DE2726988A1 - Verfahren zur herstellung eines reagens zur bestimmung von menschlichen leukozyten-antigenen und seine anwendung - Google Patents

Description

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WISCONSIN ALUMNI RESEARCH FOUNDATION, 614, North Walnut Street, Madison, Wisconsin 53705/uSA

Verfahren zur Herstellung eines Reagens zur

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Bestimmung von menschlichen Leukozyten-Antigenen und seine Anwendung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein gesehen ein Verfahren zur Typenbestimmung bzw. zur Definition von menschlichen Leukozyten-Antigenen.

Es ist bekannt, daß die Abstoßung eines transplant!erten Gewebes oder Organs initiiert wird, wenn das Immunsystem des Empfängers genetisch kontrollierte "fremde" Antigene auf dem eingepflanzten Gewebe erkennt. £s ist auch bekannt, daß beim Menschen eine einzige genetische HLA (menschliche Leukozyten-Antigene) genannte Region oder der Haupt-Histo-Verträglichkeitskomplex (MHC) den Huiptanteil von starken Anu.igenen zu steuern scheint, die bei Verpflanzungs-Abstoßungen von Bedeutung sind. Es besteht daher ein Bedürfnis, zwei Individuen "anzupassen" ("matching"),

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wenn eine Organ- oder Gewebe-Verpflanzung in Betracht gezogen wird, um zu versuchen, die Antigen-Ungleicheit zwischen Donator und Empfänger auf ein Minimum herabzusetzen, und dabei die Wahrscheinlichkeit der Abstoßung des transplantierten Organs oder Gewebes zu verringern.

Gewöhnlich werden zwei Methoden zur Bestimmung von Antigenen in Verbindung mit dem Haupt-Histo-Verträglichkeitskomplex verwendet, nämlich (i) serologische Untersuchung auf HLA SD (serologisch definierte) Antigene, und (ii) gemischte Lymphozyten-Kultur (MLC)-Untersuchungen, die die Ungleichheit an einem HLA LD (lymphozytendefinierten) Ort (oder an verschiedenen Orten) definieren. Bei den MLC-Untersuchungen werden Lymphozyten des einen Individuums (des Empfängers bzw. "Reagenten") allgemein 4 bis 7 Tage unter "Stimulierung" von Lymphozyten eines anderen Individuums kultiviert. Um ihre Proliferation zu verhindern, werden stimulierende Zellen mit Mitomycin C oder Röntgenstrahlen vor ihrer Vermischung behandelt. Stammen die stimulierenden Zellen von Personen, die nicht .erwandt sind,oder von Familienmitgliedern, deren MHC von dem des Empfängers unterschiedlich ist, so proliferieren bzw. wuchern die unbehandelten Lymphozyten; dieses Proliferieren wird durch Einbringen von mit Tritium markiertem (oder tritiiertem)' Thymidin oder tritiiertem Uridin in die proliferierenden Zellen untersucht bzw. bewertet. Alle SD- und LD-Loci sind genetisch nahe verwandt, und innerhalb von Familien werden sie gewöhnlich als eine Haplotyp genannte Einheit vererbt. Da jedoch die SD- und LD-Loci genetisch trennbar sind, sind sowohl die serologischen als auch die MLC-Tests für die Bewertung der MHC-Beziehung zwischen zwei Individuen notwendig.

Bei Transplantaten zwischen Personen mit passendem SD, die nicht verwandt sind, sind die Häufigkeit und Stärke der Abstoßung im allgemeinen wesentlich größer als bei Transplantaten zwischen Verwandten bzw. Geschwistern mit identischen MHC. Darüber hinaus sind die meisten Individuen, die nicht verwandt sind, mit identischem SD unterschiedlich im LD, wenn die MLC-Bewertung durchgeführt wird. Es gibt Hinweise, daß

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die MLC-Anpassung für HLA LD-Antigene günstig zur Vorhersage des Erfolgs einer Transplantation sein kann.

Zwei Haupthindernisse verhindern die weit verbreitete Anwendung von MLC-Tests für die Transplantationsanpassung. Diese bestehen darin, daß (i) das Ergebnise nicht in weniger als 4 bis 5 Tagen erhalten werden kann, d.h. in einem Zeitraum, der die Grenzen der Konservierung von Nieren von Leichen überschreitet; (ii) obwohl MLC-Tests zur Identifizierung von Individuen verwendet werden können, die in ihren LD-Antigenen angepaßt sind, diese nicht anzeigen, welche spezifischen LD-Antigene die beiden Personen tragen; daher müssen Lymphozyten von allen potentiellen Spendern in MLC mit Lymphozyten von allen potentiellen Empfängern getestet werden.

Dieses letztgenannte Problem könnte durch eine "LD-Typifizierungs"-Methode erleichtert werden, die analog zu der serologischen Typenbestimmung ist, die für Blutgruppen durchgeführt wurde, sowie durch HLA SD-Antigene, die die spezifischen LD-Antigene identifizieren würden. Da die LD-Typenbestimmung die Notwendigkeit der gleichzeitigen Anwesenheit von Empfänger und potentiellem Spender in dem gleichen MLC-Untersuchungslabor ausschließen würde, könnte der LD-Typ von jedem potentiellen Gewebs-Spender bestimmt werden, und das Spender-Organ oder -Knochenmark könnte zu einem LD-angepaßten Empfänger an jedem Ort der Weltgesandt werden.

M.J. Sheehy et al. beschreiben¹in Science, Band 188, S. 1308 bis 131O vom 27. Juni 1975 ein Verfahren, das eine mögliche Lösung für diese Probleme darstellt. Dieses Verfahren basiert auf der früheren Erkenntnis, daß Lymphozyten, die für die Proliferation in einer primären MLC stimuliert sind, eine beschleunigte sekundäre proliferative Reaktion ergeben, wenn sie 14 Tage später mit Leukozyten des ursprünglich sensibiIisierten Leukozyten-Spenders stimuliert werden [vergl. L.C. Anderson und P. Hayry, Eur.J.Immuno 1. , 3_, 595 (1973)].

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Sheeny et al. (loc. cit.) stellten nicht nur fest, daß dieses Verfahren zur Erkennung der HLA-D-Region-Antigene des Haupt-Histo-Verträglichkeitskomplexes beim Menschen verwendet werden könnte, sondern auch, daß, falls die Leukozyten einer Person in einer primären MLC mit Leukozyten stimuliert werden, die von einer zweiten Person erhalten werden, «lie sich von der ersten Person lediglich durch einen einzigen MHC-Haplotyp unterscheiden, und die stimulierenden Leukozyten behandelt werden, ihre Proliferation in MLC zu verhindern, ein charakteristischer bzw. unterschiedlicher Typ von Leukozyten erhalten wird, der eine LD-Typifizierung nicht nur bei Personen innerhalb von Familien, sondern auch bei der nichtverwandten Bevölkerung über die sekundäre proliferative Reaktionsmethode ermöglicht.

Beispielsweise werden Zellen (Leukozyten) vom Individuum A vorbereitet bzw. instruiert ("primed") durch Stimulierung mit Zellen, die mit Mitomycin C (B -Zellen) behandelt wurden, die

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von einer Person B erhalten wurden, die sich von A lediglich durch einen einzigen MHC-Haplo-Typ unterscheiden (beispielsweise ein Elternteil oder Kind von A). Wenn die MLC-proliferative Reaktion im wesentlichen vollständig ist (nach 9 bis 14 Tagen), werden die Zellen als PLT- (vorbereitete bzw. primed LD-Typifizierungs-)Zellen verwendet. Die in dem Inkubationsmedium verbleibenden Zellen werden durch Zentrifugieren gewonnen und durch B -Zellen oder mit Zellen einer anderen Person, die LD-typifiziert werden soll, "restimuliert", und ihre Reaktion wird durch Aufnahme von tritiiertem Thymidin oder tritiiertem Uridin bewertet. So beobachtet man bei der Restimulierung mit B -Zellen oder mit Zellen von Familienmitgliedern mit der gleichen MHC, die A an B feststellte, eine beträchtliche Reaktion, die durch Aufnahme des tritiierten Thymidins oder Uridins bereits nach 24 Stunden beobachtet wird. Die Stimulierung durch Zellen nicht-verwandter Personen liegt im Bereich von keiner bis zurmit B_m festgestellten; diese Personen, deren Zellen restimulieren, sowie B , fragen wahrscheinlich LD-Antigene, die sehr ähnlich denen sind, die an B durch A festgestellt wurden. So sollten PLT-ZeIlen Individuen identifizie-

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ren, die spezifische LD-Antigene tragen. Viele Populationen von PLT-ZeIlen, die jeweils spezifisch für Antigene eines unterschiedlichen LD-Haplo-Typs sind, können leicht über primäre MLC mit Zellen von den entsprechenden Mitgliedern verschiedener Familien erhalten werden.

Es wäre offensichtlich wertvoll, eine konstante und leicht zugängliche Quelle für stimulierende Zellen zur MLC-Sensibili-. sierung zu besitzen, die eine bekannte D-Locus-Determinante tragen. Derartige Stimulator-Zellen könnten letztlich zur Sensibilisierung von reagierenden Zellen dienen, die die Determinante nicht aufweisen, jedoch alle anderen D-Determinanten der stimulierenden Zelle besitzen.

Durch die vorliegende Erfindung werden diese Ziele erreicht durch Anwendung von lymphoblastioden Zeilstammen bzw. -familien von homozygotisch typifizierenden Zellen als sensibilisierende Zellen in MLC. So können erfindungsgemäß lymphoblastoide Zeil- lieih*»«i bzw. -Stämme zur PLT-Vorbereitung (priming) verwendet werden.

Ein Hauptvorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, eine konstante Quelle für den gleichen Stimulus zu schaffen, da lymphoblastoide Zell-Heihen bzw. -Linien im allgemeinen in jeglicher Menge gezogen werden können und relativ konstant im Hinblick auf die Antigene, die sie darstellen, bleiben. Es versteht sich, daß andere Zellen von spezifiziertem genetischen Typ, homozygotisch für HLA-D, oder andere kontinuierliche Keinen bzw. Stämme ebenfalls vorteilhaft als sensibilisierende Zellen verwendet werden können, und daher können geeignete stimulierende oder sensibilisierende Zellen aus dieser Gruppe gewählt werden. Der Hinweis auf kontinuierliche Reihen bzw. Stämme wird aufgrund des Standes der Technik als Definition von Zellen verstanden, die kontinuierlich ein Vermehrungs-. gut (Nachkommenschaft) erzeugen, das mindestens im wesentlichen identisch ist.

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Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung eines Reagens geschaffen, das geeignet ist zur Lymphozyten-definierten Typifizierung von menschlichen Leukozyten-Antigenen, das darin besteht, in vitro gereinigte Blut-Leukozyten mit menschl. Zellen, ausgew. aus lymphoblastoiden Zeil-Reihen von homozygotisch typifizierenden Zellen oder anderen Zellen mit spezifiertem genetischen Typ, die homozygotisch für die D-Region menschlicher Leukozyten-Antigene (HLA-D) sind, oder anderen kontinuierlichen Stämmen zu inkubieren und die Leukozyten aus dem Inkubationsmedium zu gewinnen. Es versteht sich, dass für die Eignung des Reagens das vorliegende Antigen oder die vorliegenden Antigene festgelegt werden müssen. Dies kann in einfacher Weise erreicht werden, indem Proben bekannter Antigene getestet werden. Im allgemeinen enthalten die gewonnenen Leukozyten Lymphozyten, die zur Erkennung bestimmter HLA-D-Antigene vorbereitet sind. Vorzugsweise führt man die Inkubation im wesentlichen bis zur Vollständigkeit der proliferativen Reaktion durch, die im allg. nach etwa 14 Tagen, insbesondere nach etwa 10 Tagen, vorliegt.

Die nachstehend angegebenen Reagentien, Medien und Techniken stellen typische Beispiele dar, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind.

Medium und Zellen

Das Kulturmedium (Agar und Blut) war RPiII 1640 mit 25 mMol HEPES-Puffer (erhältlich von der Gibco Diagnostics, Katalog Nr. 240, Madison, Wisconsin), ergänzt mit Penicillin und Streptomycin in ausreichenden Mengen, um das Wachstum von fremden Mikroogranismen in dem Medium zu inhibieren. Die Plasma-Pools stammten von mindestens 20 Spendern,bei denen niemals Transfusionen oder Verpflanzungen vorgenommen worden waren und die niemals schwanger waren. Das Plasma wurde vor der Anwendung einer Wärmeaktivierung unterzogen ($0 Minuten bei 56°C).

Heparinisiertes Gesamt-Blut wurde zentrifugiert (15 Minuten, 300g), wobei man Leukozytenfilm-Zellen (buffy coat Zellen) erhielt, die nach der Ficoll-Hypak-Technik [Boyum, Scanad, J. of Clin. and Lab. Invest., Band 21, Ergänzung 97, S. 1-91

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(1968)]gereinigt wurden. Die stimulierenden Zellen für Primär- Kulturen wurden bestrahlt (Gamma-Bestrahlung; 6000 r bei einer Dosierungsmenge von etwa 800 r/Minute).

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Verfahrensweisen Primär-KuItüren:

π PLT-Zellen wurden durch Kultivieren von 1 χ 10' Antwort- bzw.

reagierenden Zellen, die negativ für eine bestimmte DW-Gruppe (DW cluster = Antigene, welche durch Gene des hla-d locus bzw. loci eines einzigen hla Chromosoms kodifiziert sind) waren, ent-

weder mit 1 χ 10' normalen Lymphozyten des homozygotisch typifizierenden Zeil-Donators oder 1 χ 10 lymphoblastoiden Zellen von dieser homozygotisch typifizierenden Zelle generiert. Die normalen Lymphozyten wurden bestrahlt (Gamma-Bestrahlung), um ihre Proliferation zu verhindern, und die Kultur wurde in Falcon-Kolben (Katalog Nr. 3013) in 20 ml Medium durchgeführt, das 5 % (Vol./Vol.) menschliches Plasma bei 37°C enthielt. Nach 10 Kulturtagen in einem 5 % CO^-Inkubator wurden nicht-anhaftende Zellen durch kräftiges Pipettieren suspendiert, zentrifugiert (15 Minuten, 300 g) und erneut in frischem Medium zur Zählung suspendiert. Geerntete PLT-Zellen wurden entweder erneut stimuliert oder nach der später beschriebenen Methode zur späteren Anwendung gefroren.

Sekundäre Kulturen (Restimulierunq)

Sekundäre Kulturen wurden auf Mikrotiter-Platten mit U- oder V-Bodenaushöhlungen durchgeführt. Lebensfähige PLT-Zellen (von den Primär-KuItüren) und lebensfähige restimulierende Zellen, entnommen aus:

a) Zellen (5 χ 10 ) des ursprünglichen Donators für die homozygotisch typifizierende Zelle (restimulierende Bezugs-Zelle);

b) Zellen (5 χ 10 ) des ursprünglich reagierenden bzw. antwortenden Zeil-Donators (restimulierende Kontroll-Zellen) und

c) Zellen von verschiedenen anderen Individuen (restimulierende Test-Zellen)

wurden in jeder Aushöhlung in 0,15 ml Medium, das 25 % Plasma enthielt, bei 37 C kultiviert, (üie stimulierenden Zellen nur-' den nicht zur Verhinderung ih'er Proliferation behandelt.) Die Kulturen wurden nach 24, 48 und 72 Stunden miL einem ? ρ Ci- Rhythmus (pulse) von tritiiertem Thymidin (Nuclear Chicago,

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1,9 Ci/iiiMol) in 0,05 ml Medium markiert und 16 Stunden spater geerntet. Die Kulturen wurden au! Glasfaserfiltern geerntet und zur flüssigen SzintillaLionszählung vorbereitet (M.L. Bach et al., Histocompatibility Testing (1970), S. 643-653, Munksgaard, Kopenhagen).

Die Zellen wurden entweder als den gleichen HLA-D-Haplo-Typ tragend als Bezugszellen auf der Basis der Genotypifizierung innerhalb einer Familie oder, falls Test-Zellen verwendet wurden, die nicht verwandt waren mit der Kontroll- und Bezugs-Zelle, durch den homozygotisch typifizierenden Zeil -Test klassifiziert.

Ergebnisse

Die beigefügten Figuren IA und IB zeigen die PLT-Ergebnisse mit zwei unterschiedlichen PLT-Zellen. Die Ergebnisse in der Fig. IA wurden unter Anwendung einer PLT-ZeIIe erhalten, worin Zellen eines Reaktanten, die keine gegebene HLA-D-Gruppe (cluster) trugen, auf die peripheren Blut-Lymphozyten eines homozygotisch typifizierenden Zeil-Donators (KH) sensibilisiert wurden. (Diese homozygotisch typif!zierende Zelle zeigt keine wesentliche Assoziierung mit den vorstehend definierten DW-Gruppen.) Die PLT-Zellen wurden restimuliert mit den normalen Lymphozyten des Bezugszellen-Donators (KH), von drei Familienmitgliedern des gleichen D-Haplo-Typs (Individuen E, F und G) einer Testzelle von einem nicht-verwandten Individuum mit dem gleichen D-Haplo-Typ durch homozygotisch typifizierende Zeil-Untersuchung (Individuum H) und den Zellen von vier Individuen (I, J, K und L), die die D-Gruppe nicht trugen, durch Test mit der homozygotischen Zelle. Die in der Fig. IB erhaltenen Ergebnisse wurden unter Anwendung einer PLT-Zelle erhalten, worin Zellen aus einem lymphoblastoiden Zeil-Stamm von Zellen von KH zur Sensibilisierung in der primären MLC verwendet wurden. Ansonsten wurden die resultierenden PLT-Zellen identisch gehandhabt.

Die in den Fig. IC und ID erhaltenen Ergebnisse stammen von einer Untersuchung, bei der d^e Γ^ιΓ ^-A¹^₄P MLC- Sonsi hi 1 i r, i

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mit peripheren BluL-Lyrnphozyten einer DW2-homozygotisch typifizierenden Zelle (HS) [vergl. Reinsmoen et al., Histocompatibility Testing, herausgegeben von F. Kissmeyer-Nielsen, S. 459-463, Munksgaard, Kopenhagen (1975)J (Fig. IC) und mit der lymphoblastoiden Zeil-keihe bzw. dem lymphoblastoiden Zeil-Stamm dieser homozygotisch typifizierenden Zelle (Fig. ID) erzielt wurde. Die Restimulierung dieser PLT-ZeIlen wurde mit normalen peripheren Blut-Lymphozyten von dem Bezugs-Zeil-Donator, von vier nicht-verwandten Individuen (M, N, 0 und P, deren Zellen positiv für DW2, durch homozygotisch typifizierenden Zeil-Test sind) und von vier nicht-verwandten Test-Zellen (Individuen Q, R, S und T), deren Zellen negativ für DW2 sind, durchgeführt.

Obwohl die Figuren Ergebnisse für spätere Zeitpunkte darstellen, wird die PLT gewöhnlich vor 48 Stunden bewertet, d.h. vor deci Auftreten von sekundären inhibitorischen Wirkungen (was beispielsweise bei den restimulierenden Zellen E und F in der Fig. IA gesehen werden kann). Datenvergleiche werden normalerweise durchgeführt, wenn die PLT-KuItüren nach 24 Stunden markiert und 16 Stunden später abgelesen wurden.

In den Fig. IA - ID zeigt die punktierte Kurve die mit der Bezugs-Zelle erhaltenen Ergebnisse, die gestrichelte Kurve die mit den Test-Zellen, die den DW-Haplo-Typ tragen, erhaltenen Ergebnisse und die durchgezogene Kurve die Ergebnisse an, die mit Zellen erhalten wurden, die den sensibilisierenden DW-Haplo-Typ nicht tragen.

Es ist ersichtlich, daß die restimulierenden Bezugs-Zellen maximale oder nahezu maximale Restimulierung ergeben, die anderen restimulierenden Test-Zellen, die den HLA-D-Haplo-Typ der Bezugs-Zelle tragen, im Durchschnitt eine höhere Restimulierung ergeben als die Test-Zellen, die keinenD-Häplo-Typ aufweisen, und daß die Ergebnisse in den Fig. IA und IB sehr ähnlich sind: lediglich restimuliert die Test-Zelle H mehr als die Test-Zelle KH. Die Test-Zellen F, E und G zeigen absteigende Restimulierungsmengen. Alle Individuen, die keinen

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DW-Haplo-Typ von KH tragen, restimulieren am geringsten. Obwohl die in der Fig. IC angegebenen Daten keine sehr gute Charakterisierung ergeben, lieg L tatsächlich eine Parallelität zu der in Fig. ID gezeigten vor, d.h. die Bezugs-Zelle restimuliert in beiden Fällen am meisten, die Individuen N, 0 und M (die den sensibilisierenden DW-Haplo-Typ tragen) zeigen eine geringere Reatimulierung; die Zelle des Individuums P, die auch den sensibilisierenden Haplo-Typ durch homozygotisch typifizierende Zeil-Untersuchung trägt, restimuliert in der Fig. IC weniger als einige der Test-Zellen, die den Haplo-Typ nicht tragen, und ist auch in der Fig. ID relativ gering.

So ergeben PLT-Zellen, die gegenüber lymphoblastoiden ZeIliieihen erzielt wurden, sehr ähnliche Ergebnisse wie solche, die auf normale Zellen sensibilisiert wurden. Es versteht sich, daß die Untersuchung (Typifizierung) unter Anwendung der PLT-Zellen, die gegen spezifische HLA-D-Antigene an den lymphoblastoiden Zeil-Familien generiert wurden, durchgeführt wird unter Anwendung von normalen peripheren Blut-Lymphozyten aus dem zu untersuchenden Individuum.

Gegebenenfalls können erfindungsgemäß hergestellte PLT-Zellen zweckmäßig für zukünftige Anwendung in der für frische Lymphozyten angewendeten Weise gefroren werden. Das Gefriermedium kann aus 70 % Medium oder PBS (phosphatgepufferte Salzlösung), 20 % in der Wärme inanktiviertem und filtriertem (0,45m Millipore) gepooltem bzw. vereintem menschlichen Serum und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) bestehen. Die Zellen werden in dem gekühlten Gefriermedium (4 C) suspendiert, in Plastik-Gefrierfläschchen (Nunc) in zweckmäßiger Anzahl (etwa 6-20 χ 10 pro Fläschchen) verteilt und in einer sehr dünnen Pappschachtel in einem offenen Behälter in eine auf -80°C gekühlte Gefriervorrichtung über Nacht eingebracht. Später können die Fläschchen in Behälter mit flüssigem Stickstoff für längere Lagerung eingebracht werden.

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Vor der Anwendung werden die Zellen zweckmäßig rasch durch Schütteln der Fläschchen in einem Wasserbad von 37 C aufgetaut, bis das Eis eben geschmolzen ist, auf das Dreifache mit kaltein PBS (4 C) verdünnt und sanft zentrifugiert (6 Minuten, 70 g) unter Bildung von Zeil-Pellets, die erneut in Plasma-ergänztem Medium zur Zählung und Kultivierung suspendiert werden können.

Frische PLT-Zellen, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurden, und solche, die durch die vorstehende Gefriermethode konserviert wurden, ergaben gleiche quantitative Ergebnisse. Es ist daher möglich, Behälter zur Typifizierung bzw. Typenbestimmung zu schaffen, die gefrorene PLT-Zellen enthalten, die viele verschiedene LD-Antigene definieren. Der LD-Typ einer beliebigen Person könnte rasch durch Stimulieren der verschiedenen PLT-Zellen in dieser Anordnung bestimmt werden.

Die Möglichkeit zur Identifizierung von LD-Antigenen kann auch für andere Zwecke als die Transplantationsanpassung bedeutend sein. LD-Antigene werden durch die gleiche Region des MHC gesteuert, die die Vielzahl von Irnmun-Reaktionen auf bestimmt a spezifische Antigene steuert. Darüber hinaus hat man die LD-Region mit der Zugänglichkeit für onkogenetische Vireninfektionen bei der Maus in Verbindung gebracht, und bestimmte LD-Antigene wurden in Verbindung gebracht mit der immun-ätiologischen Erkrankung des Menschen. So kann PLT ein wichtiges Kriterium für die Diagnose menschlicher Erkrankungen sein sowie für eine spezifische Untersuchung dienen, die ein besseres Verständnis der Funktion und genetischen Feinstruktur von MHC beim Menschen oder anderen Species bzw. beim Tier ermöglicht.

Für den Fachmann ist ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung auch auf Zellen mit unterschiedlichen D-Ort-(bzw. D-Locus_r) Spezifizierungen anwendbar ist.

Außerdem erscheint ei, vernünftig, anzunehmen, daß der Zugang zu PLT zur Typifizierung von von HLA-D-Antigenen unterschiedlichen Antigenen für diagnostische Zwecke nützlich ist.

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Claims (5)

27?6988 Pa tentansprüche

1.1 Verfahren zur Herstellung eines Reagens, das zur Lympho- ^-^ zyten-definierten Typifizierung bzw. Typenbestimmung vor. menschlichen Leukozyten-Antigenen geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß man in vitro gereinigte Blut-Leukozyten mit menschlichen Zellen inkubiert, die aus lymphoblastoiden Zeil-Reihen von homozygotisch typifizierenden Zellen oder anderen Zellen spezifizierten genetischen Typs, homozygotisch für menschliche D-Region-Leukozyten-Antigene (HLA-D) oder anderen kontinuierlichen Reihen gewählt sind, und die Leukozyten aus dem Inkubationsmedium gewinnt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurcn gekennzeichnet, daß man aus dem Inkubationsmedium Leukozyten gewinnt, die Lyraphozyten enthalten, die: zur Erkennung bestimmter HLA-D-Antigene vorbereitet wurden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation im wesentlichen bis zur Vollendung der proliferativen Reaktion, vorzugsweise während 9 bis 14 Tagen, insbesondere während etwa 10 Tagen, durchführt.

4. Verfahren zur Herstellung eines zur Lymphozyten-definierlen Typenbestimmung von menschlichen Leukozyten-Antigenen geeigneten Reagens unter Verwendung von lymphoblastoiden Zeil-Keinen von homozygotisch typifizierenden Zellen.

5. Verfahren zur Untersuchung der Antigene von restimulxerenden Test-Zellen einer dritten Persor unter Verwendung der gemäß Anspruch 2 erhaltenen vorbereiteten Lymphosyten, wobei deren Reaktion gemessen wird.

ο. Verfahren zur Typifizierung bzw. Bestimmung von menschlichen Leukozyten-Antigenen, gekennzeichnet durch die Verwendung von einem tter gemäß Anspruch 1 h±z ' erhaltenen Reagentien

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zur Inkubierung in vilro mi L gereinigten menschlichen Blut-Leukozyten, erhalten von einer dritten Person, und Messung der Reaktion der gewonnenen Leukozyten durch die Aufnahme von tritiiertem Thymidin oder tritiiertem Uridin, das zu der Inkubationsmischung zugefügt wurde, durch die reagierenden bzw. ansprechenden Leukozyten, wodurch die in der dritten Person vorhandenen Antigene bestimmt werden,

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