DE2748520C2

DE2748520C2 -

Info

Publication number: DE2748520C2
Application number: DE19772748520
Authority: DE
Inventors: William J Mcaleer; Edward H Wasmuth
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1976-11-02
Filing date: 1977-10-28
Publication date: 1987-07-30
Also published as: GB1554399A; FR2422406B1; FR2422399B1; GB1554400A; NL7711378A; DE2748520A1; JPS635381B2; FR2422406A1; FR2394297A1; FR2422399A1; FR2394297B1; JPS5379011A

Description

Die Erfindung ist in den Ansprüchen 1, 6 und 7 gekennzeichnet. Die Unteransprüche nennen Ausgestaltungen der Erfin dung. Insbesondere werden biologische Flüssigkeiten mit einem Gehalt an HB_sAg der isopyknischen Bandenbildung unterworfen, wobei Fraktionen im Dichtebereich von 1,23 bis 1,30, vorzugsweise 1,26 bis 1,30 g/cm³ entfernt werden. Diese Fraktionen sind reich an Dane-Teilchen.The invention is characterized in claims 1, 6 and 7. The subclaims mention embodiments of the invention. In particular, biological liquids containing HB _s Ag are subjected to the isopycnic banding, fractions in the density range from 1.23 to 1.30, preferably 1.26 to 1.30 g / cm ^{3 being} removed. These fractions are rich in Dane particles.

Die Dane-Teilchen sind wertvolle diagnostische und immunologische Mittel.The Dane particles are valuable diagnostic and immunological agents.

Als Ausgangsmaterial zur Gewinnung des erfindungsgemäßen gereinigten Hepatitis B-Virus oder der Dane-Teilchen (HBV) werden Flüssigkeiten mit einem Gehalt an HB_sAg verwendet. Dazu können beliebige menschliche biologische Flüssigkeiten mit einem Gehalt an HB_sAg verwendet werden, wie Plasma, Speichel, Faecesextrakte, Nasen- und Rachensekrete, Gallenflüssigkeit, Rückenmarkflüssigkeit, Schweiß, Urin, Sperma, Vaginalsekrete oder Menstruationsblut. Die am leichtesten zugängliche bio logische Flüssigkeit ist Plasma. Plasma läßt sich auf her kömmliche Weise erhalten, beispielsweise durch Plasmaphorese. Die Konzentration an HB_sAg in den menschlichen biologischen Flüssigkeiten läßt sich nach beliebigen bekannten Verfahren messen, beispielsweise durch umgekehrte passive Hämagglutination oder Komplementfixierung. Die Dane-Teilchen in der erhaltenen Flüssigkeit werden durch eine isopyknische Bandenbildungsstufe isoliert. Bei Verwendung von Plasma als biologischer Flüssig keit kann dieses gekühlt werden. Das gebildete Kryopräzipitat kann vor der isopyknischen Bandenbildungsstufe durch leichte Zentrifugation entfernt werden.Liquids containing HB _s Ag are used as the starting material for obtaining the purified hepatitis B virus according to the invention or the Dane particles (HBV). Any human biological fluids containing HB _s Ag can be used for this, such as plasma, saliva, fecal extracts, nasal and pharynx secretions, bile, spinal fluid, sweat, urine, sperm, vaginal secretions or menstrual blood. The most accessible biological fluid is plasma. Plasma can be obtained in a conventional manner, for example by plasma phoresis. The concentration of HB _s Ag in human biological fluids can be measured by any known method, for example by reverse passive hemagglutination or complement fixation. The Dane particles in the liquid obtained are isolated by an isopycnic banding step. When using plasma as a biological liquid, it can be cooled. The cryoprecipitate formed can be removed by gentle centrifugation before the isopycnic banding step.

Bei der isopyknischen Bandenbildung wird das partiell gereinigte Konzentrat mit einem flüssigen Medium mit einem Dichtegradienten, der die Dichte des zu isolierenden spezifischen Antigens um faßt, in Kontakt gebracht. Anschließend wird das flüssige Medium der Ultrazentrifugation unterworfen, um eine Gleich gewichtsverteilung der Serumbestandteile über den Dichte gradienten hinweg je nach deren individuellen Dichten zu er reichen. Die Fraktionen des Mediums werden nacheinander ver drängt. Fraktionen mit einem Gehalt am gewünschten Antigen, d. h. die Fraktionen mit einer Dichte von 1,23 bis 1,30 g/cm³, werden abgetrennt. Die Konzentrationen der den Gradienten bildenden Lösungen werden so gewählt, daß der Dichtebereich von 1,0 bis 1,41 g/cm³ umfaßt wird. Das flüssige Medium kann in Form eines linearen Gradienten oder eines Stufengradienten eingesetzt werden. Vorzugsweise wird es in Form eines Stufengradienten verwendet, da dieser eine größere Fraktionierungskapazität aufweist.In the isopycnic band formation, the partially purified concentrate is brought into contact with a liquid medium with a density gradient which encompasses the density of the specific antigen to be isolated. The liquid medium is then subjected to ultracentrifugation in order to achieve an equilibrium distribution of the serum components over the density gradient depending on their individual densities. The fractions of the medium are successively displaced. Fractions containing the desired antigen, ie the fractions with a density of 1.23 to 1.30 g / cm ³ , are separated off. The concentrations of the solutions forming the gradient are chosen so that the density range is from 1.0 to 1.41 g / cm ³ . The liquid medium can be used in the form of a linear gradient or a step gradient. It is preferably used in the form of a step gradient, since this has a larger fractionation capacity.

Als flüssige Medien bei der isopyknischen Bandenbildungsstufe können normalerweise beliebige Dichtegradienten in den entsprechenden Be reichen verwendet werden. Beispielsweise sind als gelöste Stoffe von derartigen Lösungen Saccharose, Kaliumbromid, Cäsiumchlorid und Kaliumtartrat bekannt. Die Verwendung von Natriumbromid zur Gewinnung von HBV, die bisher nicht be schrieben worden ist, wird erfindungsgemäß durchgeführt.As liquid media in the isopycnic band formation stage can normally be any density gradient in the corresponding Be be used rich. For example, are as solved Substances from such solutions sucrose, potassium bromide, Cesium chloride and potassium tartrate are known. The use of Sodium bromide for the production of HBV, which so far has not been has been written is carried out according to the invention.

Die isopyknische Bandenbildungsstufe wird zweckmäßigerweise in einer Zentrifuge, beispielsweise einer Electronucleonics-K- Zentrifuge durchgeführt, indem man den stationären Rotor mit Kochsalzlösung füllt und anschließend die Kochsalzlösung nach oben mit Aliquotanteilen eines flüssigen Mediums (Lösung) von steigender Dichte verdrängt, bis sich ein Stufengradient ge bildet hat. Das Plasma wird am Kopf des Rotors eingefüllt, wodurch ein gewisser Anteil der dichtesten Lösung am Boden verdrängt wird. Typischerweise beträgt das Plasmavolumen etwa 15 bis etwa 40 Prozent des Volumens des Stufengradienten. Die Zentrifuge wird mittels eines programmierten Geschwindigkeits steuersystems, das ein Vermischen während der ursprünglichen Reorientierungsphase verhindert, auf Touren gebracht. Wenn der Gleichgewichtszustand erreicht ist und das Produkt sich an der Stelle entsprechender Dichte befindet, wird der Rotor mittels des gleichen Systems verlangsamt, um ein Vermischen bei der Reorientierung in die ursprüngliche Konfiguration zu verhindern. Anschließend wird der Gradient von unten abge lassen. Die Fraktion der entsprechenden Dichte wird aufge fangen.The isopycnic band formation level becomes expedient in a centrifuge, for example an electron nucleonics K Centrifuge performed by using the stationary rotor Fills saline and then the saline solution above with aliquots of a liquid medium (solution) from increasing density displaced until there is a step gradient has formed. The plasma is filled in at the head of the rotor, which creates a certain proportion of the densest solution on the ground is ousted. The plasma volume is typically approximately 15 to about 40 percent of the volume of the step gradient. The Centrifuge is operated using a programmed speed control system that merges during the original Reorientation phase prevented, revved up. If the equilibrium is reached and the product itself at the point of appropriate density, the rotor using the same system slowed down to mixing when reorienting to the original configuration prevent. The gradient is then drawn from below to let. The fraction of the corresponding density is added to catch.

Aufgrund der geringen Größe der Dane-Teilchen ist die iso pyknische Bandenbildungsstufe recht zeitaufwendig und erfordert eine Zentrifugationszeit von etwa 18 Stunden. Demzufolge kann man innerhalb 1 Woche bei ununterbrochenem Tag- und Nachtbetrieb nur etw 4 Proben pro Zentrifuge gewinnen. Selbstverständlich läßt sich die Produktivität durch Verwendung von zusätzlichen Zentrifugen steigern. Dies erfordert aber aufgrund der hohen Kosten für die Zentrifugen einen hohen finanziellen Aufwand.Due to the small size of the Dane particles, the iso pycnic band formation level is quite time consuming and requires a centrifugation time of about 18 hours. As a result one within 1 week with uninterrupted day and night operation only get sth 4 samples per centrifuge. Of course productivity can be increased by using additional Increase centrifuges. However, this requires due to the high The cost of the centrifuges is very high.

Es wurde erfindungsgemäß auch festgestellt, daß sich durch eine Mehrfachbeladung des isopyknischen Bandenbildungsgradienten eine wesentliche Produktivitätssteigerung und eine wesentliche Ver ringerung der Betriebskosten erzielen lassen. Unter Mehrfach beladung ist der Vorgang zu verstehen, daß man eine biologische Flüssigkeit mit einem Gehalt an HBV für einen Zeitraum, der ausreicht, um im wesentlichen das gesamte HBV in der Flüssig keit in den Gradienten gelangen zu lassen, die aber zur Er reichung des Gleichgewichtszustands nicht ausreicht, den Be dingungen der isopyknischen Bandenbildung unterwirft und diese Stufe mindestens einmal mit einer weiteren Flüssigkeitsprobe mit einem Gehalt an HBV wiederholt, bevor man unter den Be dingungen der isopyknischen Bandenbildung für einen zur Erreichung des Gleichgewichtszustands ausreichenden Zeitraum fortfährt. Gegebenenfalls kann ein Gradient mit mehreren, d. h. bis etwa 6, Proben einer biologischen Flüssigkeit beladen werden. Da der Zeitraum, der erforderlich ist, um das HBV in der Flüssig keit in den Gradienten gelangen zu lassen, nur einen Bruch teil des Zeitraums ausmacht, der zur Erreichung des Gleichge wichtszustands erforderlich ist, und da der anschließende Zeitraum zur Erreichung des Gleichgewichtszustands unabhängig davon, ob der Gradient ein- oder mehrfach beladen ist, immer gleich lang ist, lassen sich wesentliche Zeit- und Kosten ersparnisse erzielen.It has also been found according to the invention that a Multiple loading of the isopycnic banding gradient one substantial productivity increase and a ver reduce operating costs. Under multiple loading is the process of understanding that a biological Liquid containing HBV for a period of time sufficient to contain essentially all of the HBV in the liquid ability to get into the gradient, but the Er reach the equilibrium state is not sufficient, the Be subject to conditions of isopycnic band formation and this Level at least once with another fluid sample with HBV content repeated before under Be conditions of isopycnic band formation for one to achieve of the state of equilibrium continues for a sufficient period of time. If necessary, a gradient with several, i. H. until about 6, samples of a biological fluid are loaded. There the period of time required to keep the HBV in the liquid to get into the gradient, just a fraction is part of the period of time required to achieve the weight condition is required, and since the subsequent Period of equilibrium independent whether the gradient is loaded one or more times, always is the same length, significant time and cost achieve savings.

Ferner wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß sich wesent liche Produktivitätssteigerungen und wesentliche Kostener sparnisse erzielen lassen, indem man die biologische Flüssig keit mit einer ausreichenden Menge an Ammoniumsulfat behandelt, um eine die Dane-Teilchen enthaltende Proteinfraktion auszu fällen, bevor man die Flüssigkeit den Bedingungen der isopykni schen Bandenbildung unterwirft. Im Fall von Plasma werden im allgemeinen etwa 200 bis etwa 250 g Ammoniumsulfat pro 1 Liter Plasma und vorzugsweise 225 g pro 1 Liter Plasma verwendet. Geringere Mengen bewirken keine vollständige Fällung von HB_sAg, während größere Mengen zu einer Fällung von zusätzlichem unerwünschtem Proteinmaterial führen. Aufgrund dieser Fällung können die Dane-Teilchen von etwa 20 Liter Plasma in einem Ansatz der isopyknischen Bandenbildung unterworfen werden, während ohne Ammoniumsulfatfällung nur etwa 1,5 Liter Plasma in einem einzigen Ansatz behandelt werden können.Furthermore, it was found according to the invention that substantial increases in productivity and substantial cost savings can be achieved by treating the biological liquid with a sufficient amount of ammonium sulfate to precipitate a protein fraction containing the Dane particles before the liquid is subjected to the conditions of isopykni subject to band formation. In the case of plasma, generally about 200 to about 250 g of ammonium sulfate are used per 1 liter of plasma, and preferably 225 g per 1 liter of plasma. Smaller amounts do not completely precipitate HB _s Ag, while larger amounts lead to a precipitation of additional undesirable protein material. Because of this precipitation, the Dane particles of about 20 liters of plasma can be subjected to isopycnic banding in one batch, while without ammonium sulfate precipitation, only about 1.5 liters of plasma can be treated in a single batch.

Nach dem Zusatz von Ammoniumsulfat wird die Flüssigkeit zur Unterstützung der Lösung des Ammoniumsulfats bewegt. Vorzugs weise wird die Flüssigkeit für mindestens etwa 3 Stunden bei geringen Temperaturen von etwa 2 bis etwa 10°C und vorzugs weise etwa 5°C bewegt. Vorzugsweise wird die Flüssigkeit mindestens etwa 4 Stunden bewegt. Eine zusätzliche Bewegung über etwa 4 Stunden hinaus ist unschädlich. Der gebildete Nieder schlag wird abzentrifugiert. Die dabei erhaltenen Pellets werden in Kochsalzlösung resuspendiert und zur Entfernung des Ammoniumsulfats gegen Kochsalzlösung dialysiert. Das erhaltene Flüssigkeitskonzentrat wird sodann der isopyknischen Banden bildung unter Verwendung eines Gradientenmaterials mit einem zulässigen Dichtebereich von etwa 1,1 bis etwa 1,4 g/cm³ unter worfen.After the addition of ammonium sulfate, the liquid is agitated to support the ammonium sulfate solution. The liquid is preferably moved for at least about 3 hours at low temperatures of about 2 to about 10 ° C. and preferably about 5 ° C. Preferably the liquid is agitated for at least about 4 hours. Additional movement beyond about 4 hours is harmless. The precipitate formed is centrifuged off. The pellets obtained are resuspended in saline and dialyzed against saline to remove the ammonium sulfate. The resulting liquid concentrate is then subjected to isopycnic banding using a gradient material with an allowable density range of about 1.1 to about 1.4 g / cm ³ .

Das Konzentrat an Dane-Teilchen findet sich im Dichtebereich von 1,23 bis 1,30 g/cm³.The concentrate of Dane particles is found in the density range from 1.23 to 1.30 g / cm ³ .

Das Konzentrat an Dane-Teilchen kann gereinigt werden, indem man es durch ein Gradientenmaterial, wie Saccharose, Kalium tartrat, Ficoll (synthetisches Polysaccharid) oder Natrium bromid, pelletiert.The concentrate of Dane particles can be cleaned by one through a gradient material like sucrose, potassium tartrate, Ficoll (synthetic polysaccharide) or sodium bromide, pelleted.

Die erhöhte Produktivität und die Kostensenkung, die sich durch die erfindungsgemäßen Verfahrensstufen der Ammoniumsulfat fällung und der Mehrfachbeladung erzielen lassen, werden erfindungsgemäß mit einem Natriumbromidgradienten erreicht.The increased productivity and the cost reduction that are reflected in the process steps of ammonium sulfate according to the invention Precipitation and multiple loading can be achieved according to the invention one Sodium bromide gradient reached.

Die isopyknische Bandenbildung wird bis zum Gleichgewichts zustand durchgeführt, indem man etwa 10 Stunden oder mehr bei etwa 40 000 bis etwa 80 000 zentrifugiert. Es wurde jedoch festgestellt, daß bei einer Zentrifugation der Flüssigkeit von etwa 4 Stunden im wesentlichen das gesamte HBV in den isopyknischen Bandenbildungsgradienten wandert. Anschließend wird die verbrauchte Flüssigkeitsprobe entfernt, worauf der Gradient mit einer frischen Flüssigkeitsprobe überschichtet wird. Anschließend kann, wie vorstehend erwähnt, etwa 10 Stunden oder mehr zentrifugiert werden, wodurch das HBV in beiden Proben in den Bereich der Gleichgewichtsdichte des Gradienten (1,23 bis 1,30 g/cm³) wandert und die Bandenbildung vervoll ständigt wird. Eine andere Möglichkeit besteht darin, 4 Stunden zu zentrifugieren, die verbrauchte Flüssigkeit zu entfernen und den Gradienten mit einer dritten frischen Flüssigkeitsprobe zu überschichten. Dieses Verfahren der Mehrfachbeladung kann 6mal oder noch öfter wiederholt werden, bevor die Banden bildung durch etwa 18stündige Zentrifugation vollendet wird.Isopycnic banding is carried out to equilibrium by centrifuging at about 40,000 to about 80,000 for about 10 hours or more. However, it was found that when the liquid was centrifuged for approximately 4 hours, essentially all of the HBV migrated in the isopycnic banding gradient. The used liquid sample is then removed, whereupon the gradient is covered with a fresh liquid sample. Then, as mentioned above, centrifugation can be carried out for about 10 hours or more, whereby the HBV in both samples migrates into the region of the equilibrium density of the gradient (1.23 to 1.30 g / cm ³ ) and the band formation is completed. Another possibility is to centrifuge for 4 hours, remove the used liquid and cover the gradient with a third fresh liquid sample. This multiple loading procedure can be repeated 6 or more times before the banding is completed by about 18 hours of centrifugation.

Das Verhältnis von Probenvolumen (Flüssigkeitsvolumen) zum Gradientenvolumen kann etwa 1 : 3 bis 1 : 6 betragen. Wird eine einzige Flüssigkeitsprobe auf den Gradienten aufgesetzt und unter den Bedingungen der isopyknischen Bandenbildung (etwa 16 bis etwa 20 Stunden bei 30 000 U/min in der KII-Zentrifuge oder für einen kürzeren Zeitraum bei höheren Geschwindigkeiten oder für einen längeren Zeitraum bei niedrigeren Geschwindig keiten) zentrifugiert, so weist das erhaltene Produkt je nach der Proteinmenge im ursprünglichen Plasma im allgemeinen einen Proteingehalt von etwa 2 bis 5 mg/ml in einem Volumen von 1,0 Liter auf.The ratio of sample volume (liquid volume) to Gradient volume can be approximately 1: 3 to 1: 6. Will one only liquid sample placed on the gradient and under the conditions of isopycnic banding (approx 16 to about 20 hours at 30,000 rpm in the KII centrifuge or for a shorter period of time at higher speeds or for a longer period at lower speeds centrifuged), the product obtained depends on the amount of protein in the original plasma is generally one Protein content of about 2 to 5 mg / ml in a volume of 1.0 Liters.

Wird der Gradient doppelt beladen und unter den Bedingungen der isopyknischen Bandenbildung zentrifugiert (etwa 16 bis etwa 20 Stunden bei 30 000 U/min oder für einen kürzeren Zeitraum bei höheren Geschwindigkeiten oder für einen längeren Zeitraum bei niedrigeren Geschwindigkeiten), so weist das erhaltene Pro dukt je nach der Proteinmenge im ursprünglichen Plasma einen Proteingehalt auf, der sich additiv aus den verwendeten Proben zusammensetzt. Im allgemeinen beträgt er im Fall von Plasma etwa 4 bis 10 mg/ml bei einem Volumen von 1,0 Liter. Die Pro teinkonzentration nimmt auf diese Weise bei jeder folgenden Beladung des Gradienten mit Flüssigkeit zu.If the gradient is loaded twice and under the conditions of centrifuged isopycnic banding (about 16 to about 20 Hours at 30,000 rpm or for a shorter period higher speeds or for a longer period of time at lower speeds), the obtained Pro depending on the amount of protein in the original plasma Protein content, which is additive from the samples used put together. Generally it is in the case of plasma about 4 to 10 mg / ml with a volume of 1.0 liter. The pro In this way, the concentration of the stone decreases with every subsequent one Loading the gradient with liquid.

Natriumbromid als Gradient hat im Vergleich zu bisher verwendeten Materialien entscheidende Vorteile. Die Löslichkeit von Natriumbromid ermöglicht die Verwendung von Lösungen hoher Dichte bei der Herstellung von Gradienten bei Kühlschranktemperatur (2 bis 6°C). Fener bietet die Ver wendung von Natriumbromid gegenüber anderen Salzen, wie Cäsium chlorid, entscheidende wirtschaftliche Vorteile. Ferner handelt es sich bei Ionen, die bei Verwendung eines Natriumbromidgradien ten aufgrund von biophysikalischen Gegebenenheiten an das HBV gebunden werden, um Natriumionen, die mit vielen biologischen Systemen besser verträglich sind.Sodium bromide as a gradient has been compared decisive advantages over previously used materials. The Solubility of sodium bromide enables the use of High density solutions in the manufacture of gradients Refrigerator temperature (2 to 6 ° C). Fener offers the ver use of sodium bromide over other salts such as cesium chloride, decisive economic advantages. Furthermore acts ions when using a sodium bromide gradien due to biophysical conditions to the HBV be bound to sodium ions with many biological Systems are better tolerated.

Die höhere Löslichkeit von Natriumbromid bei geringeren Tempe raturen im Vergleich zu Kaliumbromid ermöglicht die Verwendung von geringeren Temperaturen, was der Stabilität von biologischen Materialien besser zuträglich ist. Ein Stufengradient wird gegenüber einem linearen Gradienten bevorzugt, da dabei die Verunreinigungen an den Stufengrenzen angereichert werden und somit in einem einzelnen Gradienten ein größeres Plasmavolumen verarbeitet werden kann.The higher solubility of sodium bromide at lower temperatures temperatures compared to potassium bromide enables use of lower temperatures, which is the stability of biological Materials is more conducive. A step gradient is created preferred over a linear gradient, since the Impurities are enriched at the step limits and thus a larger plasma volume in a single gradient can be processed.

Die Dane-Teilchen können vom Natriumbromidgradienten abgetrennt werden, indem man den Gradienten mit einem Verdünnungsmittel, wie einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung, verdünnt und die Dane-Teilchen pelletiert. Die Teilchen können sodann in Form eines Konzentrats in einem entsprechenden Medium, wie tris-Kochsalz-Puffer gewonnen werden.The Dane particles can be separated from the sodium bromide gradient by changing the gradient with a diluent, like a saline solution buffered with phosphate, diluted and the Dane particles pelleted. The particles can then in Form a concentrate in an appropriate medium, such as tris sodium chloride buffer can be obtained.

Das Konzentrat an Dane-Teilchen kann ferner gereinigt werden, indem man es durch ein entsprechendes Medium, wie Saccharose mit einem Gehalt an einem Proteinstabilisator, z. B. Rinder serumalbumin (BSA), pelletiert. Das erhaltene Pellet kann sodann in einem entsprechenden Medium, wie tris-Puffer, mit einem Gehalt an einem Proteinstabilisator, z. B. BSA, resuspendiert werden. The concentrate of Dane particles can also be cleaned by passing it through an appropriate medium such as sucrose containing a protein stabilizer, e.g. B. cattle serum albumin (BSA), pelleted. The pellet obtained can then in an appropriate medium such as tris buffer a content of a protein stabilizer, e.g. B. BSA, resuspended will.

Das Konzentrat an Dane-Teilchen oder gereinigten Dane-Teilchen kann durch Behandlung mit Formalin inaktiviert, an ein physio logisch verträgliches Substrat, wie Alaun, absorbiert und als immunologisches Mittel verwendet werden.The concentrate of Dane particles or purified Dane particles can be inactivated by treatment with formalin, sent to a physio logically compatible substrate, such as alum, absorbed and as immunological agents can be used.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.The examples illustrate the invention.

Beispiel 1example 1

Der Rotor einer Zentrifuge (Electronucleonics K) wird mit 8400 ml Phosphatpuffer gefüllt. Nach einem Rotorlauf bis 10 000 U/min zur Entgasung des Systems wird der nachstehend angegebene Stufengradient in den Boden des stationären Rotors gepumpt:The rotor of a centrifuge (Electronucleonics K) is 8400 ml of phosphate buffer filled. After a rotor run of up to 10,000 rpm for degassing the system is the one given below Step gradient pumped into the bottom of the stationary rotor:

1. 2400 ml 10% NaBr, p = 1,081. 2400 ml 10% NaBr, p = 1.08
2. 1000 ml 20% NaBr, ρ = 1,172. 1000 ml 20% NaBr, ρ = 1.17
3. 1500 ml 30% NaBr, ρ = 1,283. 1500 ml of 30% NaBr, ρ = 1.28
4. 3500 ml 40% NaBr, ρ = 1,414. 3500 ml 40% NaBr, ρ = 1.41

In den Kopf des stationären Rotors werden 1750 ml Plasma mit einem Gehalt an HB_sAg gepumpt, wodurch 1750 ml 40prozentiges NaBr vom Rotorboden verdrängt werden. Der Rotor wird sodann auf 30 000 U/min beschleunigt und 4 Stunden bei dieser Ge schwindigkeit betrieben. Anschließend wird der Rotor gestoppt und 1750 ml 40prozentiges NaBr werden in den Boden gepumpt, wodurch das Plasma aus dem Rotorkopf gedrückt wird. Sodann werden weitere 1750 ml frisches Plasma mit einem Gehalt an HB_sAg in den Rotorkopf gepumpt, wodurch ein entsprechendes Volumen an 40prozentigem NaBr am Rotorboden verdrängt wird. Sodann wird der Rotor 18 Stunden bei 30 000 U/min betrieben. Nach dem Stoppen des Rotors werden 1000 ml an Dane-Teilchen reichem Material im Dichtebereich von 1,23 bis 1,30 g/cm³ gewonnen.1750 ml of plasma containing HB _s Ag are pumped into the head of the stationary rotor, whereby 1750 ml of 40 percent NaBr are displaced from the rotor base. The rotor is then accelerated to 30,000 rpm and operated for 4 hours at this speed. The rotor is then stopped and 1750 ml of 40 percent NaBr are pumped into the ground, causing the plasma to be pushed out of the rotor head. A further 1750 ml of fresh plasma containing HB _s Ag are then pumped into the rotor head, as a result of which a corresponding volume of 40 percent NaBr is displaced at the rotor base. The rotor is then operated at 30,000 rpm for 18 hours. After the rotor has stopped, 1000 ml of material rich in Dane particles in the density range from 1.23 to 1.30 g / cm ^{3 are} obtained.

Die Dane-Teilchen (HBV) werden folgendermaßen von der Natrium bromid-Zonalfraktion abgetrennt. Die Zonalfraktion (1000 ml) wird mit 3000 ml mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung ver dünnt. Dieses Material wird sodann in 12 Rotorgefäße aus Kunststoff vom Typ 19 gebracht (250 ml/Gefäß). Sodann wird das Material unter Verwendung eines Rotors vom Typ 19 (Beckman) zentrifugiert. Der Rotor wird 24 Stunden bei 17 000 U/min (45 000 g) betrieben, um die Dane-Teilchen zu pelletieren. Sodann wird der Rotor gestoppt. Der Überstand wird aus den Gefäßen dekantiert. Das Pelletmaterial aus allen 12 Gefäßen wird in einem Gesamtvolumen von 5 bis 7 ml tris-Kochsalz-Puffer aufgenommen. Dieses Produkt wird als Dane-Teilchen-Konzentrat bezeichnet.The Dane particles (HBV) are made of sodium as follows bromide zonal fraction separated. The zonal fraction (1000 ml) is ver with 3000 ml of phosphate buffered saline thins. This material is then made into 12 rotor vessels Plastic type 19 brought (250 ml / jar). Then will the material using a type 19 rotor (Beckman) centrifuged. The rotor will run at 17,000 rpm for 24 hours (45,000 g) operated to pellet the Dane particles. The rotor is then stopped. The supernatant is made from the Decanted vessels. The pellet material from all 12 vessels is in a total volume of 5 to 7 ml of tris-sodium chloride buffer added. This product is called Dane Particle Concentrate designated.

Beispiel 2Example 2

Das Dane-Teilchen-Konzentrat wird weiter gereinigt, um restliche Spuren an Antikörperprotein zu entfernen. 1 ml des Dane-Konzen trats von Beispiel 1 wird auf 4 ml tris-Puffer mit einem Gehalt an 20 Prozent Saccharose und 1 Prozent Rinderserumalbumin (BSA) in einem SW 65-Rotor (Beckman) mit Cellulosenitrat-Röhrchen der Abmessungen 1,3 × 5,1 cm geschichtet. Die Teilchen werden 4 Stunden bei 35 000 U/min (125 000 g) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird die überstehende Flüssigkeit dekantiert und die Pellets werden unter Verwendung eines Wattestäbchens (mit Puffer vorbefeuchtet) vorsichtig in 0,5 ml tris-Puffer mit einem Gehalt an 1 Prozent BSA resuspendiert. Der Watte tupfer wird sodann mit 0,5 ml Puffer gespült. Das Endvolumen des Dane-Teilchenmaterials beträgt 1 ml. Die Dane-Teilchen werden bei -70°C aufbewahrt.The Dane Particle Concentrate is further cleaned to remove residual Remove traces of antibody protein. 1 ml of the Dane Concentrate trats of Example 1 is made up of 4 ml of tris buffer 20 percent sucrose and 1 percent bovine serum albumin (BSA) in a SW 65 rotor (Beckman) with cellulose nitrate tubes of the dimensions 1.3 × 5.1 cm layered. The particles are Centrifuged for 4 hours at 35,000 rpm (125,000 g). After The supernatant liquid is decanted by centrifugation and the pellets are made using a cotton swab (pre-moistened with buffer) carefully in 0.5 ml tris buffer resuspended at 1 percent BSA. The cotton wool swab is then rinsed with 0.5 ml buffer. The final volume of the Dane particle material is 1 ml. The Dane particles are stored at -70 ° C.

Beispiel 3Example 3

Das gemäß Beispiel 1 hergestellte Dane-Teilchen-Konzentrat (Typ Ad) wird auf einen Natriumbromidgradienten mit einem Dichte bereich von 1,1 bis 1,4 g/cm³ aufgesetzt. Die Dane-Teilchen mit einer Dichte von 1,23 bis 1,30 g/cm³ werden abgetrennt. The Dane particle concentrate (type Ad) produced according to Example 1 is placed on a sodium bromide gradient with a density range from 1.1 to 1.4 g / cm ³ . The Dane particles with a density of 1.23 to 1.30 g / cm ³ are separated off.

Dieses Antigen enthält etwa 10¹⁰ 42 nm-Dane-Teilchen. Dieses Material wird unter aseptischen Bedingungen 72 Stunden bei 37°C mit 1 : 4000 Formalin behandelt. Das überschüssige Formalin wird mit Natriumhydrogensulfit neutralisiert.This antigen contains about 10 ¹⁰ 42 nm Dane particles. This material is treated with 1: 4000 formalin for 72 hours at 37 ° C under aseptic conditions. The excess formalin is neutralized with sodium bisulfite.

Sodann wird das Antigen bei einem pH-Wert von 6,8 an 10prozenti gem Alaun (KAl(SO₄)₂ · 12 H₂O) adsorbiert. Einer Gruppe von Meer schweinchen werden intramuskulär 3 Dosen von je 0,5 ml des an Alaun adsorbierten Antigens in monatlichen Abständen injiziert. Dieses Antigen induziert bei diesen Tieren Kreislauf-HB_sAb.The antigen is then adsorbed at a pH of 6.8 to 10 percent alum (KAl (SO ₄ ) ₂ .12 H ₂ O). A group of guinea pigs is injected intramuscularly with 3 doses of 0.5 ml of the antigen adsorbed on alum at monthly intervals. This antigen induces circulatory HB _s Ab in these animals.

Beispiel 4Example 4

Man verfährt wie in Beispiel 3, mit der Abänderung, daß man Dane-Teilchen vom Typ Ay und eine andere Gruppe von Meer schweinchen verwendet. Das Antigen induziert bei den Meerschwein chen Kreislauf-HB_sAb.The procedure is as in Example 3, except that Dane particles of the Ay type and another group of sea pigs are used. The antigen induces circulatory HB _s Ab in guinea pigs.

Beispiel 5Example 5

20 Liter Plasma von Hepatitis B-Spendern werden durch Filtration durch ein 293 mm-Filter mit einem Gehalt an einer Ap 20-Filter membran (Millipore) geklärt. Sodann wird das Filtrat mit 4,53 kg Ammoniumsulfat versetzt und anschließend bei 5°C über Nacht leicht bewegt. Der gebildete Niederschlag wird absatzweise durch 30minütige Zentrifugation bei 7000 g unter Verwendung eines JA-10-Rotors (3 Liter Fassungsvermögen pro Ansatz) gewonnen. Die nach der Zentrifugation erhaltenen Pellets werden in 2,25 Liter Kochsalzlösung suspendiert. Die konzentrierte Suspension wird sodann gegen 40 Liter Kochsalzlösung dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu entfernen.20 liters of plasma from hepatitis B donors are filtered through a 293 mm filter containing an Ap 20 filter membrane (Millipore) clarified. Then the filtrate with 4.53 kg Ammonium sulfate and then at 5 ° C overnight easily moved. The precipitate formed is batch by Centrifugation at 7000 g for 30 minutes using a JA-10 rotor (3 liter capacity per batch) won. The pellets obtained after centrifugation are in 2.25 Liters of saline suspended. The concentrated suspension is then dialyzed against 40 liters of saline to obtain the Remove ammonium sulfate.

Sodann wird der Rotor einer Zentrifuge (Electronucleonics K) mit 8400 ml Phosphatpuffer gefüllt. Nach einem Rotorlauf bis 10 000 U/min zur Entgasung des Systems wird der nachstehend angegebene Stufengradient von unten in den stationären Rotor gepumpt.Then the rotor of a centrifuge (Electronucleonics K) filled with 8400 ml phosphate buffer. After a rotor run up 10,000 RPM for degassing the system is as follows specified step gradient from below into the stationary rotor pumped.

1. 2400 ml 10% NaBr, ρ = 1,081. 2400 ml 10% NaBr, ρ = 1.08
2. 1000 ml 20% NaBr, ρ = 1,172. 1000 ml 20% NaBr, ρ = 1.17
3. 1500 ml 30% NaBr, ρ = 1,283. 1500 ml of 30% NaBr, ρ = 1.28
4. 3500 ml 40% NaBr, ρ = 1,414. 3500 ml 40% NaBr, ρ = 1.41

2250 ml der vorstehend erhaltenen dialysierten Suspension werden in den Kopf des stationären Rotors gepumpt, wodurch 2250 ml 40prozentiges Natriumbromid vom Rotorboden verdrängt werden. Der Rotor wird sodann auf 30 000 U/min beschleunigt und 18 Stunden bei dieser Geschwindigkeit betrieben. Nach dem Stoppen des Rotors werden 1300 ml Dane-Teilchen-Material im Dichtebereich von 1,23 bis 1,30 gewonnen. Die Dane-Teilchen werden sodann gemäß Bei spiel 1 aus den Natriumbromid-Zonenfraktionen unter Gewinnung des Dane-Teilchen-Konzentrats abgetrennt.2250 ml of the dialyzed suspension obtained above are pumped into the head of the stationary rotor, making 2250 ml 40 percent sodium bromide are displaced from the rotor bottom. The The rotor is then accelerated to 30,000 rpm and 18 hours operated at this speed. After stopping the rotor become 1300 ml of Dane particle material in the density range of 1.23 won up to 1.30. The Dane particles are then according to Bei game 1 from the sodium bromide zone fractions under recovery separated from the Dane particle concentrate.

Claims

1. Verfahren zum Konzentrieren von Dane-Teilchen aus menschlichen biologischen Flüssigkeiten mit einem Gehalt an HB_sAg und Dane-Teilchen, bei dem man die Flüssigkeit der isopyknischen Bandenbildung unterwirft und die an Dane-Teil chen reichen Fraktionen gewinnt, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bandenbildung in einem Natriumbromiddichtegradienten durchführt.1. A method for concentrating Dane particles from human biological fluids containing HB _s Ag and Dane particles, in which the liquid is subjected to the isopycnic band formation and the fractions rich in Dane particles are obtained, characterized in that performs banding in a sodium bromide density gradient.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Dichtegradienten einen Stufengradienten und als biolo gische Flüssigkeit Plasma verwendet. 2. The method according to claim 1, characterized in that one a step gradient as density gradient and as biolo liquid plasma is used.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die isopyknische Bandenfraktion mit einem Dichtebereich von 1,23 g/cm³ bis 1,30 g/cm³ der Zentrifugation unterwirft, bis die Dane-Teilchen eine Bande gebildet haben.3. The method according to claim 1, characterized in that the isopycnic band fraction with a density range of 1.23 g / cm ³ to 1.30 g / cm ^{3 is} subjected to centrifugation until the Dane particles have formed a band.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die menschliche biologische Flüssigkeit mit einem Gehalt an Dane-Teilchen und HB_sAg der isopyknischen Bandenbildung in einem Dichtegradienten unter Bedingungen, die bewirken, daß im wesentlichen die gesamten Dane-Teilchen in der Flüssigkeit in den Dichtegradienten gelangen, die aber nicht das Erreichen des Gleichgewichtszustands bewirken, unterwirft, die ver brauchte Flüssigkeit entfernt und die erste Stufe mit einer frischen Flüssigkeitsprobe mindestens einmal wiederholt. 4. The method according to claim 1, characterized in that the human biological fluid containing Dane particles and HB _s Ag of isopycnic banding in a density gradient under conditions which cause essentially all of the Dane particles in the liquid get into the density gradient, but do not bring about equilibrium, subject, remove the ver used liquid and repeat the first step with a fresh liquid sample at least once.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der isopyknischen Bandenbildung eine Proteinfraktion mit einem Gehalt an Dane-Teilchen durch Behandlung der Flüssigkeit mit einer zur Ausfällung der Dane- Teilchen ausreichenden Menge an Ammoniumsulfat ausfällt, den Niederschlag dialysiert und den dialysierten Niederschlag im Dichtegradienten der Bandenbildung unterwirft.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized characterized that one before the isopycnic band formation a protein fraction containing Dane particles Treatment of the liquid with a to precipitate the dan- Particle sufficient amount of ammonium sulfate fails Precipitate dialyzed and the dialyzed precipitate in Subjects density gradient to band formation.

6. Dichtegradient, erhalten nach dem Verfahren von Anspruch 4.6. density gradient obtained by the method of claim 4.

7. Präparat mit einem Gehalt an gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 erhaltenen Dane-Teilchen in einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung oder an einem physiologisch verträglichen Substrat adsorbiert.7. Preparation containing according to one of claims 1 to 5 obtained Dane particles in one with phosphate buffered saline or on a physiological compatible substrate adsorbed.

8. Präparat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es als mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung einen tris-Koch salz-Puffer enthält.8. A preparation according to claim 7, characterized in that it as a tris-cook as saline buffered with phosphate contains salt buffer.

9. Präparat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der tris-Kochsalz-Puffer einen Gehalt an einem Proteinstabilisator enthält.9. A preparation according to claim 8, characterized in that the tris-saline buffer contains a protein stabilizer contains.

10. Präparat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es als Proteinstabilisator Rinderserumalbumin enthält.10. A preparation according to claim 9, characterized in that it contains bovine serum albumin as a protein stabilizer.

11. Präparat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es als Substrat Alaun enthält. 11. A preparation according to claim 7, characterized in that it contains alum as substrate.

12. Präparat nach Anspruch 7, enthaltend ein wässeriges Medium mit einem Gehalt an an einem physiologisch verträglichen Substrat adsorbierten Dane-Teilchen.12. A preparation according to claim 7, containing an aqueous medium containing a physiologically acceptable Substrate adsorbed Dane particles.

13. Präparat nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es als Substrat Alaun enthält.13. A preparation according to claim 12, characterized in that it contains alum as substrate.