DE2700196C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzielung von Tieftemperatur-Brüchen und auf eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.The invention relates to a method for achieving this of low temperature breaks and on a device for Performing this procedure.

Es ist bekannt, daß das Tieftemperaturbruchverfahren darin besteht, daß eine Probe, die untersucht werden soll, im wesentlichen bis auf -100°C abgekühlt wird, daß diese Probe dann gebrochen wird, wenn sie die tiefe Temperatur hat, daß auf der oder den durch den Bruch freigelegten Fläche(n) ein Abschattungsmetall aufgebracht wird, das das Relief der Oberfläche herausarbeitet, und daß dann mit Hilfe bekannter Einrichtungen dieses Relief unter­ sucht wird. Bis jetzt wurden diese kryoskopischen Brüche unter sehr verschiedenen Bedingungen erzeugt, doch wurde allgemein der Hauptteil der Arbeitsgänge und ins­ besondere das Aufbringen des Abschattungsmetalls unter absoluten Drücken in der Größenordnung von 10 ^-5 bis 10 ^-6 Torr ausgeführt.It is known that the cryogenic rupture process consists in cooling a sample to be examined substantially down to -100 ° C, then rupturing that sample when it is at the low temperature that is at or through the fracture exposed surface (s) a shading metal is applied, which works out the relief of the surface, and that this relief is then examined with the help of known facilities. So far, these cryoscopic fractures have been produced under very different conditions, but in general the main part of the operations and in particular the application of the shading metal has been carried out under absolute pressures in the order of 10 ^-5 to 10 ^-6 Torr.

Es hat sich jedoch gezeigt, daß diese Arbeitsbedingungen zu anfechtbaren Ergebnissen führen konnten, was ins­ besondere auf Verunreinigungen, die sich auf der frei­ gelegten Oberfläche der Probe absetzen können, und auf Deformationen, die auf dem Relief der Probe bei der Ab­ schattung auftreten können, zurückzuführen ist.However, it has been shown that these working conditions could lead to contestable results, which resulted in special on contaminants that are on the free placed on the surface of the sample, and on Deformations on the relief of the specimen during the ab shading can occur.

Die Verunreinigungen waren bisher vor allem darauf zu­ rückzuführen, daß Kryofrakturen in Vakuumgefäßen aus­ geführt wurden, bei denen mittels Öldiffusionspumpen ein Vakuum zwischen 10 ^-6 und 10 ^-7 Torr erzeugt wurde (Bullivant and Ames, J. Cell, Biol., 29 (1966, Seite 435 bis 447). Die Rückdiffusion von Öldampf und von Rest­ wasserdampf (mangels Ausheizungsmöglichkeit des Systems) führte zum Niederschlag einer Kondensationsschicht auf der Bruchfläche. Dabei wurde auch bereits versucht, diese Kondensation dadurch zu vermindern, daß Abschirmungen unter einer Kühlung mit flüssigem Stickstoff um die Bruch­ proben angeordnet wurden. Auch diese Möglichkeiten waren aber auf Bruchtemperaturen bis etwa -150°C beschränkt (Staehlin und Berthaud, J. Ultrastr. Res., 37 (1971) Seite 146-168).The contamination was previously mainly attributable to the fact that cryofractures were carried out in vacuum vessels in which a vacuum between 10 ^-6 and 10 ^-7 Torr was generated by means of oil diffusion pumps (Bullivant and Ames, J. Cell, Biol., 29 (1966 , Pages 435 to 447) The back diffusion of oil vapor and residual water vapor (due to the lack of heating of the system) led to the precipitation of a condensation layer on the fracture surface were arranged around the fracture samples, but these possibilities were also limited to fracture temperatures down to approximately -150 ° C. (Staehlin and Berthaud, J. Ultrastr. Res., 37 (1971) pages 146-168).

Brüche bei Temperaturen von -180°C oder niedriger wurden überhaupt nur außerhalb des Vakuumgefäßes durchgeführt, wobei die Proben in flüssigen Stickstoff oder in flüssi­ ges Helium eingetaucht wurden. Erst nach dem Bruch wurden dann die Proben in das Vakuumgefäß überführt (Chalcroft and Bullivant, J. Cell, Biol. 47 (1970), Seite 49-60, und Sleytr und Umrath, J. Microsc. 101 (1974), Seite 187- 195).Fractures have occurred at temperatures of -180 ° C or lower performed only outside of the vacuum vessel at all, the samples in liquid nitrogen or in liquid helium were immersed. Only after the break were then the samples are transferred to the vacuum vessel (Chalcroft and Bullivant, J. Cell, Biol. 47 (1970), pages 49-60, and Sleytr and Umrath, J. Microsc. 101 (1974), page 187- 195).

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Erzielung von Tieftemperaturbrüchen an geeignet gekühlten Proben und zum Abschatten der freigelegten Oberflächen sowie eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens an­ zugeben, wobei Verunreinigungen der freigelegten Bruch­ flächen und Deformationen auf dem Relief der Probe bei der Abschattung praktisch vollständig vermieden werden können.The object of the invention is to achieve a method of low temperature fractures on suitably cooled samples  and to shade the exposed surfaces as well an apparatus for performing this method admit contaminating the exposed break areas and deformations on the relief of the sample the shadowing can be practically completely avoided can.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß das Brechen und das Abschatten in einer Umhüllung aus­ geführt werden, in der der Druck unter 10 ^-7 Torr liegt, und daß das Abschatten durch Aufdampfen eines schweren Metalls wie Tantal unter solchen Temperaturbedingungen ausgeführt wird, daß das Ablagern einer Abschattungs­ schicht von ungefähr 10 bis 15 Angström in einer Zeit­ dauer in der Größenordnung von 1 bis 5 Minuten erfolgt.According to the invention this object is achieved in that the breaking and shading are carried out in an envelope in which the pressure is below 10 ^-7 torr, and that the shading is carried out by vapor deposition of a heavy metal such as tantalum under such temperature conditions that the Deposition of a shading layer of approximately 10 to 15 angstroms takes place in a time period of the order of 1 to 5 minutes.

Die Anwendung eines extrem niedrigen Drucks - unter 10 ^-7 Torr und häufig in der Größenordnung von 10 ^-9 Torr - führt zu einem vernachlässigbar geringen Wert der Ver­ unreinigung auf der Oberfläche der Probe; ein solcher Druck gestattet es, die durch das Brechen erscheinende Fläche während einer sehr langen Zeitdauer in der Größen­ ordnung von mehreren Minuten freiliegen zu lassen, bevor diese Fläche verun­ reinigt wird, während es bei Anwendung von Drücken in der Größenordnung von 10 ^-5 bis 10 ^-6 Torr zur Vermeidung jeglicher Verunreinigung notwendig war, das Aufbringen des Metalls in einigen Sekunden auszuführen. Auf Grund der Tatsache, daß auf diese Weise die zur Durchführung der Abschattung mittels des Metalls aufgewendete Zeit­ dauer verlängert werden kann, ist es möglich, einen schwächeren Dampfdruck des Metalls anzuwenden, d. h. eine geringere Temperatur der Vorrichtung, die dieses Metall verdampft. Diese niedrige Temperatur ermöglicht eine Begrenzung der thermischen Bestrahlung, der die Probe ausgesetzt ist.The application of an extremely low pressure - below 10 ^-7 Torr and often in the order of 10 ^-9 Torr - leads to a negligible level of contamination on the surface of the sample; such pressure allows the area which appears to be broken to be exposed for a very long period of time, on the order of several minutes, before this area is contaminated, whereas when using pressures of the order of 10 ^-5 to 10 ^-6 torr to avoid any contamination, it was necessary to apply the metal in a few seconds. Due to the fact that in this way the time taken to carry out the shading by means of the metal can be extended, it is possible to apply a lower vapor pressure of the metal, ie a lower temperature of the device which evaporates this metal. This low temperature limits the thermal radiation to which the sample is exposed.

Es hat sich auch gezeigt, daß es gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung wünschenswert ist, das Brechen und gegebenenfalls die anschließenden Arbeitsgänge auszuführen, wenn sich die Probe auf einer Temperatur unter -196°C befindet. Wenn dies der Fall ist, ist es natürlich besonders unerläßlich, bei einem sehr schwachen Druck gemäß dem Hauptmerkmal der Erfindung zu arbeiten, damit jegliche Verunreinigung der im Augen­ blick des Brechens freigelegten Oberfläche der Probe vermieden wird. Vorzugsweise wird bei sehr niedrigen Temperaturen (beispielsweis -250°C) gearbeitet, da die bei diesen sehr niedrigen Temperaturen ausgeführten Brüche mehr Informationen als Brüche liefern können, die bei -100°C ausgeführt werden. Schließlich kann die Kontrolle der Eissublimation im Ultrahochvakuum notwendig machen, das Brechen der Probe bei diesen sehr niedrigen Temperaturen (unter -196°C) auszuführen.It has also been shown that according to another Feature of the invention is desirable breaking and, if necessary, the subsequent operations execute when the sample is at a temperature is below -196 ° C. If so, it is it is of course particularly indispensable for a very weak pressure according to the main feature of the invention to work to prevent any contamination of the eyes view of the breaking exposed surface of the sample is avoided. Preferably at very low Temperatures (for example -250 ° C) worked because those executed at these very low temperatures Fractions can provide more information than fractions can which are carried out at -100 ° C. After all, can control of ice sublimation in an ultra-high vacuum make it necessary to break the sample at these very low temperatures (below -196 ° C).

Die Erfindung bezieht sich auch auf eine verbesserte Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, gemäß den im Anspruch 3 angegebenen Merkmalen.The invention also relates to an improved one Device for performing the invention  Process, according to that specified in claim 3 Characteristics.

Die bekannten Vorrichtungen zur Erzielung von Tief­ temperatur-Brüchen enthalten im wesentlichen eine Trägerplatte, die mittels bekannter Verfahren gekühlt werden kann; auf dieser Platte ist ein von der Platte gekühlter Objektträger angebracht, auf dem die Proben befestigt sind. Die Gesamtanordnung dieser Apparaturen ist in einer Kammer enthalten, deren Innenraum evakuiert werden kann. In dieser Kammer befinden sich eine oder mehrere mit Elektronenaufprall arbeitende Verdampfungs­ kanonen, mit deren Hilfe die Abschattung ausgeführt werden kann. Diese Vorrichtungen enthalten auch eine entsprechende automatische Einrichtung, mit deren Hilfe durch Öffnen des Objektträgers das Brechen der einen oder der mehreren Proben im Probenträger ausgeführt wird. Schließlich können diese Vorrichtungen einen Zylinder zur Verhinderung von Verunreinigungen enthalten, der die Trägerplatte teilweise umgibt und auf eine unter der Plattentemperatur liegende Temperatur abgekühlt ist, so daß er auf diese Weise die Rolle einer Kühlfalle spielt.The known devices for achieving low Temperature breaks essentially contain one Carrier plate that is cooled by known methods can be; on this plate is one from the plate cooled slide attached on which the samples are attached. The overall arrangement of these devices is contained in a chamber, the interior of which is evacuated can be. There is a or in this chamber several evaporation working with electron impact cannons, with the help of which shadowing is carried out can be. These devices also include one appropriate automatic setup, with their Help break by opening the slide the one or more samples in the sample holder is performed. Finally, these devices a pollution prevention cylinder included, which partially surrounds the carrier plate and to a temperature below the plate temperature has cooled down, so that he is the role of a Cold trap plays.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung enthält alle Bauein­ heiten der Vorrichtungen zur Erzielung von Tieftemperatur- Brüchen, wie sie oben beschrieben werden, doch enthält sie außerdem gewisse charakteristische wichtige Einrich­ tungen.The device according to the invention contains all components of the devices for achieving low-temperature Fractions as described above, but contains they also have certain characteristic important features exercises.

Es ist von Vorteil, wenn die Vorrichtung mit Einrichtungen ausgestattet ist, mit deren Hilfe in der Kammer, in der das Brechen ausgeführt werden soll, ein Druck unter 10 ^-7 Torr erzielt werden kann; zu diesem Zweck enthält die Vorrichtung die notwendigen Pumpen zur Erzielung des angestrebten Vakuums und vorzugsweise eine Pumpe mit Fallenplatten für das Primärpumpen und eine Ionenpumpe für das Pumpen bis auf das angewendete Hochvakuum. Ferner ist die Vor­ richtung zu diesem Zweck mit Materialien und Dichtungs­ verbindungen ausgeführt, die die Erzielung und die Auf­ rechterhaltung der notwendigen niedrigen Drücke er­ möglichen.It is advantageous if the device is equipped with means by means of which a pressure below 10 ^-7 Torr can be achieved in the chamber in which the breaking is to be carried out; For this purpose, the device contains the pumps required to achieve the desired vacuum and preferably a pump with trap plates for the primary pumping and an ion pump for pumping up to the high vacuum used. Furthermore, the device is designed for this purpose with materials and sealing compounds that enable it to achieve and maintain the necessary low pressures.

Es ist von Vorteil, wenn die Vorrichtung eine Schleuse zum Einführen des Objektträgers in die Bruchkammer enthält. Diese Schleuse hat ein Volumen, das kleiner als etwa 5 bis 10% des Kammervolumens ist; sie ist mit einem Unterdruckanschluß versehen und sie weist Einrichtungen auf, mit deren Hilfe der Objektträger der Schleuse unter Vakuum bis auf die Trägerplatte in der Kammer übertragen werden kann. Diese Übertragung kann mittels eines bekannten Zugschiebers oder mittels einer Drehung der Schleuse selbst ausgeführt werden, wobei diese Drehung eine Durchführung zwischen den Innenraum der Schleuse und der Kammer öffnet.It is beneficial if the device a lock for insertion of the slide into the fracture chamber. These Sluice has a volume that is less than about 5 to 10% of the chamber volume; she is with one Provided vacuum connection and it has facilities on, with the help of the slide of the lock under Transfer vacuum to the carrier plate in the chamber can be. This transmission can be done by means of a known slide valve or by rotating the Lock itself to be executed, this rotation a passage between the interior of the lock and the chamber opens.

Der Nutzen dieser Schleuse ist offensichtlich; sie ermöglicht eine beträchtliche Reduzierung der Pumpzeit (auf einige Minuten) zwischen dem Probeneinführungs­ zeitpunkt und dem Zeitpunkt, an dem die Probe gebrochen wird. The benefits of this lock are obvious; they enables a significant reduction in pumping time (for a few minutes) between sample introduction time and the point at which the sample is broken becomes.  

Es ist von Vorteil, wenn eine oder mehrere Verdampfungskanonen, mit deren Hilfe das Abschatten ausgeführt werden kann, an der Wand der Kammer befestigt sind. Diese Verdampfungskanonen sind auf diese Weise leicht zugänglich, und sie können von außen eingestellt werden.It is an advantage if one or more evaporation cannons, with their Help the shadowing can be done on the wall the chamber are attached. These are evaporation cannons this way easily accessible and they can be accessed from the outside can be set.

Der Probenträger ist von Scheiben mit einem Durchmesser von 3 mm gebildet, die folglich nur eine sehr geringe thermische Trägheit beim Gefrieren der Proben aufweisen. Eine oder mehrere dieser Probenträger werden dann nach dem Gefrieren in einen Objektträger geschoben, der einen festen Abschnitt und einen um eine Achse beweglichen Ab­ schnitt zur Durchführung des Brechens der Probe aufweist.The sample carrier is of disks with a diameter formed by 3 mm, which is consequently only a very small exhibit thermal inertia when samples freeze. One or more of these sample carriers are then used frozen in a slide that one fixed section and an Ab movable about an axis cut to perform sample breaking.

Der Objektträger der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist gegenüber bekannten Objektträgern zwei Merkmale auf:The slide of the device according to the invention has two features compared to known slides:

Einerseits ist er mit Einrichtungen, beispielsweise einer Schraube im festen Abschnitt und einer Feder im beweglichen Abschnitt, ausgestattet, mit deren Hilfe jede der Scheiben angebracht und nach dem Brechen an ihrer Stelle gehalten werden kann und mit deren Hilfe auf Grund eines sehr engen Kontakts ein ständiger Wärmeaustausch zwischen dem Objekt­ träger und den Scheiben gewährleistet wird.On the one hand he is with facilities, for example one Screw in the fixed section and a spring in the movable Section equipped with the help of each of the discs attached and held in place after breaking can be and with the help of a very narrow Contact a constant heat exchange between the object carrier and the discs is guaranteed.

Andererseits weist er vorzugsweise im Gegensatz zu bekannten Objektträgern eine relativ große thermisch Trägheit auf, die so berechnet ist, daß der Objektträger eine ausreichend niedrige Temperatur beibehält, wenn er aus der Gefrier­ flüssigkeit herausgenommen und in die Schleuse und von dieser Schleuse aus in die Kammer gebracht wird.
On the other hand, it preferably has, in contrast to known slides, a relatively large thermal inertia, which is calculated so that the slide maintains a sufficiently low temperature when it is removed from the freezing liquid and brought into the lock and from this lock into the chamber becomes.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung wird folgendermaßen angewendet:
Ein zu untersuchendes Gewebefragment wird zwischen zwei den Probenträger bildende Scheiben eingefügt;
dieser Probenträger wird in eine geeignete Kälteflüssigkeit eingetaucht und dann in den zuvor gekühlten Objektträger geschoben; jeder Objektträger kann mehrere Probenträger aufnehmen;
die engen Berührungen zwischen dem Probenträger und dem Objektträger (beispielsweise mittels Schraube und Feder) werden hergestellt;
die Gesamtanordnung wird dann in die Schleuse eingebracht, die zum Atmosphärendruck hin offen ist, während in der Kammer der Vorrichtung ein Druck unter 10 ^-7 Torr vorliegt;
in einigen Minuten wird in der Schleuse ein Vakuum in der Größenordnung von 10 ^-3 bis 10 ^-4 Torr hergestellt, worauf dann die Verbindung zwischen der Schleuse und der Kammer geöffnet wird und der Probenträger auf die in geeigneter Weise gekühlte Platte übertragen wird; nach einigen Minuten ist in der Kammer und am Objekt­ träger ein geeigneter Druck unter 10 ^-7 Torr erhalten worden; die Probe hat dann die für das Brechen gewählte Temperatur erreicht;
durch Öffnen des beweglichen Abschnitts des Objekt­ trägers wird dann das Brechen ausgeführt, worauf dann die letztlich bekannten Vorgänge des Abschattens und des Kopierens folgen. The device according to the invention is used as follows:
A tissue fragment to be examined is inserted between two disks forming the sample carrier;
this sample slide is immersed in a suitable cooling liquid and then pushed into the previously cooled slide; each slide can hold multiple specimen slides;
the close contacts between the specimen slide and the slide (for example by means of a screw and spring) are produced;
the entire assembly is then placed in the lock which is open to atmospheric pressure while the pressure in the chamber of the device is below 10 ^-7 torr;
in a few minutes a vacuum of the order of 10 ^-3 to 10 ^-4 Torr is created in the lock, whereupon the connection between the lock and the chamber is opened and the sample carrier is transferred to the suitably cooled plate; after a few minutes a suitable pressure below 10 ^-7 Torr was obtained in the chamber and on the slide; the sample has then reached the temperature selected for breaking;
by opening the movable section of the object, the breaking is then carried out, followed by the ultimately known processes of shadowing and copying.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung gestattet folgendes:
Eine sehr hohe Geschwindigkeit beim Erhalten der Nach­ bildungen;
die Durchführung der Abschattung durch Aufdampfen eines Metalls wie Tantal unter besseren Bedingungen auf Grund des Fehlens von Verunreinigungen;
die Kontrolle der Eissublimation bei der Durchführung der Brüche bei sehr niedrigen Temperaturen.The device according to the invention allows the following:
A very high speed in obtaining the replications;
performing shading by vapor deposition of a metal such as tantalum in better conditions due to the absence of impurities;
the control of ice sublimation when breaking at very low temperatures.

Claims (4)

1. Verfahren zur Erzielung von Tieftemperatur-Brüchen an geeignet gekühlten Proben und zum Abschatten der freigelegten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, daß das Brechen und das Abschatten in einer Umhüllung aus­ geführt werden, in der der Druck unter 10 ^-7 Torr liegt, und daß das Abschatten durch Aufdampfen eines schweren Metalls wie Tantal unter solchen Temperaturbedingungen ausgeführt wird, daß das Ablagern einer Abschattungs­ schicht von ungefähr 10 bis 15 Angström in einer Zeit­ dauer in der Größenordnung von 1 bis 5 Minuten erfolgt.1. A method for achieving low-temperature fractures on suitably cooled samples and for shading the exposed surfaces, characterized in that the breaking and shading are carried out in an envelope in which the pressure is below 10 ^-7 Torr, and that Shading is carried out by evaporating a heavy metal such as tantalum under such temperature conditions that the deposition of a shading layer of approximately 10 to 15 angstroms takes place in a time period of the order of 1 to 5 minutes. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Brechen durchgeführt wird, wenn die Probe eine Temperatur von weniger als -196°C hat.2. The method according to claim 1, characterized in that the breaking is done when the sample is a Temperature of less than -196 ° C. 3. Vorrichtung zur Erzielung von Tieftemperatur-Brüchen an geeignet gekühlten Proben mit einer kühlbaren Träger­ platte, auf der ein Objektträger zur Durchführung des Brechens angebracht ist, der wenigstens einen Probeträger enthält, wobei die Gesamtanordnung in einer dichten Kammer angebracht ist, in der sich wenigstens eine mit dem Aufprall von Elektronen arbeitende Verdampfungs­ kanone befindet, gekennzeichnet durch Vakuumeinrichtungen zur Erzielung eines unter 10 ^-7 Torr liegenden Drucks in der Kammer und eine Schleuse, die ein Innenvolumen in der Größenordnung von 5 bis 10% der Kammer hat, und die Einrichtungen zum Übertragen des Objektträgers aus ihrem Innenraum, dessen Druck auf wenigstens 10 ^-3 Torr gebracht worden ist, auf die in der Kammer enthaltende Platte enthält. 3. Device for achieving low-temperature fractures on suitably cooled samples with a coolable support plate on which a slide for carrying out the breaking is attached, which contains at least one sample holder, the overall arrangement being mounted in a sealed chamber in which at least an electron impacting evaporation cannon is located, characterized by vacuum devices to achieve a pressure below 10 ^-7 Torr in the chamber and a lock, which has an internal volume of the order of 5 to 10% of the chamber, and the devices for Transferring the slide from its interior, the pressure of which has been brought to at least 10 ^-3 torr, onto the plate contained in the chamber. 4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Verdampfungskanone an der Wand der Kammer befestigt ist.4. The device according to claim 3, characterized in that the evaporation gun attached to the wall of the chamber is.