DE2810264A1 - RUBRADIRIN B ANTIBIOTIC AND METHOD OF ITS OBTAINMENT - Google Patents

RUBRADIRIN B ANTIBIOTIC AND METHOD OF ITS OBTAINMENT

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DE2810264A1
DE2810264A1 DE19782810264 DE2810264A DE2810264A1 DE 2810264 A1 DE2810264 A1 DE 2810264A1 DE 19782810264 DE19782810264 DE 19782810264 DE 2810264 A DE2810264 A DE 2810264A DE 2810264 A1 DE2810264 A1 DE 2810264A1
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Germany
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rubradirin
solvent
silica gel
precipitate
practically pure
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Herman Hoeksema
Fritz Reusser
Donald Richardson Wait
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D498/08—Bridged systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms

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Description

Antibiotikum Rubradirin B und Verfahren zu seiner GewinnungRubradirin B antibiotic and method of obtaining it

Das Antibiotikum Rubradirin und ein mikrobiologisches Verfahren zu seiner Gewinnung sind aus der US-PS 3 335 057 bekannt. The antibiotic rubradirin and a microbiological process for its production are known from US Pat. No. 3,335,057.

Das neue Antibiotikum gemäß der Erfindung, nämlich Rubradirin B, erhält man durch Züchten von Streptomyces achromogenes var. rubradiris DSM 1249 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen. Die aus der US-PS 3 335 057 bekannten Fermentationsbedingungen können auch bei der Gewinnung von Rubradirin B eingehalten werden.The new antibiotic according to the invention, namely rubradirin B, is obtained by growing Streptomyces achromogenes var. rubradiris DSM 1249 in an aqueous nutrient medium under aerobic conditions Conditions. The fermentation conditions known from US Pat. No. 3,335,057 can also be used when obtaining rubradirin B be respected.

Chemische und physikalische Eigenschaften von Rubradirin B:Chemical and physical properties of Rubradirin B:

Molekulargewicht: 795 (ermittelt durch Felddesorptionsmassen-Molecular weight: 795 (determined by field desorption mass

spektroskopie). Elementaranalyse der Verbindung C4oH33N3Oi5: spectroscopy). Elemental analysis of the compound C 4o H 33 N 3 O i5 :

6060 CC. 44th HH 55 NN her. :here. : 5959 ,38, 38 44th ,18, 18 55 ,28, 28 gef. :found : ,25, 25 ,38, 38 ,17, 17th

Fp:> 265°C (unter Zersetzung).Mp:> 265 ° C (with decomposition).

UV-Absorptionsspektrum:UV absorption spectrum:

Die UV-Absorptionsmaxima von Rubradirin B ergeben sich aus Fig. 2:The UV absorption maxima of rubradirin B result from Fig. 2:

In 0,001n methanolischer NaOH:^ {£) : 248 sh (32 060), 303 '(43 450), 345 sh (17 000) , 408 (11 200), 422 sh (10 550).In 0.001N methanolic NaOH: ^ {£): 248 sh (32,060), 303 '(43,450), 345 sh (17,000), 408 (11,200), 422 sh (10,550).

809841/0655809841/0655

In O,O1n methanolischer H3SO4:λ (£): 240 sh (33 000),In O, O1n methanolic H 3 SO 4 : λ (£): 240 sh (33,000),

278 sh (25 000), 283 (25 100), 315 (33 000), 323 sh (32 500).278 sh (25,000), 283 (25,100), 315 (33,000), 323 sh (32,500).

IR-Absorptionsspektren:IR absorption spectra:

Rubradirin B besitzt ein charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum in einer Mineralölaufschwemmung entsprechend Fig. 1. Bei folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in reciproken Zentimetern lassen sich Peaks beobachten:Rubradirin B has a characteristic infrared absorption spectrum in a mineral oil flood as shown in Fig. 1. At the following wavelengths, expressed in reciprocal Peaks can be observed centimeters:

Bandenfrequenz
(Wellenzahl)Band frequency
(Wave number) Intensitätintensity 35603560 MM. 33903390 MM. 32803280 MM. 30803080 WW. 29502950 SS. 29202920 SS. 28502850 SS. 27202720 WW. 26702670 WW. 21702170 WW. 17231723 MM. 16971697 MM. 16801680 MM. 16671667 MM. 16351635 SS. 16121612 SS. 15701570 SS. 15401540 MM. 15081508 MM. 14621462 SS. 14101410 MM. 13771377 SS. 13571357 S, sh (shS, sh (sh

= Schulter)= Shoulder)

809841/0655809841/0655

Intensitätintensity 28102642810264 Bandenfrequenz
(Wellenzahl)Band frequency
(Wave number) SS. 13 2013 20 SS. 13001300 MM. 12831283 MM. 12551255 MM. 12401240 WW. 12151215 MM. 11921192 MM. 1 1621 162 MM. 11501150 MM. 11271127 MM. 11021102 MM. 10981098 MM. 10681068 WW. 10451045 WW. 10321032 WW. 10051005 WW. 967967 WW. 948948 WW. 928928 WW. 890890 WW. 880880 WW. 853853 WW. 825825 WW. 812812 WW. 805805 WW. 800800 WW. 782782 WW. 776776 WW. 760760 MM. 735735 WW. 723723

809841/0656809841/0656

Bandenfrequenz Intensität
(Wellenzahl)Band frequency intensity
(Wave number)

70S70S WW. 698698 WW. 695695 WW. 680680 WW. SS. = stark;= strong; MM. = mittel und= medium and WW. = schwach.= weak.

Rubradirin B besitzt auch in Form eines KBr-Preßlings ein charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum. Bei folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in reciproken Zentimetern, lassen sich Peaks beobachten:Rubradirin B also has a characteristic in the form of a KBr pellet Infrared absorption spectrum. At the following wavelengths, expressed in reciprocal centimeters, peaks can be found watch:

Bandenfrequenz
(Wellenzahl)Band frequency
(Wave number) Intensitätintensity 35603560 MM. 33803380 MM. 32803280 MM. 30803080 WW. 29702970 WW. 29302930 WW. 28502850 WW. 21702170 WW. 17241724 MM. 16981698 SS. 16681668 MM. 16381638 SS. 16151615 SS. 15701570 SS. 15401540 MM.

809841/06SS809841 / 06SS

28102642810264 Intensitätintensity Bandenfrequenz
(Wellenzahl)Band frequency
(Wave number) MM. 15081508 SS. 14601460 MM. 14101410 SS. 13821382 SS. 13231323 SS. 12981298 SS. 12811281 MM. 12401240 MM. 11951195 SS. 11631163 MM. 11251125 MM. 11021102 MM. 10941094 MM. 10651065 MM. 10481048 MM. 10301030 MM. 10051005 MM. 968968 WW. 947947 WW. 927927 WW. 890890 WW. 877877 WW. 852852 WW. 825825 WW. 810810 WW. 805805 WW. 800800 WW. 792792 WW. 781781 MM. 758758 MM. 732732 MM. 708708 MM. 690690 MM. 680680

809841/0666809841/0666

28102042810204

LöslichkeitsverhalteniSolubility behavior i

Die neue Verbindung gemäß der Erfindung ist in wäßrigen Basen bei pH-Werten über 7,5 löslich, in Wasser bei pH-Werten unter 6,0 unlöslich. Ferner ist sie in kurzkettigen bzw. niedrigen Alkylamiden,z.B. Dimethylformamid und Dimethylacetamid, sowie in Dimethylsulfoxid und mit Wasser gesättigtem Äthylacetat, löslich. In kurzkettigen bzw. niedrigen Alkoholen, wie Methanol und Äthanol, Chloroform und Tetrahydrofuran ist sie sehr schwach löslich. In Kohlenwasserstofflösungsmitteln, wie Benzol, Toluol und Älkanen (Pentan bis höhere Alkane) ist sie unlöslich.The new compound according to the invention is soluble in aqueous bases at pH values above 7.5 and in water at pH values below 6.0 insoluble. It is also in short-chain or low-chain Alkylamides, e.g. Dimethylformamide and dimethylacetamide, as well as in dimethyl sulfoxide and ethyl acetate saturated with water, soluble. It is very weak in short-chain or lower alcohols such as methanol and ethanol, chloroform and tetrahydrofuran soluble. It is insoluble in hydrocarbon solvents such as benzene, toluene and alkanes (pentane to higher alkanes).

Antibakterielles Spektrum von Rubradirin B:Antibacterial spectrum of rubradirin B:

Rubradirin B zeigt bei einem Standardscheibenplattentest (12,7 mm Testscheiben) in einer Konzentration von 0,5 mg/ml folgende Inhibierungszonen in Millimetern (mm):Rubradirin B shows in a standard disc plate test (12.7 mm test discs) at a concentration of 0.5 mg / ml following inhibition zones in millimeters (mm):

MikroorganismusMicroorganism xnnxDxerungs zonexnnxDxerungs zone Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus 2626th Sarcina IuteaSarcina Iutea 2929 Mycobacterium aviumMycobacterium avium 2525th Bacillus subtilisBacillus subtilis 00

Beim Testen von Rubradirin B im Rahmen eines Mikroplattenbrühenverdünnungstests unter Verwendung des Mediums BHI (Hirn-Herz-Infusion) ergibt sich folgendes Spektrum:When testing Rubradirin B in a microplate broth dilution test Using the medium BHI (brain-heart infusion) results in the following spectrum:

809841/0655809841/0655

•ΙΟ-• ΙΟ-

MikroorganismusMicroorganism

] νλ·;] νλ ·;

Mindestinhibierungs-Minimum inhibition

konzentrationconcentration

in mcg/mlin mcg / ml

Staphylococcus aureus 284 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Streptococcus hemolyticus Streoptococcus faecalis Escherichia coli Proteus vulgaris Klebsiella pneumoniae Salmonella schottmuelleri Pseudomonas aeruginosa Diplococcus pneumoniaeStaphylococcus aureus 284 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Streptococcus hemolyticus Streoptococcus faecalis Escherichia coli Proteus vulgaris Klebsiella pneumoniae Salmonella schottmuelleri Pseudomonas aeruginosa Diplococcus pneumoniae

UCUC 7676 11 ,5, 5 UCUC 570570 33 ,1,1 UCUC 746746 00 ,78, 78 UCUC 152152 66th ,2, 2 UCUC 694694 > 100> 100 UCUC 4545 > 100> 100 UCUC 9393 > 100> 100 UCUC 5858 >100> 100 UCUC 126126 > 100> 100 UCUC 9595 >100> 100 UCUC 4141 OO ,39, 39

"UC" stellt einen Hinweis auf die Mikroorganismus-Kultursammlung der Anmelderin dar. Die im einzelnen unter den verschiedenen Zahlen abgelegten Mikroorganismus-Kulturen sind auf Anfrage von der Anmelderin erhältlich."UC" is a reference to the applicant's microorganism culture collection. The details under the various Numbers of stored microorganism cultures are available from the applicant on request.

Rubradirin B wird in vivo bei Mäusen getestet. Mit S. aureus infizierte Mäuse erfahren nach subkutaner Verabreichung einer CD50 von 98 mg/kg einen Schutz.Rubradirin B is tested in vivo in mice. Mice infected with S. aureus experience protection after subcutaneous administration of a CD 50 of 98 mg / kg.

Der zur Herstellung des erfindungsgemäßen Rubradirin B verwendete Mikroorganismus ist der bekannte Mikroorganismus Streptomyces achromogenes var. rubradiris DSM 1249. Eine Kultur ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen der Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung mbH, München, Grisebachstraße 8, D-34OO Göttingen hinterlegt und hat dort die Hinterlegungsnummer DSM 1249 erhalten. Die Eigenschaften dieser Kultur ergeben sich aus der US-PS 3 335 057, Spalten 2 bis 4.The microorganism used to produce the rubradirin B according to the invention is the known microorganism Streptomyces achromogenes var. rubradiris DSM 1249. A culture is at the German collection of microorganisms of the Society for Radiation and Environmental Research mbH, Munich, Grisebachstrasse 8, D-34OO Göttingen and has the deposit number there DSM 1249 obtained. The properties of this culture can be found in US Pat. No. 3,335,057, columns 2 to 4.

Die neue Verbindung gemäß der Erfindung erhält man beim submersen Wachsenlassen des sich entwickelnden Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen. Selbstverständlich können zur Herstellung begrenzter Mengen an der erfindungsge-The new compound according to the invention is obtained when the developing microorganism is allowed to grow submerged in an aqueous nutrient medium under aerobic conditions. Of course can for the production of limited amounts of the invention

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mäßen Verbindung auch Oberflächenkulturen in Flaschen herangezogen werden. Der Organismus wird in einem Nährmedium mit einem Kohlenstofflieferanten, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat, und einer Stickstoffquelle, z.B. einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweißartigen oder -haltigen Material, gezüchtet bzw. wachsengelassen. Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glucose, brauner Zucker, Saccharose, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Casein, Brennereirückstände, tierische Peptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle und dergleichen. In vorteilhafter Weise können die verschiedensten Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz gelangen. Spurenmetalle, wie Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, brauchen dem Fermentationsmedium nicht zugesetzt zu werden, da als Bestandteile des Mediums Leitungswasser und ungereinigte Zusätze zum Einsatz gelangen. Die Bildung der erfindungsgemässen Verbindung läßt sich bei jeder beliebigen Temperatur, die ein akzeptables Mikroorganismuswachstum ermöglicht, beispielsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 18° und 4O°C, vorzugsweise zwischen etwa 26 und 30 C, bewerkstelligen. Üblicherweise dauert die optimale Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung etwa 2 bis 10 Tage. Das Fermentationsmedium liegt normalerweise recht nahe am Neutralpunkt oder während der Fermentation auf der alkalischen Seite. Der End-pH-Wert hängt teilweise von den gegebenenfalls vorhandenen Puffern und teilweise vom Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums, der zweckmäßigerweise vor der Sterilisation auf 6 bis 8 eingestellt wurde, ab.Surface cultures in bottles are also used for the appropriate connection will. The organism is in a nutrient medium with a carbon supplier, for example an assimilable one Carbohydrate, and a source of nitrogen, e.g., an assimilable one Nitrogen compound or a protein-like or protein-containing material, cultured or grown. Preferred Carbon suppliers are glucose, brown sugar, sucrose, Glycerin, starch, corn starch, lactose, dextrin, molasses and the like. Preferred nitrogen suppliers are corn steep liquor, Yeast, autolyzed brewer's yeast with milk solids, soybean meal, cottonseed meal, corn meal, Milk solids, pancreatic digestion products of casein, distillery residues, animal peptone liquids, meat and bone debris and the like. The most diverse combinations of these carbon and nitrogen suppliers are used. Trace metals, such as zinc, magnesium, manganese, cobalt, iron and the like do not need to be added to the fermentation medium, since tap water and uncleaned additives are used as components of the medium. The formation of the invention Compound can be at any temperature that allows acceptable microorganism growth, for example at a temperature between about 18 ° and 40 ° C, preferably between about 26 and 30 C. The optimal preparation of the compound according to the invention usually takes a long time about 2 to 10 days. The fermentation medium is usually quite close to the neutral point or during fermentation on the alkaline side. The final pH depends partly on the buffers that may be present and partly on the Initial pH of the culture medium, which is expediently before the sterilization was set to 6 to 8.

Wenn das Wachstum bzw. die Züchtung in großen Kesseln und Tanks erfolgt, wird der Mikroorganismus zur Beimpfung vorzugsweise inIf the growth or cultivation takes place in large vessels and tanks, the microorganism for inoculation is preferably in

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vegetativer Form, und nicht in Sporenform, zum Einsatz gebracht. Dies deshalb, um eine ausgeprägte Verzögerung bei der Herstellung der neuen Verbindung und die damit einhergehende unzureichende Ausnutzung der Anlage zu vermeiden. Es ist folglich zweckmäßig, ein vegetatives Impfgut in einer Nährbrühenkultur herzustellen, indem man die Brühenkultur mit einem aliquoten Teil Boden oder einer Kultur auf einem geneigten Agar beimpft. Wenn man ein junges, aktives, vegetatives Impfgut erhalten hat, wird dieses aseptisch in große Kessel oder Tanks überführt. Das Medium, in dem das vegetative Impfgut hergestellt wird, kann aus demselben oder einem anderen Medium, wie bzw. als es bei der Herstellung der neuen Verbindung zum Einsatz gelangt, bestehen, solange nur ein gutes Wachstum des Mikroorganismus sichergestellt ist.vegetative form, and not in spore form, brought into use. This is because of a pronounced delay in the To avoid establishing the new connection and the associated inadequate utilization of the system. It is consequently expedient to produce a vegetative inoculum in a nutrient broth culture by comparing the broth culture with an aliquot Inoculated part of soil or a culture on an inclined agar. When you receive a young, active, vegetative vaccine it is aseptically transferred into large kettles or tanks. The medium in which the vegetative inoculum is produced may be from the same or a different medium as or as used in the establishment of the new connection as long as good growth of the microorganism is ensured.

Zum Isolieren und Reinigen von Rubradirin B kann man sich der verschiedensten Maßnahmen, z.B. Lösungsmittelextraktion, Flüssig/Flüssig-Verteilung in einer Crackvorrichtung, Verwendung von Adsorptionsmitteln, Fällung aus der Brühe bei sauren pH-Werten, Kristallisieren aus Lösungsmitteln, bedienen. Zur Rückgewinnung werden saure Fällungsmaßnahmen bevorzugt, da sie weniger zeitaufwendig und preisgünstiger sind und höhere Ausbeuten ermöglichen.Various measures can be taken to isolate and purify Rubradirin B, e.g. solvent extraction, Liquid / liquid distribution in a cracking device, use of adsorbents, precipitation from the broth at acidic pH values, crystallization from solvents. To the Acid precipitation measures are preferred for recovery because they are less time-consuming, less expensive and have higher yields enable.

Bei einem bevorz'ugten Verfahren wird Rubradirin B aus seinem Kulturmedium durch Abtrennen des Mycels und nicht-gelöster Feststoffe auf übliche Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, Ausfällen des Antibiotikums aus der filtrierten Brühe durch Einstellen des pH-Werts auf etwa 4,0 mit Schwefelsäure und Abfiltrieren des gebildeten Niederschlags unter Verwendung eines Filterhilfsmittels, wie Dicalite, gewonnen. Der erhaltene Filterkuchen wird mit Aceton oder Äthylacetat eluiert, worauf die verschiedenen Eluate zu einem wäßrigen Gemisch eingeengt und gefriergetrocknet werden. Das getrocknete Material wird mit Aceton oder Äthylacetat ausgelaugt.In a preferred method, rubradirin B is removed from its culture medium by separating the mycelium and undissolved Solids in the usual way, for example by filtering or centrifuging, precipitating the antibiotic from the filtered broth by adjusting the pH to about 4.0 with sulfuric acid and filtering off the precipitate formed obtained using a filter aid such as Dicalite. The filter cake obtained is eluted with acetone or ethyl acetate, whereupon the various eluates become an aqueous one The mixture is concentrated and freeze-dried. The dried material is leached with acetone or ethyl acetate.

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worauf die Lösungsmittelphase eingeengt und dann mit 4 Volumina Skellysolve B (isomere Hexane) verdünnt wird. Der Rubradirin-Komplex wird abfiltriert und getrocknet. Zur Gewinnung von praktisch reinem Rubradirin B kann das Roh-Rubradirin B auf Silikagel chromatographiert werden. Ein zu diesem Zweck geeignetes Lösungsmittelsystem besteht aus Chloroform und Methanol im Verhältnis 97:3. Andererseits erhält man praktisch reines Rubradirin B r indem man das Roh-Rubradirin B auf einer Verteilungssäule aus Diatomeenerde, die mit einer wäßrigen 0,2 m Natriumcarbonat/Bicarbonat-Lösung auf einem pH-Wert von 10 gepuffert ist, chromatographiert. Das Entwickeln der Säule erfolgt zweckmäßigerweise mit einem Lösungsmittelsystem aus Äthylacetat, 1-Butanol und einem Puffer im Verhältnis 2:2:1 .whereupon the solvent phase is concentrated and then diluted with 4 volumes of Skellysolve B (isomeric hexanes). The rubradirin complex is filtered off and dried. To obtain practically pure rubradirin B, the crude rubradirin B can be chromatographed on silica gel. A solvent system suitable for this purpose consists of chloroform and methanol in a ratio of 97: 3. On the other hand, practically pure rubradirin B r is obtained by chromatographing the crude rubradirin B on a distribution column made of diatomaceous earth, which is buffered to a pH of 10 with an aqueous 0.2 M sodium carbonate / bicarbonate solution. The column is expediently developed with a solvent system consisting of ethyl acetate, 1-butanol and a buffer in a ratio of 2: 2: 1.

Salze des Rubradirin B erhält man aus der freien Säure Rubradirin B und einer anorganischen oder organischen Base. Die Rubradirin B-Salze erhält man beispielsweise durch Suspendieren von Rubradirin B in Form der freien Säure in Wasser, Zugabe einer verdünnten Base bis zu einem pH-Wert (des Gemische) von etwa 7 bis 8 und Gefriertrocknen des Gemischs zu einem trockenen Rückstand aus Rubradirin B-Salz. Auf diese Weise lassen sich beispielsweise die Natrium-, Kalium- und Calciumsalze des Rubradirin B herstellen. Andere herstellbare Rubradirin B-Salze sind die Salze mit organischen Basen, z.B. primären, sekundären und tertiären Mono-, Di- und Polyaminen. Auch hierbei kann man sich üblicher bekannter Maßnahmen bedienen.Rubradirin B salts are obtained from the free acid Rubradirin B and an inorganic or organic base. The rubradirin B salts are obtained, for example, by suspending rubradirin B in the form of the free acid in water, Add a dilute base to pH (the mixture) of about 7 to 8 and freeze-dry the mixture to one dry residue from rubradirin B salt. In this way, for example, the sodium, potassium and calcium salts of Rubradirin B. Other manufacturable rubradirin B salts are the salts with organic bases, e.g. primary, secondary and tertiary mono-, di- and polyamines. Here too one can use the usual known measures.

Die neue Verbindung gemäß der Erfindung, nämlich Rubradirin B, inhibiert das Wachstum der folgenden Organismen: Staphylococcus aureus, Diplococcus pneumoniae, Sarcina lutea, Mycobacterium avium und Streptococcus hemolyticus. Folglich eignet sich die neue Verbindung als Desinfektionsmittel für die verschiedensten zahnmedizinischen und medizinischen, mit Staphylococcus aureus verunreinigten Geräten. Ferner eignet esThe new compound according to the invention, namely rubradirin B, inhibits the growth of the following organisms: Staphylococcus aureus, Diplococcus pneumoniae, Sarcina lutea, Mycobacterium avium and Streptococcus hemolyticus. Consequently the new compound is suitable as a disinfectant for a wide variety of dental and medical, with Staphylococcus aureus contaminated equipment. It is also suitable

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sich als Desinfektionsmittel für mit diesem Organismus verunreinigten gewaschenen und gestapelten Nahrungsmitteln, Weiterhin eignet sich Rubradirin B zur Bekämpfung des als Erreger für generalisierte Tuberkulose bei Vögeln und Kaninchen bekannten Organismus Mycobacterium avium.as a disinfectant for those contaminated with this organism washed and stacked food, Rubradirin B is also suitable for combating as a pathogen for generalized tuberculosis in birds and rabbits known organism Mycobacterium avium.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen. Sämtliche %-Angaben bedeuten Gewichtsprozent, bei Lösungsmittelgemischen Volumenprozent.The following examples are intended to illustrate the invention in more detail. All percentages are percentages by weight and percentages by volume in the case of solvent mixtures.

Beispiel 1example 1

A. Fermentation A. Fermentation

Kiiu« ijt'iH'lcjti« Aijiirzubori'l I iunj von HtropLomycou uchromoyeneu v<ar. rubradiris DSM 1249 dient zum Beimpfen einer Reihe von 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 100 ml eines sterilen Saatmediums aus folgenden Bestandteilen:Kiiu «ijt'iH'lcjti« Aijiirzubori'l I iunj by HtropLomycou uchromoyeneu v <ar. rubradiris DSM 1249 is used to inoculate a series of 500 ml Erlenmeyer flasks with 100 ml of sterile flasks each Seed medium from the following components:

Glucosemonohydrat 25 g/lGlucose monohydrate 25 g / l

handelsübliches Baumwollsaatmehlcommercial cottonseed meal

technischer Reinheit 40 g/ltechnical purity 40 g / l

mit Leitungswasser aufgefüllt auf 1 1.made up to 1 1 with tap water.

Die Kolben werden 3 Tage lang bei einer Temperatur von 28 C auf einem mit 250 Upm umlaufenden Drehrüttler inkubiert.The flasks are left on for 3 days at a temperature of 28 C. incubated with a rotary shaker rotating at 250 rpm.

5 % in der geschilderten Weise hergestellter Saatimpfstoff werden zum Beimpfen einer Reihe von 500 ml-Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 100 ml eines sterilen Fermentationsmediums aus folgenden Bestandteilen:5% seed vaccine produced in the manner described for inoculating a series of 500 ml Erlenmeyer flasks with 100 ml each of a sterile fermentation medium consisting of the following components:

Stärke 10 g/lStarch 10 g / l

Maiseinweichflüssigkeit 20 g/lCorn steep liquor 20 g / l

Brennereirückstände 15 g/lDistillery residues 15 g / l

Mg (NO3)2-6H2O 3,8 g/lMg (NO 3 ) 2 -6H 2 O 3.8 g / l

mit Leitungswasser aufgefüllt auf 1 1made up to 1 1 with tap water

809841/065$809841/065 $

herangezogen.used.

Das Fermentationsmedium besitzt vor der Sterilisation einen pH-Wert von 7,2.The fermentation medium has a pH of 7.2 before sterilization.

Die Fermentatxonskolben werden bei einer Temperatur von 28°C auf einem mit 250 üpm umlaufenden Drehrüttler inkubiert. Nach etwa 3 bis 4 Tage wird der Mikroorganismus auf dem Kolben geerntet. Eine typische Schüttelflaschenfermentierung ist weiter unten skiziert. Der Test wird mit dem Mikroorganismus Sarcina lutea durchgeführt. Hierbei handelt es sich um einen Plattentest mit einem 0,1 m Phosphatpuffer eines pH-Werts von 7,85 als Verdünnungsmittel.The fermentation flasks are kept at a temperature of 28 ° C incubated on a rotary shaker rotating at 250 rpm. After about 3 to 4 days, the microorganism is harvested on the flask. A typical shake bottle fermentation is next sketched below. The test is carried out with the microorganism Sarcina lutea. This is one Plate test with 0.1 M phosphate buffer pH 7.85 as diluent.

Tag Test, biologische Einheit in mlDay test, biological unit in ml

1 Spuren1 tracks

2 1042 104

3 1603 160

4 644 64

BEMERKUNG: Eine biologische Einheit entspricht dem Verdünnungsfaktor der Probe, die eine Inhibierungszone von 20 mm ergibt.NOTE: One biological unit corresponds to the dilution factor of the sample, which has an inhibition zone of 20 mm results.

B. Gewinnung B. Extraction

Die gesamte Brühe aus der beschriebenen Fermentation wird mit 4 % ihres Gewichts an Diatomeenerde aufgeschlämmt und filtriert. Der hierbei erhaltene Filterkuchen wird mit 1/10 Volumen Wasser gewaschen, worauf das Waschwasser der klaren Brühe zugesetzt wird. Nun wird die klare Brühe mit 6n Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und dann mit Hilfe des Filterhilfsmittels Dicalite filtriert. Das Filtrat wird verworfen. Der feuchte Kuchen wird mit Äthylacetat ausgelaugt, worauf die Lö-The entire broth from the fermentation described is slurried with 4% of its weight in diatomaceous earth and filtered. The filter cake obtained in this way is washed with 1/10 volume of water, whereupon the washing water is added to the clear broth will. The clear broth is now adjusted to a pH of 4.0 with 6N sulfuric acid and then with the aid of the filter aid Dicalite filtered. The filtrate is discarded. The moist cake is leached with ethyl acetate, whereupon the solution

809841/0655809841/0655

sungsmittelbase bis zu einer wäßrigen Phase konzentriert wird. Letztere wird gefriergetrocknet. Der Rest wird in Äthylacetat gelöst und mit 4 Volumina Skellysolve B verdünnt. Der hierbei ausgefallene Niederschlag wird gesammelt und getrocknet, er enthält ein Gemisch aus Rubradirin und Rubradirin B.solvent base is concentrated to an aqueous phase. The latter is freeze-dried. The remainder is dissolved in ethyl acetate and diluted with 4 volumes of Skellysolve B. The one here Precipitated precipitate is collected and dried, it contains a mixture of rubradirin and rubradirin B.

C. ReinigungC. Purification

1 g des Rubradirin enthaltenden, in der geschilderten Weise erhaltenen Rohprodukts wird auf 500 g Silikagel G (70 bis 230 mesh), die auf einem pH-Wert von 5,8 gepuffert sind, chromatographiert. Das erste Eluat, das mit 1500 ml Chloroform erhalten wurde, wird verworfen. Danach werden 20 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Röhrchen 201 bis 470 enthalten Rubradirin, was durch Dünnschichtchromatographie ermittelt wurde. Nun wird beim Eluierlösungsmittel auf ein Chloroform/Methanol-Gemisch (97:3) übergegangen. Die Röhrchen 471 bis 510 enthalten ein Gemisch aus Rubradirin und Rubradirin B. Die in dieser Fraktion enthaltenen Feststoffe werden durch Konzentrieren und Fällen in Skellysolve B isoliert. Es werden 310 mg erhalten.1 g of the rubradirin containing, obtained in the manner described The crude product is chromatographed on 500 g of silica gel G (70-230 mesh), which are buffered to a pH of 5.8. The first eluate obtained with 1500 ml of chloroform is discarded. Then 20 ml fractions are collected. Tubes 201-470 contain rubradirin as determined by thin layer chromatography. Well will the eluting solvent changed to a chloroform / methanol mixture (97: 3). Tubes 471-510 contain a mixture from rubradirin and rubradirin B. The solids contained in this fraction are obtained by concentrating and precipitating isolated in Skellysolve B. 310 mg are obtained.

Die vereinigten Feststoffe aus der geschilderten Chromatographie und zwei ähnlichen Chromatographievorgängen, insgesamt 660 mg, werden dann in 30 ml Chloroform gelöst und suspendiert, worauf das Ganze 1 h lang gerührt und dann filtriert wird. Der halbkristalline Niederschlag, nämlich 160 mg, besteht, durch Dünnschichtchromatographie ermittelt, aus praktisch reinem Rubradirin B.The combined solids from the above chromatography and two similar chromatography operations, in total 660 mg, are then dissolved and suspended in 30 ml of chloroform, stirred for 1 hour and then filtered. Of the semi-crystalline precipitate, namely 160 mg, consists of practically pure, determined by thin-layer chromatography Rubradirin B.

Die dünnschichtchromatographisehe Untersuchung bzw. Präparation findet auf Eastman-Silikagel Nr. 6060-Platten mit dem Lösungsmittelsystem Äthylacetat/Aceton/Wasser (8:5:1) als Laufmittel statt. Das biologische Autogramm wird auf mit S. lutea beimpften Schalen gewonnen.. Zur Analyse dienen etwa 0,5 γ Produkt aus dem Herstellungsverfahren und entsprechend geringere Mengen Produkt höherer Reinheit.The thin-layer chromatography analysis or preparation takes place on Eastman silica gel No. 6060 plates with the solvent system ethyl acetate / acetone / water (8: 5: 1) as the mobile phase. The biological autograph is obtained on dishes inoculated with S. lutea. About 0.5 γ product from the manufacturing process and correspondingly smaller amounts of product of higher purity are used for the analysis.

809841/065S809841 / 065S

Die verschiedenen Zubereitungen werden getestet, nachdem sie auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und im Vakuum getrocknet worden waren» Die Verdünnungen erfolgen in Methanol, wobei eine Menge von 0,08 ml auf 12,7 mm Testscheiben, die getrocknet und auf mit S. lutea beimpfte Agarschalen gelegt worden waren, appliziert wird. Die Ergebnisse der Versuche sind in biologischen Einheiten wiedergegeben.The various preparations are tested after they have been adjusted to a pH of 3.0 and dried in vacuo »The dilutions are made in methanol, taking an amount of 0.08 ml on 12.7 mm test disks, which are dried and were placed on agar dishes inoculated with S. lutea, is applied. The results of the experiments are given in biological units.

Beispielexample

Natriumsalz des Rubradirin BRubradirin B sodium salt

25 mg entsprechend Beispiel 1 hergestellten Rubradirin B werden in einigen Tropfen Aceton gelöst, worauf die erhaltene Lösung mit 0,5 ml Wasser und 1 Tropfen 6 h Natriumhydroxid versetzt wird. Danach wird so viel Äther zugegeben, daß das Natriumsalz des Rubradirin B ausfällt.25 mg of rubradirin B prepared according to Example 1 will be dissolved in a few drops of acetone, whereupon 0.5 ml of water and 1 drop of sodium hydroxide are added to the resulting solution will. Then enough ether is added that the sodium salt of rubradirin B precipitates.

Das Rubradirin B besitzt die angenommene StrukturformelThe rubradirin B has the assumed structural formula

CH3 CH 3

OHOH

809841/0655809841/0655

Claims (8)

Henkel, Kern, feiler & HänzelHenkel, Kern, Feiler & Hänzel PatentanwältePatent attorneys THE UPJOHN COMPANY, Kalamazoo, Mich., V,St.A. THE UPJOHN COMPANY , Kalamazoo, Mich., V, St.A. Möhlstraße 37
D-8000 München 80Möhlstrasse 37
D-8000 Munich 80 Tel.: 089/982085-87 Telex: 0529802 hnkld Telegramme: ellipsoidTel .: 089 / 982085-87 Telex: 0529802 hnkld Telegrams: ellipsoid TUC 3471ATUC 3471A - ä MRZ, 1978- ä MAR, 1978 PATENTANSPRÜCHEPATENT CLAIMS 1,. Antibiotikum Rubradirin B, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:1,. Antibiotic Rubradirin B, characterized by the following Characteristics: a) inhibierende Wirkung auf das Wachstum verschiedener Mikroorganismen;a) inhibiting effect on the growth of various microorganisms; b) Löslichkeit in Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und wäßrigen Basen, bei Unlöslichkeit in wäßrigen Säuren und Kohlenwasserstofflösungsmitteln;b) Solubility in dimethylformamide, dimethyl sulfoxide and aqueous bases, if insoluble in aqueous acids and hydrocarbon solvents; c) Elementaranalysenwerte: C = 59,25 %; H = 4,38 %; N = 5,17 %;c) Elemental analysis values: C = 59.25%; H = 4.38%; N = 5.17%; d) ein Molekulargewicht, bestimmt durch Felddesorptionsmassenspektroskopie von 795;d) a molecular weight as determined by field desorption mass spectroscopy of 795; e) ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum entsprechend Fig. 1;e) a characteristic infrared absorption spectrum accordingly Fig. 1; f) ein charakteristisches UV-Absorptionsspektrum entsprechend Fig. 2;f) a characteristic UV absorption spectrum according to FIG. 2; 809841/0655809841/0655 g) einen Fp > 2650C {unter Zersetzung) und h) eine Molekülformel C40H33N3 0-] 5g) an mp> 265 0 C {with decomposition) and h) a molecular formula C 40 H 33 N 3 0 -] 5 2. Rubradirin B nach Anspruch 1 in praktisch reiner Form.2. Rubradirin B according to claim 1 in practically pure form. 3. Rubradirin B entsprechend Anspruch 1 in Form seines Alkalimetall-, Erdalkalimetall- oder Aminsalzes.3. Rubradirin B according to claim 1 in the form of its alkali metal, Alkaline earth metal or amine salt. 4. Rubradirin B nach Anspruch 1 in Form seines Natriumsalzes.4. Rubradirin B according to claim 1 in the form of its sodium salt. 5. Verfahren zur Gewinnung von Rubradirin B aus der unter Verwendung des Mikroorganismus Streptomyces achromogenes var. rubradiris DSM 12'49 durchgeführten Fermentation, dadurch gekennzeichnet, daß man5. Process for the production of rubradirin B from the microorganism Streptomyces achromogenes var. rubradiris DSM 12'49 carried out fermentation, thereby marked that one a) die Fermentationsbrühe zur Gewinnung eines Rubradirin B enthaltenden Filtrats filtriert;a) the fermentation broth is filtered to obtain a filtrate containing rubradirin B; b) don pH-Wert des Filtrats zur Bildung eines Rubradirin B ent haltenden Niederschlags auf etwa 4,0 einstellt;b) the pH of the filtrate to form a rubradirin B ent containing precipitation adjusts to about 4.0; c) den Niederschlag abfiltriert und den angefallenen Filterkuchen zur Gewinnung von Rubradirin B enthaltenden Eluaten mit einem Lösungsmittel für Rubradirin B eluiert;c) the precipitate is filtered off and the resulting filter cake for the recovery of rubradirin B containing Eluates eluted with a solvent for rubradirin B; d) die erhaltenen Eluate zu einem Rückstand einengt;d) the eluates obtained are concentrated to a residue; e) den Rückstand mit einem Lösungsmittel für Rubradirin B auslaugt und das Lösungsmittel konzentriert;e) the residue is leached with a solvent for rubradirin B and the solvent is concentrated; f) das erhaltene Lösungsmittelkonzentrat zur Bildung eines Rubradirin B enthaltenden Niederschlags mit einem Lösungsmittel, in dem Rubradirin B nicht löslich ist, verdünnt; f) the solvent concentrate obtained to form a precipitate containing rubradirin B with a solvent, in which rubradirin B is not soluble, diluted; g) den Rubradirin B enthaltenden Niederschlag isoliert und zu einem Feststoff trocknet undg) the precipitate containing rubradirin B is isolated and dried to a solid and h) den Rubradirin B enthaltenden Feststoff einer Silikagelchromatographie unterwirft und praktisch reines Rubradirin B isoliert.h) the solid containing rubradirin B by silica gel chromatography subjects and isolates practically pure rubradirin B. 809841/0655809841/0655 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel für Rubradirin B Äthylacetat verwendet.6. The method according to claim 5, characterized in that one used as a solvent for rubradirin B ethyl acetate. 7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nichtlösungsmittel für Rubradirin B ein Gemisch isomerer Hexane verwendet.7. The method according to claim 5, characterized in that one a mixture of isomeric hexanes was used as a nonsolvent for rubradirin B. 8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Rubradirin B in praktisch reiner Form aus der Silikagelchromatographie durch Eluieren des Silikagels zunächst mit Chloroform und dann mit einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform und Methanol im Verhältnis 97:3 gewinnt.8. The method according to claim 5, characterized in that the rubradirin B in practically pure form from silica gel chromatography by eluting the silica gel first with chloroform and then with a solvent system Chloroform and methanol in a ratio of 97: 3 wins. 8 0 9 8 4 1/06558 0 9 8 4 1/0655
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