DE2714232A1

DE2714232A1 - Testanordnung fuer antibiotika und ihre verwendung

Info

Publication number: DE2714232A1
Application number: DE19772714232
Authority: DE
Inventors: Albert Carl Dornbush; Eric John Messner
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1976-04-07
Filing date: 1977-03-30
Publication date: 1977-10-27
Also published as: FR2347439B1; FR2347439A1; DK142424B; AT348671B; US4153512A; DK142424C; ES457529A1; IE44914L; BE853253A; PL197232A1; DD130281A5; ZA771094B; DK154277A; GB1517125A; IE44914B1; NL7703040A; CA1077814A; BR7702227A; SE7704091L; GR66125B

Description

27H232

PFENNING-MAAS

MEINIG -! EMKE - SPOTT

8CHLEI33HEIMERSTR 299

8000 MÜNCHEN 40

Case 26180

tM/Sm

American Cyanamid Company, Wayne, New Jersey, V.St.A.

Testanordnung für Antibiotika und ihre Verwendung

709843/0675

27U232

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Testanordnung zur Bestimmung des Ansprechens eines Mikroorganismus auf ein Antibiotikum, mit einer Vielzahl von Testkammern, von denen mindestens einige das Antibiotikum in abgestufter, graduierter Konzentration enthalten, sowie ein Verfahren zur Bestimmung des Ansprechens eines Mikroorganismus auf ein Antibiotikum unter Verwendung dieser Testanordnung.

Die Erfindung betrifft das Prüfen von Antibiotika und insbesondere Testanordnungen, die verschiedene Antibiotika oder therapeutische Mittel in einer Reihe von verschiedenen Konzentrationen enthalten, die dazu verwendet werden, die Wechselwirkung zwischen diesen Antibiotika bzw. therapeutischen Mitteln und verschiedenen Mikroorganismen, üblicherweise pathogenen Mikroorganismen zu bestimmen, wobei die Erfindung darauf beruht., daß Polyvinylpyrrolidon als Füllstoff und als das Antibiotikum enthaltendes oder zurückhaltendes Trägermaterial vorhanden ist.

Mit der Verbreitung von Antibiotika und anderen Arzneimitteln in Krankenhäusern, in Laboratorien und auch in Erziehungseinrichtungen besteht eine wachsende Nachfrage für Informationen, die das Ansprechen bzw. die Empfindlichkeit eines bestimmten Mikroorganismus gegen verschiedene Antibiotika oder Arzneimittel betreffen, sowie für Informationen hinsichtlich der Bestimmung bestimmter Bestandteile des Bluts oder anderer biologischer Flüssigkeiten.

In der BE-PS 691 532 ist eine Testanordnung zur Bestimmung der Beständigkeit von Mikroorganismen gegen Antibiotika oder Behandlungsmittel beschrieben, die gefriergetrocknete Antibiotika oder chemotherapeutische Mittel in unterschiedlichen Konzentrationen sowie eine Blindprobe in getrennten Zellen enthält, die in Form von Reihen und Spalten in einer Scha-

709843/0675

27H232

le angeordnet sind. An der Unterseite der Kulturzellen sind Fortsätze angeordnet, in denen das gefriergetrocknete Material enthalten ist. Zum Verschluß der einzelnen Zellen und zur Identifizierung des Inhalts der betreffenden Zelle sind identifizierende Deckel vorgesehen, die auf jede Zelle passen. In den Testzellen kann ein Kulturmedium und/oder ein Indikator in gefriergetrocknetem Zustand enthalten sein. Die Zellen und die Dackel sind im wesentlichen transparent, um eine Beobachtung der Kulturen zu ermöglichen.

Gemäß der US-PS 3 713 985 sind eine Reihe von biologischen Reagentien in einer Reihe von Behältern enthalten, die zu einem Streifen oder einer Platte vereinigt sind, wobei der Streifen oder die Platte mit Schwalbenschwänzen versehen ist, um eine Gruppe der Streifen oder der Platten an ihrer Längskante zu einer Schale zu verbinden. Zum Schutz des gefriergetrockneten Inhalts während der Lagerung ist eine Foliendeckschicht beschrieben. Der Inhalt wird zum Zeitpunkt der Verwendung wiederhergestellt. Das Kulturmedium und die zu untersuchenden Organismen werden nacheinander und getrennt voneinander zum Zeitpunkt der Verwendung zugesetzt, so daß zunächst das Kontrollreagens redispergiert wird, worauf die Materialien dann inokuliert und inkubiert werden.

Die Menge, in der das Antibiotikum zur Inhibierung des Wachstums von pathogenen Mikroorganismen vorliegt, liegt häufig im Bereich von etwa 0,1 bis 250 μg/ml· Wenn man davon ausgeht, daß 0,2 ml Lösung eine geeignete Testprobe darstellen, liegt die Menge des Antibiotikums in einer Reihe von Kammern zwischen etwa 0,02 und 50 μg. Diese Mengen sind derart gering, daß man mit dem bloßen Auga nicht in der Lage ist, festzustellen, ob diese Materialien in den Kammern vorhanden sind oder nicht.

Wenn man Polyvinylpyrrolidon als wasserlöslichen Füllstoff und als das Antibiotikum enthaltendes Trägermaterial verwendet, insbesondere, wenn man das Polyvinylpyrrolidon und das Antibiotikum in Form von wäßrigen Lösungen in die Test-

709843/0675

kammern einführt und dann gefriert und trocknet, wird das Antibiotikum in den Polyvinylpyrrolidonschaum eingebettet und fest in der Testkammer zurückgehalten, so daß seine Anwesenheit zum Zeitpunkt der Verwendung visuell festgestellt werden kann. Die Sichtbarkeit des Schaums gibt eine physikalische Bestätigung der Anwesenheit des Antibiotikums und führt zu einer günstigen physiologischen Beeinflussung des Benutzers.

Das seinerseits lösliche getrocknete Polyvinylpyrrolidon unterstützt die Lösung des Antibiotikums und hält dessen feinverteilte Form aufrecht. Polyvinylpyrrolidon ist biologisch inert und wird als Blutstreckmittel und für verschiedenartige biologische Zwecke verwendet. Es ist in der ÜS-Pharmacopöe als "Povidone" aufgeführt und seine biologische Verwendung ist gut bekannt. Es ist so inert, daß eine Menge von weniger als 250 bis mindestens 10000 μg/ml dazu ausreicht, einen Schwamm zu bilden, der das Antibiotikum enthält. Eine bevorzugte Konzentration von 2000 μg/ml ist geeignet. Dies führt zu einer Menge von 400 μg pro 0,2 ml- Testbehälter, was sowohl vom Standpunkt der Herstellung und der Wiederherstellung geeignet ist, und ist ebenfalls als Schaum gut sichtbar, so daß sowohl die Anwesenheit des Polyvinylpyrrolidons als auch des Antibiotikums dadurch angezeigt wird.

Vorzugsweise wendet man in jeder Testkammer die gleiche Polyviny.lpyrrolidonkonzentration an, um die Zahl der Variablen zu vermindern und über eine visuelle Beobachtung festzustellen, daß jede Kammer gleichmäßig gefüllt ist.

Häufig wird eine Kammer verwendet, die kein Antibiotikum enthält, um das Wachstumsverhalten in Abwesenheit irgendwelcher inhibierender Mittel zu zeigen oder die Sterilität der Testanordnung zu überprüfen. Diese Testkammer kann gegebenenfalls als Blindprobe Polyvinylpyrrolidon enthalten.

Die Testanordnung sollte steril sein, so daß nur eine Vermehrung des zu untersuchenden Organismus erfolgt. Daher wer-

709843/0675

27H232

den sterile Verfahrensweisen beim Füllen und Trocknen angewandt. Man kann einige Antibiotika oder das Wachstum steuernde Substanzen, die als Mittel zur Inhibierung von Mikroorganismen wirken, in situ mit Äthylenoxid, durch Strahlung, durch Hitze oder in anderer Weise, die mit der das Wachstum bekämpfenden Substanz verträglich ist, sterilisieren. Gewisse Sulfonamid-Arzneimittel haben sich bei Sterilisierungsmethoden als sehr stabil erwiesen.

Wenn man über eine Reihe von Testplatten verfügt, die jeweils mit Kammern ausgerüstet sind, so kann man jede Testplatte für ein anderes Antibiotikum verwenden. Es kann erforderlich sein, daß bei verschiedenen Patienten eines Krankenhauses verschiedene Arten von Antibiotika untersucht werden müssen.

Dadurch, daß die Testanordnungen stapelbar sind, kann man Stapel aus fünf oder zehn Testanordnungen als Einheit beim Inkubieren und bei der Lagerung handhaben. Bis zum Zeitpunkt der Verwendung kann man eine Vielzahl von Testplatten, beispielsweise 5 oder 10 Testplatten, in Form eines Stapels in Gegenwart eines Entwässerungsmittels in einem Beutel lagern. Um einen maximalen Schutz gögen Feuchtigkeitseinwirkung zu erzielen, kann man eine Folienbeutel verwenden.

Gegenstand der Erfindung ist somit eine Testanordnung zur Bestimmung des Ansprechens oder der Empfindlichkeit eines Mikroorganismus auf eine Antibiotikum, die eine Vielzahl von Testkammern aufweist, von denen mindestens einige das Antibiotikum in abgestufter, graduierter Konzentration bzw. einer Konzentrationsreihe oder Verdünnungsreihe enthalten, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie (die Kammern) eine gleichmäßige Menge von Polyvinylpyrrolidon als wasserlöslichen Füllstoff und als das Antibiotikum enthaltendes Trägermaterial enthalten, wobei das Antibiotikum in dispergierter und wiederherstellbarer gefriergetrockneter Form in dem Polyvinylpyrrolidon vorliegt.

Weitere Ausführungsformsn, Gegenstände und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der weiteren Beschreibung, in der

709843/0675

27U232

auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen ist.

In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 eine Schnittansicht einer Kultur-Testplatte mit einem Kunststoffklemmdeckel, der die einzelnen Kammern verschließ^ und zeigt das in einem Polyvinylpyrrolidonschaum enthaltene Antibiotikum;

Fig. 2 eine Ansicht eines Kunststoffklemmdeckels,

Fig. 3 eine Schnittansicht einer Kammer, die mit einer flüssigen Lösung von Antibiotikum und Polyvinylpyrrolidon gefüllt ist;

Fig. 4 eine Schnittansicht der Kammer, nachdem die Flüssigkeit gefroren und zu einem Schaum getrocknet worden ist;

Fig. 5 eine Schnittansicht der Kammer mit dem aufgebrachten Klemrndeckel;

Fig. 6 den Inhalt einer Kammer, der durch Zugabe einer Flüssigkeit wiederhergestellt wird;

Fig. 7 eine Schnittansicht einer Kammer mit dem aufgebrachten Klemmdeckel, in der eine klare Flüssigkeit enthalten ist, die entweder vor dem Wachstum der Mikroorganismen vorliegt oder in der das Wachstum der Mikroorganismen inhibiert wurde;

Fig. 8 eine einzige Kammer mit dem aufgebrachten Klemmdeckel, in der eine wolkige oder trübe Lösung vorliegt, die sich durch die Verbreitung oder Vermehrung der Mikroorganismen ergeben hat;

Fig. 9 eine Ansicht einer Gruppe von Testplatten, die in zwei Kunststoffbeuteln vorliegen, die im Inneren einer feuchtigkeitsdichten Folienhülle angeordnet sind;

Fig. 10 eine Schnittansicht einer einzelnen Kultur-Testplatte; Fig. 11 eine Seitenansicht einer einzigen Kultur-Testplatte;

Fig. 12 eine Ansicht der Stirnseite einer Kultur-Testplatte und

Fig. 13 eine Ansicht der Stirnseite eines Stapels aus fünf Kultur-Testplatten, die zum Transport oder zur Handhabung aufeinandergestapelt sind.

7098A3/0675

27U232

Wie aus den Fig. 1 und 10 zu ersehen ist, besteht die Testplatte 21 zur Durchführung von biologischen Kulturen aus einer flachen Platte 22, in der eine Reihe von rechteckigen Kammern 23 vorgesehen sind. Jede rechteckige Kammer besitzt einen flachen Boden 24 und annähernd rechteckige Wände 25. Wenn man etwa parallel verlaufende Wände vorsieht, kann man Licht mit minimaler Steuerung oder Beugung durch zwei ungefähr parallele Wände führen, wodurch man entweder mit dem Auge oder mit Hilfe einer mechanisch-optischen Einrichtung die Trübung des Materials in der Kammer feststellen bzw. messen kann. Wünschenswerterweise verjüngen sich die Kammern nach unten etwa 1/2° bis 4°, was das Formen der Kammern und das Wiederherausziehen der Form erleichtert. Wenn sich die Kammern nach unten nicht verjüngen, ist es schwierig, das Formstück herauszuziehen. Wenn die Verjüngung mehr als etwa 4° beträgt, verhält sich die Kammer in gewissem Umfang gegenüber dem Licht als Prisma;

Die in der Fig. 1 dargestellte spezifische Ausführungsform umfaßt eine Reihe von zehn Kammern. Natürlich kann die Anzahl der Kammern variieren, wenngleich eine Anzahl von zehn für die meisten Testzwecke eine geeignete Anzahl darstellt.

An der Vorderseite der flachen Platte 22 ist eine nach unten geneigte oder sich nach unten erstreckende Vorderschürze 26 vorgesehen. Die Vorderschürze verleiht der Einrichtung zusätzliche Steifigkeit und ist ferner mib einer Gruppe von kennzeichnenden Kerben 27 versehen. Jede kennzeichnende Kerbe steht räumlich mit einer Kammer in Beziehung. Geeigneterweise sind die Kerben bezüglich der betreffenden Kammer mittig angeordnet und dienen dazu, die Testplatte bezüglich der Ableseeinrichtung zu kennzeichnen, wenn ein mechanisches Fördersystem zusammen mit einem Ablesesystem für die optische Dichte angewandt wird.

Geeigneterweise, jedoch nicht erforderlich, findet sich an der Rückseite der flachen Platte eine hintere Schürze 28. Angrenzend an die Hinterseite der Plattform ist eine Verstei-

709843/0675

•y-

27H232

Ar

fungsrippe 29 vorgesehen. Diese Rippe ist zur leichteren Formung verjüngt und erstreckt sich von der flachen Plattform soweit nach unten, daß die Testplatte auf «einer flachen horizontalen Ebene horizontal steht. Vorzugsweise besitzen die Versteifungsrippe und die Kammern eine gemeinsame untere Ebene. Dies führt dazu, daß die Kultur-Testplatten flach auf einer Arbeitsoberfläche während des Befüllens und des Bebrütens abgestellt werden können und begünstigen das Stapeln der Testplatten dadurch, daß ein Kippen vermieden wird.

An den Enden der Testplatte sind Stapelgriffe 30 vorgesehen. Diese Griffe sind innen hohl und verjüngen sich, so daß sich die Platten über die Griffe verrasten, wenn sie gestapelt werden. Die Vorderseite und die Rückseite der Griffe sind geeigneterweise Verlängerungen der vorderen Schürze 26 bzw. der hinteren Schürze 28 und besitzen an beiden Enden einen ansteigenden Abschnitt 31 und eine flache Oberseite 32. Die Verlängerungen der Schürzen sind in einem solchen Winkel ausgebildet, daß die Platten sich zu einer Einheit verrasten, ohne daß sie sich miteinander verbinden oder verklemmen und ohne daß sie übermäßig beweglich sind.

Die Oberseite der flachen Platte oberhalb der Versteifungsrippe kann mit Abstandsknöpfen 33 versehen sein. Diese Abstandsknöpfe 33 besitzen eine solche Größe, daß, wenn die im folgenden erläuterten Klemmdeckel 34 auf die Kammern aufgebracht werden, die Versteifungsrippe die Abstandsknöpfe berührt und eine gleichmäßige vertikale Stapelung ermöglicht.

Für den Transport, die Inkubierung und die Lagerung werden die Kammern mit Hilfe des Klemmdeckels 34 verschlossen, so daß ihr Inhalt geschützt ist. Der Klemmdeckel besteht aus einem dünnen Blatt 35 aus flexiblem Kunststoff. Es ist geringfügig größer als die zu bedeckenden Kammern und ist mit einer Reihe von rechteckigen Kammerdeckeln 36 versehen.

709843/0675

27U232

Wie aus den Fig. 2 und 5 zu ersehen ist, ist jeder Kammerdekkel rechteckig ausgebildet und weist eine solche Größe auf, daß er in die rechteckige Kanuner 23 paßt. Der Abstand der Kammerdecköl entspricht dem Abstand der Kammern 23. Die Kammerdeckel sind hohl und erstrecken sich in zusammengeklenuntem Zustand teilweise in die Kammer hinein. Die Ränder 37 sind bequemerweise derart gestaltet, daß sie durch einfaches Drükken in die rechteckigen Kammern 23 passen, so daß der Klemmdeckel 34 leicht entfernt und aufgebracht werden kann und nach dem Aufbringen durch Belastungen beim Transport und bei der Handhabung sich nicht löst. Der Klemmdeckel ist ferner mit einer Abhebelasche 38 versehen. Die Abhebelasche ist teilweise mit einem texturierten Bereich 39 versehen. Der texturierte Bereich wird dadurch gebildet, daß man ihn mit einer texturierten Form formt, so daß der texturierte Bereich aufgerauht ist und eine Aufschrift oder eine Markierung leichter annimmt als die glatte Oberfläche des Klemmdeckels. Die Abhebelasche erstreckt sich geeigneterweise um etwa die Breite des Klemmdeckels nach außen, so daß sie, wenn sie nach innen angeordnet wird, auf die bebrütete Testplatte paßt, so daß die Abhebelasche 38 mit einem Fingernagel hochgehoben werden kann. Der Klemmdeckel kann jedoch auch um 180° um eine vertikale Achse gedreht werden, so daß die Abhebelasche sich nach außen erstreckt und als Markierungszeichen dient.

Der texturierte Bereich auf der Abhebelasche des Klemmdeckels ermöglicht die Identifizierung einer bestimmten Kultur-Testplatte eines Stapels. Geeigneterweise, aber nicht notwendigerweise trägt die Oberfläche der Kultur-Testplatte 21 eine Markierung 40. Die Markierung enthält geeigneterweise den Namen des Antibiotikums oder des Wirkstoffs, die Identifizierung der Ansatznummer, Daten und Herkunftsort und besitzt einen freien Raum zur Aufnahme des Namen des Patienten, des Datums des Testtages und andere Informationen bezüglich des Anwendungszeitpunkts.

709843/0675

In die Enden der Griffe 30 können Markierungen 41 eingeformt oder eingeprägt sein. Bequemerweise formt man ein Warenzeichen oder den Namen des Herstellers zu Identifizierungszwecken in die Oberfläche der Griffe ein.

Die Anwendung der Kultur-Testplatte ergibt sich aus den Fig. 3 bis 8. Die Kultur-Testplatte wird mit zehn rechteckigen Kammern geformt. Wie aus der Fig. 3 zu ersehen ist, ist die Kammer mit einem flüssigen, das Antibiotikum enthaltenden Polyvinylpyrrolidon 42 als wasserlöslichem Füllstoff und das Antibiotikum enthaltendem Trägermaterial gefüllt. Polyvinylpyrrolidon ist biologisch inert und übt keine Wirkung auf das Antibiotikum, das Kulturmedium oder die Mikroorganismen aus und füllt in gefrorenem und getrocknetem Zustand die Kammer mit einem Schwamm aus, der in seiner Struktur Baumwolle (cotton candy) ähnelt und das Antibiotikum an Ort und Stelle festhält und eine Wanderung des Antibiotikums verhindert.

Wie aus der Fig. 4 zu ersehen ist, ist die in die Kammern eingefüllte Flüssigkeit gefroren und getrocknet und ergibt das getrocknete Antibiotikum in dem Polyvinylpyrrolidon 43. Bequemerweise wird eine Gruppe von Kultur-Testplatten nach der Abnahme der Klemmdeckel aufeinandergestapelt, wie es in der Fig. 13 dargestellt ist, worauf eine Gruppe solcher Stapel auf die Fachbretter einer Gefrierkammer gestellt werden, wonach der Inhalt gefroren wird, die Kammer evakuiert und die Materialien unter Anwendung üblicher Gefriertrocknungsmethoden zu einem Schwamm getrocknet werden. Die Trockenheit des Schwammes wird dadurch geschützt, daß man die Klemmdeckel auf die Kammern aufbringt und die Testanordnung bis zur Verwendung in einer trockenen Umgebung lagert.

Die Fig. 5 zeigt den getrockneten Schwamm in der Kammer, die mit dem Klemmdeckel versehen ist.

Zum Zeitpunkt der Verwendung wird, wie es in der Fig. 6 dargestellt ist, ein flüssiges Verdünnungsmittel zu dem trockenen

7098A3/0675

27H232

Schwamm zugesetzt.

Üblicherweise wird, wenn man die Rohrenverdünnungsmethode anwendet, als flüssiges Verdünnungsmittel ein geeignetes Kulturmedium 44 verwendet, das mit einem Testorganismus angeimpft worden ist. Vorzugsweise verwendet man den Testorganismus in einer Standardkonzentration, so daß die mit der Testplatte erzielten Ergebnisse sowohl quantitativ als auch qualitativ sind.

Theoretisch kann man das Kulturmedium als solches mit dem Antibiotikum vermischen, trocknen und in dieser Form lagern, so daß man lediglich zum Zeitpunkt der Verwendung den Testorganismus und ein inertes Verdünnungsmittel, insbesondere Wasser, zusetzen muß. Vorzugsweise setzt man das Kulturmedium zusammen mit dem Testorganismus zu, da

(1) der Testorganismus dem Kulturmedium vor dessen Zugabe zugesetzt werden kann, so daß eine doppelte Zugabe vermieden wird,

(2) ein Kulturmedium ausgewählt werden kann, daß für einen spezifischen Testorganismus besonders gut geeignet ist und

(3) die Konzentration des Testorganisinus für alle Tests die gleiche ist.

Viele entwässerte Kulturmedien sind hygroskopisch und können dadurch, daß sie die Feuchtigkeit anziehen, die Zerstörung einiger Antibiotika beschleunigen. Verschiedene Laboratorien bevorzugen verschiedene Kulturmedien für verschiedene Organismen oder auch für den gleichen Organismus. Wenn man den untersuchten Organismus dem Kulturmedium zusetzt, ergibt sich eine weitere Flexibilität bezüglich der Auswahl des Kulturmediums. Ohne die Anwesenheit des Kulturmediums wird auch das Risiko vermindert, daß ein System vorhanden ist, daß das Wachstum von Bakterien während der Lagerung begünstigen könnte.

In der Fig. 7 ist eine Kammer dargestellt, die eine klare Lösung 45 enthält. Nachdem der Schwamm und das Antibiotikum

709843/0675

27U232

in dem Kulturmedium gelöst sind, ist die Lösung klar. Wenn eine Menge des Antibiotikums vorhanden ist, die dazu ausreicht, das Wachstum des Testorganismus zu inhibieren, bleibt die Lösung klar, während dann, wenn die Menge dazu nicht ausreicht, der Mikroorganismus wächst und zu einer trüben Lösung 46 führt, wie es in der Fig. 8 dargestellt ist.

Eine klare Lösung 45 weist daraufhin, daß kein Bakterienwachs tum vorliegt, während eine trübe Lösung 46 das Bakterienwachs tum anzeigt.

Das Ablesen der Lösungen zur Bestimmung des Bakterienwachstums kann entweder mit dem menschlichen Auge oder mit Hilfe einer elektrooptischen Vorrichtung, beispielsweise einer lichtempfindlichen Ableseeinrichtung und einer Lichtquelle mit konstanter Intensität, erfolgen. Das Licht kann eine ausgewählte Wellenlänge oder Farbe besitzen, die ihrerseits von der Lösung abhängt. Man kann für jede Kammer eine gesonderte Ableseeinrichtung verwenden oder man kann die gleiche Ableseeinrichtung dazu verwenden, nacheinander eine Gruppe von zehn Kammern einer Kultur-Testplatte auszuwerten.

Zum Transport und zur Lagerung werden Gruppen von jeweils fünf Testplatten in Form eines Stapels bequemerweise in eine Kunststoffhülle 47 eingebracht, wie es in der Fig. 9 dargestellt ist. Man kann in die Hülle auch ein Trocknungsmittel einführen, um die Trockenheit sicherzustellen. Dann kann man 2 oder mehr derartige Kunststoffhüllen in eine äußere Folienhülle 48 einbringen. Die äußere Folienhülle kann zusätzliche Trocknungsmittel enthalten und ist derart dicht verschlossen, daß ihr Inhalt während längerer Zeitdauern von der Feuchtigkeit der Umgebung freigehalten wird.

Wenn die erfindungsgemäßen Kultur-Testplatten in dieser Weise versiegelt aufbewahrt werden, so bewahren sie ihre ursprünglichen Eigenschaften während mehrerer Monate, wobei davon auszugehen ist, daß sich die Testplatten während mindestens einiger Jahre zufriedenstellend verhalten werden.

709843/0675

27Η232

Die Größe der Kammern ist nicht kritisch, wenngleich Kammern mit den Abmessungen 8x10 mm an der Oberseite und 5x8 mm an der Unterseite mit einer Tiefe von 9 mm das Verarbeiten von Flüssigkeitsmengen von 0,2 mm ermöglichen, wobei die Kammern zur Hälfte gefüllt sind und hierdurch eine geeignete Arbeitsgröße erreicht wird, bei der eine minimale Menge von Reagentien und Materialien verbraucht wird. Man erzielt gute Ergebnisse mit einer Dicke der Kammern, der Testplatte und der Griffe von etwa 0,8 mm. Diese Dicke stellt einen Kompromiß zwischen der für die Festigkeit erforderlichen Dicke und der für eine minimale Materialanwendung angestrebten Dicke dar Bei einer solchen Dicke sind die Kultur-Testplatten fest genug, so daß sie gewünschtenfalls erneut verwendet werden können; sie sind jedoch derart kostengünstig, daß es im allgemeinen billiger ist, sie als Wegwerfprodukte zu behandeln.

Das folgende Beispiel dient der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel

Man bereitet mit dem zu untersuchenden Antibiotikum eine Zweifach-Verdünnungsreihe, indem man von zehn 4 1-Kolben ausgeht, deren ersten man mit 6 g Polyvinylpyrrolidon (Povidone USP) und 3 1 dreifach destilliertem Wasser beschickt. Sämtliche anderen neun Kolben beschickt man mit 3 g Polyvinylpyrrolidon und 1500 ml dreifach destilliertem Wasser.

Dann versetzt man den ersten Kolben mit 206,25 mg Tetracyclinhydrochlorid, worauf man den Kolben schüttelt, bis der Inhalt sich gelöst und gleichmäßig verteilt hat. Dann gibt man die Hälfte des Inhalts des ersten Kolbens in den zweiten Kolben und schüttelt diesen dann bis zum E,rhalt einer gleichmäßigen Mischung. Dann bringt man die Hälfte des Inhalts des zweiten Kolbens in den dritten Kolben ein etc. und führt diese Maßnahmen fort, bis man in dem neunten Kolben die Zweifach-Serienverdünnungsreihe erreicht hat. Die überschüssige verdünnte Lösung des neunten Kolbens verwirft man. Der zehnte Kolben enthält lediglich Polyvinylpyrrolidon und dreifach destilliertes Wasser oder kann auch leer sein.

709843/0675

-X-

27H232 44

Dann führt man eine Sterilfiltration des Inhalts eines jeden Kolbens in 2 1-Reagenzflaschen durch, die dann verschlossen und bis zum Verfüllen unter sterilen Bedingungen in einem Eiswasserbad aufbewahrt werden. Mit dem Verfüllen sollte nicht unnötig gewartet werden. Die Lösungen bleiben, wenn sie kalt aufbewahrt werden, während mindestens 24 Stunden stabil und ändern sich nicht. Dennoch ist es erforderlich, den Inhalt sofort abzufüllen, um Wirkungsverluste zu vermeiden.

Dann befüllt man die entsprechenden Kammern einer einzigen Testplatte mit jeweils 2/10 ml des Inhalts jeder der Kolben.

Man füllt die Kammern von insgesamt 5000 Testplatten, stapelt die Testplatten übereinander und stapelt sie in den Regalfächern einer Kühlkammer auf. Die Kühlkammer wird vorgekühlt, indem man die Kühlkammer bei einer Temperatur von weniger als -40⁰C hält, worauf man das Kühlen auf den Regalbrettern durchführt, bis der Gesamtinhalt sämtlicher Kammern sämtlicher Testplatten festgefroren ist. Dies sollte im Verlaufe von weniger als 12 Stunden erfolgen. Nach dem Einfrieren der Lösungen evakuiert man die Kühlkammer auf einen Gesamtdruck von weniger als 100 μπι Hg, worauf man die Temperatur der Fachbretter auf etwa 10⁰C erhöht und bei dieser Temperatur beläßt, bis Temperaturproben in der Anordnung darauf hinweisen, daß die Temperatur in den Kammern in einem Bereich von etwa 5 bis 10⁰C um die Temperatur der Fachbretter selbst liegt. Die Fachbretter werden dann auf etwa 30⁰C erwärmt, worauf man, nachdem sich die Testplatten entsprechend erwärmt haben, die Temperatur auf 40⁰C steigert und die Kammer während 4 Stunden bei diesen Bedingungen beläßt. Zu diesem Zeitpunkt sind die Inhalte der Kammern vollständig getrocknet .

Unter Anwendung steriler Techniken bringt man die Klemmdekkel auf die getrockneten Kammern der Testplatten auf, stapelt fünf Testplatten übereinander und verpackt sie in einer

7098A3/0675

27U232

Polyäthylen-Kunststoffhülle. In jede der Kunststoffhüllen bringt man zur Unterstützung der Trockenheit ein Päckchen von 5 g Kieselgel ein. Dann umhüllt man zwei derartige Hüllen, die jeweils fünf Testplatten enthalten, mit einer äußeren Folienhülle, die im wesentlichen feuchtigkeitsundurchlässig ist und die Trockenheit der Testplatten während mindestens einiger Monate und wahrscheinlich einiger Jahre, wenn nicht für immer, sicherstellt.

Die Kultur-Testplatten sind jeweils mit einer Markierung versehen, die auf das besondere Antibiotikum und dessen Konzentration in jeder der Kammern hinweist, wobei Raum für weitere Informationen bezüglich des Datums, des Patienten und der Untersuchungsbedingungen, unter denen die Kultur-Testplatte verwendet wird, freigelassen ist. Eine Reihe von Folienhüllen wird dann in einen Transportbehälter verpackt, wobei die Anzahl von der geforderten Menge des Benutzers abhängt.

Wenn die Kammern in dieser Weise gefüllt sind, enthalten sie das Antibiotikum in den in der folgenden Tabelle I angegebenen Konzentrationen.

Tabelle I

pyrrolidon

Kammer Nr.	Tetracyclinhydro- chlorid-Menqe
1	12,5 μg + 10 % Übe
2	6,25 μg
3	3,125 μg
4	1,56 μg
5	0,78 μg
6	0,39 μg
7	0,195 μg
8	0,098 μg
9	0,049 μg
10	0,00 μg

709843/0675

27K232

Die Kultur-Testplatten werden üblicherweise für irgendwelche Antibiotika oder therapeutische Mittel verwendet, wie Penicillin, Ampicillin, Clindamycin, Erythromycin, Methicillin, Tetracyclin, Demethylchlortetracyclin, 7-Dimethylamino-6-demethyl-6-desoxytetracyclin, Minocyclin, Cephalothin, Gentamycin, Colistin, Carbenicillin, Chloramphenicol, Kanamycin und irgendwelche Sulfonamide.

Man kann auch irgendwelche anderen bekannten oder noch zu findenden Antibiotika verwenden - wobei gewisse Antibiotika andere Konzentrationsbereiche benötigen können, als sie angegeben sind, wobei jedoch der weite Bereich der neun Verdünnungen, die in den entsprechenden Kammern vorliegen, eine geeignete Dosierung für die meisten Antibiotika darstellen.

Die zehnte Kammer enthält kein Antibiotikum und zeigt daher, wenn sie mit dem zu untersuchenden Mikroorganismus bebrütet wird, das Wachstum des Mikroorganismus unter nichtinhibierten Bedingungen. Wenn diese Kammer nicht inokuliert wird, so dient sie dazu, zu zeigen, daß keine Verunreinigungen vorhanden sind.

Die Anzahl der Kultur-Testplatten und die Auswahl der Kultur-Testplatten bezüglich der verschiedenen Antibiotika hängt von dem medizinischen Personal ab, das die Testplatten verwendet.

Zum Zeitpunkt der Verwendung pipettiert man aliquote Mengen von Nährbrühe, die mit der zu untersuchenden Bakterienkultur angeimpft ist, in jede Kammer der Platte ein, worauf man die Platten während einer bestimmten Zeit bei einer angegebenen Temperatur inkubiert. Der Test wird durch visuelle Untersuchung des Wachstums, das sich durch eine Trübung zeigt, oder des Nichtwachstums, das sich durch eine nichttrübe Suspension erkennen läßt, abgelesen. Der Endpunkt ist als die Kammer mit der niedrigsten Konzentration des Antibiotikums definiert, in der kein nachweisbares Mikrobenwachstum erfolgt ist. Die Kontrollkammer einer jeden Platte, in der

709843/0675

27K232

kein antimikrobielles Mittel vorhanden ist, dient als Maß für das nichtinhibierte Wachstum der Bakterienkultur.

Ein gut erkennbares Wachstum beobachtet man in den meisten Fällen bei schnellwachsenden Bakterien im Verlaufe von 4 bis 6 Stunden. Ein zu diesem Zeitpunkt ermittelter Endpunkt der minimalen inhibierenden Konzentration hat sich als äquivalent gegenüber den Endpunkten erwiesen, die man nach einer Inkubierungszeit von 18 Stunden bei Mikroorganismen mit schnellem Wachstum beobachtet. Weiterhin zeigen Untersuchungen mit Bakterien mit einer langsameren Wachstumsgeschwindigkeit, daß man vorläufige minimale inhibierende Konzentrationen nach einer Inkubationszeit von 4 bis 6 Stunden ermitteln kann, wenngleich man die Platten während der vollen 18 Stunden inkubieren sollte, um endgültige Ergebnisse zu erzielen.

Der Endpunkt ist als die Kammer definiert, die die Konzentration eines antimikrobiellen Mittels enthält, in der sich kein nachweisbares Mikrobenwachstum visuell feststellen läßt als Trübung oder als entsprechende Menge ausgeflockter oder zusammengeballter Bakterien.

Eine geringe Trübung oder eine kleine Anzahl von Teilchen, die man am Boden einer Kammer beobachtet, stehen nicht für ein Wachstum.

Die minimale inhibierende Konzentration in μg oder in Einheiten pro ml erhält man dadurch, daß man die Zahl mit dem Wert 5 multipliziert, die neben der Kammer aufgedruckt ist, in der kein Wachstum erfolgt.

Durch die erfindungsgemäße Anwendung von Polyvinylpyrrolidon werden zwei Probleme gelöst, die bei der Herstellung und der Anwendung herkömmlicher Testanordnungen auftreten.

709843/0675

27H232 AtT

Erstens, da die Menge des Antibiotikums in den Kammern sehr gering ist (Mikrogramm) und durch Serienverdünnung und Gefriertrocknung in die Kammern eingebracht wird, ist es visuell sehr schwierig, vom Standpunkt der Qualitätskontrolle aus gesehen, festzustellen, ob eine gegebene Kammer das Antibiotikum enthält oder nicht. Die Zugabe von Polyvinylpyrrolidon als Füllstoff erleichtert diesen visuellen Nachweis.

Zweitens, durch die Anwendung von Polyvinylpyrrolidon zusammen mit dem Antibiotikum erhält man einen gefriergetrockneten Schaumstöpsel mit einer Konsistenz, die der von Baumwolle (cotton candy) nicht unähnlich ist, der genau in die Kammer paßt und an dem Boden und den Seitenwänden haftet. Hierdurch ist eine Entfernung aus der Kammer während des Verschließens und des öffnens der Platten während ihres Transports und ihrer Lagerung wesentlich weniger wahrscheinlich.

Polyvinylpyrrolidon kann ohne weiteres zusammen mit dem Antibiotikum in Wasser gelöst und später mit der wäßrigen Nährbrühe angeimpft werden. Weiterhin reagiert Polyvinylpyrrolidon nicht mit dem Antibiotikum, noch beeinflußt es dessen Wirkung oder die Wachstumseigenschaften von pathogenen Organismen.

709843/0675

Leerseit

Claims

Patentansprüche

[iy Testanordnung zur Bestimmung des Ansprechens eines Mikroorganismus auf ein Antibiotikum, mit einer Vielzahl von Testkammern, von denen mindestens einige das Antibiotikum in abgestufter, graduierter Konzentration enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine gleichmäßige Menqe von Polyvinylpyrrolidon als wasserlöslichen Füllstoff und als das Antibiotikum enthaltendes Trägermaterial enthalten, wobei das Antibiotikum in dispergierter und wiederherstellbarer gefriergetrockneter Form in dem Polyvinylpyrrolidon vorliegt.
2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum in einer Zweifach-Verdünnungsreihe vorliegt, die mindestens einen Teil des Bereiches von 1 bis 10 Kg/ml umfaßt.
3. Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie steril in einem feuchtigkeitsdichten Behälter verpackt ist.
4. Verfahren zur Bestimmung des Ansprechens einer; Mikroorganismus auf ein Antibiotikum mit Hilfe einer Reihenverdünnungstechnik, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum unter Bildung einer Fonzentrationsrsihe in Wasser löst, das eine gleichmäßige Konzentration von Polyvinylpyrrolidon enthalt, das als wasserlöslicher Füllstoff und als das Antibiotikum enthaltendes Trägermaterial dient, gleichgroße Mengender Konzentrationsreihe in eine Reihe von Testkammern einbringt, die Konzentrationsreihe gefriert und gefriertrocknet, sie bis zum Zeitpunkt der Verwendung lagert und das Antibiotikum in dem Polyvinylpyrrolidon wieder herstellt, indem man ein Kulturmedium zusetzt, das mit dem zu untersuchenden Mikroorganismus angeimpft ist, das KuItur-

709843/0675 ORIGINAL INSPECTED

27H232

a.

medium inkubiert und dann das Wachstums des Mikroorganismus feststellt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum in einer Zweifach-Verdünnungsreihe vorliegt, die mindestens einen Teil des Bereichs von 1 bis 10 μg/ml einschließt.