DE2652376C2

DE2652376C2 - Verfahren zur Herstellung von Hexahydroindanonen

Info

Publication number: DE2652376C2
Application number: DE2652376A
Authority: DE
Inventors: John Costain Knight; Merle Gene Kalamazoo Mich. Wovcha
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1975-11-17
Filing date: 1976-11-17
Publication date: 1983-06-01
Also published as: IL50893A; JPS5910792B2; IL50893A0; IE44876B1; US4042459A; MX5355E; JPS584552B2; JPS56131396A; DE2652376A1; DE2660011B1; JPS56124391A; NL7612754A; JPS5264488A; FR2344628A1; IE44876L; DD128802A5; JPS5742316B2; DE2660011C2; JPS56131382A; NL169502C

Description

und

(ΠΙ)

(IV)

HO

CH₂-CH₂-CH₂-OH

durch mikrobiologischen Abbau von Steroiden, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum NRRL B-8128(DSM 774) unter Zugabe von Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron oder Testosteron oder von Gemischen dieser Steroide in einem wäßrigen Medium unter aeroben Bedingungen züchtet und die Verbindungen I bis IV aus der Gärbrühe isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn* zeichnet, daß man dieses mit Sitosterin durchführt.

Die Umwandlung von Steroiden durch Mikroorganismen wurde bereits untersucht. I9?2 (vgl, US-PS 84 657) berichten Kraychy und Mitarbeiter über den selektiven mikrobiologischen Abbau von steroidisohen 17-AlkyIresten durch Vergären von Steroiden mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp, NRRL B-3683 unter Bildung von

Androst-t,4-dien-3,l7-dion und
20α-Hydroxymethylpregπa-1 ,4-dien-3-on.
1973 (vgL US-PS 37 59 791) berichten Marsheck und

ίο Mitarbeiter über die selektive mikrobiologische Darstellung von Androst-4-en-3,17-dion durch Vergären eines Steroids der Cholestan- oder Stigmastanreihe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3805.

Die Verbindung III gemäß der Erfindung wird von Wang und Sih in »Biochem.« 2, 1238 bis 1243 (1963) als Zwischenprodukt beim Abbau von Androst-^en-^ol-3-on durch Nocardia restrictus beschrieben. Die offene Ringform der Verbindung I₁ nämlich 7«-MethyIperhydroindandion-(l,5)-[ß-propylalkohol-(4)], wird von Schubert und Mitarbeitern in »Steroids«, 4, 581 bis 586 (1964) als Zwischenprodukt beim Abbau von Progesteron durch Mycobacterium smegmatis beschrieben.
Eine Mutante, die bei selektivem Abbau von Steroiden gemäß Anspruch 1

3 aff-H-4 e-[3'-Propanol]-7 ^S-methylhexahydro-1,5-indandion, Hemiketal:

HO

3 ae-H-4 ff-[3'-Propanal j-5 e-hydroxy-7 a^S-methylhexahydro-1-indanon, Hemiacetal:

(Π)

3aa-H-4ff-[3'-Propionsäure]-5ar-hydroxy-7a/?-methylhexahydro-1 -indanon-<5-lacton:

(Dl)

3aa-H-4a-[3'-Propifj)oI]-5a-hydroxy-7aj?-methyIhexahydro-1-indanon;

HO

CH₂-CH₂-CH₂-OH

liefert, erhält man nach den im folgenden näher erläuterten Mutationsmaßnahmen oder anderen Mutationsmaßnahmen aus Mycobacterium fortuitum.

Im Rahmen der Erfindung wird als neue Mikkroorganismenmutante Mycobacterium fortuitum NRRL B-8128 (DSM 774) benutzt, wobei
Sitosterin, Cholesterin,
Stigmasterin,Caampesterin,
Anurosi-4-en-3,J 7-dion,
Androsta-1,4-dien-3,l 7-dion,
Dehydroepiandrosteron und
Testosteron

entweder in reiner Form oder in Rohform zum Einsatz gelangen.

Für den Erfindungszweck wurde in der nachstehend beschriebenen Weise die Art Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 zu einer neuen Labormikroorganismusmutante mutiert Der ATCC-Katalog von 1974 erläutert neben der Auflistung von ATCC 6842 folgendes: »J. C. Cruz 2. Cold abscess. Acta Med. Rio de Janeiro 1:1, 1936, Medium 90 37C«. M. fortuitum ATCC 6842 baut Sterine nicht selektiv zu niedrigmolekulsren Verbindungen, beispielsweise CO₂+ H₂O, ab. So.nit eignet sich dieser Mikroorganismus nicht zum selektiven Steroidabbau.

Bei der Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 mittels Nitrosoguanidin erhält man eine neue Mutante, die selektiv Steroide des beschriebenen Typs zu Verbindungen der Formeln I, II, III und IV abzubauen vermag. Dieser Mikroorganismenmutante von M. fortuitum wurde durch das Northern Regional Research Laboratory, U. S.-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, (der Mikroorganismenmutant wurde an dieser Hinterlegungsstelle in der Dauersammlung hinterlegt) die Nummer NRRL B-8128 zugeteilt.

Die neue Mikroorganismus-Mutante wurde ferner bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen der Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung mbH München, Grisebachstraße 8, D-3400 Göttingen unter der Hinterlegungsnummer DSM 774 hinterlegt.

Die Morphologie und die Chemikalien- bzw. Drogenempfindlichkeit von M. fortuitum NRRL B-8128 (DSM 774) sind von den entsprechenden Eigenschaften der Ausgangsart M. fortuitum ATCC 6842 nicht zu unterscheiden. Beide M. fortuitum-Kulturen stellen säurefeste, unbewegliche, nicht-sporenbildende Bacilli aus der Familie Mycobacteriaceae der Ordnung Actinomycetales dar. Nach der Runyon's Klassifizierung (vgl. E. H. Runyon »Med. Clin. North America«, 43, 273 [1959]) handelt es sich um ein nicht-chromogenes, der Gruppe IV angehörendes Mycobacterium, d.h. es wächst rasch bei niedriger Tempratur unter Bildung nicht-pigmentierter Kolonien auf relativ einfach zusammengesetzten Medien.

M. fortuitum ATCC 6842 und M. forte turn NRRL B-8128 (DSM 774) lassen sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Sterojdmoleküle eindeutig voneinander unterscheiden. Wie bereits ausgeführt, kommt es beim Einsatz von M. fortuitum ATCC 6842 zu einem nicht-selektiven Abbau von Steroiden, bei Einsatz von M. fortuitum NRRL B-8128 (DSM 774) erfolgt dagegen ein selektiver Steroidabbau. Diese Eigenschaft von M, fortuitum NRRL B-8128 (DSM 774) stellt eine in hohem Maße wertvolle Eigenschaft dar.
Die Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 zu M.

fortuitum NRRL B-8128 (DSM 774) erfolgt mit Hilfe von Nitrosoguanidin. Die Einzelheiten der Mutationsmaßnahmen werden im folgenden noch näher erläutert werden. Obwoh! Mutationsverfahren allgemein bekannt sind, gibt es auf dem einschlägigen Fachgebiet keine Lehrsn oder sogar Vermutungen bezüglich der möglicherweise bei Durchführung der im vorliegenden Falle eingehaltenen Mutationsmaßnahmen erhältlichen Arten von Mutanten. Die im folgenden näher erläiiterten Mutations- und Umwandlungs- bzw. Transformationsmaßnahmen werden zwar im einzelnen für ein Mycobacterium beschrieben, es ist jedoch ohne weiteres möglich, ähnliche oder äquivalente Maßnahmen bei Mikroorganismen der anderen genannten Gattungen anzuwenden.

Die erfindungsgemäße selektive Umwandlung läßt sich in einer wachsenden Kultur von M. fortuitum NRRL B-8128 (DSM 77=?) entweder durch Zugabe des jeweiligen Steroidsubstrats zu der Kultur während der Inkubationsdauer oder durch Zusatz des jeweiligen Steroidsubstrat zu dem Nährmedium vor dem Beimpfen bewerkstelligen. Das Steroid kann entweder alleine oder in Kombination mit einem anderen Steroid zugesetzt werden. Der bevorzugte, jedoch nicht zwingend erforderliche, Konzentrationsbereich für das Steroid in der Kultur beträgt etwa 0,1 bis etwa 100 g/l. Die Kultur wird in einem Nährmedium mit einem Kohlenstofflieferanten, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat, und einem Stickstofflieferanten, beispielsweise einer assimilierbaren S'ickstoffverbindung oder einem eiweißartigen Material, wachsen gelassen bzw. gezüchtet Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glucose, brauner Zucker, Rohrzucker, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreas-Verdauungsprodukte von Casein, Fischmehl, Brennereirückstände, Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle, Ammoniumsalze und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz gelangen. Den Gärbzw. Fermentationsmedien brauchen keine Spurenmetalle, z. B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, zugesetzt werden, da von der Sterilisation des Mediums Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile als Komponenten des Mediums zum Einsatz gelangen.
Das Umwandlungsverfahren dauert etwa 72 h bis 15 Tage. Die Inkubationstemperatur während des Umwandlungsverfahrens reicht von etwa 25^e bis etwa 37"C und beträgt vorzugsweise 30⁰C. Der Inhalt des Umwandlungsgefäßes wird mit sterilisierter Luft belüftet und zum leichteren Wachstum des Mikroorganismus bewegt. Auf diese Weise läßt sich der Wirkungsgrad des Umwandlungsverfahrens erhöhen.

Nach beendeter Umwandlung, ermittelt durch Dünnschichtcromatographie unter Verwendung von handeis-

ablieben Silikagelplatten und eines Lösungsmittelsystems au,s 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyciohexan, wird das umgewandelte Steroid in üblicher bekannter Weise isoliert So kann beispielsweise das Gär- bzw. Fermentations- oder Umwandlungsgemisch einschließlich der Gärbröhe und der Mikroorganismenzellen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für Steroide extrahiert werden, Gesignete Lösungsmittel sind Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichloräthylen, Äther, Amylacetat, Benzol und dergleichen, vorzugsweise "Methylenchlorid

Andererseits können die Gär- bzw. Fermentationsbrühe und die Zellen zunächst in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren voneinander getrennt und dann getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert werden. Die Zelten können entweder mit einem mit Wasser mischbaren oder mit einem mit Wasser nicht mischba-Temperatur von 28° C in einem sterilen Saatmedium der folgenden Zusammensetzung wachsen gelassen;

Nährbrühe	8 g/I
Hefeextrakt	tg/l
Natriumpropionat	0,5 g/\|
mit destilliertem Wasser
aufgefüllt auf	1 I

15 Der pH-Wert des Mediums wird mit In-NaOH vor einer 20minütigen Sterilisation bei 121°C auf 7,0 eingestellt

Die Zellen werden bis zn einer Dichte von etwa 5XlO⁸ZmI wachsen gelassen, durch Zentrifugieren in Kügelchen überführt und dann mit einem gleichen Volumen sterilen O.lm-Natriumcitrat eines pH-Werts von 5,6 gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in demselben Volumen Citratpuffer resuspendiert worauf ein aliquoter Teil zur Titerfeststeüung (d.h. zur Zellenzählung) abgetrennt wird. Schließlich wird Nitro

ren Lösungsmittel extrahiert werden. Die zellenfreie 20 soguanidin bis zu einer Endkonzp'üration von 50 μg/mi Gär- oder Fermentationsbrühe labt sich mit mit Wasser zugesetzt- Die Zellensuspension wird in einem Wasserlang bei

nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahieren.

Die Extrakte können durch Diatomeenerde filtriert werden, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene destilliert wird.

Der die gewünschten umgewandelten Steroide enthaltende Destillationsrückstand kann in einem 10% Chloroform enthaltenden handelsüblichen Hexanisomerengemisch gelöst und auf Silikagel chromatographiert werden, wobei als Entwickler das handelsübliche Hexanisomerengemisch einerseits und Mischungen desselben mit zunehmenden Mengen Äthylacetats verwendet werden. Bei diesen Maßnahmen lassen sich die Verbindungen I, II und III eluieren. Die Verbindung IV läßt sich beispielsweise mit 5% Methanol enthaltendem Äthylacetat eluieren. Kristalline Produkte erhält man mit Hilfe eines Lösungsmittels, beispielsweise Äthylacetat. Die gewünschte umgewandelten Steroide erhält man auch aus der überstehenden Flüssigkeit nach dem Verdampfen des in der überstehenden Flüssigkeit enthaltenen Lösungsmittels.

Die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV eignen sich als Zwischenprodukte bei der chemischen Synthese wertvoller Steroide. So lassen sich beispielsweise die erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen in bei dem aui der US-PS 38 80 884 bekannten Verfahren zur Totalsynthese wertvoller 19-Norsteroide verwendeten Ausgangssubstanzen überführen. Diese Umwandlung zu den genannten Ausgangssubstanzen läßt sich in üblicher bekannter Weise durchführen, beispielsweise durch Oxidation mit Chromsäure in Essigsäure und anschließender Nachbehandlung mit Essigsäureanhydrid und Natriumacetat (vgl. »Biochem.« 2, 1238 bis 1243 und »J. A. C.S.« 85,2135 bis 2137).

Die Beispiele sollen das Verfahren gemäß der Erfindung näher veanschaulichen. Sofern nichts anderes angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben »Gewichtsprozente«.

Ferner bedeuten sämtliche Mengenangaben bei Lösungsmittelgemischen, sofern nichts anderes angege- w ben, »Volumina«.

Beispiel I

Herstellung der Mutante M. fortuitum NRRL B-8128 (DSM 774) aus M. fortuitum ATCC 6842: h>

a) Nitrcsotjuanidin-Mutagenese
Zellen von M. fortuitum ATCC 6842 werden bei einer bad 30 min lang bei einer Temperatur von 37° C inkubiert, worauf erneut ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung abgetrennt wird. Der Rest wird abzentrifugiert und mit einem gleichen Volumen sterilen Ο,ΐηι-Kaliumphosphats eines pH-Werts von 7,0 gewaschen. Schließlich werden die Zellen in einem sterilen Minimalsalzmedium ohne Kohlenstofflieferant der folgenden Zusammensetzung:

NH4NO3 1,0 g/l

K₂HPO₄ 0,25 g/l

MgSO₄ ■ 7H₂O 0,25 g/l

NaCI 0,005 g/I

FeSO₄ ■ 7H₂O 0,001 g/l mit destilliertem Wasser

aufgefülltauf 1 I

resuspendiert. Der pH-Wert dieses Mediums wird vor einem 20minütigem Sterilisieren bei 121°C mit In-HCI auf 7,0 eingestellt. Endlich werden die Zellen zur Λ uswahl der Mutanten ausgebreitet.

b) Auswahl und Isolierung der Mutante M. fortuitum NRRL B-8128 (DSM 774)

Die in der geschilderten Weise mutierten Zellen werden verdünnt und auf Platten verstrichen, die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten (modifiziert nach Fräser und Jerrel, 1963 »J. Biol. Chem.«, 205,291 bis 295):

Glyzerin 10,0 g/I Na₂HPO₄ 8,4 g/l

KH₂PO₄ 4,5 g/l

NH₄Cl 2,0 g/l

MgSO₄ · 7H₂O 0,3 g/l

FeCI₃ · 6HiO 0,05 g/l mit destilliertem Wasser

aufgefülltauf 1 I

Nach Zugab", von 15 g/l Agar wird das Medium 30 min lang in einem Autoklaven auf eine Temperatur von 121°C erhitzt und dann in sterile Petrischalen gegossen. Das Wachsen bzw. die Züchtung auf diesem Medium eliminiert die meisten durch das Mutageneseverfahren gebildeten Nährauxotrophe. So werden beispielsweise Ki.iiuren,die zum Wachsen auf chemisch definierten Medien Vitamine, Wachstumsfaktoren und dergleichen erfordern, eliminiert. Nach etwa 7tätiger Inkubation bei einer Temperatur von 28⁰C werden die

gebildeten Kolonien auf zur Auswahl von Mutanten geeignete Testplatten und dann zurück auf das auf Glyzerin basierende Medium enthaltende Kontrollblatt repliziert. Die Testplatten werden entsprechend der Veröffentlichung von G. E. Peterson, H. L. Lewis und J. R. Davis »Preparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar media«, J. Lipid Research 3, 275 bis 276 (1962) hergestellt. Das Minimalsalzmedium auf diesen Platten ist u-iter (a) von Beispiel 1 beschrieben. Nach Zugabe von 15 g/l Agar und 1,0 g/l eines geeigneten Kohlenstofflieferanten werden Steroide, wie Sitosterin oder Androstendion (AD), zugesetzt, worauf die erhaltene Suspension 30 min lang bei 12I⁰C im Autoklaven erhitzt wird. Das sterile, heiße Gemisch wird hierauf in ein steriles Mischgefäß gegossen, mehrere Minuten durchgemischt und schließlich in sterile Petrischalen gegossen. Bei diesen Maßnahmen kann es infoige Schaumbildung zu Schwierigkeiten kommen, diese lassen sich jedoch durch Durchmischen des heißen Gemischs und durch Abflammen der Oberfläche der geschmolzenen Agarplatten verringern. Auf diese Weise erhält man gleichmäßige Dispersionen wasserunlöslicher Kohlenstofflieferanten, wodurch die Herstellung sehr homogenen jedoch opaker Agarplatten erleichtert wird.

Die auf den Kontrollplatten gewachsenen Kolonien, jedoch nicht die auf den AD als einzigen Kohlen^tofflieferanten enthaltenden Testplatten gewachsenen Kolonien, werden durch Ausstreichen auf Nähragarplatten gereinigt. Nach dem Wachsen oei einer in Temperatur von 28°C werden mit Hilfe steriler Zahnstocher Einzelklonen von den Nähragarplatten gepflückt und durch Beimpfen netzartig gemusterter Platten mit AD als Kohlenstofflieferanten erneut getestet. Gereinigte Isolate, die noch einen von der ij Mutterktiltur unterschiedlichen Phenotypus aufweisen, werden dann in Schü'.telflaschen ausgewertet.

c) Schüttelflaschenauswertung

Es werden 500 ml fassende Schüttelflaschen mit 100 ml ei.ies Biotransformationsmittels der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Glyzerin	10.0 g/l
Na₂HPO₄	8,4 g/l
KH₂PO₄	4.5 g/l
NH₄Ci	2,0 g/l
MgSO₁ 7H₂O	0.3 g/l
FeCh · 6H₂O	0.05 g/l
mit destilliertem Wasser
aufgefüllt auf	1 I

Hierauf werden in das Medium 1 g/l Sojamehl und dann 10 g/l Sitosterin eingemischt Nach 20minütigem Erhitzen der Flaschen in einem Autoklaven auf 121°C werden sie auf 28° C abgekühlt und dann mit 10 ml eines wie folgt hergestellten Saatguts beimpft:

Die gereinigte Isolate aus Stufe (b) werden bei einer Temperatur von 28³C auf geneigtem Agar wachsen gelassen. Zum Beimpfen einer 500 ml fassenden Flasche mit 100 ml eines sterilen Saatmediums der folgenden Zusammensetzung:

Nährbrühe 8 g/l

Hefeextrakt 1 g/l

Glyzerin 5 g/l
mit destilliertem Wasser

aufgefüllt auf 1 1

wirG eine von einem geneigten Agar entnommene Öse voll Zellen verwendet.

Der pH-Wert des Saatmediums wird vor dem 20minütigem Erhitzen der Flaschen auf 121 "C in einem Autoklaven mit In-NaOH auf 7,0 eingestellt. Die Saatflaschen werden 72 h lang bei einer Temperatur von 28°C inkubiert.

Wie bereits erwähnt, werden 10 ml gewachsene Saat zum Beimpfen sämtlicher 500-ml-Flaschen mit jeweils 100 ml sterilen Transformationsmediums verwendet. Hierauf werden die Flaschen bei einer Temperatur von 28° bis 30" C auf einem Drehrüttler inkubiert, wobei von Zeit zu Zeit aliquote Proben entnommen werden. Diese Proben umfassen jeweils 10 ml und werden nach dem Austragen durch Schütteln mit 3 Volumina Methylenchlorid extrahiert. Teilmengen der Extrakte werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel und des beschriebenen Lösungsmittelsystems, d.h. 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, sowie durch Gas/FIüssig-Chromatographie analysiert. Ein Nachweis der Anwesenheit der Verbin düngen der Formeln I, II, III und IV entsprechend den Maßnahmen des folgenden Beispiels bestätig! den selektiven Aubau von Sitosterin durch den neuen Mutanten aus dem Muttermycobacterium M. fortuitum ATCC 6842.

Beispiel 2

Umwandlung von Sitosterin in die Verbindungen
derFormelnl.il, III und IV

Das verwendete Medium entspricht dem Medium von Beispiel 1 (c). Dieses Medium wird durch 30minütiges Erhitzen auf 121⁰C sterilisiert, dann auf 30⁰C abgekühlt und schließlich mit 10 Teilen einer Saatkultur des Mutanten-Mycobacterium M. fortuitum NRRL B-8128 (DSM 774), die entsprechend Beispiel 1 (c) hergestellt worden war, beimpft. Das beimpfte Gemisch wird unter Bewegung 336 h bei einer Temperatur von 30° C zur Begünstigung eines submersen Wachstums inkubiert. Nach der Inkubation wird das Gemisch mit Methylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wird durch Diatomeenerde filtriert, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene destilliert wird. Der hierbei angefallene Destillationsrückstand wird mit einem handelsüblichen. 10% Chloroform enthaltenden Hexanisomerengemisch aufgenommen und auf Silikagel chromatographiert, wobei als Entwickler das handelsübliche Hexanisomerengemisch und Mischungen desselben mit zunehmenden Mengen an Äthylacetat verwendet werden. Hierbei lassen sich die Verbindungen I, II und III eluieren. Dip Verbindung IV läßt sich aus der Säule mit 5% Methanol enthaltendem Äthylacetat eluieren. Die Reihenfolge des Eluierens der betreffenden Verbindungen ist

I _ π - III - IV.

Die Rf-Werte dieser Verbindungen auf einem Dünnschichtchromatogramm unter Verwendung eines 3 :2-Cyclohexan/Äthylacetat-Gemischs sind:

I = 037

II = 0,28

III = 0,16

IV = 0,05

Auf dünnschichtchromatographischem Wege ermittelte geeignete Fraktionen werden gesammelt und zur Trockene eingedampft wobei die Verbindungen I, II, III und IV in einer Ausbeute von jeweils etwa 10 Gew.-% (auf Molekulargewichtsbasis) erhalten werden.

Beim Umkristallisieren aus Äthylacetat erhält man die Verbindung I in Form eines I : 1-Epimerengemischs eines F. von 100° bis ti2°C;

die Verbindung II stellt ein Öl dar;

die Verbindung III besitzt einen F. von 122° bis 124°C und

die Verbindung IV besitzt einen F. von 148° bis 150° C.

Beispiel 3

Beim Ersatz des im Beispiel Ϊ verwendeten Sitosterins durch Cholesterin erhält man ebenfalls die Verbindungen I, II, III und IV.

Beispiel 4

Beim Ersatz des im Beispiel 2 verwendeten Sitosterins durch Stigmasterin erhält man ebenfalls die Verbindungen I, II, III und IV.

Beispiel 5

Beim Ersatz des im Beispiel 2 verwendeten Sitosterin durch Campesterin erhält man ebenfalls die Verbindungen I, II, III und IV.

Beispiel 6

Durch Zusatz einer Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiele 3 bis 5 zu dem Sitosterin in Beispiel 2 oder durch Verwendung einer beliebigen Kombination der Steroide der Beispiele 2 bis 5 anstelle des Sitosterins in Beispiel 2 erhält man ebenfalls die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV.

Die Ausbeuten bei den Beispielen 3 — 6 entsprechen der in Beispiel 2 erzielten Ausbeute.

Beispiel 7

Durch Ersatz des Sitosterins im Beispiel 2 durch Androst-4-en-3,t 7-dion,

Androsta-l,4-dien-3,17-dion,

Dehydroepiandrosteron oder

Testosteron

erhält man ebenfalls die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV.

Beispiel 8

Durch Ersatz des Sitosterins im Beispiel 2 durch eine Kombination aus zwei oder mehreren Sterinen, bestehend aus

Stigmasterin.

Androst-4-en-3,l 7-dion,

Androsta-1,4-dien-3,l 7-dion,

Dehydroepiandrosteron und

Testosteron,

erhält man ebenfalls die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV.

Die Ausbeuten bei den Beispielen 7 und 8 entsprechen der in Beispiel 2 erzielten Ausbeute.

Claims

Patentansprüche:

Verfahren zur Herstellung der Hexahydro! ndanone der Formeln:

HO

HO

(Π)