DE2729459A1

DE2729459A1 - Unloesliche enzyme, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung

Info

Publication number: DE2729459A1
Application number: DE19772729459
Authority: DE
Inventors: Shmuel Amotz; Tage Kjaer Nielsen; Barrie Edmund Norman; Poul Boorge Rosenius Poulsen
Original assignee: Novo Industri AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1976-07-02
Filing date: 1977-06-30
Publication date: 1978-01-12
Also published as: IT1112120B; FR2356665B1; NL7707233A; ZA773580B; DK292177A; AR210710A1; FR2356665A1; MX4281E; AU508098B2; DK146417B; AU2619677A; JPS6117470B2; SU921470A3; DK146417C; BR7704346A; ES460304A1; GB1571987A; JPS539389A; CA1072029A; BE856365A

Description

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NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsvaerd / Dänemark

Unlösliche Enzyme, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

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Beschreibung

Unlösliche Enzyme, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

Die Erfindung betrifft unlöslich gemachte Enzyme und ein Verfahren zur Herstellung unlöslich gemachter Enzymprodukte.

Insbesondere betrifft die Erfindung teilchenförmige, physikalisch stabilisierte Formen von unlöslich gemachten verzuckernden Enzymen aus der Gruppe von Amyloglucosidase und maltogener a-Araylase, die beide gewöhnlich pilzlichen Ursprungs sind, sowie ein Verfahren zur Herstellung derartiger unlöslich gemachter Enzymprodukte.

Es ist aus technologischen sowie aus wirtschaftlichen Gründen immer bedeutsamer geworden, extrazelluläre und intrazelluläre, in Wasser lösliche Enzyme unlöslich zu machen (oder zu immobilisieren), d.h. die katalytisch wirksamen (nativen) Enzyme in einer unlöslich gemachten, festen oder quasi-festen, geformten' oder formbaren Struktur zu fixieren, um ein spezielles Enzyraprodukt in ansatzweisen Verfahren erneut verwendbar oder für

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die kontinuierliche Arbeitsweise in sogenannten Enzym-Reaktoren geeignet zu machen.

In den letzten Jahnen wurden Anstrengungen besonders hinsichtlich der Entwicklung der Immobilisierungs-Technologie bei der stärkeverarbeitenden Industrie in Verbindung mit der Herstellung von Produkten, wie Sirups mit hohem Dextrose- und hohem Fructose-Gehalt,unternommen. In der letzten Zeit hat die Bei deutung solcher Produkte bei der Nahrungsmittel-Industrie und verwandten Industrien zugenommen, da Sirup mit hohem Fructosegehalt einen vorteilhaften Ersatz für Saccharose und für den (weniger süßen) Sirup mit hohem Dextrosegehalt darstellt. Es werden zwei weitere Arten von Zuckersirups, die auf der Hydrolyse von Stärke basieren und beide einen bedeutenden Maltosegehalt aufweisen, nämlich Zuckerdicksaft mit hohem Maltosegehalt ("high maltose syrup") und Zuckerdicksaft mit hohem Umwandlungsgrad ("high conversion syrup") in steigendem Ausmaß besonders in der Konfekt-Industrie (Bonbons bzw. "hard candy") bzw. der Konservenfabrikation verwendet.

Das gesamte industrielle Verfahren zur Umwandlung von Stärke über Sirup mit hohem Dextrosegehalt in Sirup mit hohem Fructosegehalt umfaßt drei aufeinanderfolgende Stufen, nämlich das Verfahren zur Verdünnung bzw. Verflüssigung von Stärke zu Dextrinen, das durch Säure und/oder eine bakterielle a-Amylase katalysiert ist, gefolgt von der Verzuckerung zu einem Sirup mit hohem Dextrosegehalt und anschließender Umwandlung des letzteren in einen Sirup mit hohem Fructosegehalt, wobei jedes Verfahren durch sein spezifisches Enzym katalysiert wird, nämlich Amyloglucosidase bzw. Glucoseisomerase. Während die jüngste technologische Entwicklung kontinuierliche Verfahren für sowohl die erste als auch die dritte Stufe der vorstehenden Reaktionsfolge möglich gemacht hat, erfolgt die industrielle Verzuckerung weiterhin vorwie- . gend gemäß einem ansatzweise durchgeführten Verfahrenstyp. Das Ausgangsmaterial für den Siruptyp mit hohem Maltosegehalt ist ebenfalls verflüssigte Stärke, die nach einer der

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eben beschriebenen Methoden hergestellt wurde. Jedoch wird in diesem Falle der anschließende Verzuckerungsschritt, der zu einem Sirup mit hohem Maltosegehalt (und gewöhnlich relativ geringem Glucpsegehalt) führt, mittels maltogener Amylase, vorzugsweise einer pilzlichen a-Amylase, durchgeführt. Wie die glucogene Verzuckerung, führt man das entsprechende maltogene Verfahren gewöhnlich ansatzweise unter Verwendung des löslichen Enzyms durch.

Obwohl die Zweckmäßigkeit einer völlig kontinuierlichen Reaktionsfolge auf der Hand liegt, befindet sich die Entwicklung von industriellen Enzym-Reaktor-Techniken unter Anwendung von unlöslich gemachter Amyloglucosidase bei der Verzuckerungsstufe noch im Anfangsstadium·

Es finden sich bisher bereits einige Hinweise auf die Unlöslichmachung von Amyloglucosidase, beispielsweise durch Bindung des Enzyms an unlösliche anorganische oder organische Träger. Jedoch scheint es, daß nur einige dieser Methoden über den Laboratoriurasmaßstab hinaus entwickelt wurden. Unter diesen Methoden, die offenbar dieses Stadium überschritten haben, sei speziell die Immobilisierung von Amyloglucosidase durch covalente Bindung an poröse Teilchen von Glas oder Keramikmaterial genannt. In diesem Zusammenhang sei auf eine neuere Veröffentlichung von D.O. Lee et al. in "Die Stärke", Band 27 (1975) Seiten 384-387 hingewiesen.

Bei einem kontinuierlichen Verfahren, in dem eine Säule in der Größe einer industriellen Anlage mit diesem teilchenförmigen Enzymprodukt gefüllt wurde und mit Lösungen von handelsüblichen Dextrinen beschickt wurde, erzielte man Umwandlungsgrade in Dextrose, die sich der minimalen Umwandlung von etwa 92 % näherten, die im allgemeinen in einem ansatzweise durchgeführten Verzuckerungsverfahren mit löslicher Amyloglucosidase erforderlich ist. Jedoch zeigten Produktanalysen, daß Umkehr-Reaktionen, d.h. die durch Amyloglucosidase katalysierte Rückpolymerisation von Glucose zu Maltose,

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Isomaltose und höheren Oligomeren, in einem größeren Ausmaß bei einem in der Säule durchgeführten Verfahren auftritt als in ansatzweise durchgeführten Verfahren mit freiem Enzym.

Das Phänomen der gesteigerten Umkehr-Reaktion, das bei einem immobilisierten Enzymprodukt dieser Art auftritt, scheint zumindest teilweise einen Nachteil darzustellen, der der Anwendung von porösen Enzym-Trägermaterialien innewohnt. In deutlicher Weise stellt die poröse Struktur einen wesentlichen Beitrag zur Gesamtoberfläche, die sich der Enzymbindung anbietet, und dementsprechend zur maximalen Enzymaktivität, die von dem immobilisierten Enzymprodukt erzielt werden kann, dar.

Jedoch führt die hohe Konzentration an Amyloglucosidase, die an die Porenoberfläche des Trägers gebunden ist, in Verbindung mit einer verringerten Diffusionsgeschwindigkeit innerhalb der Poren, unvermeidlich zu hohen lokalen Glucosekonzentrationen, wodurch günstige Bedingungen zur Förderung von Enzymverfahren mit hohen K -Werten gebildet werden. Genau dies ist bei den unerwünschten Umkehr-Reaktionen, und insbesondere bei solchen der Fall, bei denen Isomaltose und Isoraaltriose gebildet werden.

Ein unlöslich gemachtes maltogenes a-Amylaseprodukt, das durch Bindung des löslichen Enzyms an Aminoäthylcellulose mittels Glutaraldehyd hergestellt wird, wird in der US-PS 4 011 13 7 (Thompson et al.) beschrieben. Jedoch ist hiernach die beabsichtigte Verwendung für das immobilisierte Enzym auf die Steigerung der Umwandlung von dextrinisierter Stärke in Glucose mittels eines in gleicher Weise immobilisierten Amyloglucosidase-Präparats beschränkt, wobei das Verzuckerungsverfahren mittels eines Gemischs der beiden immobilisierten Enzyme durchgeführt wird. In dem Patent befindet sich kein Hinweis auf die Verwendung von immobilisierter maltogener a-Amylase zur Herstellung eines Sirups mit hohem Maltosegehalt.

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Ein weiterer Nachteil,der in der Anwendung eines teilchenförmig immobilisierten verzuckernden Enzyms liegt, bei dem das Enzym an ein poröses oder vernetztes Material gebunden ist, das im wesentlichen in der teilchenförmigen Struktur homogen ist, ist ersichtlich, wenn man die Heterogen!tat der Molekülgröße der dextrinisierten Stärke in Betracht zieht, die als Substrat dient. Alle Dextrine, unabhängig davon, ob sie durch saure oder enzymatische Hydrolyse von Stärke hergestellt wurden, enthalten beträchtliche Fraktionen an GIucose-Oligomeren. Normalerweise wird das Stärke-Verdünnungs-Verfahren unterbrochen, wenn die durchschnittliche Kettenlänge des Hydrolysats in der Größenordnung von 6 bis 10 GIucoseresten liegt, und es ist vorstellbar, daß die bloße sterische Hinderung die Diffusion der größeren Dextrinmoleküle an die nach einer gewissen Tiefe innerhalb der Poren der vernetzten Teilchenstruktur eingebetteten Enzymstellen verhindern kann.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verhinderung oder zumindest die Abschwächung der wesentlichen Nachteile, die sich aus den vorstehenden bekannten immobilisierten verzuckernden Enzymprodukten ergeben, durch Schaffung eines unlöslich gemachten Produkts mit Verfahrenscharakteristika, die im wesentlichen denen des löslichen Enzyms gleich sind, unabhängig davon, ob das immobilisierte Produkt ansatzweise oder in einer kontinuierlichen Verfahrensweise eingesetzt wird.

Im Falle einer immobilisierten Amyloglucosidase führt dieses Erfordernis zur Möglichkeit, ein kontinuierliches Verzuckerung sver fahr en unter solchen praktisch anwendbaren Verfahrensbedingungen (d.h. bezogen auf die Zusammensetzung und die Fließgeschwindigkeit der Dextrinbeschickung) durchführen zu können, daß man eine Glucosekonzentration von mindestens 92 % erhält, wobei die Gesamtkonzentration an Disacchariden (Maltose und Isomaltose) und Trisacchariden (hauptsächlich Panose und Isomaltotriose) etwa 4 bzw. 1 % nicht übersteigt.

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Im Falle Jer immobilisierten maltogenen a-Amylase wären die entsprechenden erforderlichen Umwandlungs-Parameter etwa 40-60 % Maltose, 25-35 % Maltotriose und vorzugsweise weniger als 10 % Glucose. ·

Da die handelsüblichen löslichen verzuckernden Enzyme relativ billig und hochwirksam sind, liegt ein weiteres bevorzugtes Ziel der Erfindung in der Schaffung von wirtschaftuch günstigen unlöslich gemachten Produkten. Die Verfolgung dieses Ziels· erfordert die Verwendung von vergleichsweise billigen, im Handel leicht erhältlichen Trägern und anderer Hilfsmaterialien und darüber hinaus die Erzielung der wesentlichen Erhaltung der Enzym-Aktivitäten bei dem Immobilisierungsverfahren. Darüber hinaus sollten aus toxikologischen Gründen alle verwendeten Materialien für Zwecke der Nahrungsmittelverarbeitung brauchbar sein.

Kurz gesagt, werden diese Ziele durch die vorliegende Erfindung erreicht, durch die ein immobilisiertes bzw. unbeweglich gemachtes verzuckerndes Enzyroprodukt in teilchenartiger Form bereitgestellt wird, bei dem enzymatisch inerte, wasserunlösliche Trägerteilchen im wesentlichen mit einer von Flüssigkeit durchdringbaren bzw. permeablen proteinhaltigen Schicht,in der das verzuckernde Enzym durch Quervernetzung mit Glutaraldehyd immobilisiert ist, überzogen sind.

Versuche zur Herstellung derartiger unlöslich geraachter Produkte, bei denen die proteinhaltige Schicht aus dem mit Glutaraldehyd quervernetzten verzuckernden Enzym per se besteht, waren nicht erfolgreich, da sie, unabhängig von der Wahl des Kernmaterials, zu unvollständig immobilisierten Produkten führten, aus denen die Enzyme rasch ausgelaugt wurden. Ähnliche Probleme ergaben sich bei einer Vielzahl von in Wasser unlöslichen teilchenförmigen Trägermaterialen anorganischen (beispielsweise mineralischen oder keramischen) Ursprungs oder mit bestimmten Arten von proteinhaltigem Kernmaterial (wie granulärem Sojaprotein), wahrscheinlich wegen einer un-

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genügenden Anzahl von QuerverbindungssLellen an der Obeifläche derartiger Teilchen.

Es wurde jedoch nunmehr gefunden, daß diese und andere Hindernisse überwunden werden können und die physikalischen und enzymatischen Eigenschaften der immobilisierten, mit Enzym überzogenen Produkte stark verbessert werden können, wenn man granuläres Casein als Kerntnaterial verwendet und darüber hinaus, eine Glutaraldehyd-Quervernetzung des Enzyms in der Überzugsschicht in Anwesenheit eines wasserlöslichen, nicht-enzymatischen Protein-Bindemittels, wie Ei-Albumen, bewirkt wird, wobei die Wahl dieser Materialien offensichtlich eine günstige Kombination zur Schaffung einer ausreichenden Anzahl von Inter-Protein-Enzym-stabilisierenden Quervernetzungen darstellt.

So wird spezieller gemäß einem Merkmal der Erfindung ein immobilisiertes verzuckerndes Enzymprodukt in Teilchenform geschaffen, worin das verzuckernde Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe von Amyloglucosidase und maitogener a-Amylase, und dieses Produkt aus Trägerteilchen besteht, die im wesentlichen aus granulärem Casein bestehen und im wesentlichen mit einer von Flüssigkeit durchdringbaren bzw. flüssigkeitspermeablen proteinhaltigen Schicht überzogen sind, in der das verzukkernde Enzym mittels Glutaraldehyd mit Ei-Albumen bzw. Eiweiß co-quervernetzt ist.

Die jeweiligen Mengen von verzuckernden Enzymbestandteilen, Casein und Albumen bzw. Eiweiß, können innerhalb weiter Grenzen variieren, unter anderem in Abhängigkeit der Aktivitätseinheit (wie sie später definiert wird) des löslichen verzukkernden Enzytn-Ausgangsmaterials. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt jedoch das Verhältnis von verzuckerndem Enzym : Casein im Bereich von 1:200 bis 1:3, vorzugsweise 1:20 bis 1:5, wobei die Menge an verzuckerndem Enzym auf der Basis eines Produkts mit einer Reinheit von mindestens 50 % berechnet wird« In gleicher Weise liegt ein bevorzugter Bereich des Verhältnisses von verzuckerndem Enzym:

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Ei-Albumen bei 1:5 bis 1:0,05 und besonders bevorzugt bei 1:2 bis 1:0,2.

Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten verzuckernden Enzymprodukts in Teilchenform geschaffen, wobei das verzuckernde Enzym ausgewählt wird aus der Gruppe von Amyloglucosidase und maltogener a-Amylase; das Verfahren besteht darin, im wesent_r liehen Trägerteilchen, die hauptsächlich aus granulärem Casein bestehen, mit einer proteinhaltigen Schicht zu überziehen, in der das verzuckernde Enzym mit Ei-Albumen bzw. Eiweiß mittels Glutaraldehyd co-quervernetzt ist.

Genauer umfaßt dieses Verfahren die Stufen der Benetzung einer trockenen Mischung von granulärem Casein und von Ei-Albumenpulver durch kräftiges Verrühren mit einem wäßrigen Gemisch aus dem verzuckernden Enzym und Glutaraldehyd, gelöst beim pH-Wert 4-7, wobei das Eiweiß anstelle der Vermischung im Trokkenzustand mit Casein, gegebenenfalls zusammen mit diesen Bestandteilen, gelöst ist; anschließend folgt eine Stufe, bei der die resultierende befeuchtete Mischung in einem Ruhezustand, gewöhnlich bei Raumtemperatur, gehalten wird, um das kombinierte Träger-Überzugs- und Protein-Quervernetzungs-Verfahren zu vervollständigen. Das Vermischen kann entweder manuell, beispielsweise durch sorgfältiges Vermischen und Verkneten in einem Mörser, oder mechanisch, beispielsweise in einem Horizontalmischer vom Pflugschar-Typ (erhältlich von Gebrüder Lödige Maschinenbau-GmbH, Paderborn, Westdeutschland), oder einer ähnlichen Art einer industriellen Mischvorrichtung durchgeführt werden.

Das Verhältnis von Glutaraldehyd [der gewöhnlich als 50%-ige (Gew./Gew.) wäßrige Lösung zugefügt wird] zu den Proteinen der Überzugsschicht (Enzym plus Albumen) kann betrachtlich variieren; der bevorzugte Bereich liegt bei 0,1 bis 1. Der Wassergehalt der wäßrigen Lösung wird gewöhnlich auf den Bereich von 30 bis 60 % des gesamten Gemischs eingestellt.

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Die Eigenschaften des granulären Caseinprodukts, das als Trägermaterial gewählt wurde, sind bedeutsam zur Erzielung der erfindungsgemäßen Gegenstände. So sollten die Caseingranulate eine ausreichende physikalische Stabilität aufweisen, um einer wesentlichen Deformation bei der Durchtränkung unter Bedingungen eines gefüllten Säulenbetts zu widerstehen. Außerdem sollte der Quellgrad in Wasser ausreichend niedrig sein und vorzugsweise 200 % nicht überschreiten. Ein Beispiel für einProdukt, das diesen Erfordernissen entspricht, ist durch Säure ausgefälltes granuläres Casein. Als Nahrungsmittel geeignete Produkte dieser Art, die vorzugsweise Teilchendurchmesser im Bereich von 100 bis 500 Mikron aufweisen, sind von verschiedenen Quellen erhältlich, beispielsweise von der französischen Firma Scerma S.A. Die Bewertung durch Raster-Elektronenmikroskope zeigt, daß die Oberfläche derartiger Teilchen eine sehr unebene und unregelmäßig gefaltete Struktur aufweist, die eine gewisse Ähnlichkeit mit dem makroskopischen Aussehen von Bimsstein hat. Es kann angenommen werden, daß eine Oberflächen-Mikrostruktux" dieser Art eine große Anzahl von Bindungsstellen für Glutaraldehyd aufweist.

Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung ist es wesentlich, daß eine beträchtliche Fraktion des als Protein-Bindemittel verwendeten Albumens fast unmittelbar in Wasser löslich ist. Daher handelt es sich bei dem bevorzugten Grad von Albumen um ein allgemein erhältliches sprühgestrocknetes Produkt.

Das Mischverfahren kann zu einem gewissen Agglomerationsausmaß der überzogenen Teilchen führen, was zu einer Vervollständigung der Quervernetzungsreaktion unter Bildung eines feuchten, grobgranularen und klumpigen Produkts führt. Dieses Produkt kann einer weiteren Desintegration, beispielsweise durch Granulieren, unter Bildung eines teilchenförmigen Produkts mit Teilchengrößen im bevorzugten Bereich unterzogen werden. Die Granulation kann auf einem Oszillationsgranulator erfolgen, vom Typ,der im Handel von verschiedenen Firmen erhätlich ist (Diaf, Kopenhagen,oder Manosty, Liverpool). Das granulierte

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Produkt, das durch ein Granulationssieb mit beispielsweise Löchern von 1-2 mm hindurchgeht, kann in üblicher Weise von feinen Materialien befreit werden. Das so erhaltene Produkt kann gegebenenfalls* gewaschen werden, worauf auf den gewünschten Wassergehalt getrocknet wird.

Vor der Anwendung für ein Verzuckerungsverfahren wird das getrocknete Enzymprodukt gewöhnlich durch ein Vor-Einweichen in einer wäßrigen Lösung konditioniert. Zu diesem Zeitpunkt sowie auch zu Beginn der nachfolgenden Anwendung des Produkts kann ein gewisser Schwund an Enzym-Aktivität festgestellt werden. Es wurde gefunden, daß der Einbezug einer zusätzlichen Quervemetzungsstufe, gegebenenfalls in Verbindung mit dem Einweichverfahren, dazu dienen kann, diesen Verlust an Enzym-Aktivität wesentlich zu verringern. Daher führt man gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Vorbehandlung des Enzymprodukts in einer wäßrigen Lösung durch, die eine geeignete Menge, vorzugsweise 0,5 bis 5 % Glutaraldehyd, enthält, worauf man gewöhnlich überschüssiges Reagens durch Waschen entfernt und gegebenenfalls das getrocknete Produkt gewinnt.

Es wurde zusätzlich festgestellt, daß eine Vorbehandlung des Enzymprodukts mit einem Salz von Schwefliger-Säure einen beträchtlichen Anstieg des Umwandlungsgrades (ausgedrückt als Prozent Dextrose-Äguivalent oder DE-Wert) des verzuckerten Produkts bewirken kann. Die Sulfit-Einwirkung läßt sich am wahrscheinlichsten als eine "Öffnung" bestimmter Vernetzungsstrukturen erklären, die die proteinhaltige enzymatisch aktive Schicht betrifft, jedoch offenbar (und überraschenderweise) auf die Bindung des Enzyms nicht einwirkt, wodurch der Zugang von höheren Oligosacchariden zu den Stellen mit Enzym-Aktivität erleichtert wird. Dementsprechend betrifft eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung die Behandlung des Enzymprodukts mit einer wäßrigen verdünnten Lösung von Sulfit, die vorzugsweise 0,1-2 % Natriumsulfit beim pH-Wert von etwa 4-5 enthält. Die Sulfitbehandluny iührt man

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vorzugsweise bei Raumtemperatur durch, und sie wird gewöhnlich nach 120 Minuten durch Waschen mit Wasser, gegebenenfalls gefolgt von einer Gewinnung des getrockneten Produkts, beendet. Es hat sich gezeigt, daß nach der Sulfitbehandlung keine Enzym-Ausiaugung mehr auftritt.

Die gemäß der vorstehenden Arbeitsweise hergestellten teilchenförmigen Enzymprodukte können in ansatzweise durchgeführten Verzuckerungsverfahren unter Abtrennung und erneuter Verwendung des Enzymprodukts oder in Verfahren kontinuierlicher Art in einem Enzym-Reaktor verwendet werden.

Die mikrobiologische Quelle für das verzuckernde Enzym stellt keinen wesentlichen Teil der Erfindung dar. Jedoch erhält man ein bevorzugtes handelsübliches Amyloglucosidase-Produkt durch Kultivieren von Stämmen, die den Genera Aspergillus oder Rhizopus angehören, z.B. Aspergillus niger oder Rhizopus delemar. In gleicher Weise erhält man maltogene a-Amylase vorzugsweise aus Stämmen von Aspergillus oryzea.

Bestimmung der Amyloqlucosidase-Aktivität

Die Aktivitätseinheit von löslicher Amyloglucosidase sowie die des immobilisierten Enzyms, definiert als die Menge an Enzym oder Enzymprodukt, die eine wäßrige Lösung, enthaltend 30 % (Gew./vol.) Maltose, mit einer Ausgangsgeschwindigkeit von 1 uMol Maltose pro Minute hydrolysiert, wird unter Standardbedingungen bewertet, nämlich bei einem pH-Wert von 4,5 und einer Temperatur von 55,0 C. Die Aktivität des immobilisierten Enzyms wird ansatzweise an einer Probe untersucht, die mittels einer Schüttelvorrichtung in Suspension gehalten wird.

Bestimmung der pilzlichen g-Amylase-Aktivität

Die Aktivitätseinheit von löslicher pilzlicher ct-Amylase sowie die des immobilisierten Enzyms, definiert als die Menge an Enzym oder Ensymprodukt, diß eine wäßrige Lösung, enthaltend lösliche Stärke,

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(Merck Amyluin üolubile, DAB₁ Erg. B VI) (6,95 g pro 1000 ml) mit einer Anfangsgeschwindigkeit von 5,26 mg Stärke pro Stunde hydrolysiert, wird unter Standardbedingungen bewertet, nämlich beim pH-Wert 5; 6-5,7, bei einer Temperatur von 37,0 C + 0,05 C und in Anwesenheit von 4,3-mmolaren Ca -Ionen. Die Bildung einer blauen Farbe mit Jod wird zur Verfolgung der Reaktion ausgenutzt. Beim Zerbrechen der Stärke wird diese Farbe schwächer und ändert sich allmählich in Rotbraun. Die Farbänderung wird visuell durch Vergleich mit gefärbten Glas-StandaiLL, überwacht. Die Aktivität des immobilisierten Enzyms wird unter Bedingungen bewertet, die analog den für Amyloglucosidase angegebenen sind.

Lösliche verzuckernde Enzyme sind im Handel erhältlich. Beispiele für derartige Produkte sind AMYLOGLUCOSIDASE NOVO 150 und FUNGAMYL 1600 (bei FUNGAMYL handelt es sich um ein Warenzeichen). Das erstgenannte wird als eine wäßrige Lösung verkauft, die gewöhnlich vor der Anwendung für die erfindungsgemäßen Zwecke in ein sprühgetrocknetes Pulver umgewandelt wird. Gegebenenfalls kann dem Trocknungsverfahren eine Ultrafiltration vorausgehen, gewöhnlich in Verbindung mit einem Waschverfahren, mit dem Ziel, niedrigmolekulare Verunreinigungen zu entfernen. Durch Anwendung derartiger Konzentrier- und Reinigung s- Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, kann man leicht ein festes Amyloglucosidase-Produkt mit einer Aktivität von 5000 Einheiten pro g oder darüber erzielen.

FUNGAMYL 1600, das in Form eines Pulvers erhältlich ist, weist eine Aktiviiät von 1600 Einheiten pro g auf. Das Handelsprodukt kann als solches als zufriedenstellendes Ausgangsmaterial dienen. Jedoch können gegebenenfalls Reinigungs- und Konzentrierverfahren, beispielsweise der vorstehend genannten Arten, eingeschoben werden.

Die Gesamtausbeute an Aktivität in dem unlöslich gemachten verzuckernden Enzymprodukt ist eine Funktion der genauen Parameter des Immobilisierungsverfahrens, liegt jedoch gewöhnlich nicht unter 40 % und liegt häufig darüber.

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Ir

Das Substrat für das Verzuckerungsverfahren, das durch ein erfindungsgemüßes immobilisiertes Enzymprodukt durchgeführt wird, kann jegliches Oligosaccharid sein, das in Anwesenheit des entsprechenden «löslichen Enzyms eine Verzuckerung eingeht. Beispiele für bevorzugte Substrate sind Dextrine, die durch Säure- und/oder Enzym-Verflüssigung von Stärke erhalten wurden und DE-Werte im Bereich von 5 bis 40 aufweisen; Sirups mit hohem Maltosegehalt (DE-Werte von 35 bis 60); und Oligosaccharid-Rückstände, die in Mutterlaugen der Dextrosekrist.illisation oder in Raffinaten auftreten, die man bei der Fraktionierung von Fructose-Glucose erhält. Dextrinlösungen mit einem Trocken-Feststoffgehalt im Bereich von 20 bis 55 % (üew./Vol.) sind bevorzugt.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

y g eines relativ grob-granularen, mit Chlorwasserstoffsäure ausgefällten Caseins ("caseine alimentaire", Scerma S.A., Frankreich), bestehend aus 100-500 Mikron-Teilchen,von denen die 300-500 Mikron-Fraktion etwa GO % betrug, wurden wit 1,2 g handelsüblichem sprüchgetrockneten Ei-Albumen vermischt. Zu diesem Gemisch wurden 6,5 ml einer vorgemischten Lösung von Amyloglucosidase-Pulver [l8,5 % (Gew./Vol.)j , wäßrige Lösung, enthaltend insgesamt 12 500 Amyloglucosidase-Einheiten] und 1,2 ml einer 50%-igen (Gew./Gew.) wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd gefügt. Das Amyloglucosidase-Pulver war ein ultrafiltriertes, sprühgetrocknetes Produkt, hergestellt von der AMYLOGLUCOSIDASE NOVO (NOVO INDUSTRI a/S, Dänemark). Das Gemisch wurde sorgfältig in einem Mörser verknetet und anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Das resultierende Aggregat wurde durch Mörserbehandlung unter Formung eines granulären Produkt zerkleinert, das einen Tag bei · Raumtemperatur trocknen gelassen wurde.

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Das getrocknete granuläre Produkt (11,4 g) wies eine Aktivität von 425 Einheiten pro g auf und zeigte so eine Rückgewinnung nach der Immobilisierung von 38,8 %.

Beispiel 2

1500 g granuläres, durch Säure ausgefälltes Casein (Typ M 60 der Scertna S.A., bestehend aus 100-500 Mikron-Teilchen, von denen die 150-350-Mikron-Fraktion etwa 7O % betrug) wurden im trockenen Zustand in einem 20 1-Horizontalmischer vom Pflugschar-Typ (Gebr. Lödige Maschinenbau GmbH, Westdeutschland) mit 120 g handelsüblichem sprühgetrockneten Albumen vermischt.

Ein ultrafiltriertes Konzentrat von Amyloglucosidase, hergestellt von der AMYLOGLUCOSIDASE NOVO (650 g einer Lösung mit einem Gehalt an Trockenmaterialien von etwa 25 % und einem Gehalt von*v3200 Einheiten löslicher Amyloglucosidase pro g Konzentrat), wurde sorgfältig mit 180 ml einer 50%-igen (Gew./Gew.) wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd beim pH-Wert ■1,9 und einer Temperatur von 18 C vermischt, wonach die resultierende Lösung in die Mischvorrichtung gegossen wurde. Es wurde weitere 0,5 bis 1 Minute kräftig gemischt, worauf das befeuchtete teilchenförmige Produkt aus dem Mischer entnommen wurde. Das feuchte Produkt wurde etwa 45 Minuten ruhen gelassen, um das Quervernetzungsverfahren zu beenden, wobei Klumpen und aggregatförmige Teilchen gebildet wurden. Das Produkt wurde auf einem Oszillationsgranulator (beispielsweise der von der Diaf a/s, Kopenhagen, gelieferten Art), der mit einem Sieb von 1,5 mm Durchmesser ausgerüstet war, granuliert.

Das Granulat wurde mit 10 1 entionisiertem Wasser während 10 Minuten gewaschen, durch Filtrieren gewonnen und anschließend im Wirbelschichtbett getrocknet. Das getrocknete Produkt (1600 g, 450 Amyloglucosidase-Einheiten pro g) wurde durch Sieben von Feinteilchen befreit.

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Eine Lösung von 105 g sprühgetrocknetem Amyloglucidase-Pulver (Aktivität: 11 400 Einheiten pro g, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben) und 105 g sprüchgetrocknetem Albumen wurde in 4OO ml Leitungswasser bereitet und über Nacht im Kühlschrank
betrug 5,4.

Kühlschrank bei 6-7 C stehengelassen. Der pH-Wert der Lösung

100 ml einer 50%-igen (Gew./Gew.) wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd wurden anschließend zugesetzt, und die resultierende Lösung wurde während 3 Minuten in einen kräftig gerührten Ansatz von 725 g granulärem mit Chlorwasserstoffsäure ausgefälltem Casein (derselben Art wie in Beispiel 1 verwendet) überführt. Es wurde in einem Industrie-Mischgerät der gleichen Art wie in Beispiel 2 weiter vermischt. Das Reaktionsgemisch wurde einige weitere Minuten kräftig gerührt, worauf es stehengelassen wurde, bis die Quervernetzungsreaktion nach etwa 1 Stunde beendet war. Das resultierende aggregatförmige und klumpige Produkt wurde in einem Oszillationsgranulator durch ein Sieb von 2 mm Durchmesser granuliert.

Das Granulat wurde mit einer wäßrigen Lösung von Natriumacetat (pH-Wert 4,2) gewaschen und anschließend im Vakuum bei 35°C getrocknet.

Das getrocknete granuläre Produkt (925 g) wies eine Aktivität von 8OO Einheiten pro g auf, was einer Wiedergewinnung nach der Immobilisierung von 6 7,8 % entspricht.

Beispiel 4

20 g des gemäß Beispiel 3 hergestellten immobilisierten Amyloglucosidase-Produkts wurden während 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer wäßrigen Lösung von 500 ml Glutaraldehyd (1%-ige Lösung, eingestellt auf den pH-Wert 7) getränkt, worauf das getrocknete Produkt (20 g) gewonnen wurde.

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Die AJ;tivitat dieses Produkts betrug 625 Einheiten pro g, was einer Wiedergewinnung von 78 % aus der zweiten Immobilisierungsstufe und einer Gesamtwiedergewinnung an löslicher Amyloglucosidase von 53 % entsprach.

Beispiel 5

2 ml einer wäßrigen Lösung von maltogener a-Amylase (5%-ige, Gew./Vol., Lösung von FUNGAMYL 1600 der NOVO INDUSTRI A/s, " Dänemark, in entionisiertem Wasser vom pH-Wert 6,2) wurden mit 0,3 ml einer 50%-igen (Gew./Gew.) wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd vermischt und anschließend rasch zu einer trokkenen Mischung von 4,0 g granulärem, durch Säure ausgefälltem Casein (Typ M 60) und von 0,5 g handelsüblichem sprühgetrockneten Ei-Albumen gefügt. Nach sorgfältigem Kneten des resultierenden Produkts in einem Mörser wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Klumpen wurden durch Mörserbehandlung zerkleinert, wonach das Produkt einen Tag bei Raumtemperatur getrocknet wurde.

Beispiel 6

Eine Mantel kolonne mit einem Innendurchmesser von 15 mm, die bei 55 C gehalten wurde, wurde mit 5,7 g des immobilisierten Amyloglucosidase-Produkts, hergestellt gemäß Beispiel I₁ gefüllt.

Eine abwärtsströmende Beschickung aus 30 % (Gew./Vol.) handelsüblichem ^üure/enzyrnhydrolyüiertem Dextrin (CPC Snow Flake Maltodextrin 01915 mit einem ÜE-Wert von 20) mit etwa der folgenden Zusammensetzung:

Prozent

Glucose (DP₁): 4-5

Disaccharide (DP₂): 8-9

Trisaccharide (DP₃): 6-7

Tetra- und Oligosaccharide (DP₄+): 79-82

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die mit 0,2 % (Gew./Vol.) Natriumsulfit versetzt worden war, worauf der pH-Wert auf 4,5 eingestellt worden war, wurde in die Säule mit einer konstanten Strömungsgeschwindigkeit von 15 ml pro Stunde einlaufen gelassen.

Der Abstrom wurde durch Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) analysiert, wobei man folgende Ergebnisse erhielt:

Tage	DP₁, %	DP₂, %	DP₃, %	DP₄+, %	DE, berechnet

1	92,0	5,6	0,7		95,3
-I	93,2	'1,2	0,6	2,0	95,8
5	92,9	3,9	0,7	2,5	95,4
7	93, C,	3,2	0,6	2,5	95,8
9	93,3	3,1	0,7	2,9	95,5
1 1	92,0	3,-'	0,8	3,3	94,9
13	92,6	2,9	0,9	3,6	94,9

Beispiel 7

Exne Mantelkolonne mit einem Innendurchmesser von 25 mm, die bei 55 C gehalten wurde, wurde mit 20 g des immobilisierten Amyloglucosidase-Profiukts, hergestellt in Beispiel 2, beschickt.

Eine aufwärtsströmende Substratbeschickung mit gleicher Konzentration, Zusammensetzung und gleichem pH-Wert wie in Beispiel 6 verwendeL_t wurde in die Säule mit einer konstanten Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml pro Stunde eingespeist.

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yar -

Der Glucosegehalt (Prozent DP₁) wurde nach der Hexokinase-Methode analysiert, wobei man folgende Ergebnisse erhielt:

Tage

. 1 4 6 8

Prozent DP,

89,0 93,6 93,6 93,1

Beispiel 8

Eine Mantelkolonne mit einem Innendurchmesser von 25 mm, die bei 55 C gehalten wurde, wurde mit 25 g des immobilisierten Amyloglucosidase-Produkts, hergestellt gemäß Beispiel 1', beschicke. Eine aufwürtsströmende Substratbeschickung der glei chen Zusammensetzung,wie sie in Beispiel t> verwendet wurde, wuL de in die Säule eingeleitet. Die Beschickung (pH-Wert '!,'> wies einen Trocken-Feststof l'gehul t von 30 VO (Gew./üew.) aui, und als Konservierungsmittel wurden 2 g KaLiumsorbat pro 1 zugefügt. L)Le Strömungsgeschwindigkeit wurde so eingestellt, daß ein etwa konstantes Umwandlumjsausmaß erziel L wurde.

Der AbsLroiu wurde durch HPLC analysiert, wobei man folgende Umwandlung Ln Glucose (DP..), bezogen auf >lle ZeLl, erhielt:

Tage	DP₁, %	Strömungsgeschwindig- keit, ml/stunde
1	92,6	115
2	-	112
3	92,4	101
4	92,0	82
5	92,2	75
6	92,3	70
7	92,1	66
8	92,6	64
9	-	t.O
10	92,0	5 7

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Nach Beendigung des Ansatzes wurden hinsichtlich der Härte oder anderer physikalischer Eigenschaften des Säulenmaterials keine Veränderungen festgestellt.

Beispiel 9

Unter Anwendung der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 7, jedoch unter Ersatz des immobilisierten Amyloglucosidase-Produkts von Beispiel 2 durch das gemäß Beispiel 4 herge- ' stellte Produkt, erhielt man folgende Ergebnisse:

Tage

13

Prozent	DP₁	3
90,	9
92,	7
93,	3
93,

Beispiel 10

4 g der immobilisierten maltogenen oc-Amylase, hergestellt gemäß der Verfahrensweise von Beispiel 5, wurden in eine Mantelkolonne gefüllt, die bei 45 C gehalten wurde, und eine abwärtsfließende Beschickung von handelsüblichem Dextrin (CPC Snow Flake Maltodextrin 01913), die 30 % (Gew./Vol.) trockene Feststoffe und 0,2 % Natriumsulfit als Konservierungsmittel enthielt, wurde zugeführt. Der pH-Wert der Beschickung wurde auf 4,5 eingestellt, und die Strömungsgeschwindigkeit betrug 15 ml pro Stunde. Die folgende Tabelle zeigt die Zusammensetzung des Abstroms der Kolonne; wobei DP- hauptsächlich den Maltosegehalt darstellt.

Tage	DP₁	, %	DP₂	, %	DP₃, %	DP₄ ⁺	,3	DE, berechnet
1	5	,3	45	,4	21,0	28	,5	42,5
2	5	,0	44	,9	21,6	28	,2	42,1
3	4	,7	44	,1	22,0	29	,4	41,7
4	4	,4	43		22,7	29	41,ü

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Beispiel 11

A. Eine Mantelkolonne mit einem Innendurchmesser von 15 mm, die bei 55 C gehalten wurde, wurde mit 12 g immobilisierter Amyloglucosidase, hergestellt gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 2, beschickt.

Eine abwärtsströmende Beschickung von Dextrin (31 %, Gew./Vol., bezogen auf den Trockenmaterial-Gehalt), her-' gestellt durch Stärkeverflüssigung mit TERMAMYL ®L 60 (NOVO INDUSTRI a/s, Dänemark),und der folgenden Zusammensetzung : Prozent Glucose (DP₁): 1 Disaccharide (DP₂): 7-8 Trisaccharide (DP₃)I 10-12 Tetra- und Oligosaccharide (DP₄+): 79-82 DE 21

wurde in die Säule eingeführt.

Die Beschickung enthielt 0,2 % (Gew./Vol.) Natriumsulfit als Konservierungsmittel und hatte einen pH-Wert von 4,5. Die Strömung wurde so geregelt, daß ein konstantes Umwandlungsausmaß (ausgedrückt als Prozent DP^) erhalten wurde. Der Abstrom wurde durch HPLC analysiert, wobei man folgende Ergebnisse erhielt:

Tage	DP₁, %	DP₂, %	DP₃, %	DP₄ ⁺, %	Strömungsgeschwindig keit, ml/Stunde
3	92,1	4,2	0,7	3,1	35
7	92,3	3,6	0,8	3,3	33
14	92,2	3,6	0,7	3,5	27
28	92,4	3,1	0,9	3,6	18
56	92,1	3,3	0,8	3,7	15

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B. Ein Dextrinsubstrat, hergestellt nach der unter A beschriebenen Methode, mit der folgenden Zusammensetzung:

Prozent

Glucose (DP₁): 1,1

Disaccharide (DP₂): 6,8

Trisaccharide (DP₃): 11,0

Tetra- und Oligosaccharide (DP₄ ⁺): 81,0

wurde mit 0,01 % (bezogen auf den Gesamt-Feststoffgehalt) von maltogener a-Amylase (FUNGAMYL 1600, NOVO INDUSTRI a/s) beim pH-Wert 5,0 und bei 50°C während 2 Stunden behandelt. Nacli der Behandlung wies das Substrat folgende Zusammensetzung auf:

Prozent

Glucose (DP₁): 1,3

Disaccharide (DP₂): 13,9

Trisaccharide (DP₃): 22,3

Tetra- und Oligosaccharide (DP₄ ⁺): 62,5

Zwei Mantelkolonnen mit einem Innendurchmesser von 15 mm, die bei 55°C gehalten wurden, wurden jeweils mit 10 g der gemäß Beispiel 2 hergestellten immobilisierten Amyloglucosidase beschickt. In die Säulen wurden abwärtsströmende Beschickungen aus 30 % (Gew./Vol.) der beiden Dextrin-Arten, hergestellt wie vorstehend beschrieben und versetzt mit 0,2 % (Gew./Vol.) Kaliumsorbat, gefolgt von einer pH-Wert-Einstellung auf 4,5, eingebracht. Man erhielt folgende Ergebnisse

Beschickung	Dextrin	nach der Behandlung mit FUNGAMYL
Maximaler DX- Wert des Ab- stroms in %	vor der Behandlung mit FUNGAMYL	93,3
92,7

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Vc

Beispiel 12

Portionen von 10 g immobilisierter Amyloglucosidase, hergestel.! L gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 2, wurden in lOO ml-Lösuncjon die verschiedene Konzentrat ionen an Matriumsulfit enthielten, getränkt. Der pH-Wert der Lösung wurde durch Zugabe von Essigsäure auf 4,5 eingestellt. Nach 2-stündigem Tränken bei Raumtemperatur wurden die Enzym-Proben mit entionisiertem Wasser gewaschen und in Mantelkolonnen von 15 mm Innendurchmesser, die bei ü5 C gehalten wurden, gefüllt.

Abwärtsströinende Beschickungen aus Dextrin (30 %, Gew./Vol.), hergestellt nach der Methode des Beispiels 11 A, die mit 0,2 % (üew./Vol.) Kaliumsorbat versetzt worden waren und deren pH-Wert auf 4,5 eingestellt worden war, wurden in die Säulen eingeführt.

Durch Einstellung der Strömungsgeschwindigkeit jeder Säule zur Erzielung des maximalen DX-Wertes des Abstroms erhielt man folgende Ergebnisse:

Natriumsulfit g/100 ml	0	0,01	0,1	0,2	0,5	1,0
Maximaler DX-Wert	90,3	90,2	91,2	91,7	91,9	92,4

Beispiel 13

Der in Beispiel 10 aus der Kolonne mit immobilisiertem FUNG-AMYL gewonnene Abstrom mit hohem Maltosegehalt (DE etwa 42) wurde als Beschickung für die immobilisierte Amyloglucosidase-Kolonne des Beispiels G verwendet. Die Strömungsgeschwindigkeit wurde so eingestellt (73 ml pro Stunde), daß man einen Abstrom erhielt, der die folgende Zusammensetzung eines Sirups mit hoher Umwandlung (DE etwa 65) aufwies:

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Prozent

Glucose (DP₁): 38,1

Disaccharide (DP₂): _ 39,6

Trisaccharide (DPO: .,,r..,,·. ₂ 8
Tetra- und Oligosaccharide (DP-+): 19,6

Beispiel 14

Eine Mantelkolonne mit einem Innendurchmesser von 25 ram, die bei 55°C gehalten wurde, wurde mit 20 g des immobilisierten Amyloglucosidase-Produkts, hergestellt gemäß Beispiel 3, gefüllt.

Eine aufwärtsströmende Substratbeschickung aus der Mutterlauge (oder dem Raffinat), erhalten aus der Fructose-Glucose-Fraktionierung, mit der folgenden Zusammensetzung:

Prozent

Fructose 3,25

Glucose 85,71

Disaccharide 9,17

Trisaccharide 1»42

höhere Saccharide 0,54

und einem auf 4,5 eingestellten pH-Wert wurde in die Säule mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 250 ml pro Stunde bei einer Konzentration von 25 % (Gew./Gew.) eingeführt. Die Zusammensetzung des Abstroms, bestimmt durch HPLC, ergab sich wie folgt:

Prozent

Fructose 3,25

Glucose 91,16

Disaccharide 4,14

Trisaccharide 1,15

höhere Saccharide 0,30

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ORIGINAL INSPECTED

Claims

2729A59

Patentansprüche

1. Immobilisiertes verzuckerndes Ensymprodukt in Teilchenform, in dem das verzuckernde Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe von Amyloglucosidase und maltogener a-Amylase, enthaltend Tragerteilchen, die im wesentlichen aus Casein-Granulaten, die im wesentlichen mit einer für Flüssigkeiten permeablen proteinhaltigen Schicht überzogen sind, in der das verzuckernde Enzym mittels Glutaraldehyd mit Ei-Albumen coquervernetzt ist, bestehen.

2. Produkt gemäß Anspruch I, worin das Mengenverhältnis verzuckerndes Enzym : Casein im Bereich von 1 : 200 bis 1 : 3 liegt.

3. Produkt gemäß Anspruch I, worin das Mengenverhältnis verzuckerndes Enzym : Casein im Bereich von 1 : 20 bis 1:5 liegt.

4. Produkt gemäß Anspruch I₁ in dem das Mengenverhältnis ver zuckerndes Enzym : Albumen im Bereich von 1:5 bis 1 : 0,05 liegt.

5· Produkt gemäß Anspruch 1, in dem das Mengenverhältnis ver zuckerndes Enzym : Albumen im Bereich von 1 : 2 bis 1 : 0,2 liegt.

6. Produkt gemäß Anspruch 1, in dem der Durchmesser der Trägerteilchen im Bereich von 1OO bis 500 Mikron liegt.

7, Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten verzuckernden Enzymprodukts in Teilchenform, worin das verzuckernde Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe Amyloglucosidase und maltogener a-Amylase, dadurch gekennzeichnet , daß man im wesentlichen Trägerteilchen, die hauptsächlich aus ausgefälltem Casein bestehen, mit einer prcteinhaltigen Schicht überzieht, in der das ver-

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ORIGINAL INSPECTED

zuckernde Enzym mi LLeIi; Glularuldehyd co-querverneLzL ist miL· Ei-Albumen.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mengenverhältnis von verzuckerndem Enzym : Casein im Bereich von 1 : 200 bis 1 : 3 verwendet.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mengenvei hai Luis von verzuckerndem Enzym : Casein im Bereich von 1 : 20 bis 1 : 5 verwendet.

10. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mengenverhältnis von verzuckerndem Enzym : Albumen im Bereich von 1 : 5 bis 1 : 0,05 verwendet.

11. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mengenverhältnis von verzuckerndem Enzym : Albumen im Bereich von 1 : 2 bis 1 : 0,2 verwendet.

12. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Durchmesser der Trägerteilchen im Bereich von 100 bis SOO ilLkron wählt.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einem Verhältnis von Glutaraldehyd zu den Proteinen der Überzugsschicht (Enzym plus Albumen) im Bereich von 0,1 bis 1 arbeitet.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man das immobilisierte verzuckernde Enzymprodukt in einer verdünnten Lösung von Glutaraldehyd vorbehandelt.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man das immobilisierte verzuckernde Enzymprodukt in einer verdünnten Lösung eines Salzes der Schwefligen-Säure vorbehandelt.

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16. Verwendung der immobilisierten verzuckernden Enzymprodokte gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Hydrolyse von Stärke bzw. von Stärkeprodukten.

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