DE2755171A1 - Verfahren zur synthese von proteinen aus methanol - Google Patents

Verfahren zur synthese von proteinen aus methanol

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Description

PATENTANWALT DR. HANS-GUNTHER EGGERT1 DIPLOMCHEMIKER
5 KÖLN 51, OBERLANDER UFER 90 2 7 S S 1 7 1
Köln, den 6. Dezember 1977 Nr. 129
PRODUITS CHIMIQUES UGINE KUHLMANN,
25 boulevard de l'Amiral Bruix, 75116 Paris, Frankreich
Verfahren zur Synthese von Proteinen aus Methanol
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen aus Methanol mit Hilfe von Stämmen von Mikroorganismen mit verbessertem Verhalten . bezüglich der Herstellung von Methanol (Geschwindigkeit, Ausbeute an Biomasse/Methanol, Affinität für Methanol).
Bei Verfahren zur Herstellung von Proteinen durch einzellige Organismen besitzt der Mikroorganismusstamm eine beträchtliche Bedeutung. Für die Verwendung eines gegebenen kohlenstoffhaltigen Substrats ist einerseits der biologische Wert des Produktes (nicht vorhandene Toxizitat, Nährwert...) und andererseits die ökonomischen Bedingungen der industriellen Produktion von Proteinen in kontinuierlicher Weise von dem Stamm abhängig. Dies sind insbesondere die kinetischen Leistungen des Stammes,
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die die Form der industriellen Einrichtung und damit der notwendigen Investition bestimmen.
Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren ermöglicht es, verbesserte Stämme von irtethylotrophen Mikroorganismen zu verwenden, die das Methanol metabolisch als Serin verwenden. Die Verbesserung der Stämme, die kinetische Leistungen liefern, die vergleichbar mit der Entwicklung eines industriellen Verfahrens zur kontinuierlichen Herstellung von Proteinen aus Methanol sind, können auf eine große Anzahl von Mikroorganismen angewendet werden. Unter diesen werden beispielsweise folgende genannt:
Bacillus, MiQrococcus, Arthrobacter, Flavobacterium, Pseudomonas, Aeromonas, Methylomonas, Rhodopseudomonas, Methylococcus, Klebsiella,Rhodospirillum, Rhodomicrobium, Hyphomicrobium, Acinetobacter, Achromobacter, Moraxella.
Die fakultativen methyIotrophen Mikroorganismen, die das Methanol über den Weg des Serins verwenden, sind sehr verbreitet. Diejenigen, die durch bekannte Methoden isoliert worden sind (aufeinanderfolgendes Aufnehmen aus einem Milieu mit Methanol als einziger kohlenstoffhaltiger Quelle), besitzen oft mittelmäßige kinetische Leistungen.
Einige sind in der Literatur beschrieben, und zwar insbesondere in folgenden Texten:
W.HARDER, MM. ATWOOD, J.R. QUAYLE J.Gen.Microbiol. (1973) 78 155-163, ASTHANA und Coil. Biotechnol. Bioeng. (1971) 13, 923 und (1971) 8, 923, M. REUSS u.a.Coil. Eur. J. Appl. Microbiol. (1975) 1 295-3o5, WHITTENBURY u.a. J.Gen.
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Microbiol. (197o) 61 2o5, HIRSH u.a.CONTI Archiv. Fin Mikrobiologie (1964) 43 : 358, OGATA u.a.Coll. J. Ferment, Technol. (197ο) 48 : 47ο.
Die Verfahren zum Isolieren von Stämmen durch kontinuierliche Selektion ermöglichen es, leistungsfähige Stämme zu isolieren, jedoch sind die Versuche langwierig (wenigstens 1 Monat an Experimentierarbeit im kontinuierlichen Fermentierer), schwierig und die Ergebnisse ungewiß. Andererseits verwirklicht man auf diese Weise nur eine Anreicherung und es ist unerläßlich, aus der erhaltenen komplexen Flora den leistungsfähigsten Mikroorganismus zu isolieren.
Es wurde gefunden, daß unter den Stämmen, die Methanol über den Weg des Serins metabolisieren, die Widerstandsfähigkeit gegenüber Glycin gewöhnlich eine vermehrte Verwendung von Methanol mit sich bringt (Vergrößerung von um, Abnahme des Ks für Methanol) .
Es wird ein Verfahren vorgeschlagen, das es ermöglicht, zur Herstellung von Proteinen aus Methanol einen verbesserten Stamm von irgendwelchen Stämmen zu verwenden, der die vorgenannten Eigenschaften aufweist (Verwendung von Methanol über den Weg des Serins). Die Verbesserung dieses methylotrophen Stamnes besteht einerseits in einer Steigerung der Affinität für Methanol (Abnahme des Ks) und andererseits in einer Verringerung der Erzeugungszeit auf dem methanolhaltigen Substrat.
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Diese verbesserten methylotrophen Stäime unterscheiden sich von wilden Stämmen, aus denen sie hervorgegangen sind, durch ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber der Wirkung von Glycin.
1. Der verbesserte methylotrophe Stamm bleibt unempfindlich gegenüber der Wirkung von Glycin bei Konzentrationen dieser Aminoessigsäure, die wenigstens zehnmal höher ist als diejenigen, die das Verhindern der Verwendung des Methanolsubstrats (Steigerung von Ks) bei dem wilden Stamm beginnen lassen.
2. Der verbesserte methylotrophe Stamm kann in einem Milieu aus Methanolsubstrat und Glycin (0,5 bis 2 %) wachsen, während der entsprechende wilde Stamm in Anwesenheit dieser Glycinkonzentrationen nicht wachsen kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht im Auswählen von gegenüber Glycin resistenten Mutationen aus fakultativen methylotrophen Stämmen.
Die Kultur des zu verbessernden Stammes wird in folgender Weise vorgenommen:
Die Zellen werden vorzugsweise in exponentieller Wachstumsphase aufgenommen und dann auf dem Selektionssieb (festes Milieu für methylotrophe Mikroorganismen + o,5 bis 2 % Glycin) entweder direkt oder nach vorheriger Einwirkung eines physikalischen oder chemischenMutationsnittels ausgebreitet.
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AlIo auf diese Weise ausgewählten Stämme sind gegenüber Glycin (in einer Konzentration von o,5 bis 2 %) widerstandsfähig.
Die verbesserten Stämme werden in ein Kulturmilieu eingesetzt, das Mineralsalze, Stickstoff in anorganischer Form und Methanol in veränderlicher Konzentration von o,1 bis 2 % (Gewicht/Volumen) enthält. Das Methanol, das durch Filtrieren sterilisiert wird, wird dem im Autoklaven bei 12o C während 3o min behandelten Milieu zugesetzt. Der pH-Wert wird zwischen 6 und 8 eingestellt.
Die Kultivierung wird in sterilen Bechergläsern unter Rühren derart vorgenommen, daß die Belüftung nicht beschränkt wird* und bei Temperaturen, die zwischen 25 und 45°C variieren können,
Das Wiedergewinnen der Seilen geschieht durch Zentrifugieren. Das Maß des spezifischen Wachstumsgrades wird festgestellt, indem die Vergrößerung des Trockengewichtes der Zeilen pro Volumeneinheat als Funktion der Zeit gemessen wird. Die Konzentration von Methanol in dem Kulturmilieu wird durch Gaschromatographie gemessen,
Die erhaltenen Stämme können nicht nur für die Synthese von Proteinen aus Methanol, sondern auch zur biologischen Entfernung von Methanol aus einem Abwasser, zur eventuellen Verminderung von Methanol in fermentierten Getränken und allgemein für die gesamte Fermentierung unter Verwendung
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von Methanol gleichzeitig mit einem kohlenstoffhaltigen Substrat verwendet werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert .
Beispiel 1
Ein als zu der Art Pseudomonas stuzeri gehörend identifizierter Stamm wird auf folgendem Milieu kultiviert:
Kulturmilieu (M1)
NH4Cl s eingestellt. 3 g
Na2HPO4 : 3 g
KH2PO4 : o,5 g
CaCl2 : o,o1 g
FeSO4 o,oo1 g
ZnCl2 o,oo1 g
MnSO4 o,oo1 g
MgSO4 o,5 g
CH3OH 5 g
Wasser 1 1
pH-Wert auf 6,8
Die Temperatur der Kultur beträgt 3o C.
Die Generationszeit dieses Stammes ist dann 12o min und seine scheinbare Affinitätskonstante für Methanol ist Ks = 1o9o ppm.
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Die wirksame Produktion von Biomasse am Ende von drei Tagen der Kultivierung beträgt o,3o g für 1 g Methanol.
Die wiederaufgenommene Zellensuspension dieser Kultur wird
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in physiologischem Wasser so verdünnt, daß 1o bis 1o Zellen pro ml untergebracht werden, bevor sie auf dem Milieu M1 mit 2,5 % Agar versehen und mit 2 % Glycin vervollständigt ausgebreitet werden.
Die Petrischalen werden in einen Wärmeschrank bei 3o°C angeordnet. Das Auftreten von resistenten Mutanten ergibt sich am Ende von wenigen Tagen. Die Kolonien werden abgenommen und in flüssigem Milieu M- eingeimpft, um bezüglich ihrer methylotrophen Eigenschaften getestet zu werden.
Man erhält mehrere gegenüber Glycin resistente Mutanten. Das Studium der kinetischen Leistungen eines dieser Mutanten führte zu den nachfolgenden Ergebnissen auf dem Milieu der Kultur M1.
Generationszeit 1oo min
Ks Methanol 2o ppm
Die wirksame Produktion von Biomasse am Ende von 3 Tagen betrug bei dieser Kultur o,4o g pro 1 g Methanol.
Beispiel 2
Andere Mutanten des Stammes von Beispiel 1, die gegenüber 2 % Glycin resistent waren, wurden durch eine Behandlung vor der Zellensuspension mit 2 % Äthylmethansulfonat während 2 h bei 3o°C und einem pH-Wert von 7,4 isoliert. Man stellt
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die gleichen Verbesserungen wie bei dem Mutanten von Beispiel 1 fest, das heißt eine Verminderung der Generationszeit und insgesamt eine starke Abnahme von Ks:
) g - 12o min ) g = 88 min
Wilder Stamm mutierter Stamm
)Ks = 1o9o ppm ) Ks = 2o ppm
Beispiel 3
Die Behandlung von Beispiel 1 wird auf einen methylotrophen Stamm von Pseudomonas aeruginosa angewendet. Man isoliert auf einem Selektiersieb ( Milieu M. + o,5 % Glycin) die gegenüber Glycin resistenten Mutanten.
Die kinetischen Leistungen dieser neuen Stämme (auf dem Milieu M.) werden im Verhältnis zu dem wilden Stamm stark verbessert.
Wilder Stamm Mutierter Stamm
g = 5 h 45 min g - 3 h 3o min
Ks = 83o ppm Ks = 1oo ppm Beispiel 4
Die Behandlung von Beispiel 1 wird auf einen methylotrophen Stamm von Micrococcus Varians angewendet, wobei Stämme isoliert werden, die bezüglich Methanol verbesserte Leistungen in bezug auf den wilden Stamm aufweisen.
Wilder Stam Mutierter Stamm
g - 4 h 2o min g = 3 h 3o min
Ks = 45o ppm Ks = 15o ppm
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Claims (1)

  1. Patentanspruch
    Verfahren zur Herstellung von Proteinen aus Methanol, dadurch gekennzeichnet, daß man methylotrophe Stämme verwendet, die gegenüber Glycin resistent sind.
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    INSPECTED
DE2755171A 1976-12-14 1977-12-10 Verfahren zur Herstellung von Proteinen aus Methanol unter Verwendung methylotropher Mikroorganismen Expired DE2755171C3 (de)

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