DE2808396C2 - Protease inhibitors - Google Patents
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- DE2808396C2 DE2808396C2 DE19782808396 DE2808396A DE2808396C2 DE 2808396 C2 DE2808396 C2 DE 2808396C2 DE 19782808396 DE19782808396 DE 19782808396 DE 2808396 A DE2808396 A DE 2808396A DE 2808396 C2 DE2808396 C2 DE 2808396C2
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Description
3. Pharmazeutisches Mittel gekennzeichnet durch einen Gehalt an Eglin B und/oder Eglin C in einem üblichen Träger gegebenenfalls mit üblichen Zusatzstoffen. 3. Pharmaceutical agent characterized by a content of eglin B and / or eglin C in one customary carrier, optionally with customary additives.
Die Anmeldung betrifft Protease-.'nhibitoren aus Blutegelextrakten.The application relates to protease inhibitors Leech extracts.
Es ist bekannt, daß Extrakte aus Blutegeln (Hirudo medicinalis) Protease-Inhibitoren enthalten. Aus Methods Enzymol. 19, Seiten 924 bis 932 ist z. B. bekannt, daß aus Blutegeln ein gegen Thrombin spezifisch wirkender Inhibitor gewonnen werden kann. Dieser Inhibitor ist von den Verfassern der obigen Literatursteiie mit der Bezeichnung Hirudin gekennzeichnet worden.It is known that extracts from leeches (Hirudo medicinalis) contain protease inhibitors. From Methods Enzymol. 19, pages 924 to 932 is e.g. B. known that a specific inhibitor against thrombin can be obtained from leeches. This Inhibitor is from the authors of the above literature labeled hirudin.
Aus Proc. Int Res. Conf. on Proteinase Inhibitors, 1970, Seiten 271 bis 280 ist bekannt, daß die Extrakte von Blutegeln auch trypsin-plasmin-spezifische Inhibitoren enthalten.From Proc. Int Res. Conf. on Proteinase Inhibitors, 1970, pages 271 to 280 it is known that the extracts leeches also contain trypsin-plasmin-specific inhibitors.
Bei der Untersuchung der Extrakte von Blutegeln (Hirudo medicinalis) wurden nunmehr zwei neue Protease-Inhibitoren vom Proteintyp gefunden, die mit den wissenschaftlichen Namen Eglin B und Eglin C bezeichnet wurden. Gegenstand der Erfindung sind deshalb Protease-Inhibitoren Eglin B und Eglin C aus Blutegelextrakten, wobeiWhen examining the extracts of leeches (Hirudo medicinalis), two new ones were found Protease inhibitors of the protein type found with the scientific names Eglin B and Eglin C were designated. The invention therefore relates to protease inhibitors Eglin B and Eglin C from Leech extracts, where
jo a) Eglin B ein berechnetes Molekulargewicht von 8073 und Eglin C ein Molekulargewicht von 8099
aufweisen
b) Eglin B pro Moleküljo a) Eglin B have a calculated molecular weight of 8,073 and Eglin C a molecular weight of 8,099
b) eglin B per molecule
7 Asp
5 Thr7 Asp
5 th
3 Ser
7 GIu
6 Pro
5 GIy3 Ser
7 GIu
6 per
5 GIy
1 AIa1 AIa
0 Cys0 Cys
(nach Perameisensäureoxidation)(after performic acid oxidation)
11 VaI11 VaI
0 Met0 Met
(nach Perameisensäureoxidation)(after performic acid oxidation)
0 Ue0 Ue
5 Leu5 leu
4-5 Tyr4-5 Tyr
5 Phe5 phe
so 4 Hisso 4 His
2 Lys2 Lys
4 Arg
0-1 Trp4 arg
0-1 trp
(spektrophotomevrisch bestimmt) aufweist und(determined spectrophotomevrically) and
Eglin C folgende Aminosäuresequenz besitzt:Eglin C has the following amino acid sequence:
1010
NHj-Thr-Glu-Phe-Gly-Ser-Glu-Leu-Lys-Ser-Phe-NHj-Thr-Glu-Phe-Gly-Ser-Glu-Leu-Lys-Ser-Phe-
20 Pro-Glu-Val-Val-Gly-Lys-Thr-Val-Asp-Gln-20 Pro-Glu-Val-Val-Gly-Lys-Thr-Val-Asp-Gln-
30 Ala-Arg-Glu-Tyr-Phe-Thr-Leu-His-Tyr-Pro-30 Ala-Arg-Glu-Tyr-Phe-Thr-Leu-His-Tyr-Pro-
40 Gln-Tyr-Asp-Val-Tyr-Phe-Leu-Pro-Glu-Gly-40 Gln-Tyr-Asp-Val-Tyr-Phe-Leu-Pro-Glu-Gly-
50 Ser-Pro-Val-Thr-Leu-Asp-Leu-Arg-Tyr-Asn-50 Ser-Pro-Val-Thr-Leu-Asp-Leu-Arg-Tyr-Asn-
60 Arg-Val-Arg-Val-Phe-Tyr-Asn-Pro-Gly-Thr-60 Arg-Val-Arg-Val-Phe-Tyr-Asn-Pro-Gly-Thr-
70 Asn-Val-Val-Asn-His-Val-Pro-His-Val-Gly-COOH70 Asn-Val-Val-Asn-His-Val-Pro-His-Val-Gly-COOH
c) Eglin B einenc) Eglin B.
Chymotrypsinkomplex mit einer Dissoziationskonstanten von K,■ = 3 ■ 10-'0M, (Substrat: 3-Carboxypropionyl-L-phenyl-alanin-pnitroanilid) bzw./C, = 1,8 · 10-" M, (Substrat: NKBenzoyl-L-tyrosin-äthylester), Subtilisinkomplex mit einer Dissoziationskonstanten von Ki = 2 · 10-:o M, (Substrat: Azocasein), Chymotrypsin complex with a dissociation constant of K, ■ = 3 ■ 10- ' 0 M, (substrate: 3-carboxypropionyl-L-phenyl-alanine-pnitroanilide) or / C, = 1.8 · 10- "M, (substrate: NK benzoyl-L-tyrosine ethyl ester), subtilisin complex with a dissociation constant of Ki = 2 · 10- : o M, (substrate: azocasein),
granulozytäre Elastasekomplex mit einer Dissoziationskonstanten von Kj = 2,3 · 10-'0M, (Substrat: N^-Succinyl-falanyljs-p-nitroanilid), granulozytäres Kathepsin G-Komplex mit einer Dissoziationskonstanten vonGranulocytic elastase complex with a dissociation constant of Kj = 2.3 · 10- ' 0 M, (substrate: N ^ -Succinyl-falanyljs-p-nitroanilide), granulocytic cathepsin G complex with a dissociation constant of
Ki = 2,5 · 10-10M, (Substrat: Nh-Benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid),
und
Eglin C einen Ki = 2.5 x 10- 10 M, (substrate: Nh-benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide), and
Eglin C.
Chymotrypsinkomplex mit einer Dissoziationskonstanten von Κ, = !- 10-'0M, (Substrat: 3-Carboxypropionyl-L-phenyl-aIanin-pnitroanilid) bzw. K1 = 2,6 · 10-" M, (Substrat: NKBenzoyl-L-tyrosin-äthylester), Subtilisinkomplex mit einer Dissoziationskonstanten von K1= 1,2 ■ 10-10M, (Substrat: Azo-casein),Chymotrypsin complex with a dissociation constant of Κ, =! - 10- ' 0 M, (substrate: 3-carboxypropionyl-L-phenyl-aIanine-pnitroanilide) or K 1 = 2.6 · 10- "M, (substrate: NK-benzoyl- L-tyrosine ethyl ester), Subtilisinkomplex with a dissociation constant of K 1 = 1.2 ■ 10 -10 M, (substrate: azo-casein),
granuiozytäre Elastasekomplex mil einer Dissoziationskonstanten von K,■= 2 ■ 10"'0M, (Substrat: N^-Succinyl-falanylJs-p-nitroanilid) granulozytäres Kathepsin G-Komplex mit einer Dissoziationskonstanten vonGranuiocytic elastase complex with a dissociation constant of K, ■ = 2 ■ 10 "' 0 M, (substrate: N ^ -Succinyl-falanylJs-p-nitroanilide) Granulocytic cathepsin G complex with a dissociation constant of
Ki= 2,8 · 10-'0M, (Substrat: N^-Benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid bilden, Ki = 2.8 · 10- ' 0 M, (substrate: form N ^ -Benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide,
d) Eglin B bei der diskontinuierlichen Gelelektrophorese bei einer Stromstärke von 5 mA, einer Laufzeit von 1,5 Stunden und einem pH-Wert von 4,3 einen Rp-Wert von 0,61 und bei einem pH-Wert von 8,9 einen Rf-Wert von 0,53 aufweist, und Eglin C bei der diskontinuierlichen Gelelektrophorese bei einer Stromstärke von 5 mA, einer Laufzeit von 1,5 Stunden und einem pH-Wert von 4,3 einen Rf-Wert von 0,54 und bei einem pH-Wert von 8,9 einen RF-Wert von 0,59 und bei der SDS-Gelelektrophorese bei einer Stromstärke von 2,5 mA und einer Laufzeit von 3 Stunden einen RF-Wert von 0,85 bzw. 0,86 aufweist undd) Eglin B in the discontinuous gel electrophoresis at a current strength of 5 mA, a running time of 1.5 hours and a pH value of 4.3 an Rp value of 0.61 and at a pH value of 8.9 a Rf value of 0.53, and Eglin C in the discontinuous gel electrophoresis at a current strength of 5 mA, a running time of 1.5 hours and a pH value of 4.3 an Rf value of 0.54 and at a pH 8.9 has an R F value of 0.59 and in SDS gel electrophoresis at a current of 2.5 mA and a running time of 3 hours has an RF value of 0.85 and 0.86, respectively and
e) Eglin B und C in neutraler und schwach-saurer Lösung und gegenüber unspezifischer Proteolyse beständig sind, erhältlich dadurch, daß mane) Eglin B and C in neutral and weakly acidic solution and against unspecific proteolysis are stable, obtainable by
A) Blutegelextrakte über eine Chromatographiesäule gibt, die mit einem dreidimensional vernetzten Polysacchrid (Sephadex ® G-75) gefüllt ist, die Säule mit einer 0,05 m TRA · HCI/0,4 m Natriumchloridlösung mit einem pH-Wert von 7,8 äquilibriert und eluiert (TRA = Triethanolamin),A) Leech extracts over a chromatography column are made with a three-dimensional cross-linked polysacchride (Sephadex ® G-75) is filled, the column with a 0.05 m TRA · HCl / 0.4 M sodium chloride solution with a pH of 7.8 equilibrated and eluted (TRA = triethanolamine),
B) die entsalzten und lyophilisierten Fraktionen mit einem Molekulargewicht von ca. 6000B) the desalted and lyophilized fractions with a molecular weight of approx. 6000
ίο (bestimmt mittels SDS-Gelelektrophorese)ίο (determined by means of SDS gel electrophoresis)
(Fraktion II) in der unten genannten Äquilibrierungspufferlösung löst und dann auf eine Chromatographiesäule, die mit Diäthylaminoäthylgruppen als funktioneile Gruppen aufwei-(Fraction II) in the equilibration buffer solution mentioned below dissolves and then on a chromatography column with diethylaminoethyl groups as functional groups
i-j sende Zellulose gefüllt ist, gibt, die mit eineri-j send cellulose is filled, that gives that with a
0,03 m Ammoniumacetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,5 äquilibrierte Säule zunächst mit diesem Puffer eluiert und danach mit einer Pufferlösung mit linearem Salzgradienten, hergestellt durch kontinuierliches0.03 M ammonium acetate buffer solution with a pH 6.5 equilibrated column first eluted with this buffer and then with a buffer solution with a linear salt gradient, produced by continuous
Vermischen von jeweils 300 ml der 0,03 m Ammoniumacetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,5 und einer 0,4 m Natriumchlorid/0,06 m Ammoniumacetat-Lösung mit einem pH-Wert von 6.5 eluiert undMix each 300 ml of the 0.03 M ammonium acetate buffer solution with a pH 6.5 and a 0.4 M sodium chloride / 0.06 M ammonium acetate solution with a pH of 6.5 and eluted
C) die eluierten Fraktionen (Fraktion Il b, c) nach dem Entsalzen und Lyophilisieren in der nachstehenden Äquilibrierungspufferlösung löst und auf eine Chromatographiesäule gibt,C) the eluted fractions (fraction II b, c) after desalting and lyophilizing in the equilibration buffer solution below dissolves and puts it on a chromatography column,
ω die mit einem dreidimensional vernetzten,ω those with a three-dimensional network,
Sulfopropylgruppen als funktioneile Gruppen aufweisendem Polysaccharid (SP-Sephadex ®) gefüllt ist, die Säule mit einer 0,05 m Ammoniumacetatlösung mit einem pH-Wert von 5,0Sulfopropyl groups as polysaccharide containing functional groups (SP-Sephadex ®) is filled, the column with a 0.05 M ammonium acetate solution with a pH of 5.0
J5 äquilibriert und mit einer Pufferlösung mitJ5 equilibrated and with a buffer solution with
linearem Salzgradienten, hergestellt durch kontinuierliches Vermischen von jeweils 300 ml der 0,05 m Ammoniumacetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 5,0 und einer 0,5 m Natriumchlorid/0,05 m Ammoniumacelinear salt gradient produced by continuously mixing each 300 ml of the 0.05 M ammonium acetate buffer solution with a pH of 5.0 and a 0.5 m sodium chloride / 0.05 m ammonium ace
tat-Lösung mit einem pH-Wert von 5,0 eluiert, wobei Eglin B und Eglin C in getrennten Fraktionen erhalten werden.tat solution at pH 5.0 eluted, with Eglin B and Eglin C in separate Fractions are obtained.
Die erfindungsgemäßen Inhibitoren bilden mit Chymotrypsin, Subtilisin, Elastase und Kathepsin-G Komplexverbindungen, die sehr kleine Dissoziationskonstanten aufweisen und einen labileren Komplex mit Trypsin. Von besonderer Bedeutung ist hierbei die InhibierungThe inhibitors according to the invention form complex compounds with chymotrypsin, subtilisin, elastase and cathepsin-G, which have very small dissociation constants and a more labile complex with trypsin. The inhibition is of particular importance here
so der Proteasen Chymotrypsin, Subtilisin, der granulozytären Elastase und des granu'.ozytären Kathepsin G. Die Dissoziationskonstanten K, für Eglin B und Eglin C gegenüber den obigen Proteasen sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßtfor example the proteases chymotrypsin, subtilisin, granulocytic elastase and granulocytic cathepsin G. The dissociation constants K for eglin B and eglin C with respect to the above proteases are summarized in Table 1 below
ProteaseProtease
Chymotrysin (Bovine)Chymotrysin (Bovine)
SubtilisinSubtilisin
menschliche granulozytäre Elastasehuman granulocytic elastase
menschliches granuliozytäres Kathepsin Ghuman granuliocytic cathepsin G.
*) Substrat: 3-CarboxypropionyI-L-phenylalanin-p-nitroanilid (Merck AG, ArL Nr. 10 754). **) Substrat: N"-Benzoyl-L-tyrosin-äthylester (Fluka AG, Art. Nr. 13 110).*) Substrate: 3-carboxypropionyl-L-phenylalanine-p-nitroanilide (Merck AG, ArL No. 10 754). **) Substrate: N "-Benzoyl-L-tyrosine ethyl ester (Fluka AG, Art. No. 13 110).
Der erfindungsgemäße Inhibitor Eglin B weist gegenüber dem System, bestehend aus dem Enzym Chymotrypsin und dem Substrat 3-Carboxypropionyl-L-phenylalanin-p-nitroanilid, eine spezifische Hemmaktivität von 115mIU/mg auf. Die spezifische Hemmaktivität des erfindungsgemäßen Eglins C gegenüber dem System, bestehend aus dem Enzym Chymotrypsin und dem Substrat 3-Carboxypropionyl-L-phenyIalanin-p-nitroanilid, beträgt 120mlU/mg. Die Inhibierung der Proteinasen bzw. Proteasen durch die erfindungsgemäßen Verbindungen wurde nach bekannten Methoden (vgl. Methoden der enzymatischen Analyse, 3. Auflage, VoLI, Seiten 1105 bis 1121 und Anal. Biochem. 54, Seiten 262 bis 265) bestimmt. Eine Inhibitoreinheit (IU) verringert die durch das jeweilige Enzym katalysierte Hydrolyse des 1 μΜοΙ pro Minute bei 25°C. Dabei wird der Komplex bestehend aus dem Enzym und dem Inhibitor durch Zugabe der beiden Verbindungen zu einer geeigneten Pufferlösung bei 25° C gebildet. Das Enzym und der Inhibitor werden etwa 5 Minuten vor der Zugabe des Substrats zu der Pufferlösung gegeben.The inhibitor according to the invention Eglin B has opposite to the system consisting of the enzyme chymotrypsin and the substrate 3-carboxypropionyl-L-phenylalanine-p-nitroanilide, a specific inhibitory activity of 115mIU / mg. The specific inhibitory activity of the Eglins C according to the invention compared to the system consisting of the enzyme chymotrypsin and the Substrate 3-carboxypropionyl-L-phenylalanine-p-nitroanilide, is 120mlU / mg. The inhibition of the proteinases or proteases by the inventive Compounds were determined according to known methods (see Methods of enzymatic analysis, 3rd edition, VoLI, pages 1105 to 1121 and Anal. Biochem. 54, Pages 262 to 265). An inhibitor unit (IU) reduces the one catalyzed by the respective enzyme Hydrolysis of the 1 μΜοΙ per minute at 25 ° C. It will the complex consisting of the enzyme and the inhibitor by adding the two compounds to it a suitable buffer solution at 25 ° C. The enzyme and the inhibitor are about 5 minutes before added to the addition of the substrate to the buffer solution.
Zur Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung der erfindungsgemäßen Inhibitoren wurden Proben von Eglin B und Eglin C in 6 η HCl für 20,40 und 72 Stunden hydrolysiert. Die Aminosäureanalyse wurde mit einem Durrum-Analysegerät durchgeführt. Der Gehalt an Cystein und Methionin wurde nach der in Methods Enzymol. 11, Seiten 197 bis 199 beschriebenen Perameisensäureoxydationsmethode bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen keine Cystein- und Methioninreste enthalten.To determine the amino acid composition of the inhibitors according to the invention, samples of Eglin B and Eglin C hydrolyzed in 6 η HCl for 20., 40 and 72 hours. The amino acid analysis was carried out with a Durrum analyzer carried out. The content of cysteine and methionine was determined according to the in Methods Enzymol. 11, pages 197 to 199 described performic acid oxidation method certainly. It was found that the compounds according to the invention do not contain any cysteine and methionine residues.
Der Gehalt an Trypthophan wurde photometrisch nach der in Biochem. 6, Seiten 1948 bis 1954 beschriebenen Methode bestimmt Für die Bestimmung der Endgruppen wurde die in Eur. J. Biochem. 7, Seiten 463 bis 470 beschriebene DANSYL-Methode verwendet. The tryptophan content was measured photometrically according to the method described in Biochem. 6, pages 1948 to 1954 The method described was determined for the determination of the end groups in Eur. J. Biochem. 7, pages 463 to 470 used the DANSYL method.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten einen ungewöhnlich hohen Gehalt an hydrophoben Aminosäuren, aber kein Methionin, kein Isoleucin und insbesondere kein Cystein bzw. keine Disulfidbrücken. Die erfindungsgemäßen Verbindungen gehören somit zu den ersten Protease-Inhibitoren vom Proteintyp, die keine Disulfidbrücken besitzen. Diese Strukturbesonderheit ist von besonderem biochemischen Interesse, da bisher angenommen wurde, daß Protein-Proteaseinhibitoren in Nachbarschaft zum reaktiven Zentrum eine Disulfidbrücke enthalten. Es wird angenommen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen durch hydrophobe Wechselwirkungen von benachbarten Aminosäureresten im Molekül stabilisiert wprHen Der sich zwkrhpn den erfindungsgemäßen Verbindungen und den obengenannten Proteasen ausbildende Komplex ist über längere Zeit, selbst in Anwesenheit eines Überschusses der zu komplexierenden Protease, beständig.The compounds according to the invention contain an unusually high content of hydrophobes Amino acids, but no methionine, no isoleucine and especially no cysteine or disulfide bridges. The compounds according to the invention are thus among the first protease inhibitors of the protein type which have no disulfide bridges. This structural feature is of particular biochemical interest because It was previously assumed that protein protease inhibitors in the vicinity of the reactive center a Disulfide bridge included. It is believed that the compounds of the invention by hydrophobic Interactions of neighboring amino acid residues in the molecule are stabilized by the zwkrhpn the complex forming the compounds according to the invention and the abovementioned proteases is over stable for a long time, even in the presence of an excess of the protease to be complexed.
Für die völlige Inhibierung der obengenannten Proteasen genügt der Zusatz von äquimolaren Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen. Es wurden Versuche durchgeführt, bei denen jeweils eine konstante Menge der zu inhibierenden Protease mit steigenden Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen in einer geeigneten Pufferlösung bei einem pH-Wert von 7,8 und einer Temperatur von 25°C zusammengegeben wurde und 5 Minuten danach wurde das entsprechende Substrat hinzugegeben, um die Restaktivität bzw. die Aktivität der restlichen freien Protease zu bestimmen. Die jeweils eingesetzten Mengen an erfindungsgemäßem Inhibitor wurden auf der Abszisse der folgenden Fig. 1 bis 6 aufgetragen und die gemessene freie Enzymaktivität in Abhängigkeit von der zugegebenen Inhibitormenge wurde auf die Ordinate der folgenden F i g. 1 bis 6 aufgetragen.The addition of equimolar amounts is sufficient for the complete inhibition of the abovementioned proteases of the compounds according to the invention. Tests were carried out in each of which a constant Amount of the protease to be inhibited with increasing amounts of the compounds according to the invention in one suitable buffer solution at a pH of 7.8 and a temperature of 25 ° C was put together and 5 minutes later the corresponding Substrate added in order to determine the residual activity or the activity of the residual free protease. The amounts of inhibitor according to the invention used in each case were on the abscissa of the following 1 to 6 and the measured free enzyme activity as a function of the added The amount of inhibitor was determined on the ordinate of the following Fig. 1 to 6 applied.
Die F i g. 1 zeigt die Verringerung der hydrolysierenden Wirkung des Trypsins gegenüber dem Substrat N-Benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid. Das Eglin B und Eglin C wurden in Mengen zwischen 0 bis 30 μg eingesetzt. Die eingesetzten Inhibitormengen zeigen, daß die inhibierende Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber Trypsin relativ schwach ist.The F i g. 1 shows the reduction in the hydrolyzing effect of trypsin compared to the substrate N-Benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide. The Eglin B and Eglin C were used in amounts between 0 to 30 μg used. The amounts of inhibitor used show that the inhibiting effect of the invention Compounds against trypsin is relatively weak.
Die F i g. 2 zeigt die steigende Inhibierung der hydrolysierenden Wirkung von Chymotrypsin gegenüber dem Substrat 3-Carboxypropionyl-L-phenyl-ala-The F i g. Figure 2 shows the increasing inhibition of the hydrolyzing effects of chymotrypsin versus the substrate 3-carboxypropionyl-L-phenyl-ala-
!5 nin-n-nitroanilid durch den Zusatz steigender Mengen (0 bis 8 μg) von Eglin B und Eglin C.! 5 nin-n-nitroanilide by adding increasing amounts (0 to 8 μg) of Eglin B and Eglin C.
Die F i g. 3 zeigt die steigende Inhibierung der hydrolysierenden Wirkung von Chymotrypsin gegenüber dem Substrat N*-Benzoyl-L-tyrosin-äthylester durch den Zusatz steigender Mengen (0 bis 0,7 μg) von Eglin B und Eglin C.The F i g. 3 shows the increasing inhibition of the hydrolyzing effects of chymotrypsin against the substrate N * -Benzoyl-L-tyrosine ethyl ester by adding increasing amounts (0 to 0.7 μg) of Eglin B and Eglin C.
Die F i g. 4 zeigt die Inhibierung der hydrolysierenden Wirkung von Subtilisin durch den Zusatz der erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber dem Substrat Azo-casein.The F i g. 4 shows the inhibition of the hydrolyzing Effect of subtilisin through the addition of the compounds according to the invention to the substrate Azo casein.
Die F i g. 5 zeigt die Inhibierung von Elastase durch den Zusatz steigender Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber dem Substrat N*-Succinyl-[alanyl]3-p-nitroanilid. The F i g. 5 shows the inhibition of elastase by the addition of increasing amounts of the invention Compounds towards the substrate N * -Succinyl- [alanyl] 3-p-nitroanilide.
Die F i g. 6 zeigt die Inhibierung der hydrolysierenden Wirkung von Kethepsin G durch den Zusatz steigender
Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber dem Substat N*-Benzoyl-L-tyrosin-äthylester.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden aus Blutegelextrakten hergestellt. Der rohe Blutegelextrakt
(1,5 g) wird in der ersten Reinigungsstufe auf eine Gelchromatographiesäule gegeben, die mit einem
dreidimensional vernetzten Polysaccharid (Sephadex β
G-75) gefüllt ist, wobei der Extrakt in einer Äquilibrierungspufferlösung
bestehend aus 0,05 molarem TRA · HCl/0,4 moairem NaCl mil einem pH = 7,8
gelöst ist und das Säulenmaterial mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert ist Die Säule wird mit der
genannten Pufferlösung in Mengen von 52 ml pro Stunde eluiert. Es werden Fraktionen von 9,7 ml
aufgefangen.The F i g. 6 shows the inhibition of the hydrolyzing action of kethepsin G by the addition of increasing amounts of the compounds according to the invention compared with the substrate N * -benzoyl-L-tyrosine ethyl ester.
The compounds according to the invention are prepared from leech extracts. In the first purification stage, the raw leech extract (1.5 g) is placed on a gel chromatography column which is filled with a three-dimensionally crosslinked polysaccharide (Sephadex β G-75), the extract in an equilibration buffer solution consisting of 0.05 molar TRA.HCl / 0.4 moairem NaCl with a pH = 7.8 is dissolved and the column material is equilibrated with the same buffer solution. The column is eluted with the said buffer solution in amounts of 52 ml per hour. Fractions of 9.7 ml are collected.
Die erhaltenen Fraktionen werden entweder durch mehrfache Ultrafiltration (Amicon-Zelle mit UM 05 Membranen) bzw. durch Gelfiltration über eineThe fractions obtained are either purified by multiple ultrafiltration (Amicon cell with UM 05 Membranes) or by gel filtration through a
so lonenaustauschersäule (Sephadex · G-25 oder Fracto- <Tf»l ΡΓίΜ 70nn\ unH Fliiii»riin<T mit 0.1 m Essigsäure So ion exchange column (Sephadex · G-25 or Fracto- <Tf »l 70nn \ unH Fliiii» riin <T with 0.1 M acetic acid
entsalzt. Die salzfreie Lösung, die die erfindungsgemäßen
Proteaseinhibitoren enthält, wird lyophilisert.
Die Fraktionen, die die Substanzen mit Molekulargewichten von ca. 38 000 und ca. 8500 (bestimmt mittels
SDS-Gelelektrophorese, SDS = Na-Dodecylsulfat)
enthalten, werden nicht weiter aufgearbeitet.desalinated. The salt-free solution which contains the protease inhibitors according to the invention is lyophilized.
The fractions which contain the substances with molecular weights of approx. 38,000 and approx. 8500 (determined by means of SDS gel electrophoresis, SDS = Na dodecyl sulfate) are not processed further.
Die Fraktionen, die die Substanzen mit Molekulargewichten von ca. 6000 (Fraktion II) enthält, wird einer weiteren Reinigung unterworfen. Die Fraktion II (70 mg) wird in der nachstehenden Äquiiibrierungspufferlösung gelöst und dann auf eine Chromatographiesäule gegeben, die mit Zellulose, die Diäthylaminoäthylgruppen als funktionell Gruppen aufweist, gefüllt ist.The fractions which contain the substances with molecular weights of approx. 6000 (fraction II) become one subjected to further cleaning. Fraction II (70 mg) is added to the equilibration buffer solution below dissolved and then placed on a chromatography column containing cellulose, the diethylaminoethyl groups as having functional groups, is filled.
Das Säulenmaterial wird mit einer 0,03 m Ammoniumacetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,5 equilibriert Die Säule wird mit dieser Pufferlösung in Anteilen von 17 ml pro Stunde eluiert bis nur nochThe column material is washed with a 0.03 M ammonium acetate buffer solution equilibrated with a pH of 6.5 The column is eluted with this buffer solution in proportions of 17 ml per hour until only
Fraktionen erhalten werden, die keine nennenswerte Inhibierwirkung gegenüber Chymotrypsin aufweisen. Danach wird die Säule mit einer Pufferlösung mit linearem Salzgradienten, hergestellt durch kontinuierliches Vermischen von jeweils 300 ml der oben beschriebenen Äquiübrierungspufferiösung und einer 0,4 m Natriumchlorid/0,06 m Ammoniumacetatlösung von pH 6,5 eluiert. Es werden jeweils Fraktionen von 3,7 ml aufgefangen.Fractions are obtained which have no appreciable inhibitory effect on chymotrypsin. Thereafter, the column is filled with a buffer solution with a linear salt gradient prepared by continuous Mix 300 ml each of the above-described equilibration buffer solution and one 0.4 M sodium chloride / 0.06 M ammonium acetate solution of pH 6.5 eluted. There are fractions of 3.7 ml collected.
Die erhaltenen Fraktionen (Il b, c) werden wie oben angegeben entsalzt und anschließend lyophilisiert.The fractions obtained (II b, c) are desalted as indicated above and then lyophilized.
Die Fraktion II b, c (50 mg) wird in einer 0,05 m Ammoniumacetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 5,0 gelöst und zur weiteren Reinigung auf eine Chromatographiesäule gegeben, die mit einem dreidimensional vernetzten Polysaccharid, das Sulfopropylgruppen als funktioneile Gruppen (SP-Sephadex) aufweist, gefüllt ist. Das Säulenmaterial wird zuvor mit einer 0,05 m Ammoniumacetatlösung mit einem pH-Wert von 5,0 equilibriert. Die Säule wird mit einer Pufferlösung mit linearem Salzgradienten, hergestellt durch kontinuierliches Vermischen von jeweils 300 ml der oben beschriebenen Äquilibrierungspufferlösung und einer 0,5 m Natriumchlorid/0,05 m Ammoniumacetatlösung von pH 5,0, in Mengen von 17 ml pro Stunde eluiert, wobei zwei verschiedene Fraktionen aufgefangen werden. Die Fraktion I enthält das Eglin B und die Fraktion II das EgHnC. Durch Entsalzen und Lyophilisieren der Eluate werden die erfindungsgemäßen Verbindungen im Reinzustand erhalten.The fraction II b, c (50 mg) is in a 0.05 M ammonium acetate buffer solution with a pH of 5.0 dissolved and placed on a chromatography column for further purification, which is marked with a three-dimensional cross-linked polysaccharide, the sulfopropyl groups as functional groups (SP-Sephadex) has, is filled. The column material is previously with a 0.05 M ammonium acetate solution with a pH equilibrated to 5.0. The column is prepared with a buffer solution with a linear salt gradient by continuously mixing each 300 ml of the equilibration buffer solution described above and a 0.5 M sodium chloride / 0.05 M ammonium acetate solution, pH 5.0, in amounts of 17 ml per hour eluted, collecting two different fractions. Fraction I contains the Eglin B and the Fraction II the EgHnC. By desalting and lyophilizing the eluates, the Compounds obtained in the pure state.
Es wurde die spezifische Hemmaktivität der Fraktionen der einzelnen Reinigungsstuten gegenüber dem System bestehend aus dem Enzym Chymotrypsin und dem Substrat 3-Carboxypropionyl-L-phenylalanin-p-nitroanilid bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengefaßt.It was the specific inhibitory activity of the fractions of the individual cleaning mares compared to the System consisting of the enzyme chymotrypsin and the substrate 3-carboxypropionyl-L-phenylalanine-p-nitroanilide certainly. The results are summarized in Table 2 below.
Fraktionfraction
Spezifische Hcmma'itivität
(mIU/mg) Specific Hcmma'itivity
(mIU / mg)
Ausgangsmaterial 5,5Starting material 5.5
II 15,5II 15.5
Hb, c 74Hb, c 74
Eglin b 115Eglin b 115
Eglin C 120Eglin C 120
In de· fo'genden Tabell 3 ist die spezifische Hemmak ivität der erfindungsgemäßer. Substanzen in den einzelnen Reinigungsstufen gegenüber Chymotrypsin (Substrat: N^-Succinyl-L-phenylalanin-p-nitroanilid) in lnhibitoreinheiten pro mg zusammengefaßt. Die Tabelle 3 zeigt, daß die spezifische Hemmaktivität mit zunehmender Reinigung ansteigt.In the following table 3 is the specific Inhibitory activity of the invention. Substances in the individual purification stages against chymotrypsin (Substrate: N ^ -Succinyl-L-phenylalanine-p-nitroanilide) summarized in inhibitor units per mg. Table 3 shows that the specific inhibitory activity with increasing cleaning increases.
4040
mlU = milliinhibitor-Einheiten.mlU = milliinhibitor units.
Die bei der Reinigung von Blutegelextrakten erhaltenen erfindunesgemäßen Inhibitoren sind — wie durch diskontinuierliche Gelelektrophorese (10% Gel) festgestellt wurde — chromatographisch rein (vgl. H. R. Maurer, Disc. Elektrophorese, 1971, Walter de Gruyter, Berlin). Auch anhand der SDS-Gelelektrophorese (15% Gel) konnte nachgewiesen werden, daß die nach dem obigen Verfahren hergestellten erfindungsgemäßen Verbindungen in reiner Form vorliegen (vgl. SDS-Gelelektrophorese K. Weber, M. Osborn, The Proteins (Neurath, H, Hill R. L, eds.) Vol. I, Seiten 179 bis 223 Academic Press, New York).The inhibitors according to the invention obtained in the purification of leech extracts are like was determined by discontinuous gel electrophoresis (10% gel) - chromatographically pure (cf. H. R. Maurer, Disc. Electrophoresis, 1971, Walter de Gruyter, Berlin). Also based on SDS gel electrophoresis (15% Gel) it could be demonstrated that the inventive prepared by the above process Compounds are present in pure form (cf. SDS gel electrophoresis K. Weber, M. Osborn, The Proteins (Neurath, H, Hill R. L, eds.) Vol. I, pages 179-223 Academic Press, New York).
Eglin B weist bei der diskontinuierlichen Elektrophorese (Disc-Elektrophorese) bei einer Laufzeit von 1,5 Stunden, einer Stromstärke von 5 mA und einem pH-Wert von 8,9 einen RF-Wert von 0,53 und bei einem pH-Wert von 4,3 einen RF-Wert von 0,61 auf.In discontinuous electrophoresis (disc electrophoresis) at a running time of 1.5 hours, a current of 5 mA and a pH of 8.9, Eglin B has an R F value of 0.53 and at a pH value of 4.3 has an R F value of 0.61.
Eglin C weist bei der diskontinuierlichen Elektrophorese bei einer Laufzeit von 1,5 Stunden, einer Stromstärke von 5 mA und einem pH-Wert von 8,9 einen RF-Wert von 0,59 und bei einem pH-Wert von 4,3 einen RF-Wert von 0,54 und bei der SDS-Gelelektrophorese bei einer Laufzeit von 3 Stunden und einer Stromstärke von 2,5 mA einen Rt>Wert von 0,85 bzw. 0,86 auf. In discontinuous electrophoresis, Eglin C has an R F value of 0.59 at a running time of 1.5 hours, a current intensity of 5 mA and a pH value of 8.9 and an R F value of 0.59 at a pH value of 4.3 R F value of 0.54 and in SDS gel electrophoresis with a running time of 3 hours and a current strength of 2.5 mA an Rt> value of 0.85 and 0.86, respectively.
Hierzu 6 Blatt ZeichnungenIn addition 6 sheets of drawings
Claims (2)
granulozytäres Kathepsin G-Komplex mit einer Dissoziationskonstanten von Ki = 2,8 · 10-10M, (Substrat: N*-Benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid), bilden,Granulozy'ary elastase complex with a dissociation constant of K 1 · = 2 · 10- ' 0 M, (substrate: N «-Succinyl- [alanyl] 3-p-nitroanilide),
granulocytic cathepsin G complex with a dissociation constant of Ki = 2.8 x 10- 10 M, (substrate: * N-benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide), which form,
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| JPH0730119B2 (en) | 1983-11-21 | 1995-04-05 | チバ−ガイギ− アクチエンゲゼルシヤフト | Egulin, method for producing the same, and medicament containing the same |
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