N.J./USA).

Als Virus wurde ein Masern-Virus in Form eines Vakzine-Stammes (eines Edmonston-Enders-Stammes) der Attenuvax-Marke (Merck, Sharp & Dohme) verwendet. Er wurde in Lymphoblast-Zellen gezüchtet. Sein Infizierungsvermögen wurde mittels Vero-Zellen (CCL-81) (Flow Laboratories, Irvine, Schottland) bestimmt und in CCID₁. /ml ausgedrückt. As the virus, a measles virus in the form of a vaccine strain (an Edmonston-Enders strain) of the Attenuvax brand (Merck, Sharp & Dohme) was used. It was grown in lymphoblast cells. Its ability to infect was determined using Vero cells (CCL-81) (Flow Laboratories, Irvine, Scotland) and in CCID ₁ . / ml expressed.

Dur-clifiihruiig_des_Vexf ahrerisDur-clifiihruiig_des_Vexf ahreris

Zu Beginn (am Tage O) wurden 4 ml Masern-Virus (10 ' CCID- /ml) zu 800 ml Lymphoblast-Zelie η In dem Eagle-Medium (10,5 Zellen/ml) zugegeben. Die Mischung wurde auf 4 1,9 1-Rotationsflaschen verteilt und dann bei 37°C in der RoIlace11-Apparatur inkub-iert. Am Tage 3 ließ man die Zellen ausfallen und die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, danach wurden 700 ml frische Zellen mit Medium zugegeben und das Ganze wurde wiederumAt the beginning (on day 0) 4 ml measles virus (10 'CCID- / ml) were added to 800 ml lymphoblast cells η In the Eagle medium (10.5 cells / ml) was added. The mixture was divided into 4 1.9 liter rotary bottles and then incubated at 37 ° C in the RoIlace11 apparatus. At the On day 3 the cells were allowed to precipitate and the supernatant was removed, after which 700 ml became fresh Cells with medium were added and the whole was again

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bei 37°C inkubiert. Die abgetrennte Flüssigkeit (600 ml) wurde mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf pH2 gebracht und 5 Tage lang bei 4 C aufbewahrt, um den Virus zu inaktivieren. Auf diese Weise erhielt man 600 ml rohes Interferon, dessen Qualität auf übliche Weise bestimmt wurde. Am Tage 6 und an jedem nachfolgenden dritten Tage wurden die Verfahren wiederholt.incubated at 37 ° C. The separated liquid (600 ml) was treated with concentrated hydrochloric acid brought to pH2 and stored at 4 C for 5 days to inactivate the virus. To this In this way, 600 ml of crude interferon were obtained, the quality of which was determined in the usual way. On day 6 and on every subsequent third day the procedures were repeated.

Bestimmung des InterferonsDetermination of interferon

Der Interferon-Gehalt in dem Produkt wurde mittels einer Mikrotitfer - Platte mit flachem Boden (Falcon Eastics, Oxnard, Kalifornien/USA) bestimmt. Aus dem Produkt wurden aufeinanderfolgende dreifache Verdünnungen hergestellt, danach wurden Proben in doppelter Ausfertigung in die Vertiefungen dev^ikrotiter- Platte (100 jul pro Vertiefung) eingeführt. Zum Vergleich wurde ein Labor-Standard von Human-Fibroblast-Interferon verendet, der auf die gleiche Weise behandelt worden war_e In jede Vertiefung wurden 100 Jul Zellensuspension (6 χ 10 Zellen/ml) einer Humantumor-Zellenart CCL-23 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland/USA) eingeführt. Nach 6-stündiger Inkubation bei 37 C wurden die Kulturenmit 50" yttl vesikularem Stomatitis-Virus infiziert entsprechend 100 TCID-- pro Mikrotiter- Vertiefung (eigene Produktion). The interferon content in the product was determined using a microtiter plate with a flat bottom (Falcon Eastics, Oxnard, California / USA). From the product of three successive fold dilutions were made, and then samples were introduced in duplicate into the wells dev ^ ikrotiter- plate (100 jul per well). For comparison, a laboratory standard of human fibroblast interferon was found dead, which had been treated in the same manner _e each well 100 July cell suspension (6 χ 10 cells / ml) of a human tumor cell type CCL-23 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland / USA). After incubation at 37 C for 6 hours, the cultures were infected with 50 "yttl vesicular stomatitis virus corresponding to 100 TCID- per microtiter well (own production).

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■tf·■ tf

Nach 24-stündiger Inkubation bei 37 C wurden die Zellen mit einer mit Phosphat gepufferten NaCl-Lösung (Dulbecco und Vogt, 3. Exp. Med., 99, 167 - 182 (1954)) gewaschen und mit einer 0,5%igen Kristallviolett-Lösung (Merck, Darmstadt, BRD) angefärbt. Das Kristallviolett wurde in einer Mischung aus Formaldehyd, Äthanol und einer 0,25%igen NaCl-Lösung in einem Verhältnis von 1 : 10 : 20 gelöst. Alle Ergebnisse wurden mit einem MRC-Vergleichspräparat 69/19 (vgl. das Buch von Finster) verglichen und ausgedrückt in Vergleichseinheiten/ml (Ref. U/ml).After incubation at 37 ° C. for 24 hours, the cells were washed with a phosphate-buffered NaCl solution (Dulbecco and Vogt, 3rd Exp. Med., 99, 167 - 182 (1954)) washed and washed with a 0.5% crystal violet solution (Merck, Darmstadt, FRG) colored. The crystal violet was in a mixture of formaldehyde, ethanol and a 0.25% NaCl solution in a ratio of 1:10:20. All results were with a MRC comparator preparation 69/19 (see Finster's book) compared and expressed in comparison units / ml (Ref. U / ml).

ErgebnisseResults

Die dabei erzielten Ergebnisse und die Menge der jedesmal zugegebenen frischen Zellen sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben. Aus dieser Tabelle geht hervor, daß im Verlaufe des Verfahrens eine 100-fache Zunahme der Interferon-Bildung auftrat, wobei das Produkt der Anfangs-The results obtained and the amount of fresh cells added each time are as follows Given in the table. From this table it can be seen that in the course of the process there was a 100-fold increase in Interferon formation occurred, with the product of the initial

stufe nur geringe Mengen Interferon (10 Ref. U/ml) enthielt, während diese Menge in den Produkten der nach-level contained only small amounts of interferon (10 Ref. U / ml), while this amount in the products of the subsequent

4 folgenden Stufen schnell bis auf einen Wert von 104 following levels quickly up to a value of 10

Ref. U/ml anstieg. Dieses Phänomen ist auf eine Änderung der Virus-Population und auf die Übertragung des Masern-Virus von Zelle zu Zelle zurückzuführen.Ref. U / ml increase. This phenomenon is due to a change in the virus population and to the transmission of the measles virus from cell to cell.

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TabelleTabel

Ergebnisse der Herstellung von Lymphoblast-InterferonResults of Lymphoblast Interferon Production

οο 33 tf»tf » cöcö 66th 1010 ■ο*■ ο * 1414th ee φφ 1717th 2121st 2424 2727 3131 3535 3030th

Volumen (ml)Volume (ml)

600600

800800

600600

600600

700700

500500

500500

575575

550550

550550

550550

Produktionproduction

Zugabe von frischen ZellenAddition of fresh cells

2.02.0

2.02.0

3.53.5

4.24.2

4.44.4

4.04.0

4.14.1

4.24.2

4.14.1

4.1 ■ Gesamteausbeute Volumen (log₁₀Ref.U)4.1 ■ Total yield volume (log ₁₀ Ref.U)

bei ,„.Zellen/mlat, ". cells / ml

7QO 900 800 800 600 600 .600 600 GOO 600 6007QO 900 800 800 600 600 .600 600 GOO 600 600

10⁶ 10 ⁶

2 X 10^U 2 X 10 ^U

10⁶ 10⁶ 10 ⁶ 10 ⁶

1.5 x 10^ß 1.5 x 10 ^ß

10⁶ 10 ⁶

1.4 χ1.4 χ

0.9 x 10^L 0.0 x0.9 x 10 ^L 0.0 x

Claims (12)

PatentansprücheClaims 1. Verfahren zur Herstellung von Interferon durch Kultivieren von Lymphoblast-Zellen, die mit einem die Interferonbildung induzierenden Virus inokuliert (geimpft) sind, dadurch gekennzeichnet , daß man in einer Anfangsstufe Lymphoblast-Zellen in einem flüssigen bzw. fließfähigen Medium mit einem geeigneten, die Interferonbildung induzierenden Virus inokuliert (impft), der an seiner Vermehrung nicht gehindert1. A process for the production of interferon by culturing lymphoblast cells which are inoculated (inoculated) with a virus which induces interferon formation, characterized in that in an initial stage lymphoblast cells are in a liquid or flowable medium with a suitable which Interferon formation-inducing virus is inoculated (vaccinated), which is not prevented from multiplying 809840/0927809840/0927 Baywitcht Hypothek·«- unt WMutlbank MOnehan »«7004451« (BLZ 70020001) · PoiUchackkonlo München 74133-SQ2 (BU 700100(0) Baywitcht mortgage · "- unt WMutlbank MOnehan""7004451" (BLZ 70020001) · PoiUchackkonlo Munich 74133-SQ2 (BU 700100 (0) ist, und daß man die auf diese Weise infizierten Zellen während einer für die Interferonbildung ausreichenden Zeitspanne vermehrt, und daß man dann in einer Produktionsstufe das flüssige bzw. fließfähige Kultivierungsmedium von den Zellen trennt, das gebildete Interferon aus dem abgetrennten Kultivierungsmedium gewinnt, frische Lymphoblast-Zellen in einem flüssigen bzw. fließfähigen Medium den restlichen infizierten Zellen zusetzt und die Mischung aus frischen und restlichen Zellen während eines für die Interferonbildung ausreichenden Zeitraumes vermehrt, und daß man die Produktionsstufe beliebig oft wiederholt.and that the cells infected in this way are multiplied for a period of time sufficient for interferon formation, and that the liquid or flowable culture medium is then separated from the cells in a production stage, the interferon formed is obtained from the separated culture medium, fresh lymphoblasts Cells in a liquid or flowable medium are added to the remaining infected cells and the mixture of fresh and remaining cells is increased for a period of time sufficient for interferon formation, and that the production stage is repeated as often as desired. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lymphoblast-Zellen Human-Lymphoblast-ZeIlen vom Namalva CL-8-Typ verwendet.2. The method according to claim 1, characterized in that the lymphoblast cells used are human lymphoblast cells of the Namalva CL-8 type. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als flüssiges bzw. fließfähiges Medium das Eagle-Medium verwendet.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that there is a liquid or flowable Medium uses the Eagle medium. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Virus den Masern-Virus4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the virus is the measles virus * verwendet. * used. 809840/0927 optimal inspected809840/0927 optimally inspected 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Virus den Mumps-Virus I, Il oder III oder einen anderen Virus der Paramyxo- oder Pseudomyxo-Gruppe verwendet.5. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized characterized in that the virus is the mumps virus I, II or III or another Virus of the Paramyxo or Pseudomyxo group used. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Virus den Semliki-Forest-Virus oder einen anderen Toga-Virus verwendet.6. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the virus is used Semliki Forest Virus or another toga virus used. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Anfangsstufe und in jeder Produktionsstufe die Zellen jeweils 3 bis 5 Tage lang vermehrt.7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that in the initial stage and in each production stage the cells respectively Increased for 3 to 5 days. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen jeweils 3 Tage lang vermehrt.8. The method according to claim 7, characterized in that the cells are each multiplied for 3 days. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das flüssige bzw. fließfähige Kultivierungsmedium durch Ausfällen und Absaugen der Zellen abtrennt.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the liquid or flowable Separating the cultivation medium by precipitating and aspirating the cells. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das Interferon aus dem flüssigen bzw. fließfähigen Kultivierungsmedium10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the interferon from the liquid or flowable culture medium 809840/0927809840/0927 durch Inaktivieren des darin enthaltenen Virus gewinnt.by inactivating the virus it contains wins. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inaktivierung des Virus dadurch bewirkt, daß man ihn 5 Tage lang bei 4 C und pH2 hält.11. The method according to claim 10, characterized in that the inactivation of the virus is effected by that it is kept at 4 C and pH2 for 5 days. 12. Interferon, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 hergestellt worden ist.12. Interferon, characterized in that it is produced by the method according to any one of claims 1 to 11 has been. 809840/0927809840/0927