DE2715893A1

DE2715893A1 - Verfahren zur selektiven inaktivierung von amylase

Info

Publication number: DE2715893A1
Application number: DE19772715893
Authority: DE
Inventors: Raymond D Hoerle
Original assignee: Baxter Travenol Laboratories Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1976-04-09
Filing date: 1977-04-09
Publication date: 1977-10-20
Also published as: DK161877A; DK147305C; JPS52134091A; FR2347380B1; FR2347380A1; NL7703872A; CA1080146A; GB1538739A; US4086139A; DK147305B

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf proteolytische Enzympräparate, die von Amy laseakt i v/itä t praktisch frei sind, auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung und insbesondere auf proteolytische Enzympräparate, die nach einem einmaligen Verfahren zur .differentiellen oder selektiven Aktivierung der Amy läse in Mischungen aus Protease und Amylase hergestellt werden.

Proteolytische Enzympräparate werden nach bekannten Verfahren aus Bakterien- und Pilzkulturen sowie Tierorganen, wie Pankreas, hergeleitet. Besonders bekannt ist die Herstellung von proteasehaltigen Enzymmischungen aus bakteriellen Quellen. Gewöhnlich werden mährend des Wachstum des Mikroorganismus gleichzeitig Amylaseenzyme mitgebildet. Für bestimmte Zwecke ist es wünschenswert, ein proteasehaltiges, von jeglichem Amylaseenzym praktisch freies Präparat zu schaffen. So würde man für Zwecke, diß oine EnzymoinuJirkunr) diif riio P rootrinphnse einer Substanz ohne Benin-

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trächtiqung ihrna Anylacegehaltes fordern, zweckmäßig ein von amylolyt:scher Aktivität freies Protcaseenzympräparat verwenden. So ist es bei der Behandlung von Sojamehl mit Protease Tür bestimmte Zwecke wünschenswert, ein amylasefreies Enzympräparat zu verwenden.

Die verschiedenen bekannten Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Enzymen umfassen die fraktionierte Ausfällung mit anorganischen Salzen, wie Natrium- und Ammoniumsulfate oder polymere Ausfällungsmittel; organischen Lösungsmittel, uiie Alkohole und Ketone; die Ionenaustausch-chromatographie: die selektive Absorotion und Eluierung mit Calciumphosphatgelen; die Trennung auf Kolonnen aus CMC oder DEAE Cellulose; die Sephadex-Gelfiltr?tion; die Differentialuärmeiriaktivierung bei unterschiedlichen pH-Werten; die isoe]uktrische Ausfällung, Ultrafiltration und Ultrazentifugierung. Die weitere Beschreibung üblicher Verfahren zur Enzymreinigung und -isolierung findet sich in "Process Biochemistry" Aug. 1973, Seite 9 ff. und in den dort angeführten Literaturstellen .

Ein besonders wirksamen Verfahren zur Entfernung einer unerwünschten Enzymaktivität aus rohen Präparaten besteht in der Behandlung desselben zwecks Inaktivierung des verunreinigenden Enzyms, während die gewünschte Aktivität praktisch intakt gelassen wird. Trotz der Anwesenheit der inaktiven Verunreinigung im Präparat ist diese ebenso wirksam neutralisiert, als ob sie physikalisch entfernt worden wäre. "Inaktivierung" in diesem Zusammenhang bedeutet eine irreversible Inaktivierung und nicht eine bloße Inhibiurung. Daher gibt es nach Entfornung oder Verdünnung des Inaktivierungcmittels kein erneutes Auftreten der inaktivierten

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Enzymaktivitöt.. Dia Kneten dieser Inaktiv ierungr,vorFahrun sind wesentlich geringer als Reinigungsverfahran, din kostspielige Reagenzien und mehrfache Behänd lungs- und Abtrennungsstufen erfordern. In solches Inaktivierungsverfharen ist in der US PS 2 683 682 beschrieben, wobei der pH-Wert eines Proteinase-OUAmylsepräparates zur differentiellen Inaktivierung entweder der Proteinase oder c^-Amylase eingestellt uiird.

Aufgrund dieses Standes der Technik ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, protaolytische Enzympräparate zu schaffen, die von Amylaseaktivität praktisch befreit wurden, ohne daO langwierige Abtrennungsstufen oder die Verwendung teurer Reagenzien notwendig sind.

Ein weiteres Ziel ist die Schaffung eines Verfahrens zur Behandlung von Mischungen aus proteolytischen und amylolytischen Enzymen, insbesondere solchen, die aus bakteriellen und tierischen Quellen hergeleitet sind, zur Bildung protealytischer, von Amylaseaktivität praktisch freier Enzympräparate. Weiterhin schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Inaktivierung von

Amylase in Proteasepräparaten unter gleichzeitiger Zerstörung

aller anwesenden Mikroorganismen. Die erfindungsgemäOen proteolytischen Enzympräparate sind von Amylaseaktivität praktisch frei und außerdem lagerungsbeständig.

Es ujurde nun gefunden, daß man ein gemischtes Protease-Amylase-Enzympräparat von seiner Amylseaktivität befreien kann, indem ma man es mit einem Oxidierungsmittel aus der Gruppe von Chlorit- und Hypochloritionen behandelt.

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Die Ionen u/erden der Enzymmischung in ausreichender Menge zur Inaktivierung der Atnylaso in stärkerem Maß als der Protease zugefügt. Dies bewirkt gewöhnlich eino wesentliche Inaktivierung der Amylase, während die Protease praktisch auf ihrer ursprünglichen Aktivität im unbchandelten Präparat belassen wird. Da die Ionen uiährend der Amylase— aktivierung weitgehend durch das Präparat verbraucht werden und da die inaktivierte Amylase ein enzymatisch unbedeutendes Protein ist, besteht keine Notwendigkeit für irgendwelche Trennungs- oder Reinigungs- :ufen nach der Behandlung mit den Ionen. Das Präparat ist nach der Behandlung lagerungsbeständig.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Ionen die Mikroorganismuspopulation im Präparat verringern oder eliminieren. Diese Populationen können sonst allmählich zu einem Verderben des Präparates führen oder die durch Verwendung des Präparates hergestellten Produkte beeinträchtigen.

Bekanntlich kann man Oxidierungs- oder Bleichmittel, einschließlich Hypochloritionen, mit Enzymen kombinieren (vgl. z.B. die US PSS 2 262 138, 3 709 790, 3 755 085 und 3 795 586 sowie "Chem. Abstr." 7j):107533 (1973)). Bariumperoxid wurde zum Inaktivieren von Amylasen sowie Proteinasen verwendet (vgl. die US PS 2 647 854). Weiter ist es bekannt, die mikrobiale Verunreinigung von Materialien und Oberflächen durch ihre Behandlung mit Hypochlorit zu verringern. Keine der Literaturstellen lehrt jedoch, daß Amylase in Protease-Amylase-Mischungen differentioll inaktiviert werden kann; tatsächlich scheinen die Ausführungen in "Chem.Abstr." das Gegenteil nahszulagen.

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Ein geeignetes Oxidierungsmittel zur Inaktivierung der Amylase sind Hypochloritionen (ClD"). Sie können durch unterchlorige Säure oder ein Alkalimetallsalz derselben, u/ie Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesiumhypochlorit, geliefert werden. Die Chloritionen (ClO₂") können auch direkt durch chlorige Säure oder ein Alkalimetallsalz derselben verfügbar sein. Die hier verwendete Endung "-it" bedeutet, daG ein Ion entweder durch die Säure oder das Salz geliefert wird. Gewöhnlich wird jede Ionenart allein in wässriger Lösung verwendet. Es körnen jedoch auch Mischungen der beiden Ionen verwendet werden. Außerdem können sie durch eine in situ Reaktion gebildet werden, die eine oder beide Formen aus den dem Präparat zugefügten Vorläufern liefert. Reaktion und Ausgangsmateria lien dürfen selbstverständlich für die Protease nicht ychädlich sein; weiterhin sollten sie vorzugsweise ungefährlich sein. So ist es z.B. nicht günstig, das Anhydrid von Hypochlorit, Chlormonoxid (Cl₂O) in ein wässriges Enzympräparat zur Bildung des Hypochlorits in situ einzuführen. Statt dessen wird zweckmäßig Natriumhypochlori.t in verdünnter wässriger Lösung zum Enzympräparat zugefügt. Eine leicht verfügbare verdünnte wässrige Lösung aus Natriumhypochlorit mit einem Gehalt von 5,25 % Natriümhypochlorit und 94,75 % ineiker Materialien ist unter dem Handelsnamen CLOROX^ erhältlich.

Geeignete Enzympräparate, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren differentiell inaktiviert werden können, sind aus bakteriellen und tierischen Quellen erhältlich. Die tierisch hergeleiteten Präparate stammen von Tieren mit diskreten Organen oder Flüssigkeiten, die zur Gewinnung als Enzymquelle geeignet sind. Ein

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solches Organ ist z.B. die Bauchspeicheldrüse, eine roiche Quelle von Verdauungscnzyrnen schließlich Protease und Amylase. Ein zur erfindungsgcmäßen Behandlung geeignetes pankreatisches Enzympräparat ist Pancreatin, ein bekanntes, L ipaso, Esterase, Protease Und Amylase enthaltendes Material.

Amylsehaltige Proteasen aus vielen verschiedenartigen Bakterien sind im erfindungsgemäGen Verfahren verwendbar. Besonders bevorzugt werden die Proteasen aus Bacillus subtilis und Bacillus licheniformis.

Die Wirksamkeit oder das MaG der differentiellen Inaktivierung der Amylaso in Proteasepräparaten kann von vielen Faktoren abhängen. So körrai z.B. das Verhältnis der Konzentrationen einer oder beider Ionenformen zur Protninmenge im gemischten Protease-Amylase-Präparat, die Verdünnung desselben sowie pH-Wert, Temperatur und Zeit der Berührung der Ionen mit dem Präparat die Ergebnisse beeinflussen. Diese Faktoren können vorn Fachmann leicht ausgeglichen werden, so daß die Amylase in gewünschtem MaG inaktiviert wird, während die Proteaseaktivität praktisch gleich bleibt. Es ist gewöhnlich zweckmäßig, mindestens etwa 80 % der Amylase zu inaktivieren, während die Proteaseaktivität weniger als etwa 20 % verringert wird. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man gewöhnlich eine Verminderung der Amylaseaktivität von mehr als 95 % erreichen, während gleichzeitig die Proteaseaktivität um weniger als 5 % verringert wird. Die Inaktivierung kann nach jeder üblichen Bestimmung der proteolytischen und amylolytischen Aktivität verfolgt werden.

Günstige Ergebnisse erzielt man nach dem erfindunqsgemäGen Verfahren über ninen weiten Dernich nn Geujic htsverhältnissen von

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Enzympräparat zu zugefügten Ionen. Das Präpatat braucht nur mit ausreichend Ionen zur wesentlichen Inaktivierung seiner Amylaseaktiv/ität behandelt zu werden, u/obei die Proteaseaktivität praktisch unverändert bleibt. So liefern z.B. etwa 0,1-5 Gew.-/5 Ionen, bezogen auf das Trockengeu/icht des pulverisierten Enzympräparates in der umgebenden Luft, zufriedenstellende Ergebnisse. Vorzugsweise vuerden etwa 0,2-0,5 % Hypochloritionen oder etwa 0,2-2 % Chloritionen verwendet. Die am meisten bevorzugte Konzentration Jeder getrennt verwendeten Ionenform liegt bei etwa 0,30 % Hypochlorit bzw. bei etwa 0,35 % Chlorit. Gewöhnlich wird für Jede gegebene Chloritmenge etwas weniger Hypochlorit verwendet. Insgesamt ist die Menge der verwendeten Ionen nicht entscheidend. Zu wenig führt zu einer relativ hohen restlichen Amylaseaktivita't, obgleich dies für manche Verwendungszwecke des behandelten Präparates wünschenswert sein kann, während zu viel eine Verschwendung an Reagenz ist.

Die zu behandelnden Enzympräparate können praktisch oder im wesentlichen zellfreie Lösungen, wie Filtrate von Fermentationsbrühen, rohe Tierorganextrakte oder Lösungen getrockneter Fermentationsbrühenfiltrate sein. Die Präparate können nicht nur eine Fermentationsbrühe sondern auch die Zellen des verwendeten Mikroorganismus allein oder in Kombination mit einer Vielzahl anderer Arten zur Herstellung der gemischten Protease-Amylase-Präparate enthal- ten. Weiter kann jedes der obigen Präparate Zellen von Verunreinigungen enthalten. Diese Zellen werden durch die Behandlung abgetötet, was ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäOen Verfahrens ist, Daher braucht man keine Abtrennungsstufe im erfindungsgcmäOen Verfahren anzuwenden, um das Präparat von lebenden Zellen frei zu

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machon. Es uiird bemerkt, daß eine groGe Zaiil von Zellen so viele Ionen verbrauchen, daß sine Ergänzung der zugefügten Ionen notwendig sein kann, um die gewünschte Inaktivierung der Amylase zu gewährleisten.

Geeignete Quellen der gemischten, als Ausgangsmaterialien irn erfindungsgemäOen Verfahren verwendbaren Protease-Amylase-Enzmysysteme sind bekannt und können durch mikrobiale Fermentation nach bekannten Fermentationsverfahren hergestellt werden, wie sie in Kirk-Othmer "Encyclopedia of Chemical Technology" 8, 173-230 und den dort genannten Literaturstellen beschrieben werden. Die Anwendung von bakteriellen Quellen zur Herstellung gemischter proteolytischer und amylolytischor Enzymsystome durch Fermentation ist besonders in der U5 PS 2 530 210 beschrieben.

Eine besonders geeignete Quelle eines Protease enthaltenden Enzympräparates^ist Bacillus subtilis. Dieser Mikroorganismus ist eine weit verbreitete, sporenbildende, aerobe und catalasepositive Bakterienart, die in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", Seite 613-621, 7. Aufl. 1957, erschienen bei Williams and Wilkings Co, Baltimore, Md., sowie in "Aerobic Spore Forming Bacteria", Agricultural Monograph" Nr. 16, U.S. Department of Agriculture, klassifiziert ist. Dieser Mikroorganismus ist aufgrund seiner weiten Verbreitung in der Natur der Öffentlichkeit leicht zugänglich.' Auch zahlreiche Kulturen dieses Mikroorganismus sind in öffentlichen Niederlegungsstellen verfügbar, die der Öffentlichkeit einen leichten Zugang des Deponates gewährleisten. Ein solches Deponat befindet sich z.B. bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Bezeichnung ATCC 6051a. Ein weiteres Beispiel diuses Mikroorganismus

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ist die beim U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, I1L» unter der Nr. IMRRL B-3411 deponierte Kultur. Weitere Beispiele sind dem Fachmann aus den verschiedenen öffentlichen Niederlegungsstcllen für Mikroorganismen in der ganzen Welt bekannt.

Das Enzympräparat kann bei Berührung mit dem Oxidierungsmittel trocken, in Lösung oder als Aufschlämmung vorliegen. Seine Konzentration in der Lösung ist nicht entscheidend. Gewöhnlich werden etwa 5-75 Ce .-% Feststoffe in Wasser oder einem Puffer, vorzugsweise etuia 20 Gem. -f_3f verwendet. Die gewählte Konzentration hängt weitgehend davon ob, welche Verarbeitung5verfahren vor oder nach der Behandlung angewendet worden sollen. Ein geringer Feststoffgehalt ist z.B. kennzeichnend für Fermentationsbrühen, die im erfindungsgemäßen Verfahren ohne weitere Verarbeitung behandelt u/erden können. Wünscht man dagegen ein konzentriertes Endprodukt, dann kann die Lösung des Präparates vor der Dehmdlung auf das entsprechende MaO entwässert werden.

Man kann jeden pH-Wert für die Behandlung wählen, der die Proteaseaktivität nicht beeinträchtigt; diese variiert als Funktion des pH-Wertes in Abhängigkeit von der Quelle des Enzympräparates. Aus praktischen Gründen enthalten die meisten rohen Präparate aus bakteriellen oder tierischen Quellen eine Vielzahl von Proteasen, die jeweils über einen unterschiedlichen pH-Bereich aktiv sind. Eben diese Verteilung der Proteasen bestimmt den pH Aktivitätsbereiph der Enzyme. Wo ein Enzym daher innerhalb eines pH-Bereiches von etwa 3-10 die beste Proteaseaktivität zeigt, hängt von

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der Verteilung dor Proteasen im Präparat ab. Bei Verwendung dor B. subtilis Enzynmischung iuird uin Dereich von etwa 5,8-7 bevorzugt, wobei etwa 6,3 optimal ist. Gegobenonfalls kann die Einstellung der Enzymmischung auf den gowünschten pH-Wert durch Zugabe einer geoigenten Mange an verdünnter Säure oder Alkali erfolgen .

Weder die Temperatur noch die Dauer der Ionenbehandlung sind kritisch, obgleich die Temperatur nicht so hoch sein sollte, daß die Protease inaktiviert irird. Lösungen einer Temperatur zwischen etwas oberhalb des Gefrierpunktes bis etrna 6D°C. können z.B. mehrere Minuten bis 3 Stunden lang behandelt u/erden. Gewöhnlich sind längere Behandlungszeiten mit niedrigeren Temperaturen und Ionenkonzentrationen notwendig. Vorzugsweise werden die Lösungen etwa 1 Stunde und 15 Minuten etwa bei Zimmertemperatur behandelt. Die Wahl dieser Parameter beruht weitgehend auf wirtschaftlichen Überlegungen.

Nach der Behandlung mit dem Oxidierungsmittel kann die Lösung in üblicher Weise behandelt werden, um das Produkt zur weiteren Verwendung bereitzumachen. Sie wird gewöhnlich lyophilisiert oder sprühgetrocknet, wobei diese Verfahren auch restliche Chlorit- oder Hypochloritionen entfernen.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie zu beschränken.

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"«p

Beispiel 1 ^

Ein alkalischos Proteasepräparat aus B. subtilis (als "Alkaline Protease" von der Firma Wallorstein Co. im Handel) wurde in Leitungswasser auf eine Konzentration von 20 Gnw.-^ό, bezogen auf das Trockengewicht des Präparates bei Zimmertemperatur, gelöst. Es wurde nicht versucht, unlösliches Material zu entfernen, obgleich dies gegebenenfalls leicht hätte getan werden können. Der pH-Wert dieser Lösung lag bei 6,3. Es wurden ausreichende Mengen an wässriger Natriumhypochlorit- und Natriumchloritlösung durch Mischen zu 26-g-Aliquoten der Proteaselösung zugefügt, um verschiedene Natriumhypochlorit- und -chloritkonzentrationen, bezogen auf das Trockengewicht des Enzympräparates bei Zimmertemperatur, zu erhalten. Diese Konzentrationen sind in Tabelle I in % aufgeführt. Die unterschiedlichen Anteile der inaktivierenden Ionenlösung wurden durch Zugabe von Wasser «ausgeglichen. Die Zugabo der inaktivierenden Ionen veränderte den anfänglichen pH-Wert der Enzymlöeung nicht merklich. Die Ionen blieben mit der Enzymlösung etwa 1 1/4 Stunden in Berührung, dann wurde die Lösung auf Protease- und Amylaseaktivität untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 genannt.

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zugef. Ionensalz

Tabelle 1

Wirkung der Chlorit- und Hypochloritzugabe auf die Protease- und Amyfeseaktivität

Ionensalz

Amylseaktivität

Verlust

Proteaseaktivität*

Verlust

Natriumchlorit

0,152

0,304

0,486

1,94

282

151

14

47 95 99 99

40 300 40 800 40 800 39 900 37 200

0 0 1 8

n> fJatriumhypochlorit

0,125 0,25 0,40

583

242

16

11

55
97

93

25 900 25 100 2 5 90Π 24 600

0 5

Amylase und Protease vuurden nach dem Verfahren in "Food Chemicals Codex", First Sppletnent, 2. Aufl. Seite 66 bzui. 89 bestimmt-

B β i s p i ο 1 2

Beispiel 1 wurde unter Verwendung von Natriumchlorat oder Natriumperchlorat als Ionensalz wiederholt. Die Salze wurden in Mengen von 0,179-2,29 bzui. 0,236-3,02 Gew.-^, bezogen auf das trockene Enzympulver bei Zimmertemperatur, verwendet. Diese Mengen an Notriumchlorat und Natriumperchlorat sind die entsprechenden molaren Äquivalente der Natriumhypochloritkonzentrationen von 0,125-1,6 %. Keines dieser Salze hatte irgendeine Wirkung auf die Protease- oder Amylaseaktivität trotz der Tatsache, das Natriumchlorat und Natriumperchlorat mit Chlorit und Hypochlorit nahe verwandt sind. Dies unterstreicht das äußerst selektive und unerwartete Verhalten der erfindungsgemäQen Hypochlorit- und ChIoritionen bei der selektiven Inaktivierung der Amylase.

Beispiel 3

Gasförmiges Chlor wurde bsi Zimmertemperatur durch 25 g der in Beispiel 1 beschriebenen Enzymlösung geleitet, wodurch Protease und Amylase vollständig inaktiviert wurden. Chlor ist ein bekanntes Bleichmittel, dennoch versagt es überraschenderweise bei der selektiven Inaktivierung von Amylase, wie sie durch die erfindungsgemäßen Hypochlorit- und Chloritionen erzielbar ist.

Beispiel 4

Gemäß Beispiel 1 wurde eine Enzymlösung hergestellt und auf pH 6,4 eingestellt. Zu 976 g der pH-eingestellten Lösung wurde Natriumhypochlori,t auf eine Konzentration von 0,3 %, bezogen auf das Gewicht des Enzympräparates, zugefügt. Das Gesamtgewicht iturde mit Leitungswasser auf 1000 g gebracht. Der endgültige pH-Wert

jedoch betrug 6,5, Dann wurde dieses Verfahren wiederholt, uiobei/Wasserstoffperoxid auf eine Konzentration von 0,15 %, bezogen auf das Gewicht des Enzympriipsrates, zugefügt wurde. Der pH-Wort betrug

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6,4. Diese Wassorstoffporoxidkonzc-ntration ist um 9,5 % höher als eine dem Natriumhypochlorit in 0,3-^iger Konzentration entsprnchende äquimolare Menge. Die übrigo Bohandlung nrfolgte gemäG
Beispiel 1. Die Protease- und Amylaseaktivitäten sind in Tabelle

2 genannt.

Tabelle 2

Vergleich der Wirkung von Wasser stoffperoxid und
Hypochlorit auf Protease-AmyIse-Mischungen

Cxidierungsmittel Amylase- Proteaseakt i vit ät

Natriumhypochlorit 3 27 365

Wasserstoffperoxid 236 29 579

Dann wurden die behandelten Lösungen sprühgetrocknet, erneut
gelöst und analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt.

Tabelle 3
Untersuchung des sprühgetrocknetes Produktes

Oxidierungsmittel Amylase- Protease-

' '_ \ akt ivität

Natriumhypochlorit 15 147 65Π

Wasserstoffperoxid 1250 157 512

Die Daten aus Tabelle 2 und 3 zeigen, daß Wasserstoffperoxid, ein bekanntes Oxidierungsmittel, bei der 3Glektiuen Inaktivierung von

aktiv
Amylase wesentlich weniger'als das erfindungsgemäße Hypochlorit

B β i s ρ i e 1 5

Ein von der Firma Cudahy Co. erhaltencsPancreatin wurde in isotonischer Salzlösung (ⁿ,9 % NaCl) auf eine Konzentration von 3,13 g in 25 g Lösung gelöst; die Lösung hatte einen pH-Wert von 6,5.
Es wurdn eine Natriumhypochloritlüsung ("CLOROX"^ zugefügt und
die Anteile durch Zugabe von isotonischer Salzlösung nqualisiert. Die isotonische Salzlösung wurde v/arwondet, um eine mögliche Zornotzuny r.'or Lösung bo.ν ΓΠ;ρ!ιηη .tu vormnidnn. Wie hug Tabelle h

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ersichtlich, hatto das Salz keine Wirkung auf die differentielle Inaktiviorung. Ein ähnlicher Mangel an V/irkung wurde bei der Verwendung einer Enzymlösung tnit einem pH-Wert von 5,8 anstelle von 6,5 festgestellt. Die Enzymmischung luurdo 1 1 '4 Stunden bei Zimmertonperatur behandelt und dann auf Protease- und Amylaseaktivität untersuch t.Wie in den obigen Beispielen ist dor Prozentsatz an Natriumhypochlorit auf den Feststoffgohalt der Enzymlcsung bezogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 genannt.

Tabelle A

Wirkung der Hypochloritzugabe auf Pancreatin

% Natriumhypo- Amy läse- % Protease- % chlbrit aktivität* Verlust aktivität* Verlust

0 1076 -- 27 300

1,8 467 57 28 400 0

3,6 31 97 24 800 9

7,2 3 100 19 100 30

10,8 0 100 11 200 59

* Bestimmung von Amylase- und Proteaseaktiv ität wie in Tabelle 1 Bei s ρ i el 6_

11,34 kg einer unstandardisierten, trockenen Enzymmischung, erhalten durch Trocknen des geklärten Kulturfiltrates aus der aeroben Fermentation von Bacillus subtilis in einem u/ässrigen, assimilierbares C, N und Mineralsalze enthaltenden Nährkulturmedium, die laut Bestimmung neutele.Protease, alkalische Protease und Amylase enthielt, wurde mit 45,4 kg Wasser bei 21-29,5⁰C. gemischt und zum leichteren Lösen gerührt. Die Lösung wurde durch langsame Zugabe einer 20-^igen wässrigen NaOH Lösung auf pH 6,2-6,6 eingestellt Dann wurden 758 g CLORHX ®(_mlt einem NaOCl Gehalt von 5,25 %) langsam zur obig™ Enzymlösung zugefügt, was eine Zugabe von 40 g oder 0,35 % NaOCl, bezogen auf das Gewicht der trockenen

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Mischung ergab. Das NaOCl zerstörte sofort die Amylase,und die erhaltene Lösung wurde dann sprühgetrocknet.

Die Analyse des Enzymausgangcinaterials und des endgültigen, sprühgetrockneten Materials nach den in Tabelle 1 genannten Verfahren zeigte, daß etwa 98 % der Amylase inaktiviert waren, während mehr als 90 % der Protease (in neutraler und alkalischer Form) im Endprodukt bewahrt geblieben waren.

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Claims

1.- Verfahren zur S8 lc!: tiven Innkti νierung von Amylar.ü in einer Mischung aus Protonse und Arnylasc, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mischung mit einem Oxidicrungsmilto1 aus der Gruppe von Hyppchloridioncn und Chloritionon in einer Nnnge in Berührung bringt, die zum Inaktivieren dor Amylase auf ein wesentlich höheres MaQ als der Protease wirksam ist.

2,- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekannte ichnot, daß etwa 0,1-5 % OxidierungsmittG] , bezogun :iuf das Gericht der Mischung verwendet werden.

3,- V/erfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung aus einer bakteriellen oder tierischen Quelle erhalten wird,

A.- Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daG als Oxidierungsmittel Hypochloritionen in einer Menge von etu/a 0,2-0,5 %, bezogen auf das Gewicht der Mischung, verwendet uierden.

5.- Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidierungsmittel Chloritionen in einer Menge von etiua 0,2-2 %, bezogen auf das Gewicht der Mischung, verwendet werden.

6.- Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daG die Menge des verwendeten Oxidierungsmittels wirksam ist, um mehr als etu/a 00 % der Amy laseaktivi tat, jedoch weniger als etwa 20 % der Protoaseaktivität zu inaktivieren. 7,- Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daG die Hypochlorit- oder Chloritionen als ihre Alkalimotalisa]ze vorliegen.

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ORIGINAL INSPECTED

8,- Vorfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gnkennzeichnet, daß die Hypochlorit- oder Ch lor it inn en als unlü rchlor iqc; Säure bzw. chlorige Säure vorliegen.

9,- Verfahren nach Anspruch 1 bis 0, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mischung aus einer Dacillusart, insber, on der e Oacillus subtilis oder Bacillus 1ichrniPormis, oder Bauchspeicheldrüsen erhält.

■10,- Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daIi die Lösung einen pH-Wort von etwa 5,8-7 hat.

11.- Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch geksnnzeichnet, daß eine zellfreie Mischung verwendet wird.

12,- Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung nach Inaktivierung der Amylase sprühgetrocknet wird.

Der Patentanwalt:

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