DE2643207C2 - Method for the detection and determination of a partner in an immunological reaction - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung eines Partners einer immunologischen Reaktion in indirekten Techniken, dadurch gekennzeichnet, daß statt Antikörper-Molekülen deren Fc-Teil-freies Fragment F(ab)2 verwendet wird.The subject of the invention is accordingly a method for the detection and determination of a partner an immunological reaction in indirect techniques, characterized in that instead of antibody molecules whose Fc part-free fragment F (ab) 2 is used.

Gegebenenfalls kann nach Abtrennung des überschüssigen letzten (zweiten) Antikörpers die Umsetzung mit weiteren, ggf. markierten F(ab)₂-Fragmenten von Antikörpern, die jeweils spezifisch gegen den zuletzt eingesetzten Antikörper gerichtet sind, wiederholt werden.If necessary, after the excess last (second) antibody has been separated off, the reaction _{can be repeated with further, optionally labeled F (ab) 2} fragments of antibodies which are each specifically directed against the antibody last used.

Als indirekte Technik im Sinne der Erfindung gelten alle Teste, bei welchen der gesuchte Reaktionspartner durch mehr als nur einen weiteren Reaktionspartner nachgewiesen wird. Zu indirekten Techniken im Sinne deErfindung zählen somit der Antiglobulintest und der Sandwichtest Diese Methoden sind ausführlich in J. H. Humphrey, R. F. White: Kurzes Lehrbuch der Immunologie; Thieme Verlag 1971, Stuttgart, Seite 257—260, in D.M. Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell, Oxford 1973. page 18.14—18.16 und von G. Wick in »Wiener klinische Wochenschrift«, 84:1, Seite 2—7 (1972) unter Zugrundelegung von Fluoreszenzfarbstoffen als Identifizierungsmerkmale beschrieben.In the context of the invention, all tests in which the desired reaction partner are considered to be indirect technology is detected by more than one other reaction partner. To indirect techniques in the sense of the invention thus include the antiglobulin test and the sandwich test. These methods are extensively described in J. H. Humphrey, R. F. White: Short Textbook of Immunology; Thieme Verlag 1971, Stuttgart, pages 257-260, in DM. Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell, Oxford 1973. pages 18.14-18.16 and by G. Wick in "Wiener Klinische Wochenschrift", 84: 1, pages 2-7 (1972) on the basis of fluorescent dyes described as identifying features.

Die Methodik der indirekten Technik kann derart erweitert werden, daß alle außer dem gesuchten Reaktionspartner eingesetzten Reaktionspartner markiert sind und/oder daß zusätzlich zu einem dritten Reaktionspartner weitere, spezifisch gegen den vorhergehenden Reaktionspartner gerichtete Reaktionspartner benutzt werden.The methodology of the indirect technique can be extended in such a way that all but the desired reaction partner used reaction partners are marked and / or that in addition to a third reaction partner further reactants specifically directed against the previous reactant can be used.

Ferner ist demnach Gegenstand der Erfindung ein Verfahren, wonach die Inkubation mit markiertem F(ab)₂-Fragment mehrmals durchgeführt wird. Im Falle, daß bei den Umsetzungen stöchiometrische Mengen der Reaklionspartaer beachtet werden, ist ein Oberschuß des Fragments nicht erforderlich, so daß auf eine Abtrennung und Waschung der Reaktionsprodukte verzichtet werden kann.The invention also relates to a method according to which the incubation with the labeled F (ab) ₂ fragment is carried out several times. In the event that stoichiometric amounts of the reactants are taken into account in the reactions, an excess of the fragment is not necessary, so that the reaction products need not be separated off and washed.

Es ist bekannt, daß Antikörper-Moleküle (Immunglobulin-Moleküle) durch proteolytische Enzyme in eine Anzahl von Fragmenten zerlegt werden; so spaltet die Proteinase Pepsin das Immunglobulin-Molekül zu einem bivalenten, dem F(ab)₂-Fragment und zu zwei weiteren kleineren Peptiden.It is known that antibody molecules (immunoglobulin molecules) are broken down into a number of fragments by proteolytic enzymes; The proteinase pepsin splits the immunoglobulin molecule into a bivalent, the F (ab) ₂ fragment and two other smaller peptides.

Ein Beispiel der F(ab)₂-HersteUung findet sich in Reid, K. B. Ch. (1971), Immunology 20,649.An example of F (ab) ₂ production can be found in Reid, KB Ch. (1971), Immunology 20,649.

Im Sinne der Erfindung kann als Identifizierungsmerkmal ein fluoreszierender oder phosphoreszierender Farbstoff, vorzugsweise die Fluoresceinabkömmlinge, vor allem das Fluoresceiniso'Saiocyanat (FITC) verwendet werden.For the purposes of the invention, a fluorescent or phosphorescent feature can be used as the identification feature Dye, preferably the fluorescein derivatives, especially the fluorescein iso saiocyanate (FITC) are used will.

Diese Farbstoffe werden im alkalischen Milieu durch eine Thiocarbamidbindung an Proteine gebunden und ihr Emissionsspektrum hat den Gipfel im Grün, d. h. im Bereich der maximalen Empfindlichkeit der menschlichen Retina. Ferner werden mit Vorteil eingesetzt Rhodaminderivate, wie Tetramethylrhodaminisothiocyanat und Lissamin Rhodamin B 200 Sulfonalchlorid (RB 200 SC), wenn sie auch nicht so häufig in die entsprechenden Techniken Eingang gefunder, haben wie die Fluoreszeinfarbstoffe.In an alkaline environment, these dyes are bound to proteins by a thiocarbamide bond and their emission spectrum has the peak in the green, i. H. in the range of the maximum sensitivity of human Retina. It is also advantageous to use rhodamine derivatives such as tetramethylrhodamine isothiocyanate and Lissamine Rhodamine B 200 sulfonal chloride (RB 200 SC), although not as common in the corresponding Techniques have found acceptance, such as the fluorescein dyes.

Die Koppelung der Rhodasninderivate an Proteine erfolgt über eine Thiocarbamid- oder Sulfonylchlorid-Amin-Bindung. Rhodamine fluoreszieren im Rot-Orange-Bereich und ihre Konjugate werden hauptsächlich zusammen mit fluoreszeinmarkierten Immunglobulinlösungen für die gleichzeitige Darstellung zweier verschiedener Antigene in demselben Präparat verwendet Sowohl die grüne Fluoreszenz des Huoreszeins ais auch die rot-orange Fluoreszenz der Rhodaminverbindungen kontrastieren deutlich mit der meist bläulichen Eigenfluoreszenz bestimmter Gewebe bei deren Betrachtung im Fluoreszenzmikroskop.The rhodasnine derivatives are coupled to proteins via a thiocarbamide or sulfonyl chloride-amine bond. Rhodamines fluoresce in the red-orange range and their conjugates are mainly together with fluorescein-labeled immunoglobulin solutions for the simultaneous display of two different Antigens used in the same preparation Both the green fluorescence of the huoreszein as well as the The red-orange fluorescence of the rhodamine compounds clearly contrasts with the mostly bluish autofluorescence certain tissues when viewed in a fluorescence microscope.

Statt der verwendeten auf fluoreszierende Strahlung abgestellten Identifizierungsmerkmale steht es dem Fachmann selbstverständlich frei, im Rahmen der vorliegenden Erfindung die ihm bekannten anderen Identifizierungsmerkmale zu verwenden, wie beispielsweise die radioaktive Markierung oder die Enzym-Markierung, um nur einige Beispiele zu nennen.Instead of the identification features used based on fluorescent radiation, this is the case The person skilled in the art is of course free to use the other identification features known to him within the scope of the present invention to use, such as radioactive labeling or enzyme labeling, to name just a few examples.

Insbesondere wird bei der Markierung mit radioaktiven Substanzen eine geringere durch die Markierung bedingte Beeinträchtigung des biochemischen Verhaltens des F(ab)₂-Fragmentes beobachtet als bei Markierung mit fluoreszierenden Substanzen wie z. B. FITC oder TRITC.In particular, when labeling with radioactive substances, less impairment of the biochemical behavior of the F (ab) ₂ fragment caused by the labeling is observed than when labeling with fluorescent substances such as e.g. B. FITC or TRITC.

Die erfindungsgemäße Anwendung von Immunglobulin-Fragmenten in indirekten Techniken ist im folgenden kurz für die Antiglobulintechnik und die Sandwichtechnik beispielhaft beschrieben:The use of immunoglobulin fragments in indirect techniques according to the invention is as follows briefly described as an example for the antiglobulin technique and the sandwich technique:

Bei der Antiglobulintechnik wird das antigene Substrat zunächst mit einem unmarkierten Antikörper in Kontakt gebracht Hierbei kommt es zur Bindung der Antikörper an das homologe Antigen. Die auf diese Weise fixierten Immunglobuline können nun ihrerseits als Antigen für ein mit einem Identifizierungsmerkmal versehenen Antikörper dienen. Damit wird das ursprünglich in Frage stehende Antigen indirekt nachgewiesen. Da darüber hinaus stets mehr als ein Antikörper-Molekül pro Antigen-Molekül in Reaktion tritt, ist die Antiglobulin-Methode empfindlicher als der direkte Test.In the antiglobulin technique, the antigenic substrate is first coated with an unlabelled antibody in Brought into contact Here, the antibodies bind to the homologous antigen. That way Fixed immunoglobulins can now be used as an antigen for an identifier provided with an identifier Antibodies are used. The antigen originally in question is thus indirectly detected. There In addition, more than one antibody molecule per antigen molecule always reacts, this is the antiglobulin method more sensitive than the direct test.

Beim Nachweis bzw. der Bestimmung eines Antigens in der Antiglobulintechnik gemäß der Erfindung bringt man die unbekannte Probe oder eine Verdünnungsserie davon mit einer bekannten Menge des markierten Antikörperfragmentes, das spezifisch gegen das Antigen gerichtet ist, in Kontakt und läßt danach das Gemisch 20 Minuten bis 20 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten, bei einer Temperatur zwischen 4—30°C, vorzugsweise etwa 20° C, in Wasserdampf-gesättigter Atmosphäre stehen.When detecting or determining an antigen in the antiglobulin technique according to the invention brings the unknown sample or a dilution series thereof with a known amount of the labeled Antibody fragment, which is directed specifically against the antigen, in contact and then leaves the mixture 20 minutes to 20 hours, preferably 30 minutes, at a temperature between 4-30 ° C, preferably about 20 ° C, in a steam-saturated atmosphere.

Nichtgebundene Antikörper werden durch mehrmaliges Waschen (in der Regel 2—6 χ) des Reaktionsgemisches, vorzugsweise mit einer polyionischen isotonischen wäßrigen Lösung vom Reaktionsgemiseh abgetrennt. Nachfolgend wird das Reaktionsgemiseh in Kontakt gebracht mit einer bekannten Menge eines markierten Antikörperfragments, das spezifisch gegen das erste Antikörperfragment gerichtet ist und daraufhin inkubiert und gewaschen unter Bedingungen, wie für das zuerst verwendete Antikörperfragment beschrieben.Unbound antibodies are removed by washing the reaction mixture several times (usually 2—6 χ), preferably separated from the reaction mixture with a polyionic isotonic aqueous solution. The reaction mixture is then brought into contact with a known amount of a labeled one Antibody fragment that is specifically directed against the first antibody fragment and is then incubated and washed under conditions as described for the antibody fragment used first.

Anschließend wird je nach Art des verwendeten Antigens das Reaktionsgemiseh auf einen Objektträger aufgestrichen (z. B. Zellsuspension), sofern es nicht auf einem Träger bereits fixiert ist (z. B. Histologischer Schnitt).Then, depending on the type of antigen used, the reaction mixture is placed on a slide painted on (e.g. cell suspension), unless it is already fixed on a carrier (e.g. histological Cut).

Bei der Sandwichtechnik wird der erste Reaktionspartner, ein Antikörper mit einem zweiten Reaktionspartner, einem Antigen, gegen das der erste Reaktionspartner immunologisch spezifisch gerichtet ist, inkubiert.In the sandwich technique, the first reaction partner, an antibody with a second reaction partner, an antigen against which the first reaction partner is immunologically specifically directed, incubated.

Gegebenenfalls nach Abtrennung und Entfernung der nicht gebundenen Menge des zweiten Reaktionspartners wird das Reaktionsgemisch mit einem spezifisch gegen den zweiten Reaktionspartner gerichteten dritten Reaktionspartner, einem ein Identifizierungsmerkmal tragenden Antikörper inkubiert und nachfolgend die nicht gebundene Menge des dritten Reaktionspartners abgetrennt Inkubationszeiten, Inkubationsbedingungen, Waschungen und weitere Aufarbeitung für die Messung des Identifizierungsmerkmales entsprechen den dem Fachmann bekannten Bedingungen.Optionally after separating and removing the unbound amount of the second reactant the reaction mixture with a third specifically directed against the second reaction partner Reaction partner, an antibody bearing an identifier and subsequently the not Bound amount of the third reaction partner separated incubation times, incubation conditions, washes and further processing for the measurement of the identifier correspond to the Conditions known to those skilled in the art.

Inkubationszeiten, Inkubationsbedingungen, Waschungen und weitere Aufarbeitung für die Messung des Identifizierungsmerkmales entsprechen den dem Fachmann bekannten Bedingungen.
Die Unteiiuchung erfolgt mit Hilfe von dem Fachmann bekannten und von einschlägigen Firmen angebotenen qualitativen und quantitativen Meß- und Beobachtungsgeräten, wie Fluoreszenzmikroskopen mit Auflicht- oder Durchlichtanregung und Fluoreszenzphotometern, Photometern oder Strahlungsmeßgeräten.Incubation times, incubation conditions, washes and further work-up for the measurement of the identifier correspond to the conditions known to the person skilled in the art.
The investigation is carried out with the aid of qualitative and quantitative measuring and observation devices known to the person skilled in the art and offered by relevant companies, such as fluorescence microscopes with incident or transmitted light excitation and fluorescence photometers, photometers or radiation measuring devices.

Als Antigene kommen in Frage z. B. virale Antigene (z. B. Röteln-Antigen, Masern-Antigen, Hepatitis-Antigen), bakterielle Antigene (z. B. Salmonella-Antigene, Escherichia coli-Antigene, Staphylokokken-Antigene), Kohlenhydrat-Antigene (z. B. ßlutgruppensubstanzen), Protein-Antigene (z. B. Plasmaproteine, wie Immunglobuline, Komplementfaktore(n), Glykoprotein-Antigene (z. B. an-Antitrypsin, Coeruloplasmin) und Lipoprotein-Antigene(z. Β.Λΐ-Lipoproteifi).Possible antigens are e.g. B. viral antigens (e.g. rubella antigen, measles antigen, hepatitis antigen), bacterial antigens (e.g. Salmonella antigens, Escherichia coli antigens, staphylococcal antigens), Carbohydrate antigens (e.g. blood group substances), protein antigens (e.g. plasma proteins such as immunoglobulins, Complement factor (s), glycoprotein antigens (e.g. an-antitrypsin, ceruloplasmin) and lipoprotein antigens (e.g. Β.Λΐ-Lipoproteifi).

Sie können isoliert, gelöst, suspendiert, an einen Träger, beispielsweise an ein wasserunlösliches Polymeres wie chemisch quervernetzte Kohlehydrate gebunden sein oder in bzw. auf Zellen vorkommen oder in histologischen Gewebsschnitten vorhanden sein.They can be isolated, dissolved, suspended, on a carrier, for example on a water-insoluble polymer how chemically cross-linked carbohydrates are bound or occur in or on cells or in histological ones Tissue sections are available.

Die für die Herstellung des F(ab)2-Fragments erforderlichen Immunglobuline werden in χ·> sich bekannter Weise durch Immunisierung von Tieren, vorzugsweise Wirbeltieren, mit einem Antigen, die diese als fremd erkennen, hergestellt Bei Vorliegen einer ausreichenden Zahl von Antikörpern im Serum der Tiere wird das Blut bzw. das Serum gewonnen und daraus zunächst die Antikörper und schließlich das F(ab)2-Fragment nach bekannten Verfahren hergestelltThe immunoglobulins required for the production of the F (ab) 2 fragment are listed in χ ·> known way by immunizing animals, preferably vertebrates, with an antigen that makes them foreign recognize, produced If there is a sufficient number of antibodies in the serum of the animals, the blood or the serum obtained and from it first the antibodies and finally the F (ab) 2 fragment known processes

Die Verminderung der unspezifischen Bindung bei erhaltener Empfindlichkeit durch erfindungsgemäße Verwendung von Fragmenten von spezifischen Antikörpern in der indirekten Technik verdeutlichen folgende Versuche am Beispiel einer Antiglobulintechnik, deren Ergebnisse tabellarisch zusammengestellt sind. Die Versuchsanordnung ist sinngemäß nach Beispiel 1 gewählt, wobei nach dem Stand der Technik durchgeführte Bestimmungen mit denen verglichen werden, die unter Verwendung von F(ab)2-Fragment vorgenommen wur-The reduction in unspecific binding while maintaining sensitivity through use according to the invention of fragments of specific antibodies in the indirect technique illustrate the following Experiments using the example of an antiglobulin technique, the results of which are summarized in a table. the The experimental set-up is chosen analogously to Example 1, with those carried out according to the prior art Determinations are compared with those made using the F (ab) 2 fragment.

Wie die Tabelle 1 deutlich zeigt, ist bei Verwendung von F(ab)2-Fragmenten eine deutliche Verminderung der unspezifischen, Fc-bedingten Bindung von Kaninchen-^-Globulin und Ziegen-^-Globulin festzustellen, während die entsprechenden nativen Antikörperpräparationen eine hohe unspezifische Bindung an die Zellmembranen aufweisen (I und II in Tabelle 1). Eine hohe unspezifische Bindung beeinflußt die Analysenergebnisse mit spezifischen Antikörpern (s. 111 in Tabelle 1).As Table 1 clearly shows, when using F (ab) 2 fragments, there is a significant reduction in the Determine unspecific, Fc-related binding of rabbits - ^ - globulin and goats - ^ - globulin, while the corresponding native antibody preparations have a high level of unspecific binding to the cell membranes (I and II in Table 1). A high non-specific binding also influences the analysis results specific antibodies (see 111 in Table 1).

Dieser Effekt der Vermänderung der unspezifischen Bindung kann nicht beobachtet werden, wenn einer der verwendeten Antikörper ein natives Immunglobulin istThis effect of altering unspecific binding cannot be observed when either of the antibody used is a native immunoglobulin

Werden Gefrierschnitte verschiedener Organe, z. B. Leber oder Niere von Maus, Ratte, Kanii.chen oder Mensch, auf Glasobjektträger nach bekannter Methodik aufgezogen und jeweils mit etwa 0,1 ml nativen FITC-markierten Ziege-/-Globulin oder Kaninchen-^-Globulin überschichtet, in einer feuchten Kammer 30 Minuten bei 20⁰C inkubiert, nachfolgend ausgiebig — mindestens 5 χ — in isotonischer Salzlösung gewaschen und dann mit etwa 0,1 ml eines nativen FITC-markierten Kaninchen-Antiziege-Ig-Antikörpers bzw. eines nativen FITC-markierten Ziegen-Aniikaninchen-Ig-Antikörpers überschichtet, wiederum in einer feuchten Kammer 30 Minuten bei 2O⁰C inkubiert und nachfolgend ausgiebig — mindestens 5 χ — gewaschen, sodann unter dem Fluoreszenzmikroskop beurteilt, so ergibt sich auch hier eine größere unspezifische Fluoreszenz als bei Verwendung von FITC-markiertem F(ab)₂-Antikörperfragment der entsprechenden Antikörperfraktionen.Are frozen sections of various organs, e.g. B. liver or kidney of mouse, rat, rabbit or human, mounted on glass slides according to known methods and each coated with about 0.1 ml of native FITC-labeled goat - / - globulin or rabbit - ^ - globulin, in a moist Chamber incubated for 30 minutes at 20 ^° C., subsequently washed extensively - at least 5 - in isotonic saline solution and then with about 0.1 ml of a native FITC-labeled rabbit anti-goat Ig antibody or a native FITC-labeled goat ani-rabbit Ig antibody overlaid, in turn, in a humid chamber for 30 minutes at 2O ⁰ C and incubated extensively below - at least 5 χ - washed, then evaluated under a fluorescence microscope, there is also here a larger non-specific fluorescence than when using FITC-labeled F (ab) ₂ antibody fragment of the corresponding antibody fractions.

Tabelle 1Table 1

Verminderung der unspezifischen Bindung von normalem Kaninchen-^-GIobulin, normalem Ziegen-^-Globulin oder von einem Ziegenantihuman-Ig-Antikörper in der indirekten (Doppel)-Antikörper-Methode an Raji-Zellen, RPMI 1788-ZeIlen oder humanen peripheren Lymphozyten durch Verwendung von F(ab)2-Fragmenten.Reduction of the unspecific binding of normal rabbits - ^ - GIobulin, normal goats - ^ - Globulin or from a goat anti-human Ig antibody in the indirect (double) antibody method on Raji cells, RPMI 1788 cells or human peripheral lymphocytes by using F (ab) 2 fragments.

55 Zellen55 cells 6060 RPMI 1788RPMI 1788 6565 11 I Kaninchen-^-GlobulinI rabbit - ^ - globulin F(ab)₂ F (down) ₂ II ZiegenII goats -/■Globulin- / ■ globulin III Ziegen-AntiniKiianIII Goat AntiniKiian F(ab)2F (down) 2 lglg 44th nativenative nativenative F(ab)2)F (ab) 2) nativenative 1616 IgIg 00 IgIg IgIg 99 Raji')Raji ') 6464 19²)19 ² ) 00 55 00 1717th 33 11 1111th 00 11 00 1010 00 44th 55 00 00 00 33 00 1616 00 00 00 00 00 1818th 6464 2727 00 2525th 00 2525th 1212th 256256 2121 00 3131 00 1919th 44th 1616 00 2222nd 00 1414th 00 77th 00 77th 00 88th 00 11 00 00 00

26 43 20/26 43 20 /

Fortsetzung Tabelle ITable I continued

ZellenCells

I Kaninchen-^-Globulin native F(ab)2 I rabbit - ^ - globulin native F (ab) 2

IgIg

Il Ziegen-^-Globulin
native F(ab)₂)Il goats - ^ - Globulin
native F (ab) ₂ )

III Ziegen-Antihuman-Ig
native F(ab)j III goat anti-human Ig
native F (ab) j

igig

Spender A
LymphozytenDonor A
Lymphocytes I
4
16I.
4th
16 3,1 ±1^Λ)
0
03.1 ± 1 ^Λ )
0
0 0
0
00
0
0 I2,8±l,9
2,6 ±1,2
0I2.8 ± 1. 9
2.6 ± 1.2
0 0
0
00
0
0 22,8 ± 2,2
5,9 ±1.4
1,9 ±0,722.8 ± 2.2
5.9 ± 1.4
1.9 ± 0.7 27,6 ±2
5,8 ±1,8
3,9 ±1,327.6 ± 2
5.8 ± 1.8
3.9 ± 1.3 Spender B
LymphozytenDonor B
Lymphocytes 1
4
161
4th
16 19,4 ±1,0")
1,9 ±0,7
019.4 ± 1.0 ")
1.9 ± 0.7
0 0
0
00
0
0 9,2 ±1,0
1,3 ±0,5
09.2 ± 1.0
1.3 ± 0.5
0 0
0
00
0
0 37,8 ±1,1
6,9 ±0,7
1,3 ±0,737.8 ± 1.1
6.9 ± 0.7
1.3 ± 0.7 8.0 ±0.7
1,4 ±0,5
08.0 ± 0.7
1.4 ± 0.5
0

') Reziproker Titer der Verdünnung des ersten Antikörpers. I, II, III. ²) Ergebnisse gefärbter Lymphozyten in Prozent. '*) miivon !Ounsbhängigen Bestimmungen.') Reciprocal titer of the dilution of the first antibody. I, II, III. ² ) Results of stained lymphocytes in percent. *) with independent provisions.

Werden Objektträger z. B. solche aus Glas oder Kunststoff ähnlich wie die histologischen Schnitte mit FITC-konjugiertem Kaninchen-^Globulin oder FITC-konjugiertem Ziege-;--Globulin inkubiert, gewaschen und nachfolgend mit FITC-konjugiertem Antikaninchen-Ig-Antikörpern von der Ziege bzw. Antiziegen-Ig-Antikörpern vorn Kaninchen inkubiert und gewaschen, so ergibt sich alternativ zur Verwendung von FITC-konjugierten F(ab)2-Fragmenten der jeweiligen Antikörper folgendes Ergebnis:Are slides z. B. those made of glass or plastic similar to the histological sections with FITC-conjugated rabbit - ^ globulin or FITC-conjugated goat -; - globulin incubated, washed and subsequently with FITC-conjugated anti-rabbit Ig antibodies from goat or anti-goat Ig antibodies Incubated and washed by rabbits, this results in an alternative to the use of FITC-conjugated F (ab) 2 fragments of the respective antibodies give the following result:

Quantitative Messungen mit Hilfe eines Auflichtfluoreszenzmikroskops mit Einrichtung zur quantitativen Immunfluoreszenz zeigen eine eindeutige unspezifische Bindung nativer Antikörper an die Objektträger, während F(ab)2-Fragmente dieser Antikörper sich nicht oder nur geringfügig binden (s. Tabelle 2).Quantitative measurements with the help of a reflected light fluorescence microscope with a device for quantitative Immunofluorescence show a clear non-specific binding of native antibodies to the slide while F (ab) 2 fragments of these antibodies do not bind or bind only slightly (see Table 2).

Tabelle 2Table 2

Verminderung der unspezifischen Bindung von Antikörpern und deren Kaninchen-/-Globulin bzw. Ziegen-^ Globulin an Objektträger durch Verwendung von F(ab)2-Fragmenten.Reduction of the unspecific binding of antibodies and their rabbit - / - globulin or goat- ^ Globulin on microscope slide using F (ab) 2 fragments.

Träger beschichtet mitCarrier coated with

native Antikörper ■)native antibodies ■)

²) ² )

F(ab)2-Fragmente ² F (ab) 2 fragments ²

Kaninchen-^-GlobuIin (+ Ziegen-Antikaninchen-lg 1 :40verdünnt)Rabbit - ^ - GlobuIin (+ goat anti-rabbit lg 1:40 diluted)

Ziege-v-Globulin (+ Kaninchen-Antiziege-Ig 1 :40 verdünnt)Goat v-globulin (+ rabbit anti-goat Ig diluted 1:40)

Träger unbehandeltCarrier untreated

11 3232 25,525.5 44th 3232 26.526.5 1616 30.530.5 26.026.0 11 3535 25,525.5 44th 3434 25.525.5 1616 30,530.5 25.525.5 2626th 2525th

') Reziproker Titer der Verdünnung des ersten Antikörpers.') Reciprocal titer of the dilution of the first antibody.

²) Fluoreszenzintensität verglichen mit einem Uranylazetat-Standard (Meßzeit V₂₅ Sek.). ² ) Fluorescence intensity compared with a uranyl acetate standard (measurement time V ₂₅ sec.).

Das erfindungsger.iäße Verfahren ist aufgrund des vorher Gesagten besonders geeignet zum Nachweis von so cytoplasmatischen Zellmembran oder Zellkern-Antigenen oder auch von Antikörpern, die über ein Antigen an einen Träger gebunden sind. Diese Anwendung stellt im besonderen Maße Gegenstand der vorliegenden Anmeldung dar.The method according to the invention is particularly suitable for the detection of such cytoplasmic cell membrane or cell nucleus antigens or antibodies that have an antigen are bound to a carrier. This application is particularly the subject of the present Registration.

Die Erfindung wird im nachfolgenden Beispiel des Nachweises von zellmembrangebundenen Immunglobulinen auf Lymphozyten näher erläutert:The invention is illustrated in the following example of the detection of cell membrane-bound immunoglobulins explained in more detail on lymphocytes:

Beispielexample

Humane periphere Lymphozyten, nach bekannter Methode aus venösem Vollblut isoliert, werden 2 χ in einer isotonischen Kochsalzlösung gewaschen und sedimentiert. Ein Sediment von 2xlO^fc derartigen Zellen wird mit t>0 0,1 ml eines Fluoresceinisothiocyanat (FITQ-konjugierten Ziegen-Anti-Human-ig-F(ab)z-Fragments (l°/oige Proteinlösung) resuspendiert und 30 Minuten bei 20° C inkubiert.Human peripheral lymphocytes, isolated from venous whole blood by a known method, are washed 2 in an isotonic saline solution and sedimented. A sediment of 2 × 10 ^fc cells of this type is resuspended with t> 0.1 ml of a fluorescein isothiocyanate (FITQ-conjugated goat anti-human ig-F (ab) z fragment (10% protein solution) and resuspended for 30 minutes at 20 Incubated ° C.

Nachfolgend werden die Zellen in einer isotonischen Kochsalzlösung 3 χ gewaschen. Das Sediment wird mit 0.05 ml eines Anti-Ziegen-Ig-F(ab)2-Fragments vom Kaninchen resuspendiert (l%ige Proteinlösung), für 30 Minuten bei 20°C inkubiert und nachfolgend 3 κ gewaschen in einer isotonischen Kochsalzlösung.The cells are then washed in an isotonic saline solution 3. The sediment is with 0.05 ml of an anti-goat Ig-F (ab) 2 fragment from rabbits resuspended (1% protein solution), for 30 Incubated minutes at 20 ° C and then washed 3 κ in an isotonic saline solution.

Das Sediment wird in 0,05 ml Rinderserumalbuminlösung (2% ^w/v) resuspendiert und die Suspension auf einen Objektträger ausgestrichen, luftgetrocknet, nach bekannter Art mit Glycerin eingebettet.The sediment is resuspended in 0.05 ml of bovine serum albumin solution (2% ^w / v) and the suspension is spread onto a slide, air-dried and embedded with glycerol in the known manner.

Mit Hilfe eines FluoreszenzmikroskoDs wird der Anteil fluoreszierender Zellen an den Gesamtzellen ausge-With the help of a fluorescence microscope, the proportion of fluorescent cells in the total cells is determined.

zählt und in Prozent angegeben.counts and given in percent.

Ergebnis: Die Anzahl fluoreszierender Zellen ist aus Tabelle 1,111. rechte Spalte, Spender A, zu ersehen.Result: The number of fluorescent cells is from Table 1,111. right column, donor A, can be seen.

Entsprecherrdes kann gefunden werden, wenn statt humaner periopherer Lymphozyten humane lymphoblatoide Zellen des Stammes RPMl 1788 verwendet werden, die als Zellen mit Ig, Fc- und Komplementreceptorcn gelten.The same can be found if, instead of human periopheric lymphocytes, human lymphoblatoid cells of the RPM1 1788 strain are used, which are cells with Ig, Fc and complement receptors are valid.

Claims (6)

Patentansprüche:Patent claims: 1. Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung eines Partners einer immunologischen Reaktion in indirekten Techniken, dadurch gekennzeichnet, daß statt Antikörper-Molekülen deren Fc-Teil1. Method for the detection and determination of a partner in an immunological reaction in indirect techniques, characterized in that instead of antibody molecules their Fc part freies Fragment F(ab)2 verwendet wird.free fragment F (ab) 2 is used. 2. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß weitere, gegebenenfalls markierte Fc-Teilfreie Fragmente von Antikörpern, die jeweils spezifisch gegen den zuletzt eingesetzten Antikörper gerichtet sind, eingesetzt werden.2. The method according to claim 1, characterized in that further, optionally labeled Fc-partially free fragments of antibodies, each specifically directed against the antibody last used are used. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fc-Teil-freien Fragmente markiert to sind.3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the Fc-part-free fragments are marked to are. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Überschuß von Fc-Teil-freiem Fragment vermieden und demnach eine Abtrennung von den Reaktionspartnern nicht erforderlich ist4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that an excess of Fc-part-free Avoided fragment and therefore a separation from the reactants is not necessary 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Reaktionspartner sich im Zytoplasma, in der Zellmembran, im Zellkern oder im Gewebe befindet5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that a reactant is in Cytoplasm, located in the cell membrane, in the cell nucleus or in tissue 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Reaktionspartner immunologisch an einen6. The method according to claim 5, characterized in that a reaction partner immunologically to one Träger gebunden istCarrier is bound Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung eines Partners einer immunologischen Reaktion unter Ausnutzung der bekannten Affinität von Antikörpern und Antigenen zueinander. Sie betrifft insbesondere ein empfindliches Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung einer im weitesten Sinne als Antigen zu bezeichnenden Substanz.The invention relates to a method for detecting and determining a partner in an immunological reaction using the known affinity of antibodies and antigens for one another. she relates in particular to a sensitive method for the detection and determination of a in the broadest sense substance to be designated as an antigen. Dabei wird Gebrauch gemacht von der Kenntnis, daß derartige Reaktionen mit Hilfe von bestimmten Identifizierungsmerkmalen deutlicher registrierbar gemacht werden können.It is made use of the knowledge that such reactions with the help of certain Identification features can be made more clearly registered. In der immunologischen Reaktion mit derartigen, markierten Reaktionspartnern werden grundsätzlich folgende Methoden unterschieden: der direkte Test und die indirekten Techniken.In the immunological reaction with such, labeled reaction partners, a basic distinction is made between the following methods: the direct test and the indirect techniques. Beim direkten Test wird der erste Reaktionspartner, meist das Antigen, kenntlich gemacht durch Inkubation mit einem spezifisch gegen ihn gerichteten und markierten zweiten Reaktionspartner, meist einem Antikörper.In the direct test, the first reaction partner, usually the antigen, is identified by incubation with a specifically targeted and labeled second reaction partner, usually an antibody. Bei den indirekten Techniken wird der erste Reaktionspartner mit einem spezifisch gegen ihn gerichteten zweiten Reaktionspartner inkubiert und nach Abtrennung und Entfernung der nicht gebundenen Menge des zweiten Reaktionspartners das Reaktionsgemisch mit einem spezifisch gegen den zweiten Reaktionspartner gerichteten dritten, meist markierten Reaktionspartner, inkubiert und die nicht gebundene Menge des dritten BIn the case of indirect techniques, the first reaction partner is directed against one specifically directed against him second reactant incubated and after separation and removal of the unbound amount of the second reactant the reaction mixture with a specific against the second reactant directed third, mostly labeled reaction partner, incubated and the unbound amount of the third B Reaktionspartners abgetrennt. ISeparated reaction partner. I. Es ist dem Fachmann bekannt, daß sich der direkte Test auszeichnet durch eine hohe Spezifität. Sein Nachteil ist die geringe Sensitivität. Andererseits sind die indirekten Techniken bekannt für ihre große Sensitivität, jedoch für geringe Spezifität.It is known to the person skilled in the art that the direct test is characterized by a high specificity. Its disadvantage is the low sensitivity. On the other hand, the indirect techniques are known for their great sensitivity, however for low specificity. Als eine der wesentlichen Ursachen, die bei dem direkten Test als auch bei den indirekten Techniken die Spezifität einschränken, ist die unspezifische Bindung der in den unterschiedlichen Methoden eingesetzten Antikörper an die übrigen Reaktionspartner und die sie umgebenden Strukturen anzusehen.As one of the main causes of the direct test as well as the indirect techniques Limiting specificity is the unspecific binding of the used in the different methods Antibodies to the other reaction partners and the structures surrounding them to be viewed. Die unspezifische Bindung wird auch bei hoch spezifischen Antikörpern hauptsächlich verursacht durch das sog. Fc-Teil des Antikörper (= Immunglobulin)-Moleküls.The unspecific binding is mainly caused by the, even with highly specific antibodies so-called Fc part of the antibody (= immunoglobulin) molecule. Dessen Bindungsaktivität zu verschiedenen, in der Literatur als Fc-Receptoren umschriebene Strukturen vonIts binding activity to various structures of *s Zellen oder Geweben wird verstärkt, wenn sich im Antikörpermolekül eine Konformationsänderung vollzieht.* s cells or tissues are strengthened when a conformational change occurs in the antibody molecule. Diese tritt auf bei der spontanen Aggregation von Antikörpermolekülen in Antikörperpräparationen oder beiThis occurs with the spontaneous aggregation of antibody molecules in antibody preparations or at der Bindung von Antikörpern an ein Antigen oder bei der Adsorption von Antikörpermolekülen an künstlichethe binding of antibodies to an antigen or the adsorption of antibody molecules to artificial ones Flächen, z. B. Latexpartikeln.Areas, e.g. B. latex particles. Bislang wurden verschiedene Methoden zur Verminderung der unspezifischen Bindung angewandt: z. B. Elimination von Aggregaten aus Antikörperpräparationen durch die Ultrazentrifugation, Zugabe von Albumin zu den Antikörperpräparationen zur Proteinstabilisierung und Verhinderung von Aggregatbildungen.So far, various methods have been used to reduce unspecific binding: z. B. Elimination of aggregates from antibody preparations by ultracentrifugation, addition of albumin to antibody preparations for protein stabilization and prevention of aggregate formation. In dem direkten Test wurde zusätzlich erfolgreich eine Antikörperpräparation benutzt, deren Fc-Teil durch bekannte Methoden abgespalten worden war ohne die immunologische Reaktionsweise des Restfragments (F(ab)i (Synonym: Fab) oder F(ab)₂) wesentlich zu beeinträchtigen. Diese Methoden waren bislang jedoch nicht befriedigend genug.In the direct test, an antibody preparation was also successfully used, the Fc part of which had been cleaved off by known methods without significantly impairing the immunological reaction of the residual fragment (F (ab) i (synonym: Fab) or F (ab) ₂ ). However, these methods have so far not been satisfactory enough. Mit vorliegender Erfindung werden nun die indirekten Techniken zur Immunreaktion mit markierten Reaktionspartnern derartig verändert, daß die bekanntermaßen hohe Sensitivität voll erhalten bleibt, während die bekanntermaßen hohe Unspezifitätauf ein Minimum reduziert wird.With the present invention, the indirect techniques for immune reaction with labeled reaction partners are now changed in such a way that the known high sensitivity is fully maintained, while the known high unspecificity is reduced to a minimum. Der Erfindung liegt der Gedanke zugrunde, daß in den indirekten Techniken eine Fc-vermittelte unspezifische Bindung vermieden werden kann, wenn alle an der Reaktion beteiligten Antikörper frei von Fc sind.The invention is based on the idea that in the indirect techniques an Fc-mediated unspecific Binding can be avoided if all antibodies involved in the reaction are free of Fc. Ist ein Reaktionspartner ein nativer Antikörper, so kann dessen Fc-bedingte unspezifische Bindungsstärke größer sein als die spezifische Bindung eines der Glieder in der Antikörperreihe. Das kann eine Abspaltung des Komplexes an der immunologisch spezifischen Bindungsstelle vom ersten Reaktionspartner und eine unspezifische Bindung über das Fc-Teil an Fc- Receptor-ähnliche Strukturen zur Folge haben.If a reaction partner is a native antibody, its Fc-related unspecific binding strength can be be greater than the specific binding of any member in the antibody suite. That can be a spin-off of the Complex at the immunologically specific binding site from the first reaction partner and non-specific binding via the Fc part to Fc receptor-like structures. Aus J. of Immunology, Vol. 116. No. 6. S. 1554—1560 ist ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung eines Partners einer immunologischen Reaktion in der Sandwich-Technik, einer indirekten Technik, bekannt. In diesem Verfahren werden an Stelle von intakten Antikörpermolekülen deren F(ab)i-Fragmente verwendet (besonders Seite 1554, linke Spalte, 2. Absatz und rechte Spalte, Zeilen 5—12 der genannten Druckschrift).From J. of Immunology, Vol. 116. No. 6. pp. 1554-1560 is a method of detection and determination a partner of an immunological reaction in the sandwich technique, an indirect technique, is known. In In this method, their F (ab) i fragments are used instead of intact antibody molecules (especially page 1554, left column, 2nd paragraph and right column, lines 5-12 of the cited publication).