DE2606257A1 - RECOGNINE - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Gruppe von Verbindungen, die hierin als "Recognine" bezeichnet werden. Recognine werden hergestellt, indem man normale oder abnormale Zellen oder Gewebe, z.B. Tumorzellen oder künstliche Krebszellen, behandelt und die gewünschten Produkte abtrennt. Die Recognine können dazu verwendet werden, um ihre chemischen Gegenstücke herzustellen, d.h. indem man die Recognine oder die auf einem Träger befindlichen Recognine mit Körperflüssigkeiten in Kontakt bringt. Diese chemischen Gegenstücke sind für diagnostische und therapeutische Zwecke, d.h. für die Diagnose und Behandlung von Krebs erkrankungen, nützlich. Die chemischen Gegenstücke bzw. Chemoreziprokale sind Substanzen, die mit einer immunochemisch-artigen Spezifizität mit einem Recognin in vivo oder in vitro reagieren, z.B. bei einem quantitativen Ausfällungstest, bei der Ouchterlony-Doppeldiffusion oder bei der Immunofluoreszenz.The invention relates to a new group of compounds which are referred to herein as "Recognins". Recognins are made by taking normal or abnormal cells or tissues, e.g. tumor cells or artificial ones Cancer cells, treated and separated the desired products. The Recognine can be used to improve your chemical counterparts, i.e. by using the Recognine or the Recognine on a carrier brings into contact with body fluids. These chemical counterparts are for diagnostic and therapeutic purposes, i.e., useful for the diagnosis and treatment of cancer. The chemical counterparts or chemo-reciprocal are substances with an immunochemical-like specificity react with a Recognin in vivo or in vitro, e.g. in a quantitative precipitation test in which Ouchterlony double diffusion or in immunofluorescence.

Eines der erfindungsgemäßen Recognine ist das Astrocytin. Astrocytin wird aus Gehirntumorgewebe, vorzugsweise Gehirngliomtumorgewebe, erzeugt. Proteinfraktionen, die den Astrocytin-Vorläufer enthalten, werden zunächst aus dem Gewebe extrahiert. Eine bevorzugte ExtraktionsmethodeOne of the recognins according to the invention is astrocytin. Astrocytin is obtained from brain tumor tissue, preferably Brain glioma tumor tissue. Protein fractions that contain the astrocytin precursor are initially made up extracted from the tissue. A preferred extraction method

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besteht darin, das Gewebe mit einem neutralen Puffer bei Homogenisierungsbedingungen oder durch Anwendung anderer Techniken zur Zerteilung der Zellen und Gewebe zu behandeln, um Proteinfraktionen, welche den Astrocytin-Vorlaufer enthalten, löslich zu machen.consists in treating the tissue with a neutral buffer under homogenization conditions or by applying others Techniques for dividing cells and tissues to treat protein fractions, which are the astrocytin precursors contain solubilizing.

Zu diesem Punkt ist der Astrocytin-Vorlaufer immer noch an Substanzen mit großem Molekulargewicht wie z.B. Proteine, Glykoproteine, Lipoproteine, Nucleinsäuren, Nucleoproteine etc. gebunden. Die solubilisierten Proteine werden sodann von dem resultierenden Gewebeextrakt abgetrennt. Die Extraktlösung aus dem Gewebe wird sodann geklärt, um unlösliche Teilchen zu entfernen. Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht werden hierauf durch eine Vorverdampf ungs -Konzentrat ions te chnik aus der resultierenden Lösung entfernt. Die erhaltene- Lösung wird hierauf behandelt, um den Astrocytin-Vorläufer von anderen Verunreinigungen abzutrennen, um eine Proteinfraktion zu erhalten, welche einen pK-Bereich zwischen 1 und 4 besitzt. Somit wird z.B. die Lösung auf eine chromatographische Säule gegeben und mit zunehmend sauren Lösungsmitteln eluiert. Sämtliche Fraktionen, die im neutralen oder sauren Bereich bis zu einem pK-Wert von 4 hinunter eluiert werden, werden.verworfen, und diejenigen Fraktionen mit einem pK-Bereich von 1 bis 4 werden gesammelt. Das Eluat wird sodann behandelt, um ein Produkt mit einem Molekulargewicht von etwa 8000 zu erhalten. Dies geschieht z.B. in der Weise, daß man zuerst das Material filtert, um Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, d.h. solche mit einem Molekulargewicht von unterhalb 1000, zu entfernen, und daß man erneut filtert, um diejenigen Substanzen mit einem Molekulargewicht oberhalb 25 000 zu entfernen. Die Fraktion mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 25 000 wird sodann weiterbehandelt, z.B. durch eine Dünnschichtgel(TLG)-Chromatographie, um Astrocytin zu erhalten.At this point, the astrocytin precursor is always substances with a large molecular weight such as proteins, glycoproteins, lipoproteins, nucleic acids, Nucleoproteins etc. bound. The solubilized proteins are then separated from the resulting tissue extract. The extract solution from the tissue is then clarified to remove insoluble particles. Impurities with Low molecular weight are then removed from the resulting solution by a pre-evaporation technique removed. The resulting solution is then treated to separate the astrocytin precursor from other impurities, to obtain a protein fraction which has a pK range between 1 and 4. Thus, for example, the Solution applied to a chromatographic column and eluted with increasingly acidic solvents. All political groups, which are eluted in the neutral or acidic range down to a pK value of 4, are discarded, and those fractions with a pK range of 1 to 4 are pooled. The eluate is then treated to make a product with a molecular weight of about 8000. This is done, for example, by first looking at the material filters to remove substances with a low molecular weight, i.e. those with a molecular weight below 1000, to remove, and that one again filtering to those substances with a molecular weight above 25,000 remove. The fraction with a molecular weight between 1000 and 25,000 is then further treated, e.g. by thin layer gel (TLG) chromatography to obtain astrocytin.

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Somit kann Astrocytin in der Weise hergestellt werden, daß man Gehirnglioratumorgewebe mit einem neutralen Puffer unter wiederholter Homogenisierung und Hochgeschwindigkeitszentrifugierung extrahiert, von dem resultierenden Extrakt eine Fraktion mit einem pK-Bereich von etwa 1 bis 4 abtrennt, aus dieser Fraktion die Substanzen mit einem hohen Molekulargewicht, d.h. bis zu etwa 230 000, abtrennt und daß man daraus das Produkt Astrocytin, welches ein Molekulargewicht von etwa 8000 besitzt, isoliert. ■Thus, astrocytin can be produced in such a way that brain glioroma tumor tissue with a neutral Buffer with repeated homogenization and high speed centrifugation extracted, from the resulting extract a fraction with a pK range of about 1 to 4 separates, from this fraction the substances with a high molecular weight, i.e. up to about 230,000, separates and that the product astrocytin, which has a molecular weight of about 8,000, is isolated therefrom. ■

Das nach diesem Verfahren hergestellte Astrocytin-Produkt ist dadurch gekennzeichnet, daß es mit seinem spezifischen Antikörper bei quantitativen Präzipitin- bzw. Koagulintests und Ouchterlony-Geldiffusionstests ein Einzellini enpräzipitat bzw. einen Einzellinienniederschlag bildet, daß es in Wasser und wäßrigen Lösungen mit einem sauren oder neutralen pH-Wert löslich ist und bei einem alkalischen pH-Wert unlöslich ist, daß es eine Wellenlänge des spektrophotometrisGhen Absorptionspeaks von 280 m/u hat und daß es schließlich ein Molekulargewicht von etwa 8000 aufweist.The astrocytin product produced by this process is characterized in that it has its specific Antibodies a single lini in quantitative precipitin or coagulin tests and Ouchterlony gel diffusion tests precipitate or a single line precipitate that forms it in water and aqueous solutions with an acidic or neutral pH is soluble and is insoluble at an alkaline pH that it is a wavelength of spectrophotometrisGhen Has absorption peaks of 280 m / u and that it eventually has a molecular weight of about 8,000.

Astrocytin ist auch dadurch gekennzeichnet, daß es einen sehr hohen Prozentgehalt von Resten der Glutaminsäure und der Asparaginsäure und ein sehr hohes Verhältnis dieser Säuren zu Histidin hat. Eine nähere Analyse von Astrocytin wird weiter unten gegeben.Astrocytin is also characterized in that it has a very high percentage of residues of glutamic acid and which has aspartic acid and a very high ratio of these acids to histidine. A Closer Analysis of Astrocytin is given below.

In ähnlicher Weise wie oben beschrieben wird ein weiteres Recognin, das als "Malignin" bezeichnet wird, aus künstlichen Krebszellen, d.h. Krebszellen, die bei einer in vitro-Fermentierung wachsen, erzeugt wird. Malignin hat ein Molekulargewicht von etwa 10 000 und eine ähnliche, jedoch verschiedene Aminosäurerestzusammensetzung gegenüber dem Astrocytin, d.h. hohe Verhältnisse von Glutaminsäure und Asparaginsäure und hohe Verhältnisse dieser Säuren zuIn a manner similar to that described above, another recognin called "malignin" is selected artificial cancer cells, i.e. cancer cells that grow through in vitro fermentation. Has malignin a molecular weight of about 10,000 and a similar but different amino acid residue composition from that Astrocytin, i.e. high ratios of glutamic acid and aspartic acid and high ratios of these acids too

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Histidin. Eine nähere Analyse von Malignin wird untenstehend angegeben.Histidine. A more detailed analysis of malignin is given below.

Somit kann Malignin in der Weise hergestellt werden, daß man in einer Fermentationskultur gewachsene künstliche Krebszellen mit einem neutralen Puffer unter wiederholter Homogenisierung und Hochgeschwindigkeitszentrifugierung extrahiert, aus dem resultierenden Extrakt die Fraktion mit einem pK-Bereich von ungefähr 1 bis 4 abtrennt, aus dieser Fraktion die Substanzen mit einem hohen Molekulargewicht, d.h. bis zu etwa 230 000, abtrennt und daß man hieraus das Produkt mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 isoliert.Thus, malignin can be produced by using artificial fermentation cultures Cancer cells extracted with a neutral buffer with repeated homogenization and high-speed centrifugation, separates the fraction with a pK range of approximately 1 to 4 from the resulting extract, from this Fraction separates the substances with a high molecular weight, i.e. up to about 230,000, and that from this the Product isolated with a molecular weight of about 10,000.

Die Menge an Malignin, die bei einer künstlichen Zellfermentation erzeugt wird,und die Prozentmenge des Gesamtproteins, das bei der künstlichen Zellfermentation erzeugt wird, welche Malignin ist, können dadurch erhöht werden, daß man das Wachstum der künstlichen Krebszellenkultur in großdimensionierten Behältern durchführt.The amount of malignin produced by artificial cell fermentation and the percentage of total protein that is generated in artificial cell fermentation, which is malignin, can thereby be increased that one carries out the growth of the artificial cancer cell culture in large-sized containers.

Nach diesem Verfahren hergestelltes Malignin ist dadurch gekennzeichnet, daß es mit seinem spezifischen Antikörper bei quantitativen Präzipitintests und Ouchterlony-Geldiffusionstests ein Einzellinienpräzipitat bzw. einen Einzellinienniederschlag bildet, daß es in Wasser und wäßrigen Lösungen mit einem sauren oder neutralen pH-Wert löslich und bei einem alkalischen pH-Wert unlöslich ist, daß es eine Wellenlänge des spektrophotometrischen Absorptionspeaks von 280 m/U hat und daß es ein Molekulargewicht von etwa 10 000 aufweist.Malignin produced according to this process is characterized in that it is associated with its specific antibody in quantitative precipitin tests and Ouchterlony gel diffusion tests, a single line precipitate and a Single line precipitate forms that it is in water and aqueous solutions with an acidic or neutral pH soluble and insoluble at an alkaline pH in that it is one wavelength of the spectrophotometric absorption peak of 280 m / U and that it has a molecular weight of about 10,000.

Recognine sind weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß sie dazu imstande sind, mit Bromacetylcellulose einen Komplex zu bilden, wobei Bromacetylcellulose-Recognin gebildet wird,und daß sie nach dem Injizieren in SäugetiereRecognins are further characterized by the fact that they are able to combine with bromoacetyl cellulose To form a complex, whereby bromoacetylcellulose-Recognin is formed, and that after being injected into mammals

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die spezifischen Antikörper Anti-Recognin bilden. Das Anti-Recognin ist spezifisch an den Recognin-Vorläufer in situ angefügt. So ist z.B. ein Anti-Recognin, nämlich Anti-Malignin, gegenüber Gehirntumorzellen in vitro toxisch.the specific antibodies form anti-recognin. The anti-recognition is specifically attached to the Recognin precursor in situ. For example, there is an anti-recognin, namely anti-malignin, toxic to brain tumor cells in vitro.

Recognine wie Astrocytin, Malignin und ähnliche Substanzen sind als Produkte nützlich, die in ein biologisches System eingeführt werden können, um Fremdreaktionen zu vermindern, beispielsweise indem ein Material mit einem Recognin überzogen wird. Ein weiteres Beispiel ist die Einführung eines Recognins, um in dem biologischen System das chemische Gegenstück zu erzeugen. Die Recognine können auch als Nährstoffe verwendet werden, um das Wachstum von bestimmten biologischen Systemen, von dem sie ein Teil sind, zu ermuntern. Eine weitere Einsatzmöglichkeit der Recognine ist die Erzeugung von Target-Reagentien, welche die Recogninkomplexe mit einem Träger enthalten, um die Anwendbarkeit in biologischen Systemen zu erleichtern. So befördert z.B. der Komplex die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Recognins selbst. Der Träger sollte aus solchen ausgewählt werden, die einen Komplex mit dem Recognin bilden und die im wesentlichen biologisch inert sind.Recognins like astrocytin, malignin and similar substances are useful as products that are included in a biological System can be introduced to reduce external reactions, for example by a material with a Recognin is coated. Another example is the introduction of a Recognins in order in the biological system to generate the chemical counterpart. The Recognins can also be used as nutrients to help the growth of to encourage certain biological systems of which they are a part. Another possible use of the Recognine is the production of target reagents, which contain the Recognine complex with a carrier, in order to increase the applicability to facilitate in biological systems. For example, the complex promotes the physico-chemical properties of the Recognin itself. The carrier should be selected from those that form a complex with the Recognin and which are substantially biologically inert.

Alle beliebigen, bekannten Substanzen, die mit Polypeptiden oder Proteinen einen stabilen Komplex bilden, können zur Komplexbildung mit dem Recognin geeignet sein. Ein Beispiel ist ein Material auf Cellulosebasis, z.B. Bromacetylcellulose. Abgesehen davon, daß der Träger gegenüber dem biologischen System inert sein muß, sollte der Träger so beschaffen sein, daß er die spezifischen physikalischchemischen Eigenschaften des Recognins, die für die oben angegebenen Zwecke nützlich sind, nicht verändert.Any known substance that forms a stable complex with polypeptides or proteins, can be suitable for complex formation with the Recognin. An example is a cellulosic material such as bromoacetyl cellulose. Apart from the fact that the carrier must be inert to the biological system, the carrier should be such that it has the specific physicochemical properties of the Recognins necessary for the above specified purposes are useful, not modified.

Die Komplexe aus Recognin und seinem Träger sind dazu geeignet, um in beliebigen biologischen Systemen, mit denen sie in Kontakt gebracht werden, die chemischen Gegen-The complexes of Recognin and its carrier are suitable to be used in any biological system to which they are brought into contact, the chemical counter-

+) bzw. Ziel- oder Angriffspunktreagentien+) or target or point of attack reagents

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stücke bzw. chemischen Reziproken zu erzeugen, abzutrennen und zu identifizieren. Der Recognin-Trägerkomplex ist auch dazu geeignet, um die Produktion des chemischen Gegenstück-Vorläufers in einem beliebigen biologischen System
zu stimulieren, in das er eingeführt wird.to generate, separate and identify pieces or chemical reciprocals. The Recognin carrier complex is also suitable for the production of the chemical counterpart precursor in any biological system
to stimulate into which it is introduced.

Eine Klasse von chemischen Gegenstücken sind die Anti-Recognine, d.h. Anti-Astrocytin und Anti-Malignin.
Diese können in der Weise hergestellt werden, daß das
Recognin in ein biologisches System injiziert wird. Eine immunologisch wirksame Dosis des Recognins wird mit Körpergeweben oder -flüssigkeiten nach zur Erzeugung von Antikörpern bekannten Techniken in einer solchen Weise in Kontakt gebracht, daß eine Antikörperreaktion induziert wird. Die
Anti-Recognine können zur Herstellung von Materialien wie diagnostische, Nahrungs- und Arzneimittel für spezifische Zellen oder Stellen in biologischen Systemen verwendet
werden, wobei man das Mittel in Komplexform mit dem Anti-Recognin in das biologische System einführt. Die Anti-Recognine sind auch für die Diagnose des Vorhandenseins
von Tumorzellen in histologischen Abschnitten geeignet,wobei man das Anti-Recognin in Kombination bzw. Konjugation, mit einer Markierungssubstanz wie Farbstoffe und radioaktive Substanzen dem Abschnitt zuführt. Hierbei erfolgt eine Anfärbung oder
radioaktive Markierung nur bei den Tumorzellen. Ein weiterer Anwendungszweck für Anti-Recognine ist die Erhöhung der Ausbeute von anderen einsetzbaren chemischen Vorläuferprodukten (wie z.B. TAG-Produkte, wie sie nachstehend beschrieben werden) von Säugetieren, wobei man eine immunologisch wirksame Dosis des Recognins in das Säugetier oder in ein anderes biologisches System injiziert.One class of chemical counterparts are the anti-recognins, that is, anti-astrocytin and anti-malignin.
These can be produced in such a way that the
Recognin is injected into a biological system. An immunologically effective dose of the recognin is brought into contact with body tissues or fluids according to techniques known for generating antibodies in such a way as to induce an antibody response. the
Anti-Recognins can be used to manufacture materials such as diagnostic, nutritional and medicinal products for specific cells or sites in biological systems
, whereby the agent is introduced into the biological system in complex form with the anti-recognin. The Anti-Recognine are also used to diagnose the presence
suitable for tumor cells in histological sections, the anti-recognin being supplied to the section in combination or conjugation with a marker substance such as dyes and radioactive substances. There is a staining or
radioactive labeling only on the tumor cells. Another application for anti-recognins is to increase the yield of other usable chemical precursor products (such as TAG products, as described below) from mammals, whereby an immunologically effective dose of the recognins is introduced into the mammal or into another biological system injected.

Bislang sind schon Glykoproteinkomplexe aus Gehirngewebe hergestellt und entsprechende Antikörper erzeugtworden. Abgetrennte Materialien, die als 10B-Glykoproteine be-So far, glycoprotein complexes have been made from brain tissue and corresponding antibodies have been generated. Separated materials known as 10B glycoproteins

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kannt sind und die aus dem Gehirn der Tay-Sachs¹ sehen Krankheit erzeugt worden waren, wurden in Kaninchen injiziert, und es wurden auf diese Weise Antikörper hergestellt. Diese Tay-Sachs-Antikörper wurden für Immunofluoreszenz-Untersuchungen von tumorhaltigen Gehirnen verwendet: Durch diese Antikörper wurden nur reaktive normale Nicht-Tumorglia, jedoch nicht Tumorglia, eingefärbt.and produced from the brain of Tay-Sachs ¹ disease were injected into rabbits, and antibodies were thus produced. These Tay-Sachs antibodies were used for immunofluorescence examinations of tumor-containing brains: only reactive normal non-tumor glia, but not tumor glia, were stained by these antibodies.

"Im Gegensatz dazu, wenn das Astrocytin aus Tumorgewebe erzeugt worden war und Antikörper gegenüber Astrocytin (Anti-Astrocytin) hergestellt und bei Immunofluoreszenzunter suchungen des Gehirns verwendet wurden, dann wurden nur Tumorglia, jedoch nicht normale (Nicht-Tumor)Glia durch das Anti-Astrocytin eingefärbt. Somit sind aufgrund der ursprünglichen Gewebe und aufgrund der Natur der Antikörper sowie der spezifischen Typen von eingefärbten Zellen Anti-Tay-Sachs-Antikörper und Anti-Astrocytin klar unterschiedliche Produkte."In contrast, when the astrocytin comes from tumor tissue and antibodies to astrocytin (anti-astrocytin) were produced and decreased upon immunofluorescence Brain surveys were used then only tumor glia but not normal (non-tumor) glia were found stained by the anti-astrocytin. Thus, because of the original tissue and because of the nature of the antibodies as well as the specific types of stained cells, anti-Tay-Sachs antibodies and anti-astrocytin clearly different Products.

Eine weitere Klasse von chemischen Gegenstücken sind Target-Reagentien, die mit ihren chemischen Gegenstücken in einen Komplex überführt worden sind. So wird z„B. Target (das Produkt, das erhalten wird, wenn Astrocytin mit einem Träger wie Bromacetylcellulose in einen Komplex überführt wird) in Kontakt mit Anti-Astrocytin gebracht. Dieser Verbindungstyp kann damit in einen Komplex überführt werden und zur Herstellung von diagnostischen Nähr- und Arzneimitteln für spezifische Zellen oder Stellen in biologischen Systemen verwendet werden. Diese Verbindungen können auch für Reinigungsverfahren verwendet werden. So kann z.B.Anti-Astrocytin hergestellt werden, indem man Bromacetylcellulose-Astrocytin-Anti-Astrocytin durch eine hydrolytische Behandlung mit einer Säure oder einem Proteinase-Enzym einer Entkomplexierungsbehandlung unterwirft. Target-Reagentien sind auch dazu geeignet, um die Menge der TAG-Produkte (wie sie unten beschrieben werden) in biologischen Systemen zu er-Another class of chemical counterparts are target reagents that interact with their chemical counterparts have been transferred to a complex. For example, “B. Target (the product obtained when astrocytin is complexed with a carrier such as bromoacetyl cellulose is brought into contact with anti-astrocytin. This type of connection can thus be converted into a complex and for the manufacture of diagnostic nutrients and drugs for specific cells or sites in biological Systems are used. These compounds can also be used for cleaning processes. For example, anti-astrocytin can be made by getting bromoacetylcellulose-astrocytin-anti-astrocytin through a hydrolytic treatment subjected to a decomplexing treatment with an acid or a proteinase enzyme. Target reagents are also suitable for determining the amount of TAG products (as described below) in biological systems

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höhen, z.B. indem man eine immunologisch wirksame Dosis von Target in Kontakt mit Körpergewebe oder -flüssigkeiten bringt.by bringing an immunologically effective dose of target into contact with body tissue or fluids.

Weitere chemische Gegenstücke sind TAG-Reagentien (z.B. an Target haftende Globuline). Die TAG-Produkte werden in der Weise hergestellt, daß man Target-Reagentien in Kontakt mit Körperflüssigkeiten über variierende Zeitspannen bringt, um einen Komplex zu bilden, und daß man das TAG davon abspaltet.Further chemical counterparts are TAG reagents (e.g. globulins adhering to the target). The TAG products will prepared by placing target reagents in contact with body fluids for varying periods of time to form a complex and split off the TAG from it.

Zwei geeignete Ausführungsformen sind S-TAG und F-TAG.Two suitable embodiments are S-TAG and F-TAG.

Bei einem Verfahren zur Herstellung von S-TAG (langsam am Target haftendes Globulin = Slow-Target-Attaching-Globulin) geht man so vor, daß man Blutserum oder eine andere Körperflüssigkeit mit einem Target (d.h. Bromacetylcellulose-Malignin) ungefähr 2 Stunden oder mehr bei niedriger Temperatur, z.B. bei etwa 4°C, umsetzt und daß man das S-TAG aus dem resultierenden Material, beispielsweise mit verdünnter Säure, über einen Zeitraum von ungefähr 2 Stunden und bei einer Temperatur von etwa 37°C abspaltet. Das nach diesem Verfahren hergestellte S-TAG ist dadurch gekennzeichnet, daß es in wäßrigen, gepufferten Lösungen löslich ist, daß es ein Eihzellinienpräzipitat mit seinem entsprechenden Recognin bei Ouchterlony-Geldiffusionstests bildet, daß es durch Cellophanmembranen nicht dialysierbar ist, daß es durch Milliporenfilter zurückgehalten wird, welche Moleküle mit einem Molekulargewicht von über 25 000 zurückhalten, daß es Molekulargewichte in unterschiedlichen Aggregationszuständen, bestimmt durch eine Dünnschichtgelchromatographie,von ungefähr 50 000 und Vielfachen davon im Makroglobulinbereich besitzt und daß es eine Wellenlänge des spektrophotometrischen Absorptionspeaks von 280 m/u aufweist.In a process for the production of S-TAG (globulin slowly adhering to the target = slow target attaching globulin) the procedure is to test blood serum or other body fluid with a target (i.e. bromoacetylcellulose malignin) about 2 hours or more at low temperature, e.g., about 4 ° C, and that the S-TAG from the resulting material, for example with dilute acid, over a period of approximately 2 hours and at a temperature of about 37 ° C. The S-TAG made by this process is characterized in that it is soluble in aqueous, buffered solutions, that it is an egg cell line precipitate with its corresponding recognition in Ouchterlony gel diffusion tests forms that it cannot be dialyzed by cellophane membranes, that it is retained by millipore filters which molecules with a molecular weight in excess of 25,000 will retain that there are molecular weights in different aggregation states by thin layer gel chromatography, of about 50,000 and multiples thereof in the macroglobulin range and that it has a wavelength of the spectrophotometric absorption peak of 280 m / u.

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? 6 η R ? S - 9 - ? 6 η R? S - 9 -

Bei einem Verfahren zur Herstellung von F-TAG (schnell am Target haftendes Globulin = Fast-Target-Attaching-Globulin) geht man so vor, daß man Blutserum oder eine andere Körperflüssigkeit mit Target (d.h. Bromacetylcellulose-Malignin) ungefähr 10 Minuten bei niedriger Temperatur, z.B. etwa 4°C, umsetzt und daß man aus dem resultierenden Material F-TAG, z.B. mit verdünnter Säure, über einen Zeitraum von ungefähr 2 Stunden und bei einer Temperatur von ungefähr 37°C abspaltet. Das nach diesem Verfahren hergestellte F-TAG ist dadurch gekennzeichnet, daß es in wäßrigen, gepufferten Lösungen löslich ist, daß es ein Einzellinienpräzipitat mit seinem entsprechenden Recognin bei Ouchterlony-Geldiffusionstests bildet, daß es durch Cellophanmembranen nicht dialysierbar ist, daß es durch Milliporenfilter zurückgehalten wird, welche Moleküle mit einem Molekulargewicht von über 25 000 zurückhalten, daß es Molekulargewichte in unterschiedlichen Aggregationszuständen, bestimmt durch Dünnschichtgelchromatographie, von ungefähr 50 000 und Vielfachai davon im Makroglobulinbereich besitzt und daß es eine Wellenlänge des spektrophotometrischen Absorptionspeaks von 280 m/U aufweist.In a process for the production of F-TAG (globulin that adheres quickly to the target = fast target attaching globulin) one proceeds in such a way that blood serum or another body fluid with target (i.e. bromoacetylcellulose malignin) about 10 minutes at low temperature, for example about 4 ° C, and that one from the resulting material F-TAG, e.g. with dilute acid, over a period of approximately 2 hours and at a At a temperature of about 37 ° C. The F-TAG produced by this process is characterized in that it is soluble in aqueous, buffered solutions that it is a single-line precipitate with its corresponding recognin in Ouchterlony gel diffusion tests that it is not dialyzable through cellophane membranes, that it is through Millipore filters are retained, which retain molecules with a molecular weight in excess of 25,000 that it Molecular weights in different aggregation states, determined by thin layer gel chromatography, from about 50,000 and multiples thereof in the macroglobulin range and that it has a spectrophotometric absorption peak wavelength of 280 m / U.

TAG-Produkte sind dazu geeignet, um Krebstumore in lebenden Säugetieren zu entdecken, indem man die Konzentration von S-TAG und F-TAG bestimmt, die durch ein bekanntes Volumen des Blutserums des Säugetiers oder einer anderen Körperflüssigkeit erzeugt wird,und indem man diese Konzentration mit Mengen in Beziehung setzt, die als Krebs anzeigend bestimmt worden sind. TAG-Produkte sind auch dazu geeignet, um die Anwesenheit von Tumorzellen in histologischen Schnitten zu diagnostizieren. Dabei geht man so vor, daß man TAG, das mit einer Markierungssubstanz, z.B. einem Farbstoff oder einer radioaktiven Substanz, kombiniert ist, auf den Schnitt aufbringt, wodurch ein Anfärben oder eine radioaktive Markierung nur bei den Tumorzellen erfolgt. EsTAG products are useful for detecting cancerous tumors in living mammals by measuring the concentration determined by S-TAG and F-TAG by a known volume of the blood serum of the mammal or another Body fluid is produced and by relating this concentration to amounts that are indicative of cancer have been determined. TAG products are also suitable for histological detection of the presence of tumor cells Diagnosing cuts. One proceeds in such a way that one TAG, which with a marking substance, e.g. a Dye or a radioactive substance, combined, is applied to the incision, causing a staining or a radioactive labeling only occurs on the tumor cells. It

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hat sich weiterhin gezeigt, daß TAG-Produkte gegenüber Tumor-Zellen cytotoxisch sind. TAG-Produkte sind auch zur Herstellung von diagnostischen, Ernährungs- und Arzneimitteln für spezifische Zellen oder Stellen geeignet, wobei diese Mittel in Komplexform mit dem TAG-Produkt eingeführt werden.it has also been shown that TAG products act against tumor cells are cytotoxic. TAG products are also used to manufacture diagnostic, nutritional and medicinal products for specific cells or sites, these agents being introduced in complex form with the TAG product.

Die normale Zellteilung in Pflanzen oder Tieren wird eingeschränkt oder inhibiert, wenn die Zellen dazu kommen, einen jeweiligen Raum vollständig einzunehmen. Die Mechanismen (a), nach denen die normalen Zellen "erkennen", daß sie den für sie verfügbaren Raum ausgefüllt haben, und (b), nach denen der Ablauf dieses Erkennungsmechanismus seinerseits die Zellteilung inhibiert, sind beide unbekannt gewesen. Es wurde nun eine Gruppe von Verbindungen hergestellt, deren Vorläufer eine erhöhte Konzentration haben, wenn eine normale Erkennung und Erlernung auftreten. Diese Verbindungen stehen mit der Erkennung und Erlernung in Teilchen und Zellen und mit der Verbindung der Zellen untereinander in Beziehung. Diese Verbindungen werden als Recognine bezeichnet. Beim Versuch,^ diese Verbindungen aus normalen Krebszellen herzustellen, wurde festgestellt, daß sie als solche nicht vorhanden sind und daß zum gleichen Zeitpunkt, wo die Krebszellen ihre Fähigkeit verloren haben, (a) zu erkennen, daß sie ihr normales Volumen ausgefüllt haben, und/oder (b) die Teilung zu unterbrechen, wenn sie ihr normales Volumen ausgefüllt haben, Veränderungen ihrer Molekularstruktur stattgefunden haben.Normal cell division in plants or animals is restricted or inhibited when the cells do so come to completely occupy a respective room. The mechanisms (a) by which normal cells "recognize" that they have filled in the space available to them, and (b) after which the process of this recognition mechanism in turn inhibits cell division, both have been unknown. A group of connections has now been established whose precursors have increased concentration when normal recognition and learning occur. These There are connections with the recognition and learning in particles and cells and with the connection between the cells in relationship. These connections are known as recognize. When trying to ^ these compounds out normal To produce cancer cells, it was found that they do not exist as such and that at the same time, where the cancer cells have lost their ability to (a) recognize that they have filled their normal volume have, and / or (b) interrupt the division when they have filled their normal volume, changes in their Molecular structure have taken place.

Es sind neue Verbindungen sowie Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen entdeckt worden. Diese neuen Verbindungen werden als Recognine bezeichnet. Recognine sind neue Verbindungen, die physikochemische Eigenschaften haben, die diejenigen Konfigurationseigenschaften der Krebszellen hinsichtlich ihres Unvermögens,zu erkennen und die Zellteilung abzubrechen, nachahmen. Die Verwendung der RecognineNew compounds and methods of making these compounds have been discovered. These new ones Connections are known as recognize. Recognins are new compounds that have physicochemical properties those configuration properties of cancer cells in terms of their inability to recognize and cell division cancel, imitate. The use of the Recognine

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geht über eine reine Einsicht in den Krebsmechanismus hinaus, da hierdurch Produkte und Verfahren zur Verfügung gestellt werden, die für die Diagnose, Behandlung und Prophylaxe von Krebs geeignet sind.goes beyond a mere insight into the cancer mechanism, as this makes products and processes available useful for the diagnosis, treatment and prophylaxis of cancer.

Es sind Methoden aufgefunden worden, nach denen künstlich kultivierte Zellen dazu verwendet werden können, um Malignine herzustellen. Ein Vorteil der hierin beschriebenen Methoden besteht darin, daß nun Malignine und daraus neue Produkte wirksam in praktisch unbegrenzten Mengen hergestellt werden können.Methods have been found by which artificially cultured cells can be used to to make malignins. An advantage of the methods described herein is that now malignins and from them new products can be effectively manufactured in virtually unlimited quantities.

Die vorliegende Erfindung überschreitet das Gebiet der Krebsforschung, und sie ist unmittelbar auf alle beliebigen biologischen Systeme anwendbar, bei denen gewünscht wird, das Gesamtwachstum und den Metabolismus zu beeinflussen. Somit kann durch Herstellung der jeweiligen Verbindung oder der jeweiligen Verbindungen des entsprechenden Zelltyps in künstlichen Kulturen und weiterhin durch Herstellung von Produkten aus diesen Substanzen erstmals eine spezifische Beeinflussung auf alle beliebigen Gewebe, Zellen, Zellorganellen, sub-organellen Moleküle oder Molekülanhäufungen in jedem beliebigen lebenden System ausgeübt werden. Somit können erstmals spezifische Ernährungsbeeinfluasungen zu kritischen Zeitpunkten der Entwicklung, spezifische diagnostische, prophylaktische und Behandlungsmethoden sowie die Konstruktion von künstlichen bioelektrischen Systemen (z.B. in Gewebe- oder Organtransplantaten) durchgeführt werden. Diese künstlichen bioelektrischen Systeme können die charakteristischen Eigenschaften des spezifischen Recognins, Malignins oder ihrer chemischen Gegenstücke des normalen Gewebes oder der Komponente, denen sie benachbart sind, tragen, und sie können somit als "fremd" "erkannt" werden, wodurch Fremdkörperreaktionen mit Einschluß der Abstoßung vermieden werden können.The present invention transcends the field of cancer research and is immediately applicable to any and all biological systems in which it is desired to influence the overall growth and metabolism. Thus, by making the respective connection or the respective connections of the corresponding Cell type in artificial cultures and, for the first time, a specific one through the manufacture of products from these substances Influence on any tissue, cell, cell organelle, sub-organelle molecule or molecule cluster practiced in any living system. Thus, for the first time, specific nutritional influences can be applied at critical times of development, specific diagnostic, prophylactic and treatment methods as well as the construction of artificial bioelectrical systems (e.g. in tissue or organ transplants) be performed. These artificial bioelectrical systems can have the characteristic properties of the specific Recognins, malignins, or their chemical counterparts of normal tissue or the component to which they are adjacent are, wear, and they can thus be "recognized" as "foreign", thereby foreign body reactions with inclusion the rejection can be avoided.

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Ein weiterer Gesichtpunkt der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung eines verwertbaren, spezifischen, antikörperartigen Produktes (Anti-Astrocytin) gegenüber einem spezifischen Gehirnprodukt (Astrocytin), wobei es ermöglicht wird, daß dieses antikörperartige Produkt zur spezifischen Komplexbildung damit und als spezifischer Zuführungsträger für spezifische Punkte im Nervensystem aller Arten verwendet werden kann. Malignine und Astrocytin sind Recognine.Another aspect of the present invention is the production of a useful, specific, antibody-like product (anti-astrocytin) versus a specific brain product (astrocytin), whereby it enables will require this antibody-like product to specifically complex with it and as a specific delivery vehicle can be used for specific points in the nervous system of all types. Malignins and Astrocytin are Recognine.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Erzeugung von neuen Produkten, nämlich an Target haftenden Globulinen (TAG) aus biologischen Flüssigkeiten. Diese Produkte werden so bezeichnet, weil sie durch zwei Reaktionen erzeugt werden, wobei die erste Reaktion die Umsetzung von biologischen Flüssigkeiten mit einem synthetischen Komplex ist, welcher physikochemische Konfigurationen enthält, die diejenigen der Malignine nachahmen, und der als Target bzw. Ziel bezeichnet wird. Bei der zweiten Reaktion wird das spezifische TAG von dem Komplex abgespalten. Durch Messung des so erzeugten TAG wird somit eine quantitative Anzeige der biologischen Flüssigkeiten der lebenden Organismen erhalten, ob in diesen Organismen ein Tumor vorhanden ist. Somit wird erfindungsgemäß ein diagnostischer Test für Tumore zur Verfügung gestellt. Da TAG-Produkte und Anti-Malignin physikochemisch gegenüber Maligninen entgegengesetzt bzw. komplementär sind, werden sie hierin als chemische Gegenstücke bzw. Chemoreziprokale bezeichnet.Another aspect of the present invention is the creation of new products, namely those adhering to the target Globulins (TAG) from biological fluids. These products are so named because they go through two reactions can be generated, the first reaction being the conversion of biological fluids with a synthetic one Is complex, which contains physicochemical configurations, which mimic those of the malignins, and which is referred to as the target. The second reaction the specific TAG is cleaved from the complex. By measuring the TAG generated in this way, it becomes a quantitative one Obtain indication of the biological fluids of the living organisms, whether a tumor is present in these organisms is. Thus, according to the invention, a diagnostic test for tumors is made available. Da TAG products and anti-malignin physicochemically opposite to malignins or complementary, they are referred to herein as chemical counterparts or chemo-reciprocal.

Es wurde weiterhin gefunden, daß zwei quantitativ und qualitativ unterschiedliche TAG-Produkte je nach dem Zeitraum, den man für die Umsetzung des Serums mit dem speziellen Target-Reagens gestattet, und je nach dem Zeitraum, den man für die Abspaltung des Produktes, das in einen Komplex überführt worden ist, gestattet, hergestellt v/erden können. It was also found that two quantitatively and qualitatively different TAG products depending on the Period of time allowed for the reaction of the serum with the specific target reagent, and depending on the period of time which one allows for the cleavage of the product which has been converted into a complex, can be produced.

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Nach Untersuchung der Mengen dieser Produkte, die aus einer Anzahl von verschiedenen Personen mit Gehirntumoren und verschiedenen anderen medizinischen Störungen sowie von solchen, die keinen augenscheinlichen Krankheitsprozeß hatten, hergestellt worden waren, wurde ersichtlich, daß die Mengen dieser zwei neuen Produkte, die in einer gegebenen Person erzeugt werden können, eine Anzeige darüber geben, ob die jeweilige Person einen Gehirntumor hatte. Es ist somit ein neuer serum-diagnostischer Test für Gehirntumore entdeckt worden.After studying the amounts of these products obtained from a number of different people with brain tumors and various other medical disorders, as well as those produced by those which had no apparent disease process, became apparent that the amounts of these two new products that can be created in a given person have an indication of it indicate whether the respective person had a brain tumor. It is thus a new serum diagnostic test for brain tumors been discovered.

Die Eignung dieser neuen Produkte, zusätzlich zu ihrer Verwendung zur Diagnose aus dem Serum und anderen biologischen Flüssigkeiten, das Vorhandensein von Gehirn- und anderen Tumoren anzuzeigen, wird durch die Tatsache veranschaulicht, daß TAG und Anti-Recognin-Verbindungen in histologischen Schnitten von Gehirntumor vorzugsweise an den glialen Tumorzellen und dem umgebenden Gewebe, das beim chirurgischen Eingriff des Gehirntumors entfernt worden ist, haften. Diese bevorzugte Markierung der Tumorζeilen durch TAG und Anti-Recognine wird durch Standard-Immunofluoreszenz-Techniken demonstriert. Somit wird durch die Erfindung auch eine neue Methode zur Verfügung gestellt, um durch eine histologische Untersuchung mit einem neuen Sicherheitsgrad zu bestimmen, ob Tumorzellen zu den Ecken bzw. Kanten des entfernten Gewebes vorangedrungen sind, was einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit abgibt, daß in dem Gehirn oder dem anderen Organ immer noch ein Tumor vorhanden ist oder daß Tumorzellen an der Peripherie des entfernten Gewebes nicht mehr vorhanden sind. Hierdurch wird eine Aussage über die Möglichkeit gegeben, daß der gesamte Tumor aus dem Gehirn oder einem anderen Organ entfernt worden ist. Es hat sich weiterhin gezeigt, daß TAG und Anti-Malignine, deren Herstellung oben beschrieben wurde, gegenüber Gliom-Gehirntumorzellen, die in vitro in einer Gewebekultur ge-The suitability of these new products, in addition to their use for diagnosis from the serum and others biological fluids to indicate the presence of brain and other tumors is supported by the fact Illustrates that TAG and anti-recognin compounds preferentially appear in histological sections of brain tumor the glial tumor cells and the surrounding tissue that was removed during surgery for the brain tumor, be liable. This preferred marking of the tumor cells by TAG and Anti-Recognine is carried out using standard immunofluorescence techniques demonstrated. Thus, the invention also provides a new method is available through a histological examination with a new degree of certainty to determine whether tumor cells are at the corners or edges of the removed tissue, which gives an indication of the likelihood that in the brain or the other organ still has a tumor or that tumor cells on the periphery of the removed tissue no longer exist. This gives a statement about the possibility that the entire tumor from the brain or another organ has been removed. It has also been shown that TAG and anti-malignins, their Production described above, against glioma brain tumor cells, which are generated in vitro in a tissue culture

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züchtet worden sind, cytotoxisch sind. Diese hohe Affinität für Tumorzellen in einem anderen Medium, die in diesem Fall in einer Gewebekultur gezüchtet worden sind, ist ein weiteres Beweisanzeichen für das spezifische Kupplungspotential der neuen TAG-Produkte. Hierdurch wird der Name "am Target haftende Globuline" (Target-Attaching-Globulins) (TAG) erläutert, wie es auch die Eigenschaften von TAG hinsichtlich des synthetischen Target-Produktes und den Tumorzellen in histologischen Schnitten tun.are cytotoxic. This high affinity for tumor cells in another medium, in this case grown in tissue culture is another evidence of specific coupling potential of the new TAG products. This will make the name "on the target Adhesive Globulins "(Target-Attaching-Globulins) (TAG) explains how it also relates to the properties of TAG of the synthetic target product and the tumor cells in histological sections.

Die Cytotoxizität von TAG und Anti-Recogninen gegenüber Tumorzellen liefert einen weiteren, neuen, diagnostischen Test für das Serum von Patienten, bei denen Tumorverdacht besteht. Somit wird z.B. das Serum oder eine andere Körperflüssigkeit dieser Patienten mit Target unter Bildung von TAG umgesetzt. Das TAG-Produkt wird in Gewebekulturen von Tumorzellen auf die Cytotoxizität getestet. Sowohl die Konzentration an TAG als auch der Grad der Cytotoxizität, der von dem TAG gezeigt wird, welches aus dem Serum einer gegebenen Person erzeugt werden kann, können nicht nur für diagnostische Zwecke geeignet sein, sondern auch von Wert sein, um den Verlauf der Krankheit präoperativ und postoperativ bei einem gegebenen Patienten zu verfolgen. Die Kupplung von radioaktiven und Farbstoff-Tracern an TAG liefert neue TAG-Produkte, die in vivo für die Diagnose von Tumoren und ihre exakte Lokalisierung geeignet sind. Somit gestattet die intraarterielle oder intravenöse Injektion von geeignet markiertem TAG in die cerebrospinale Flüssigkeit oder direkt in das Gehirngewebe oder seine Höhlungen das Vorhandensein eines.Gehirntumors durch radioaktive Mittel oder durch Sichtbarmachung durch den gekuppelten Farbstoff anzuzeigen, da das TAG spezifisch nur an den Tumorzellen haftet. Ferner gestattet diese Methode die präzise Sichtbarmachung des Orts des Gehirntumors. Dies stellt eine Verbesserung dieser diagnostischen in vivs-Methode unter Verwendung von in Kaninchenblut erzeugtem Anti-Astro-The cytotoxicity of TAG and anti-recognins versus Tumor cells provides another, new, diagnostic test for the serum of patients in whom a tumor is suspected consists. Thus, for example, the serum or other body fluid of these patients is targeted with formation implemented by TAG. The TAG product is tested for cytotoxicity in tissue cultures of tumor cells. Both the Concentration of TAG as well as the degree of cytotoxicity exhibited by the TAG obtained from the serum of a given person can be useful not only for diagnostic purposes but also of value to follow the course of the disease preoperatively and postoperatively in a given patient. the Coupling of radioactive and dye tracers to TAG provides new TAG products that can be used in vivo for the diagnosis of Tumors and their exact localization are suitable. Thus allows for intra-arterial or intravenous injection of appropriately labeled TAG into the cerebrospinal fluid or directly into the brain tissue or its Cavities the presence of a. Brain tumor due to radioactive Means or visualization through the coupled dye, as the TAG is specific only to the Tumor cells adheres. Furthermore, this method allows the precise visualization of the location of the brain tumor. This represents an improvement of this diagnostic in vivs method using anti-astro-

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? 6 η R 2 5 7? 6 η R 2 5 7

cytin zur Markierung des Gehirntumors dar, weil die Verwendung von TAG, das aus Humanserum erzeugt worden ist, die Möglichkeit von Fremdproteinreaktionen vermeidet. Da TAG und Anti-Recognine chemisch spezifische Eigenschaften haben, die die bevorzugte Anheftung an Astro cytin-Vorlauf er enthaltende Tumorzellen sowohl in vitro als auch in vivo gestatten, können diese Produkte sowohl therapeutisch als auch diagnostisch verwendet werden, wenn sie z.B. mit radioaktiven Mitteln, Protonen einfangenden Mitteln oder anderen toxischen physikalischen oder chemischen Mitteln gekuppelt sind, so daß diese toxischen Substanzen bevorzugt durch die Spezifizität dieser Verbindungen,an Tumorzellen im Vergleich zu den benachbarten normalen Zellen zu haften, lokalisiert werden können. Diese Selektivität wird als wesentlich oder zumindestens als ein wesentlicher Faktor angesehen, um eine wirksame chemische oder physikalische Therapie von Tumoren zu erreichen. Ein solcher Faktor ist bislang noch nicht erreicht worden. Das TAG hat nun seine Wirksamkeit gezeigt, bevorzugt an den Tumorzellen zu haften, so daß es aus diesen Gründen eine gewisse Aussicht als neues Arzneimittel haben müßte.cytin to mark the brain tumor because the use of TAG, which has been generated from human serum, the Avoids the possibility of foreign protein reactions. Since TAG and Anti-Recognine have chemically specific properties, the one containing the preferred attachment to astro cytin forerunner Allowing tumor cells both in vitro and in vivo, these products can be both therapeutic and diagnostic used when used with, for example, radioactive agents, proton trapping agents, or other toxic physical or chemical means are coupled so that these toxic substances are preferred by the specificity these compounds localized to adhere to tumor cells compared to neighboring normal cells can be. This selectivity is considered to be essential or at least an essential factor in order to to achieve effective chemical or physical therapy of tumors. One such factor is still so far has not been achieved. The TAG has now shown its effectiveness in adhering preferentially to the tumor cells, so that it for these reasons should have a certain prospect as a new drug.

Im Serum von Patienten mit malignen Tumoren kann, wie aus den Beispielen ersichtlich werden wird, ein Typ von TAG, nämlich Langsam-TAG (SLOW-TAG) (S-TAG) gegenüberIn the serum of patients with malignant tumors, as will be apparent from the examples, one type of TAG, namely Slow-TAG (SLOW-TAG) (S-TAG) opposite

Schnell-TAG (FAST-TAG) (F-TAG) in relativ größeren Mengen aus einem gegebenen Serumvolumen erzeugt werden als bei Patienten ohne solche Tumoren. Dies deutet darauf hin, daß die Konzentration eines natürlich vorkommenden Vorläufers (P-TAG) für TAG erhöht ist oder daß andere Faktoren vorliegen, die die relative in vitro-Erzeugung von S-TAG gegenüber F-TAG begünstigen.Schnell-TAG (FAST-TAG) (F-TAG) in relatively larger quantities can be generated from a given volume of serum than in patients without such tumors. This suggests that the concentration of a naturally occurring precursor (P-TAG) for TAG is increased or that other factors are present which favor the relative in vitro generation of S-TAG versus F-TAG.

Die mögliche Beziehung zwischen der Funktion der tatsächlichen synthetischen Produkte Target und TAG undThe possible relationship between the function of the actual synthetic products Target and TAG and

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ihren Vorläufern und seinerseits den Funktionen der postulierten, jedoch noch nicht gezeigten Zeil-"Antigene" und der zirkulierenden "Antikörper",gegenüber denen sie in vivo existieren können, ist bislang noch nicht aufgeklärt worden. So ergeben z.B. F-TAG und S-TAG in antikörperartiger Weise einzige bzw. einzelne diskrete Linien der Reaktion mit Astrocytin bei der Ouchterlony-Geldiffusion,und die Injektion von Target in Kaninchen induziert eine Zunahme der Ausbeute der TAG-Produkte aus dem Kaninchenserum nach der Umsetzung mit dem Target. Die Entdeckung, daß ein normaler Gehalt eines Vorläufers vorliegen kann, der dem zirkulierenden Antikörper gegenüber einem Zell-Antigen ähnelt, welches in den nicht-teilenden Zellen verborgen ist, wirft die Frage nach einer möglichen Funktion des Paars auf. Es wird hier vorgeschlagen, daß der TAG-Vorläufer (P-TAG) und targetähnliche Substanzen in vivo existieren, die eine Funktion der Kontrolle der Zeilproliferation und des ZeIlabsterbens ausüben. So kann z.B. während der Zellteilung ein Zellbestandteil den Serumproteinen ausgesetzt werden, was normalerweise nicht direkt der Fall ist. Die Aussetzung dieses Zellbestandteils könnte dazu führen, daß dieser Bestandteil in eine targetartige Substanz umgewandelt wird, an dem die Anhaftung eines P-TAG-artigen Moleküls aus dem Serum sodann stattfinden könnte, was die Zellteilung stimulieren oder inhibieren würde. Alternativ kann eine nichtteilende Zelle, die beschädigt worden ist oder die falsch funktioniert, eine targetartige Substanz freisetzen, an der die Anheftung der P-TAG-artigen Moleküle reparierend sein kann. Jedoch, unter bestimmten Zellbedingungen, kann die Anhaftung der P-TAG-artigen Moleküle die Zerstörung der Zelle induzieren (so ist z.B. synthetisch hergestelltes, wie hierin beschrieben, Anti-Gliom —TAG gegenüber Gliomtumorzellen, die in einer Gewebekultur wachsen, ausgeprägt cytotoxisch). Dies könnte somit das Spiegelbild eines normalen Mechanismus zur Kontrolle der Zellteilung und entwedertheir precursors and in turn the functions of the postulated but not yet shown cell "antigens" and the circulating "antibodies" to which they are exposed in vivo may exist has not yet been clarified. For example, F-TAG and S-TAG give in an antibody-like manner single discrete lines of reaction with astrocytin in the Ouchterlony gel diffusion, and the injection von Target in rabbits induces an increase in the yield of the TAG products from the rabbit serum after the reaction with the target. The discovery that there may be a normal level of precursor to that of the circulating Raises antibodies to a cell antigen that is hidden in the non-dividing cells the question of a possible function of the couple. It is suggested here that the TAG precursor (P-TAG) and target-like substances exist in vivo that have a function of controlling cell proliferation and cell death exercise. For example, a cell component can be exposed to serum proteins during cell division, which is usually not the case directly. Exposure to this cell component could result in this component is converted into a target-like substance to which the attachment of a P-TAG-like molecule from the Serum could then take place, which would stimulate or inhibit cell division. Alternatively, it can be a non-dividing Cell that has been damaged or that is malfunctioning can release a target-like substance which can repair the attachment of the P-TAG-like molecules. However, under certain cell conditions, it can the adhesion of the P-TAG-like molecules induce the destruction of the cell (for example, synthetically produced, as described herein, anti-glioma TAG versus glioma tumor cells, which grow in a tissue culture, markedly cytotoxic). This could thus be the mirror image of a normal one Mechanism to control cell division and either

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zur Reparatur oder zur Entfernung von individuellen Zellen in dem Körper durch die Lebenszeit des Organismus hindurch darstellen. Wenn das Aussetzen der Zellbestandteile abnorm erhöht ist, so daß abnorm große Mengen von targetartigen
Zellsubstanzen gebildet v/erden, was z.B. bei rasch teilenden Krebszellen wie in Gehirngliomen erfolgen kann, dann kann
eine Zunahme der Konzentration von einem Typ von Serum
P-TAG gegenüber einem anderen induziert v/erden.to repair or remove individual cells in the body throughout the life of the organism. When the exposure of the cellular components is abnormally increased, causing abnormally large amounts of target-like
Cell substances are formed, which can then take place, for example, in rapidly dividing cancer cells such as in brain gliomas
an increase in the concentration of one type of serum
P-TAG induced against another.

Ungeachtet der tatsächlichen Funktion der Vorläufer ist die Zunahme der relativen Menge eines vorherrschenden Typs von TAG, Langsam-TAG (SLOW-TAG) (S-TAG), der in vitro nach den beschriebenen Methoden aus dem Serum von Patienten mit malignen Tumoren hergestellt v/erden kann,
die Basis für die in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen serum-diagnoßtischen Tests.Regardless of the actual function of the precursors, the increase in the relative amount of a predominant type of TAG, Slow-TAG (SLOW-TAG) (S-TAG), prepared in vitro from the serum of patients with malignant tumors by the methods described v / can earth
the basis for the serum diagnostic tests described in the following examples.

Beispiel 1example 1

Herstellung einer den Astrocytin-Vorläufer enthaltenden
Rohfraktion.Preparation of one containing the astrocytin precursor
Crude fraction.

Menschliches Gehirngliomtumorgewebe, entfernt bei einem chirurgischen Eingriff, wird von Oberflächenblutgefäßen und normalem Gehirngewebe soweit wie möglich freigeschnitten. Für eine typische Menge von herausseziertem
Tumorgewebe von 11 g wird das Gewebe in sechs 1,5 g Proben und zwei 1,0g Proben abgewogen. Jede Probe wird wie folgt behandelt.Human brain glioma tumor tissue, removed during surgery, is cut free of surface blood vessels and normal brain tissue as much as possible. For a typical amount of dissected out
For tumor tissue of 11 g, the tissue is weighed into six 1.5 g samples and two 1.0 g samples. Each sample is treated as follows.

Jede Probe wird in einer neutralen Pufferlösung
durch Beschallung oder andere mechanische Maßnahmen homogenisiert. So wird z.B. jeder Teil in 100 ecm einer 0,005 M
Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7 pro Gramm Gewebe in einem Waringmischer homogenisiert. Die Homogenisierung sollte in der Kälte erfolgen, um eine DenaturierungEach sample is in a neutral buffer solution
homogenized by sonication or other mechanical measures. For example, every part in 100 ecm becomes a 0.005 st
Phosphate buffer solution with a pH of 7 per gram of tissue is homogenized in a Waring mixer. The homogenization should be done in the cold to avoid denaturation

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der Proteine zu verhindern. So sollte z.B. der Mischer in einem kalten Raum von 0 bis 5°C vorgekühlt und nur etwa 3 Minuten lang in Betrieb genommen werden.of proteins to prevent. For example, the mixer should be pre-cooled in a cold room from 0 to 5 ° C and only about Be put into operation for 3 minutes.

Das Homogenat wird sodamm zur Klärung, beispielsweise mit der 80 OOOfachen Schwerkraft 30 Minuten lang in einer gekühlten Ultrazentrifuge, zentrifugiert. Das lösliche überstehende Produkt wird dekantiert und in der Kälte gehalten. Der unlösliche Rückstand wird mit weiteren 100 ecm des neutralen Puffers rehomogenisiert und wie vorstehend beschrieben zentrifugiert. Der zweite lösliche Extrakt wird mit dem ersten Extrakt kombiniert. Beste Ergebnisse werden erhalten, wenn diese Verfahrensweise der Homogenisierung und Zentrifugierung wiederholt wird, bis weniger als 50/Ug Protein/ml Lösung in dem überstehenden Produkt erhalten werden. Bei den meisten Geweben wird dies durch die fünfte Extraktion erreicht.The homogenate is then used for clarification, for example centrifuged at 80,000 times gravity for 30 minutes in a refrigerated ultracentrifuge. The soluble one Supernatant product is decanted and kept in the cold. The insoluble residue is with a further 100 ecm of the neutral buffer and centrifuged as described above. The second soluble extract is combined with the first extract. Best results are obtained when using this homogenization procedure and centrifugation is repeated until less than 50 / Ug protein / ml solution in the supernatant can be obtained. For most tissues, this is accomplished by the fifth extraction.

Die auf diese Weise erhaltenen Lösungen werden kombiniert und durch Eindamp^fung und nachfolgende Dialyse, z.B. Dialyse gegen einen0,006 M Phosphatpuffer in der Kälte, konzentriert, um ein Volumen von 15 ml zu erhalten. Das Volumen dieser Lösung wird .notiert und ein aliquoter Teil wird zur Analyse des Gesamtproteins entnommen. Der Rest wird fraktioniert, um eine Proteinfraktion mit einem pK-Bereich zwischen 1 und 4 zu erhalten. Die bevorzugte Fraktionierungsmethode ist eine chromatographische Methode, wie sie nachstehend beschrieben wird.The solutions obtained in this way are combined and by evaporation and subsequent dialysis, e.g. dialysis against a 0.006 M phosphate buffer in the cold, concentrated to make a volume of 15 ml. That The volume of this solution is noted and an aliquot is withdrawn for analysis of the total protein. The rest is fractionated to obtain a protein fraction with a pK range between 1 and 4. The preferred method of fractionation is a chromatographic method as described below.

Die Lösung wird in einem kalten Raum (4°C) auf einer Säule mit DEAE-Cellulose (Cellex-D) mit den Abmessungen 2,5 χ 11,0 cm fraktioniert. Die Säule ist mit einem 0,005 M Natriumphosphatpuffer ins Gleichsgewicht gesetzt worden. Es werden stufenweise Veränderungen des Eluierungslösungsmittels mit den folgenden Lösungsmitteln (Lösungen) durchgeführt: The solution is in a cold room (4 ° C) on a column with DEAE cellulose (Cellex-D) with the dimensions 2.5 χ 11.0 cm fractionated. The column was equilibrated with a 0.005 M sodium phosphate buffer. It Gradual changes in the eluting solvent are carried out with the following solvents (solutions):

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Lösung (1): 4,04 g NaH₂PO₄ und 6,50 g ₂₄ werden in 15 1 destilliertem Wasser (0,005 molar, pH 7) aufgelöst;Solution (1): 4.04 g of NaH ₂ PO ₄ and 6.50 g of ₂₄ are dissolved in 15 l of distilled water (0.005 molar, pH 7);

Lösung (2): 8,57 g NaH₂PO₄ werden in 2480 ml destilliertem Wasser aufgelöst;Solution (2): 8.57 g of NaH ₂ PO ₄ are dissolved in 2480 ml of distilled water;

Lösung (3): 17,1 g NaH₂PO₄ werden in 2480 ml destilliertem Wasser (0,05 molar, pH 4,7) aufgelöst;Solution (3): 17.1 g of NaH ₂ PO ₄ are dissolved in 2480 ml of distilled water (0.05 molar, pH 4.7);

- Lösung (4): 59,65 g NaH₂PO₄ werden in 2470 ml destilliertem Wasser (0,175 molar) aufgelöst;- Solution (4): 59.65 g of NaH ₂ PO ₄ are dissolved in 2470 ml of distilled water (0.175 molar);

Lösung (5): 101,6 g NaH₂PO₄ v/erden in 2455 ml destilliertem Wasser (0,3 molar, pH 4,3) aufgelöst;Solution (5): 101.6 g of NaH ₂ PO ₄ v / earth dissolved in 2455 ml of distilled water (0.3 molar, pH 4.3);

Lösung (6): 340,1 g NaH₂PO₄ werden in 2465 1 destilliertem Wasser (1,0 molar, pH 4,1) aufgelöst;Solution (6): 340.1 g of NaH ₂ PO ₄ are dissolved in 2465 l of distilled water (1.0 molar, pH 4.1);

Lösung (7): 283,64 g 80%ige Phosphorsäure (H₃PO₄) v/erden in 2460 ml destilliertem Wasser (1,0 molar, pH 1,0) aufgelöst.Solution (7): 283.64 g of 80% phosphoric acid (H ₃ PO ₄ ) dissolved in 2460 ml of distilled water (1.0 molar, pH 1.0).

Es wird ein Nervengewebeextrakt mit einem Volumen von 6 bis 10 ml zugesetzt. Sodann wird durch die Säule durchlaufen gelassen. Hierauf wird mit der Lösung (1) übergelegt und es wird ein Reservoir von 300 ml der Lösung (1) angebracht, damit diese Lösung durch die Schwerkraft auf die Säule auftropft. Aliquote Teile von 3 ml des abströmenden Produkts werden mittels eines automatischen Fraktionssammlers gesammelt. Die nachfolgenden Eluierungslösungen werden stufenweise bei den folgenden Zahlen der Eluierungsröhrchen ausgetauscht:It becomes a nerve tissue extract with a volume from 6 to 10 ml added. The column is then passed through. The solution (1) is then overlaid and a reservoir of 300 ml of the solution (1) is attached to allow this solution to be gravity-fed the column drips on. Aliquots of 3 ml of the effluent Products are collected using an automatic fraction collector. The following elution solutions are gradually exchanged at the following numbers of the elution tubes:

Lösung (2): beim Röhrchen 88; die Lösung wird in die Säule auf die Oberseite des Harzes aufgebracht, sodann wird überlegt und ein Reservoir von 50 ml der Lösung (2) angefügt;Solution (2): at tube 88; the solution is placed in the column on top of the resin, then is considered and a reservoir of 50 ml of the solution (2) is added;

Lösung (3): beim Röhrchen 98; die Lösung wird in die Säule auf die Oberseite des Harzes aufgebracht, sodann überlegt und es wird ein Reservoir von 75 ml der Lösung (3) angefügt;Solution (3): at tube 98; the solution is placed in the column on top of the resin, then think about it and add a reservoir of 75 ml of the solution (3);

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Lösung (4): beim Röhrchen 114; die Lösung wird in die Säule auf die Oberseite des Harzes aufgebracht, sodann überlegt und es wird ein Reservoir von 150 ml der Lösung (4) angefügt;Solution (4): at tube 114; the solution is placed in the column on top of the resin, then think about it and add a reservoir of 150 ml of the solution (4);

Lösung (5): beim Röhrchen 155; die Lösung wird in die Säule auf die Oberseite des Harzes aufgebracht, sodann überlegt und es wird ein Reservoir von 125 ml der Lösung (5) angefügt;Solution (5): at tube 155; the solution is placed in the column on top of the resin, then think about it and add a reservoir of 125 ml of the solution (5);

Lösung (6): beim Röhrchen 187; die Lösung wird in die Säule auf die Oberseite des Harzes aufgebracht, sodann überlegt und es wird ein Reservoir von 175 ml der Lösung (7) angefügt.Solution (6): at tube 187; the solution is placed in the column on top of the resin, then and a reservoir of 175 ml of the solution (7) is added.

Die Eluierung wird bis zum Röhrchen 260 weitergeführt, wo die Eluierung vollständig ist. Es wird frischhergestelltes Harz für jedes neue Volumen des Gewebeextrakts verwendet. Jedes Röhrchen für das abströmende Produkt wird quantitativ auf Protein untersucht. Die Eluate in den Röhrchen mit den Nummern 212 bis 230 werden kombiniert und sie enthalten die Rohprodukte, aus denen Astrocytin hergestellt wird.Elution continues to tube 260 where elution is complete. It is freshly made Resin used for each new volume of tissue extract. Each tube for the effluent is quantitatively examined for protein. The eluates in the tubes with the Numbers 212 to 230 are combined and they contain the raw products from which astrocytin is made.

Hinsichtlich dieses Rohmaterials, das als Fraktion 1OB bezeichnet wird, sind zwar schon Werte veröffentlicht worden [Protein Metabolism of the Nervous System, S.555-69 (Pleum Presse, 1970); Journal of Neurosurgery, Band 33» S.281-286 (September 197O)], doch ist nunmehr auch die Abspaltung des spezifischen Produkts, das hierin als Astrocytin bezeichnet wird, von der Fraktion 1OB gelungen. Die Rohfraktion 1OB kann als Produkt in Mengen zwischen 0,1 und 10 mg/g des ursprünglichen frischen Nervensystemgewebes, aus dem es erhalten worden ist, hergestellt werden. Zusätzlich zu einem Astrocytin-Vorläufer enthält sie variierende Mengen von kovalent gebundenen Kohlenhydratresten mit Einschluß einer Anzahl von Hexosen, nämlich Glucose, Galatose, Mannose; Hexosaminen mit Einschluß von Glucosamin, Galatosamin und Mannosamin; und gelegentlich weiteren Zuckern, z.B. Fructose, Ribose und möglicherweise Rhamnose. Sie enthältWith regard to this raw material, which is referred to as fraction 10B, values have already been published [Protein Metabolism of the Nervous System, pp 555-69 (Pleum Presse, 1970); Journal of Neurosurgery, Volume 33 » 281-286 (September 197O)], but now there is also the secession of the specific product referred to herein as astrocytin from fraction 10B. the Crude fraction 10B can be used as a product in amounts between 0.1 and 10 mg / g of the original fresh nervous system tissue, from which it was obtained. In addition to an astrocytin precursor, it contains varying Amounts of covalently linked carbohydrate residues with inclusion a number of hexoses, namely glucose, galatose, mannose; Hexosamines including glucosamine, galatosamine and mannosamine; and occasionally other sugars, e.g. fructose, ribose and possibly rhamnose. It contains

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auch Proteinprodukte mit hohem Molekulargewicht, mehrere Lipide und Nucleinsäuren.also high molecular weight protein products, multiple lipids and nucleic acids.

Beispiel 2Example 2

Herstellung von gereinigtem Astrocytin aus der Rohfraktion, die den Astrocytin-Vorlaufer enthält.Production of purified astrocytin from the crude fraction that contains the astrocytin precursor.

Die den Astrocytin-Vorläufer enthaltende Fraktion wird weiterhin von Verunreinigungen befreit. Bei bevorzugten Ausführungsformen wird das Material des Beispiels 1 auf Sephadex G-50-Harz in einer typischen Säule mit einer Länge von 40 cm, einem Durchmesser von 2,5 cm und einem Volumen von 196 ml chromatographiert. Der angewendete Druck beträgt 40 mm Hg. Die Fließgeschwindigkeit beträgt 35 ml/h und als Puffer wird eine 0,05 molare Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7*2 verwendet. Der erste (Durchfluß) Peak enthält den Astrocytin-Vorläufer zusammen mit Verunreinigungen, während die darauf folgenden Peaks nur Verunreinigungen enthalten.The fraction containing the astrocytin precursor is further freed from impurities. With preferred Embodiments are the material of Example 1 on Sephadex G-50 resin in a typical column with a Chromatographed length of 40 cm, a diameter of 2.5 cm and a volume of 196 ml. The pressure applied is 40 mm Hg. The flow rate is 35 ml / h and a 0.05 molar phosphate buffer solution is used as the buffer used with a pH of 7 * 2. The first (flow through) peak contains the astrocytin precursor along with impurities, while the following peaks contain only impurities.

Bei der bevorzugten Ausführungsform v/erden sodann die Produkte in dem ersten Durchflußpeak auf Sephadex G-15 konzentriert und sodann auf eine Säule von Cellex-D mit der gleichen Lösung bzw. den gleichen Lösungen (1) bis (7), wie in Beispiel 1, ausgegeben, und es werden die gleichen Eluierungsstufen wie in Beispiel 1 durchgeführt. Das Produkt Astrocytin liegt als scharfer Peak in den gleichen Röhren (Nr. 212 bis 230) wie zuvor vor. Es hält somit sein Verhalten bei der Chromatographie auf Cellex-D ohne die Anwesenheit einer großen Anzahl von Verunreinigungen aufrecht.In the preferred embodiment, the products in the first flow peak then ground on Sephadex G-15 concentrated and then on a column of Cellex-D with the same solution or the same solutions (1) to (7), as in Example 1, and the same elution steps as in Example 1 are carried out. The product Astrocytin is present as a sharp peak in the same tubes (Nos. 212 to 230) as before. So it keeps being Performs chromatography on Cellex-D without the presence of a large number of impurities.

Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht können sodann nach bekannten Techniken, z.B. durch eine Filtration durch Milliporenscheiben entfernt werden. Bei der bevorzugten Methode wird das Produkt Astrocytin vonLow molecular weight impurities can then be removed by known techniques, e.g. Filtration through Millipore disks can be removed. In the preferred method, the product is astrocytin from

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Salz und anderen niedermolekularen Verunreinigungen durch Filtration durch Milliporen Pellicon-Scheiben Nr. 1000 mit 13 mm befreit. Dieser Filter hält Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 zurück und gestattet den Durchgang von Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000. Das Produkt Astrocytin bleibt auf den Pellicon-Scheiben zurück und wird davon durch Waschen mit der Lösung (1) des Beispiels 1 gewonnen.Salt and other low molecular weight contaminants by filtration through Millipore Pellicon # 1000 disks 13 mm exempt. This filter holds back substances with a molecular weight of more than 1000 and allows Passage of substances with a molecular weight less than 1000. The product astrocytin remains on the Pellicon disks and is obtained therefrom by washing with the solution (1) of Example 1.

Astrocytin wird sodann in der Weise erhalten, daß man die Verbindung mit einem Molekulargewicht von etwa 8000 aus der obigen Lösung isoliert. Bei einer bevorzugten Methode wird die Dünnschichtgel(TLG)-Chromatographie wie folgt angewendet.Astrocytin is then obtained by treating the compound having a molecular weight of about 8,000 isolated from the above solution. In a preferred method, thin layer gel (TLG) chromatography such as follows applied.

Als Vorrichtung wird eine handelsübliche 'Vorrichtung von Boehringer Mannheim GmbH; Pharmacia Fine Chemicals and CAMAG (Schweiz) verwendet. Das Harz, nämlich 2,5 g Sephadex G-200 superfein, wird in 85 ml 0,5 M NaCl in 0,02 M Na₂HPO₄KH₂PO₄-Phosphatpuffer, pH 6,8 (6,6 bis 7,o) vorbereitet. Es wird 2 oder 3 Tage bei Raumtemperatur unter gelegentlichem, behutsamem Vermischen quellen gelassen. (Es sollten keine Magnetrührer oder andere Rührerverwendet werden.) Das gequollene Gel wird 3 Wochen bei Kühlschranktemperatur stabilisiert, wobei jedoch ein Bakterien- und Pilzwachstum das gequollene Gel stören können. Wenn das Gel über längere Zeiträume gehalten werden soll, dann sollte eine geringe Menge eines bakteriostatischen Mittels (z.B. Ο,Ο25ό Natriumazid) zugesetzt werden. 2,5 g trockenes Gel v/erden dazu verwendet, um zwei Glasplatten mit den Abmessungen 20 χ 20 cm und einer Dicke von 0,5 mm zu beschichten. Die Platten werden entweder bei Raumtemperatur 10 Minuten lang trocknen gelassen und in eine feuchte Kammer überführt, wo sie etwa 2 Wochen lang gelagert werden können, oder sie werden sofort nach einer geeigneten Vor-Ins-Gleich-A commercially available device from Boehringer Mannheim GmbH; Pharmacia Fine Chemicals and CAMAG (Switzerland) used. The resin, namely 2.5 g of Sephadex G-200 superfine, is dissolved in 85 ml of 0.5 M NaCl in 0.02 M Na ₂ HPO ₄ KH ₂ PO ₄ phosphate buffer, pH 6.8 (6.6 to 7, o) prepared. It is allowed to swell for 2 or 3 days at room temperature with occasional, gentle mixing. (Magnetic or other stirrers should not be used.) The swollen gel is stabilized for 3 weeks at refrigerator temperature, but bacterial and fungal growth can disturb the swollen gel. If the gel is to be kept for long periods of time, a small amount of a bacteriostatic agent (e.g. Ο, Ο25ό sodium azide) should be added. 2.5 g of dry gel are used to coat two glass plates measuring 20 × 20 cm and a thickness of 0.5 mm. The plates are either allowed to dry at room temperature for 10 minutes and transferred to a humid chamber, where they can be stored for about 2 weeks, or they are immediately after a suitable pre-ins

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gewicht-Setzung verwendet (gewöhnlich während der Nacht über einen Minimalzeitraum von 12 Stunden). Die Hauptfunktion der Ins-Gleichgewicht-Setzung ist die Normalisierung des Volumenverhältnisses zwischen der stationären und der mobilen Phase. Bei einer horizontalen Stellung der ins Vor-Gleichgewicht gesetzten Platten werden die zu erfassenden Substanzen mit Mikropipetten als Flecken oder als Streifen an der Startlinie aufgebracht. 10 bis 20 ml der 0,2-bis 2%igen Proteinlösung werden auf die Kante einer mikroskopischen Objektplatte (18 χ 18 mm) aufgebracht und gegen die Geloberfläche gehalten. Innerhalb von wenigen Sekunden dringt die Lösung in das Gel ein. Alle Proben werden zuerst auf den Deckplättchen hergestellt und sodann rasch aufgebracht. Wenn nicht genügend Material verwendet wird, dann ist es schwierig, nach der Trennung einzelne Flecken zu lokalisieren. Wenn zuviel Material aufgebracht wird, dann erfolgt keine definierte Trennung. Die Proben werden mit Puffer zur leichteren Handhabung verdünnt und die Auftrennung der Proben erfolgt nach der absteigenden Technik, wobei die Platte mit einem Winkel von 22 angeordnet ist. Eine Fließgeschwindigkeit von etwa 1 bis 2 cm/h ist am besten geeignet. Markierungssubstanzen (z.B. Cytochrom C, Hämoglobin, Myoglobin oder mit Bromphenolblau markiertes Albumin) werden an verschiedenen Stellen über die Platte aufgebracht und sie dienen als Referenzproteine zur Errechnung des relativen Abstands (Mobilität) der unbekannten Substanzen. Nach Aufbringung der Proben werden die Platten in der Vorrichtung ersetzt und der Papiertampon wird leicht nach unten gedrückt, um einen guten Kontakt mit der Gelschicht zu gewährleisten. Der Papiertampon darf nicht tropfen. Überschüssige Feuchtigkeit wird abgewischt. Das flüssige Lösungsmittel im Reservoir wird konstant bei 1 cm vom oberen Ende des Gefäßes gehalten. Die einzelnen Durchgänge sind gewöhnlich je nach dem Fortschritt der Trennung in 4 bis 7 Stunden beendigt. Bei gefärbten Substanzen kannweight-setting used (usually during the night over a minimum period of 12 hours). The main function of equilibrium is normalization the volume ratio between the stationary and the mobile phase. If the ins Pre-equilibrated plates are the substances to be detected with micropipettes as spots or as stripes applied at the start line. 10 to 20 ml of the 0.2 to 2% protein solution are applied to the edge of a microscopic slide (18 χ 18 mm) and against held the gel surface. The solution penetrates the gel within a few seconds. All samples are first made on the coverslip and then quickly applied. If not enough material is used, then it is difficult to locate individual spots after separation. If too much material is applied, then there is no defined separation. The samples are diluted with buffer for easier handling and separation of the samples is carried out according to the descending technique, with the plate arranged at an angle of 22 °. A flow rate of about 1 to 2 cm / h is most suitable. Marking substances (e.g. cytochrome C, Hemoglobin, myoglobin, or marked with bromophenol blue Albumin) are applied to different places on the plate and they serve as reference proteins for the calculation the relative distance (mobility) of the unknown substances. After applying the samples, the plates are Replace in the device and the paper tampon is pushed down slightly to make good contact with the gel layer to ensure. The paper tampon must not drip. Excess moisture is wiped off. That liquid solvent in the reservoir is kept constant at 1 cm from the top of the vessel. The individual rounds are usually according to the progress of the separation Finished in 4 to 7 hours. In the case of colored substances

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die Auftrennung direkt verfolgt werden. Die aufgetrennten Flecken des Proteins werden leicht sichtbar gemacht, indem man sie auf eine Papierblattkopie der TLG-Platte überführt, nachdem die chromatographische Auftrennung vervollständigt worden ist, und indem man sie 48 Stunden auf dem System vorgewaschenes Methanol + ^O + Essigsäure - 90:5:5 anfärbt. Als Papierblatt wird ein 3 mm Filterpapier verwendet. Ein Papierblatt mit den Dimensionen 20 χ 18 cm wird über die Gelschicht gelegt und gerade genügend aufgepreßt (gewalzt), daß ein Kontakt mit dem Gel gewährleistet wird. Es wurde darauf geachtet, daß keine Luft unter dem Papier (der Kopie) e.ingefangen wird und daß die Gelschicht nicht gestört wird. Die flüssige Phase wird von der Gelschicht durch das Papier abgesaugt, und dieses wird nach etwa 1 Minute entfernt, sofort 15 Minuten in einem Ofen bei 60°C getrocknet und in normaler Weise nach beliebigen, routinemäßigen Einfärbungsverfahren eingefärbt. Die Einfärbung erfolgt, indem man das Kopiepapier mit 0,03% diazotierter Sulfanilsäure in 10% Natriumcarbonat (Pauley's Reagens) besprüht wird. Das Einfärben^kann auch mit einer gesättigten Lösung von Amidoschwarz in Methanol-Essigsäure (es werden 90:10 Vol/Vol verwendet) durchgeführt werden. Die^lFärbezeit beträgt 5 bis 10 Minuten. Zum Entfärben wird mit 2 Vol. einer Lösung aus 90:10 Methanol und Essigsäure, gemischt mit 1 Vol. H₉O, gespült. Es ist schwierig, eine . niedrige Hintergrundfärbung zu erhalten, ohne daß sehr ausgedehnt gewaschen wird. Die Platten selbst können auch bei etwa 60°C (in einem Ofen mit Luftzirkulierung) getrocknet werden, doch nur dann, wenn das Astrocytin angefärbt werden soll. Zum Zwecke der Isolierung sollte die Platte nur bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet werden. Ein Überhitzen kann zu einer Rißbildung führen, was aber gewöhnlich bei einer Temperatur von 50 bis 60⁰C vermieden werden kann, bei welcher eine Sephadex G-200-Platte in 15 bis 30 Minuten trocknet. Die trockenen Platten werden 10 Mi-the separation can be followed directly. The separated spots of protein are easily visualized by transferring them to a copy of the paper sheet of the TLG plate after the chromatographic separation has been completed and by placing them methanol + ^ O + acetic acid - 90: 5 pre-washed on the system for 48 hours : 5 colors. A 3 mm filter paper is used as the paper sheet. A sheet of paper measuring 20 18 cm is placed over the gel layer and pressed on (rolled) just enough to ensure contact with the gel. Care was taken to ensure that no air is trapped under the paper (copy) and that the gel layer is not disturbed. The liquid phase is sucked from the gel layer through the paper, and this is removed after about 1 minute, immediately dried for 15 minutes in an oven at 60 ° C. and colored in the normal way using any routine coloring process. The coloring is done by spraying the copy paper with 0.03% diazotized sulfanilic acid in 10% sodium carbonate (Pauley's reagent). The coloring ^ can also be carried out with a saturated solution of amido black in methanol-acetic acid (90:10 vol / vol are used). The ^l dyeing time is from 5 to 10 minutes. To decolorize, it is rinsed with 2 vol. Of a solution of 90:10 methanol and acetic acid mixed with 1 vol. H ₉ O. It's difficult to find one. to obtain low background staining without extensive washing. The plates themselves can also be dried at around 60 ° C (in an oven with air circulation), but only if the astrocytin is to be stained. For insulation purposes, the plate should only be air-dried at room temperature. Overheating can lead to cracking, but this can be avoided usually at a temperature of 50 to 60 ⁰ C, at which a Sephadex G-200 plate dries in 15 to 30 minutes. The dry plates are 10 minutes

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nuten in einem Gemisch aus Methanol + HpO + Essigsäure (75:20:5) quellen gelassen und mit gesättigtem Amidoschwarz in dem gleichen Lösungsmittelsystem 5 Stunden lang angefärbt und sodann gewaschen, indem sie 2 Stunden in dem gleichen Lösungsmittel gebadet werden. Dann werden sie getrocknet. Zur Bestimmung des Molekulargewichts wird der Abstand von der Startlinie bis zum Mittel jeder Zone mit einer Genauigkeit von 0,05 nimm entweder direkt auf dem Druck (Kopie) oder auf dem Densitogramm gemessen. Das Ergebnis wird als R -Wert ausgedrückt, welcher als- Verhältnis der Wanderungsstrecke des getesteten Proteins (d ) zu derjenigen des Cytochroms C oder Myoglobins (d_m), welches als Referenzprotein verwendet wird, definiert. Die Beziehung der Wanderungsstrecke der getesteten Substanz zu dem Standard ergibtutes swelled in a mixture of methanol + HpO + acetic acid (75: 20: 5) and stained with saturated amido black in the same solvent system for 5 hours and then washed by bathing in the same solvent for 2 hours. Then they are dried. To determine the molecular weight, the distance from the start line to the center of each zone is measured with an accuracy of 0.05 either directly on the print (copy) or on the densitogram. The result is expressed as the R value, which is defined as the ratio of the migration distance of the tested protein (d) to that of the cytochrome C or myoglobin (d _m ) which is used as a reference protein. The relationship of the migration distance of the tested substance to the standard gives

die Formel (-R_m = ^p)· Es wird eine Eichgerade erhalten,the formula (-R _m = ^ p) A calibration line is obtained,

wenn man den Logarithmus des Molekulargewichts der verwendeten Standardproben gegen R_m aufträgt. Aus dieser Gerade kann das Molekulargewicht des unbekannten Proteins erhalten werden. Zur Erzielung exaktester* Werte werden gleiche Teile der Proteinprobenlösung mit dem Standard, in diesem Fall Cytochrom C, vor dem Aufbringen auf die Platte vermischt. Durch die obige TLG-Verfahrensweise wird das Produkt Astrocytin als getrennter Flecken bei einem Abstand von ungefähr 0,83+/- 0,02, bezogen auf die Standardsubstanz Cytochrom C, festgestellt, woraus sich ein ungefähres Molekulargewicht von 8000 für das Astrocytin ergibt. Es werden mehrere verschiedene Produkte von dem Astrocytin auf der Grundlage geringer Unterschiede des Molekulargewichts abgetrennt. Somit sind drei Produkte, die als Verunreinigungen bis zu diesem Punkt getragen worden sind, mit einem Molekulargewicht von ungefähr 64 000, 148 000 und 230 000 und gelegentlich ein Produkt mit einem Molekulargewicht von 32 000 festgestellt und durch die oben beschriebenen TLG-Methoden entfernt worden. Das Produkt Astrocytin wird mit dem Gel, in dem es ent-when the logarithm of the molecular weight of the standard samples used is plotted _{against R m.} The molecular weight of the unknown protein can be obtained from this straight line. To achieve the most exact * values, equal parts of the protein sample solution are mixed with the standard, in this case cytochrome C, before application to the plate. By the TLG procedure above, the product astrocytin is found as a separate spot at a distance of about 0.83 +/- 0.02 based on the standard substance cytochrome C, resulting in an approximate molecular weight of 8,000 for the astrocytin. Several different products are separated from the astrocytin on the basis of slight differences in molecular weight. Thus, three products carried as impurities up to this point, having a molecular weight of approximately 64,000, 148,000 and 230,000, and occasionally one product having a molecular weight of 32,000, have been identified and removed by the TLG methods described above . The product astrocytin is combined with the gel in which it is

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halten ist, in trockener Form abgesaugt, in der Lösung (1) aufgelöst und durch Zentrifugierung oder ähnliche Maßnahmen von dem Harz befreit.hold, sucked off in dry form, dissolved in the solution (1) and centrifuged or similar measures freed from the resin.

Das Produkt Astrocytin, das in dieser Stufe erzeugt worden ist, ist in destilliertem Wasser löslich, bei neutralem und saurem pH-Wert löslich und bei alkalischem pH-Wert unlöslich. Es hat bei einer Wellenlänge von 280 m/u einen spektrophotometrischen Absorptionspeak. Es handelt sich um ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 8000, wie oben angegeben. Die Hydrolyse mit 6n HCl gibt die kovalent verbundenen Aminosäuren an. Die quantitative automatische Untersuchung liefert die folgende durchschnittliche Zusammensetzung an Aminosäuren:The product astrocytin produced at this stage is soluble in distilled water, at neutral and acidic pH-value soluble and insoluble at alkaline pH-value. It has a wavelength of 280 m / u spectrophotometric absorption peak. It is a polypeptide with a molecular weight of approximately 8000 as stated above. The hydrolysis with 6N HCl gives the covalently linked amino acids. The quantitative automatic investigation gives the following average Amino acid composition:

Ungefähre Anzahl ■ der ResteApproximate number of ■ remains

Asparaginsäure 9Aspartic acid 9

Threonin 5Threonine 5

Serin 6Serine 6

Glutaminsäure · . , 13Glutamic acid ·. , 13

Prolin 4Proline 4

Glycin 6Glycine 6

Alanin 9Alanine 9

Valin 4Valine 4

1/2 Cystein 21/2 cysteine 2

Methionin 1Methionine 1

Isoleucin 2Isoleucine 2

Leucin 8Leucine 8

Tyrosin 2Tyrosine 2

Phenylalanin 3Phenylalanine 3

Lysin 8Lysine 8

Histidin 2Histidine 2

Arginin 4Arginine 4

ungefähre Gesamtzahl 88approximate total 88

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Cysteinsäure, Hydroxyprolin, Norleucin, Ammoniak, Isodesmosin, De.smosin, Hydroxylysin, Lysinonorleucin und γ-Aminobuttersäure sind alle in erfaßbaren Mengen nicht vorhanden, doch kann eine Spur von Glucosamin vorhanden sein.Cysteic acid, hydroxyproline, norleucine, ammonia, isodesmosine, De.smosine, hydroxylysine, lysinonorleucine and γ-aminobutyric acid are all absent in detectable amounts, but a trace of glucosamine may be present.

Aus 11 g des Ausgangsgehirntumorgewebes des Beispiels 1 werden nach den obigen Methoden ungefähr 3 mg gereinigtes Astrocytin erzeugt.From 11 g of the starting brain tumor tissue of Example 1, approximately 3 mg of purified tissue are purified by the above methods Astrocytin generated.

Beispiel 2AExample 2A

Herstellung des "Taumel- bzw. Schwindel"-RecogninsProduction of the "tumbling or vertigo" Recognin

Die Taumel- bzw. Schwindelkrankheit ist eine genetische Störung, bei der Tiere nicht dazu imstande sind, eine stabile, koordinierte, motorische Aktivität zu erreichen,und bei der aufgrund des· Fehlvermögens bestimmter Nervenzellen,zu einem besonderen Platz in dem Kleinhirn, dem Cerebellum, bei einer besonderen Entwicklungszeit zu wandern, ein Taumel- bzw. Schwindelzustand erzeugt wird. Bei elektronenmikroskopischen Untersuchungen Rind besondere Glialzellen gezeigt worden, welche vertikale, polartige Achsen ergeben, entlang derer die Nervenzellen im ,normalen Zustand zu ihren neuen Stellungen wandern. Das Fehlvermögen der Nervenzellen, diese Glialfasern bei der Taumel- bzw. Schwindelkrankheit zu erklettern, ist vermutlich auf Störungen in den Nervenzellen oder den Glia oder beiden zurückzuführen .Dizziness or dizziness is a genetic disorder in which animals are unable to to achieve a stable, coordinated, motor activity, and due to the · failure of certain Nerve cells, to a special place in the cerebellum, the cerebellum, at a special time of development wander, causing a state of stumbling or dizziness. In the case of electron microscopic examinations, cattle special Glial cells have been shown, which give rise to vertical, polar-like axes along which the nerve cells in, normal State to their new positions. The failure of the nerve cells to use these glial fibers in the wobble resp. Climbing vertigo is believed to be due to disorders in the nerve cells or the glia, or both .

Nach den Methoden der Beispiele 1 und 2 wurde Recognin. aus dem Gehirn einer Maus, die mit der Taumel- bzw. Schwindelkrankheit behaftet war, hergestellt und mit Recognin verglichen, das aus dem Gehirn einer normalen Maus hergestellt worden war. Das Molekulargewicht des Recognins, das aus allen Gegenden des normalen Mäusegehirns hergestellt worden war, betrug 8000. Das Molekulargewicht des Taumel- bzw. Schwindel-Recogninß betrug 3600 bis 5000. Das Taumel- bzw.Following the methods of Examples 1 and 2, Recognin. from the brain of a mouse, which with the tumbling resp. Dizziness was prepared and compared to Recognin obtained from the brain of a normal mouse had been made. The molecular weight of the Recognin, which is produced from all areas of the normal mouse brain was 8000. The molecular weight of the tumbling or vertigo recognition was 3600 to 5000. The tumbling or vertigo recognition was.

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Schwindel-Recognin ist abnormal, wie es durch das erheblich geringere Molekulargewicht angezeigt wird. Weiterhin ist die Recognin-Menge, die aus dem Kleinhirn des Taumel- bzw. Schwindel-Mausgehirns erzeugt wird, im Vergleich zum Normalfall erheblich vermindert. Dies wird in Tabelle I gezeigt.Vertigo Recognin is abnormal as indicated by the significantly lower molecular weight. Furthermore is the amount of Recognin that is generated from the cerebellum of the tumbled or dizzy mouse brain, compared to the normal case considerably reduced. This is shown in Table I.

Tabelle I Recognin-Konzentration im Mäusegehirn, mg/g Table I Recognin concentration in mouse brain, mg / g

Normal Taumel-bzw.Schwindel-Krankheit Normal stumbling or vertigo disease

Kleinhirn (16 Tage alte Maus) 2,50 0,71Cerebellum (16 day old mouse) 2.50 0.71

Rinde (16 Tage alte Maus) 0,60 0,96Bark (16 day old mouse) 0.60 0.96

Rinde (4 Tage alte Maus) 0,29 0,53Bark (4 day old mouse) 0.29 0.53

Hirnstamm (16 Tage alte Maus) 0,90 1,64Brain stem (16 day old mouse) 0.90 1.64

Ganzhirn (17 Tage alte Maus) -1,27 1,53Whole brain (17 day old mouse) -1.27 1.53

Ganzhirn (1 Tag alte Maus) 5,00 5,86Whole brain (1 day old mouse) 5.00 5.86

Die Tabelle I zeigt, daß, obgleich eine ausgeprägte Abnahme der Konzentration von Recognin im Kleinhirn der Taumel- bzw. Schwindel-Maus vorliegt, doch in anderen Gegenden des Gehirns die gleichen' oder größere Mengen von Recogninen sind. Das Recognin kann sich nicht von den anderen Stellen des Gehirns in das Kleinhirn bewegen oder die geringfügige Zunahme in anderen Stellen des Gehirns der Taumelbzw. Schwindel-Maus kann eine gewisse kompensatorisehe Wirkung widerspiegeln.Table I shows that, although there was a marked decrease in the concentration of Recognin in the cerebellum, the Wobbly or vertigo mouse is present, but the same or greater amounts of recognins in other areas of the brain are. The Recognin cannot move from the other parts of the brain into the cerebellum or the minor ones Increase in other parts of the brain of the tumbling or Vertigo mouse can have a certain compensatory effect reflect.

Dieses pathologische Recognin im Gehirn der Taumelbzw. Schwindel-Maus steht mit dem Unvermögen in Beziehung, daß die Hirnzellen wandern, um die Kontakte herzustellen, die erforderlich sind, um eine richtige Placierung zu erhalten, wodurch die Rolle der Recognine beim Erkennen und Erlernen in den Zellen bestätigt wird.This pathological Recognin in the brain of the tumbling or Vertigo Mouse is related to the inability to that the brain cells migrate to make the contacts necessary to obtain proper placement, whereby the role of the Recognine in recognition and learning in the cells is confirmed.

Analog können die Anti-Recognine gegenüber dem vom Gehirn von Taumel- bzw. Schwindel-Mäusen erzeugten RecogninAnalogously, the anti-recognins can be compared to the recognins generated by the brain of tumbling or dizzy mice

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hergestellt werden und in ähnlicher Weise wie das oben beschriebene Anti-Astrocytin und Anti-Malignin verwendet werden. and in a manner similar to that described above Anti-astrocytin and anti-malignin can be used.

Beispiel 3Example 3

Herstellung des Malignin-Vorläufers in Kulturen von künstlichen Krebszellen.Production of the malignin precursor in cultures of artificial Cancer cells.

Dabei wird sorgfältig darauf geachtet, daß eine sterile Arbeitsweise angewendet wird. _r Care is taken to ensure that a sterile working method is used. _r

Alle Lösungen (z.B. Hank's Ausgleichssalz = Hank's Balanced Salt (BSS), F-10 Nährmedium, Serum von Kalbföten, Trypsinlösung) werden bei etwa 35⁰C in einem Wasserbad ungefähr 20 Minuten oder länger vor der Verwendung inkubiert.All solutions (such as Hank's balance salt = Hank's Balanced Salt (BSS), F-10 nutrient medium, serum of fetal calf, trypsin) are incubated at about 35 ⁰ C in a water bath about 20 minutes or longer before use.

'Zellen werden von dem Tumorgewebe entfernt und in vitro über viele Generationen gezüchtet, wozu ein geeignetes Medium verwendet wird, wie es unten beschrieben wird. Die zu verwendenden Kolben werden mit einer Sterilisierungslösung, z.B. 12-Proponal plus Amphyl oder Creolinlösung, vorgespült.'Cells are removed from the tumor tissue and placed in grown in vitro for many generations using an appropriate medium as described below. the Flasks to be used are filled with a sterilizing solution, e.g. 12-proponal plus amphyl or creolin solution, pre-rinsed.

Bei der .bevorzugten Ausführungsform werden die künstlichen Krebszellen (d.h. Zellen, die in vitro über viele Generationen gewachsen sind) in 250 ml-Kolben wachsen gelassen. Das flüssige Medium, in dem die Zellen gezüchtet werden, wird in vorgespülte Bechergläser eingetragen. Die Zellen werden sodann mäßig mit 5 bis 10 ml einer Hank'sehen Ausgleichlösung BSS oder einer ähnlichen, anderen Lösung etwa 30 Sekunden lang gewaschen. Rühren ist zu vermeiden. Alle Wände und Oberflächen werden gewaschen. Die Lösung wird von Zellen durch Zentrifugierung in der Kälte über einen Zeitraum von 10 Minuten bei 3000 U/min geklärt. Das Medium wird in ein Becherglas wie oben gegossen. Es wird eine geringe Menge gepufferter Proteinase-Enzymlösung zugesetzt undIn the preferred embodiment, the artificial Cancer cells (i.e. cells that have grown for many generations in vitro) are grown in 250 ml flasks. The liquid medium in which the cells are grown is introduced into pre-rinsed beakers. the Cells are then seen moderately with 5 to 10 ml of a Hanks' Equalization solution BSS or a similar, other solution for about 30 seconds. Avoid stirring. All walls and surfaces are washed. The solution is removed from cells by centrifugation in the cold over a Clarified period of 10 minutes at 3000 rpm. The medium is poured into a beaker as above. It will be a minor one Amount of buffered proteinase enzyme solution added and

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es wird rasch gespült, um einen Abbau der Zellen zu vermeiden. Bei der bevorzugten Methode vrerden 1 bis 2 ml Trypsinlösung (EDTA) zugesetzt und es wird nur 10 Sekunden lang gespült. Die Trypsinlösung wird abgegossen.it is flushed quickly to avoid degradation of the cells. The preferred method takes 1 to 2 ml Trypsin solution (EDTA) is added and it is only rinsed for 10 seconds. The trypsin solution is poured off.

Es wird ein ähnliches Volumen einer frischen Trypsinlösung zugesetzt und es wird inkubiert, bis durch mikroskopische Beobachtungen ersichtlich wird, daß sich die Zellen von den Wänden der Kammer abtrennen. Dies erfordert gewöhnlich 5 bis 10 Minuten. Es wird ein geeignetes Wachstumsmedium, z.B. 50 ml einer Lösung einer 7- bis 1Obigen Lösung von Serum von Kalbföten in 100 ml F-10-Nährmedium, zugesetzt.A similar volume of fresh trypsin solution is added and incubated until done microscopic observation shows that the cells are separating from the walls of the chamber. This requires usually 5 to 10 minutes. A suitable growth medium, e.g. 50 ml of a solution of a 7 bis 1 Above solution of serum from calves in 100 ml F-10 culture medium, added.

25 ml des frischen Mediums mit den Zellen werden in eine neue Wachstumskammer für die Fortpflanzung überführt. Beide Kammern werden ungefähr 7 Tage lang in einen Inkubator von 35⁰C gegeben. Nach der Arbeitsweise dieses Beispiels bis zu diesem Punkt wird eine Kultur der künstlichen Krebszellen in zwei frische Kulturen ungefähr alle 7 Tage aufgeteilt. Diese gesamte Verfahrensweise kann so oft wie gewünscht in ungefähr 7tägigen Intervallen für jede Wachstumskammer wiederholt werden. Somit kann die Anzahl der in vitro wachsenden Zellen ungefähr alle 7 Tage verdoppelt werden.25 ml of the fresh medium with the cells is transferred to a new growth chamber for reproduction. Both chambers are placed in an incubator at 35 ^° C. for approximately 7 days. Following the procedure of this example up to this point, a culture of the artificial cancer cells is divided into two fresh cultures approximately every 7 days. This entire procedure can be repeated as many times as desired at approximately 7 day intervals for each growth chamber. Thus, the number of cells growing in vitro can be doubled approximately every 7 days.

Die Zellen können zur Erzeugung von Malignin ungefähr nach 7 Tagen des Wachstums extrahiert werden. So können z.B. folgendermaßen Zellen, die in den einzelnen 250 ml-Wachstumskammern gezüchtet werden, gewonnen werden.The cells can be extracted to produce malignin after approximately 7 days of growth. So can e.g. cells residing in each 250 ml growth chamber as follows be bred, be won.

Das Medium wird in ein Zentrifugenrohr überführt und in der Kälte 10 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert. Das Medium wird verworfen. Die in der Wachstumskammer zurückbleibenden Zellen werden von den Kammerwänden abgekratzt und mit einer neutralen Pufferlösung in die Zentri-The medium is transferred to a centrifuge tube and centrifuged in the cold for 10 minutes at 3000 rpm. The medium is discarded. The cells remaining in the growth chamber are scraped off the chamber walls and with a neutral buffer solution in the centrifugal

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fugenrohre hineingewaschen. Die Zellen werden zweimal mit einer neutralen Pufferlösung gewaschen, erneut in der Kälte bei.3000 U/min zentrifugiert und das Medium wird verworfen. Die gewaschenen Zellen werden in 10 ml neutralem Phosphatpuffer suspendiert, bis sie für die Extraktion der Fraktion, die den rohen Malignin-Vorläufer enthält, bereit sind.joint pipes washed into it. The cells are washed twice with a neutral buffer solution, again in the cold centrifuged at 3000 rpm and the medium is discarded. The washed cells are in 10 ml neutral phosphate buffer suspended until ready for extraction of the fraction containing the crude malignin precursor.

Beispiel 4Example 4

Herstellung der Rohfraktion, die den Malignin-Vorläufer enthält.Production of the crude fraction containing the malignin precursor.

Gewaschene Zellen, suspendiert in dem neutralen Puffer des Beispiels 3, werden mechanisch bei Bedingungen zerbrochen, bei denen eine Denaturierung der meisten Proteine vermieden wird. Bei der bevorzugten Methode werden die gewaschenen Zellen in der. Kälte 20 Sekunden lang mit einer Schallvorrichtung behandelt. ^Washed cells suspended in the neutral buffer of Example 3 become mechanically under conditions broken, avoiding denaturation of most proteins. Be the preferred method the washed cells in the. Cold treated with a sonic device for 20 seconds. ^

Nach der Beschallung werden die Zellreste 30 Minuten bei 30 000 U/min zentrifugiert und das überstehende Produkt wird dekantiert. 10 ml aliquote Teile der Pufferlösung werden zum Waschen der zurückgebliebenen Zellreste verwendet. Es wird, wie oben beschrieben, beschallt und zentrifugiert, und die überstehenden Produkte werden kombiniert. Dieses Verfahren wird ein Mal wiederholt.After sonication, the cell debris is centrifuged for 30 minutes at 30,000 rpm and the supernatant product is decanted. 10 ml aliquots of the buffer solution are used to wash the remaining cell debris. Sonicate and centrifuge as described above and combine the supernatants. This procedure is repeated once.

Das kombinierte überstehende Produkt wird vorverdampft, um das Volumen von ungefähr 30 ml auf etwa 6 bis 7 ml zu vermindern. Ein aliquoter Teil wird zur Gesamtprotein-Analyse abgenommen und der Rest wird entsprechend den Methoden des Beispiels 1 zur Herstellung des Astrocytin-Vorläufers fraktioniert.The combined supernatant is pre-evaporated to bring the volume from about 30 ml to about 6 to 7 ml to decrease. An aliquot is taken for total protein analysis and the remainder is made accordingly the methods of Example 1 for the preparation of the astrocytin precursor fractionated.

Beispiel 5Example 5

Herstellung des gereinigten Malignin-Produktes von der Rohfraktion, die das Malignin enthält.Production of the purified malignin product from the crude fraction, which contains the malignin.

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- Dc. -- Dc. -

Das Produkt Malignin wird nach den Methoden des Beispiels 2 zur Herstellung von Astrocytin von Verunreinigungen weiter isoliert·The product malignin is made by the methods of Example 2 for the production of astrocytin from impurities further isolated

Bei der TLG-Stufe der bevorzugten Ausführungsform wird das Produkt Malignin als ausgeprägter Flecken in einem Abstand von ungefähr 0,91 +/- 0,02, bezogen auf den Standard Cytochrom C, beobachtet, was ein ungefähres Molekulargewicht von 10 000 für das Malignin ergibt.At the TLG stage of the preferred embodiment the product malignin appears as a pronounced stain at a distance of approximately 0.91 +/- 0.02, based on the standard Cytochrome C, observed giving an approximate molecular weight of 10,000 for the malignin.

Das in dieser Stufe hergestellte Malignin ist in destilliertem Wasser löslich, bei neutralem oder saurem pH-Wert löslich und bei alkalischem pH-Wert unlöslich. Es hat einen spektrophotometrisehen Absorptionspeak von 280 m Ai. Es handelte sich um ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10 000.The malignin produced in this stage is soluble in distilled water, soluble at neutral or acidic pH, and insoluble at alkaline pH. It has a spectrophotometric absorption peak of 280 m Ai. It was a polypeptide with a molecular weight of approximately 10,000.

In Tabelle II sind die Molekulargewichte von Malignin, bestimmt durch die Dünnschichtgelchromatographie, dargestellt. Das Malignin wa;r in stabilisierten Fermentationskulturen in aufeinanderfolgenden Generationen der Kulturen erzeugt worden. Die Reproduzierbarkeit der Molekulargewichtsbestimmungen ist angesichts der inhärenten Beschränkungen der TLG-Chromatographie beachtlich.In Table II are the molecular weights of malignin determined by thin layer gel chromatography, shown. The malignin was in stabilized fermentation cultures generated in successive generations of cultures. The reproducibility of the molecular weight determinations is noteworthy in view of the inherent limitations of TLG chromatography.

. Mol.Gew.. Mole weight TabelleTabel IIII Mol.Gew.Mole weight gebildeteneducated Mol.Mole. Molekulargewichts desMolecular weight of the Gew.Weight Reproduzierbarkeit desReproducibility of the 95009500 10 10010 100 Versuch Nr.Attempt no. 10 18010 180 MaligninsMalignins 89008900 Versuch Nr.Attempt no. 10 18010 180 10 19010 190 Versuch Nr,Attempt no, 1000010,000 10 18010 180 1717th 10 19010 190 1005010050 99 10 18010 180 1818th 10 18010 180 11 1010010100 1010 10 18010 180 1919th 10 00010,000 22 1000010,000 1111 10 05010 050 2020th 9 5009 500 33 1015010150 1212th 10 18010 180 2121 10 18010 180 44th 12 50012 500 1313th 10 19010 190 2222nd 55 1414th 2323 66th 1515th 77th 1616 88th

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Die Hydrolyse mit 6n HCl zeigt die kovalent verbundenen Aminosäuren des Malignins. Die quantitative Analyse ergibt die folgende durchschnittliche Zusammensetzung an Aminosäuren:The hydrolysis with 6N HCl reveals the covalently linked Amino acids of malignin. The quantitative analysis gives the following average composition of amino acids:

Ungefähre Anzahl der Reste Approximate number of remains

Asparaginsäure 9Aspartic acid 9

Threonin 5Threonine 5

Serin 5Serine 5

Glutaminsäure 13Glutamic acid 13

Prolin 4Proline 4

Glycin 6Glycine 6

Alanin 9Alanine 9

Valin 6Valine 6

1/2 Cystein 11/2 cysteine 1

Methionin 2Methionine 2

Isoleucin 4Isoleucine 4

Leucin 8Leucine 8

Tyrosin 3 'Tyrosine 3 '

Phenylalanin 3Phenylalanine 3

Lysin ■ ' 6Lysine 6

Histidin 2Histidine 2

Arginin 5 . 'Arginine 5. '

ungefähre Gesamtzahl 89approximate total number 89

Die Aminosäuren Cysteinsäure, Hydroxyprolin, Norleucin, Ammoniak, Isodesmosin, Desmosin, Hydroxylysin, Lysinonorleucin und γ-Aminobuttersäure sind in erfaßbaren Mengen nicht vorhanden.The amino acids cysteic acid, hydroxyproline, norleucine, Ammonia, isodesmosine, desmosine, hydroxylysine, lysinonorleucine and γ-aminobutyric acid are detectable Quantities not available.

■Eine typische Ausbeute an reinem Malignin aus zwölf 250 ml-Reaktionskammern des Beispiels 3 insgesamt ist ungefähr 1 mg Malignin.■ A typical yield of pure malignin from twelve 250 ml reaction chambers of Example 3 in total is approximately 1 mg of malignin.

Die einzigartigen Strukturen von Malignin und Astrocytin wurden durch ausgedehnte Computeruntersuchungen bestä-The unique structures of malignin and astrocytin have been confirmed by extensive computer tests

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tigt, wobei ihre Zusammensetzungen mit praktisch allen bekannten Proteinsubstanzen verglichen wurden.where their compositions were compared with practically all known protein substances.

Die Aminosäure-Zusammensetzung von Malignin und Astrocytin, die absoluten und relativen Mengen von jeder Aminosäure-Komponente, ausgedrückt als Gesamtzahl der Aminosäurereste/Mol,und die absoluten und relativen Mengen jeder Aminosäure-Komponente, ausgedrückt als Molekulargewicht des Moleküls, wurden einer Matrizen-Computeranalyse gegen die größte bekannte Aufzählung von Proteinstrukturen in der Welt, nämlich der National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C, unterworfen. Beim Matrizen-Analysevergleich mit mehreren hunderttausend Proteinen und Proteinfragmenten wurde keine Struktur ermittelt, die mit derjenigen von Astrocytin oder Malignin identisch war oder ihr sehr nahekam.The amino acid composition of malignin and astrocytin, the absolute and relative amounts of each Amino acid component, expressed as the total number of amino acid residues / mole, and the absolute and relative amounts of each amino acid component, in terms of the molecular weight of the molecule, were template computer analysis against the largest known enumeration of protein structures in the world, namely National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. When comparing the matrix analysis with hundreds of thousands of proteins and protein fragments, no structure has been determined that was identical to or very close to that of astrocytin or malignin.

Die einzigen Proteine, die in irgendeiner Weise strukturell verwandt waren, sind in Tabelle III zum Vergleich zusammen mit ihren einzelnen Aminosäure-Zusammensetzungen und Molekulargewichten zusammengestellt. Der Computer war so programmiert, daß er aus mehreren hunderttausend Möglichkeiten jeden beliebigen Grad der Strukturähnlichkeit identifizierte. So passen z.B. Proteine mit einem Molekulargewicht, das erheblich größer oder kleiner ist, bei der Computeranalyse nicht. Auch solche Proteine mit weniger als 85 oder mehr als 95 Resten, noch solche mit weniger als 12 oder mehr als 15 Glutaminsäureresten noch solche mit weniger als 6 oder mehr als 11 Asparaginsäureresten usw. für jede der betreffenden zwanzig Aminosäuren ergeben bei der Computeranalyse keine Passung.The only proteins that were structurally related in any way are in Table III for comparison compiled along with their individual amino acid compositions and molecular weights. The computer was programmed in such a way that he could select any degree of structural similarity from several hundred thousand possibilities identified. For example, proteins with a molecular weight that is considerably larger or smaller fit into the Computer analysis does not. Also proteins with fewer than 85 or more than 95 residues, nor those with less than 12 or more than 15 glutamic acid residues nor those with less than 6 or more than 11 aspartic acid residues, etc. for each of the twenty amino acids in question there is no match on computer analysis.

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Tabelle IIITable III

Vergleich dercomparison of Strukturen von AstrocytinAstrocytin structures MaligninMalignin Cyto-Cyto- 99 . und Malignin. and malignin mit. den nächstkommenden Strukturen durchwith. the closest structures AIf.AIf. AcylträgerAcyl carrier RinderBovine Schweine- GonadotropinPorcine gonadotropin freisetzenrelease ΓΌΓΌ chromchrome 66th eine Computeranalvse'a computer analysis' E. coliE. coli neuro -neuro - neuro-neuro- des Hormonof the hormone CDCD . Astro. Astro ^b5 ^b 5 55 Ferredoxin 'Ferredoxin ' 88th physinphysine physinphysine 00 OlOil cytincytine 99 1414th Luc.Luc. 66th 77th 22 33 00 cncn • 5• 5 33 Gl.Eq. 88th 66th 22 22 11 AsparaginsäureAspartic acid 99 VJIVJI 66th 1010 1313th 33 66th 77th 00 ThreoninThreonine VJlVJl 1313th 44th 44th 33 1414th 99 99 11 SerinSerine 66th 44th 44th 77th 77th 11 88th 77th 22 GlutaminsäureGlutamic acid 1313th 66th 00 1313th 99 44th 1616 1414th 00 ProlinProline 44th 77th 11 vjivji 99 77th 66th 77th 00 σ, Glycinσ, glycine 66th 66th 44th 77th VJlVJl 77th 44th 22 00 ο Alaninο alanine • 9• 9 11 77th 66th 00 00 1414th 1414th 00 co Valinco valine 44th 22 33 66th 44th 11 11 11 0 ι0 ι oo 1/2 Cysteinoo 1/2 cysteine 22 44th 33 VJlVJl 66th ■7■ 7 22 22 1 VJj1 previous year ^ω Methionin ^ω methionine 11 88th 77th 0 ·0 · 44th VJlVJl 66th 77th 1 öl1 oil ^] Isoleucin^] Isoleucine 22 33 77th 4 _N 4 _N CvJCvJ 11 11 11 0 ,0, _* Leucin_ * Leucine 88th 33 33 1010 55 22 33 33 00 ο Tyrosinο tyrosine 22 66th 00 VjJPrevious year 22 44th 22 22 11 -j Phenylalanin-j phenylalanine 33 22 11 33 11 11 00 00 11 ο Lysinο lysine 88th 55 JDJD 55 11 11 77th VJlVJl 00 HistidinHistidine 22 OO 11 11 22 33 22 11 ArgininArginine 44th OO 8787 22 00 0'0 ' 00 J)J) AsparaginAsparagine OO JSJS 035 10035 10 00 -it-it 55 JfJf TryptophanTryptophan OO 11 9797 1010 GlutaminGlutamine OO 8989 JtJt 85098509 7777 9797 9292 Gesamtzahl derTotal number of 10 000 1010,000 10 ResteLeftovers 8888 9696 Molekulargew.Molecular weight 80008000 493493

Bei dieser "Fingerabdruckanalyse" müssen somit 22 einzelne Variablen passen bzw. übereinstimmen. Es zeigt sich, daß zwar einige Substanzen hinsichtlich eines, vier oder fünf Variabler passen, daß aber keine hinsichtlich aller 22 Variablen passen bzw. übereinstimmen. Tatsächlich findet keine bessere Übereinstimmung als mit 14 Variablen statt, wobei somit Unterschiede an 8 Variablen zurückbleiben. 'In this "fingerprint analysis", 22 individual variables must match or agree. It shows that some substances fit with respect to one, four or five variables, but none with respect to of all 22 variables match or match. In fact, it doesn't match better than 14 variables instead, whereby differences in 8 variables remain. '

Die nächstkommende Substanz ist daher Cy to chrom b,-(vom Menschen). Wie aus Tabelle III ersichtlich wird, unterscheiden sich die Alanin-, Arginin-, Asparagin-, Asparaginsäure-, Cystein-, Glutamin-, Histidin-, Methionin-, Tyrosin- und Tryptophan-Restzahlen alle erheblich bis ausgeprägt von denjenigen des Astrocytins und Malignins. Da Cytochrom b,- 7 Histidinreste enthält, während Astrocytin und Malignin nur 2 Reste enthalten, können sie nicht die gleiche chemische Struktur haben.The closest substance is therefore Cy to chrom b, - (from People). As can be seen from Table III, the alanine, arginine, aspartic, aspartic acid, Cysteine, glutamine, histidine, methionine, tyrosine and tryptophan residual numbers are all considerable to pronounced of those of astrocytin and malignin. Since cytochrome b, - contains 7 histidine residues, while astrocytin and malignin contain only 2 residues, they cannot have the same chemical structure.

Die unerwartetste Feststellung hinsichtlich der Zusammensetzung des Astrocytins und Malignins ist die hohe Konzentration an Glutaminsäure. Man würde erwarten, unter 89 nur 5 oder 6 solche Reste zu finden.The most unexpected finding regarding the composition of astrocytin and malignin is the high one Concentration of glutamic acid. One would expect to find only 5 or 6 such residues under 89.

Weitere, nächstkommende Substanzen sind die Ferrodoxine von Leucaene glauca und von alfalfa. Diese Substanzen unterscheiden sich jedoch ausgeprägt hinsichtlich vier bzw. sechs Aminosäuren und nennenswert hinsichtlich zwei anderer und schließlich dadurch, daß sie 96 bzw. 97 Reste besitzen. Die am nächsten kommende Substanz ist das Acylträgerprotein von E. coli 26, doch unterscheidet sich diese Substanz ausgeprägt hinsichtlich elf Aminosäuren vom Malignin und Astrocytin und sie hat nur 77 Reste.Further, closest substances are the ferrodoxins from Leucaene glauca and from alfalfa. These substances however, differ markedly with regard to four or six amino acids and notably with regard to two others and finally by having 96 and 97 residues, respectively. The closest substance is that E. coli acyl carrier protein 26, but differs this substance is pronounced in terms of eleven amino acids from malignin and astrocytin and it has only 77 residues.

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In Tabelle III sind schließlich noch weitere Gehirnproteine (Neurophysin, vom Rind und vom Schwein, sowie das Gonadotropin freisetzende Hormon) zusammengestellt, um zu zeigen, wieviel schlechter die Übereinstimmung in der Computergedächtnisbank für die restlichen mehreren hunderttausend Proteinfragmente war.Finally, in Table III there are other brain proteins (neurophysin, from bovine and porcine, as well as the gonadotropin releasing hormone) compiled to show how much worse the match in the Computer memory bank for the remaining hundreds of thousands of protein fragments.

Atmungsproteine können Metalle und/oder Hämkomponenten in ihrem in situ-Zustand enthalten, doch enthält das isolierte Proteinfragment, z.B. für Apocytochrom bj-, keines, davon. Eine weitere Mikroanalyse von Astrocytin und Malignin hat gezeigt, daß diese Substanzen von Eisen, Schwefel, Phosphor und Magnesium frei sind (d.h. sie liegen in geringeren Mengen als 0,01% vor), und die Spektraleigenschaften zeigen eine typische Absorption bei 280 m/U. Nach Wiederkombination von Häm mit Apoprotein werden die typischen Absorptionsspektren zwischen 400 und 450 m/u wiederhergestellt.Respiratory proteins may contain metals and / or heme components in their in situ state, but that does contain isolated protein fragment, e.g. for apocytochrome bj-, none, of that. Another microanalysis of astrocytin and malignin has shown that these substances are free of iron, sulfur, phosphorus and magnesium (i.e. they are in lesser amounts Amounts than 0.01% above), and show the spectral properties a typical absorption at 280 m / rev. After recombination of heme with apoprotein, the typical absorption spectra become restored between 400 and 450 m / u.

Trotz der strukturellen Einzigartigkeit von Astrocytin und Malignin gegenüber^ allen anderen Proteinen und Proteinfragmenten ist es erwähnenswert und möglicherweise von großer Wichtigkeit, daß die engsten Strukturen diejenigen der Atmungsproteine sind. Es ist bekannt, daß viele" wichtige Beziehungen sowohl vom entwicklungsgenetischen Gesichtspunkt als auch vom funktioneilen Gesichtspunkt hinsichtlich des Typs der repräsentierten Struktur gezogen werden können. Wenn Astrocytin und Malignin neue Proteinprodukte sind, deren in situ-Strukturäquivalente respiratorische bzw. Atmungsfunktionen darstellen, und wenn diese Proteine, wie nun gezeigt wird, eine Beziehung zur Malignität haben, dann ist eine Möglichkeit aufgefunden worden, um eines der größten Rätsel des Krebses zu lösen - d.h. wie die energetischen Verhältnisse sind, denen bei diesen unersättlichen, rasch reproduzierenden malignen Zellen genüge getan wird.Despite the structural uniqueness of astrocytin and malignin compared to ^ all other proteins and Protein fragments it is worth noting and possibly of great importance that the closest structures are those of respiratory proteins are. It is known that many "important relationships both from the developmental genetic Point of view as well as from the functional point of view with regard to the type of structure represented can be. If astrocytin and malignin are new protein products, their in situ structural equivalents are respiratory or respiratory functions, and if these proteins, as will now be shown, a relationship to malignancy then a way has been found to solve one of Cancer's greatest mysteries - i.e., how the energetic conditions are, which with these insatiable, rapidly reproducing malignant cells is sufficient.

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Abgesehen von der theoretischen Wichtigkeit dieser Entdeckung ergänzen sich die obigen Werte hinsichtlich der
Zunahme der Prozentmenge des Malignins in stärker malignen Zellen mit den unten angegebenen Werten, welche anzeigen,
daß Anti-Malignin nicht nur an maligninartigen chemischen
Gruppierungen der Krebszelle haftet, sondern daß diese angehaftete Produkt gegenüber den Zellen cytotoxisch ist.
Wenn die maligninartigen in situ-Verbindungen in den Krebszellen Atmungsproteine sind, weil sich die erfindungsgemäßen Anti-Maligninprodukte bevorzugt an diese in situ-Verbindungen anheften, dann ist es, wenn funktioneile respiratorische Gruppen bei dieser Anheftung eine Rolle spielen,
leicht zu verstehen, wie dies zum Absterben der Krebszellen führt.Apart from the theoretical importance of this discovery, the above values are complementary with regard to the
Increase in the percentage of malignin in more malignant cells with the values given below, which indicate
that anti-malignin is not just related to malignant-like chemical
Clusters of the cancer cell adheres, but that this adhered product is cytotoxic to the cells.
If the malignant in situ compounds in the cancer cells are respiratory proteins, because the anti-malignant products according to the invention preferentially attach to these in situ compounds, then it is when functional respiratory groups play a role in this attachment
easy to understand how this leads to the death of cancer cells.

Die therapeutischen Möglichkeiten für die Anti-Malignine und andere ähnliche chemische Gegenstücke werden
durch diese Strukturinformation über Malignin und Astrocytin sowie durch die gezeigte Beziehung zwischen der Malignin-Menge und dem Malignitätsgrad stark erhöht.The therapeutic options for the anti-malignins and other similar chemical counterparts will be
by this structural information about malignin and astrocytin as well as by the shown relationship between the amount of malignin and the degree of malignancy.

Beispiel 5AExample 5A

Dieses Beispiel zeigt, daß eine erhöhte Ausbeute und erhöhter Malignitätsgrad sowie erhöhter Malignin-Anteil erhalten werden können, wenn man während der Fermentation ein größeres Volumen und eine größere Oberfläche vorsieht.This example shows that an increased yield and an increased degree of malignancy as well as an increased proportion of malignin are obtained if one provides a larger volume and a larger surface area during the fermentation.

Die Beispiele 3 bis 5 wurden wiederholt, wobei anstelle der 250 ccm-Kolben 1000 ccm-Kolben verwendet wurden. Alle Reagensmengen wurden dreifach erhöht ..Examples 3 to 5 were repeated using 1000 cc flasks instead of the 250 cc flasks. All reagent levels have been increased three-fold.

Die Ausbeute des Produkts Malignin nach einem 7tägigen Wachstum des Inokulums war fast zweifach gesteigert,
indem der für das Wachstum der malignen Zellen verfügbare
Raum von 250 ecm auf 1000 ecm erhöht wurde. Die Tabelle IV
zeigt die Ausbeute an Gesamtprotein in mg und das gebildeteThe yield of the product malignin after a 7 day growth of the inoculum was increased almost twice,
by the one available for the growth of the malignant cells
Space has been increased from 250 ecm to 1000 ecm. Table IV
shows the total protein yield in mg and that formed

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Malignin als Prozentsatz des Gesamtproteins bei aufeinanderfolgenden Generationen von Fermentationskulturen in den Kolben jeder Größe. Unter Verwendung von 250 ccm-Kolben war das durchschnittlich erzeugte Gesamtprotein 17,5 mg. Unter Verwendung von 1000 ccm-Kolben war das durchschnittlich erzeugte Gesamtprotein 40,4 mg.Malignin as a percentage of total protein in consecutive Generations of fermentation cultures in flasks of all sizes. Using a 250 cc flask was the average total protein produced 17.5 mg. Using 1000 cc pistons this was the average produced Total protein 40.4 mg.

Überraschenderweise wurde,als das Ausmaß des Wachstums der-malignen Zellen (Malignitätsgrad) über eine 7tägige Wachstumsperiode durch Zurverfügungstellung eines größeren Raums und einer größeren Oberfläche für das Zellwachstum erhöht wurde, die Gesamtmenge an gebildetem Malignin, ausgedrückt als Prozentsatz des gesamten Proteins, signifikant erhöht. Der Prozentsatz von Gesamtprotein,der aus Malignin besteht, wurde von einem Mittelwert von 10,7% bei Verwendung von 250 ccm-Kolben auf einen■Mittelwert von 28,3% bei Verwendung von 1000 ccm-Kolben bei einer konstanten Wachstumsperiode von 7 Tagen erhöht. Surprisingly, than the extent of growth of the malignant cells (degree of malignancy) over a 7-day growth period by making a larger one available Space and a larger surface for cell growth was increased, the total amount of malignin formed, expressed as a percentage of total protein, increased significantly. The percentage of total protein that is made up of malignin consists of a mean value of 10.7% when using 250 cc pistons to a mean value of 28.3% when using increased from 1000 cc flasks with a constant growth period of 7 days.

Die Beziehung zwischen dem Verhältnis des gebildeten Malignins und dem Malignitätsgrad (d.h. als Funktion des Ausmaßes des malignen Zellwachstums in vitro über_t7 Tage, gemessen als gebildetes Gesamtprotein) wird in der Figur dargestellt.The relationship between the ratio of malignin formed and the degree of malignancy (ie as a function of the extent of malignant cell growth in vitro over _t 7 days, measured as total protein formed) is shown in the figure.

MaligninMalignin GesamtproteinTotal protein MaligninMalignin mgmg mgmg % Malignin% Malignin Tabelle IVTable IV 0,330.33 6,46.4 0,160.16 6,76.7 5,15.1 Verbesserte Ausbeuten bei aufeinanderfolgenden GenerationenImproved yields for successive generations 0,210.21 8,98.9 2,42.4 von Fermentationsproduktionskulturen vonof fermentation production cultures of 1,31.3 26,326.3 2,42.4 KolbengrößePiston size 1,41.4 21,621.6 4,84.8 ecmecm 6,46.4 250250 250 .250. 250250 250250 250250

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Tabelle IVTable IV (Fortsetzung)(Continuation) mgmg % Malignin% Malignin KolbengrößePiston size 17,917.9 •• ecmecm Malignin GesamtproteinTotal Malignin Protein 16,416.4 14,414.4 250250 mgmg 13,413.4 10,710.7 250250 2,62.6 17,817.8 9,8 ,9.8, 250250 1,81.8 18,918.9 11,311.3 250250 1,31.3 19,419.4 12,012.0 250250 2,02.0 13,813.8 10,810.8 250250 2,32.3 15,115.1 11,611.6 250250 2,12.1 21,621.6 14,614.6 250250 1,61.6 14,014.0 20,420.4 250250 2,22.2 23,023.0 23,223.2 250250 4,44.4 23,223.2 9,79.7 250250 3,33.3 22,322.3 9,09.0 250250 2,22.2 18,918.9 12,512.5 250250 2,12.1 24,524.5 12,712.7 250250 2,82.8 17,5 mg17.5 mg 9,89.8 250250 2,42.4 41,341.3 10,7%10.7% 2,42.4 25,425.4 23,623.6 10001000 MittelwertAverage 24,924.9 28,428.4 10001000 9,89.8 37,537.5 ^l23,6 . ^l 23.6. 10001000 7,27.2 44,844.8 31,231.2 10001000 5,95.9 56,556.5 29,829.8 10001000 11,711.7 41,341.3 29,429.4 10001000 13,313.3 38,838.8 22,922.9 10001000 16,516.5 41,641.6 27,527.5 10001000 9,59.5 46,746.7 29,929.9 10001000 10,710.7 45,245.2 29,429.4 10001000 12,512.5 40,4 mg40.4 mg 25,725.7 10001000 13,313.3 28,3%28.3% 11,611.6 MittelwertAverage

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Das Beispiel 5A zeigt, daß das Wachstum von künstlichen Krebszellkulturen in großdimensionierten Wachstumsbehältern überraschenderweise eine erhöhte Verhältnismenge des erzeugten Malignins bewirkt, d.h. eine Zunahme der Prozentmenge des gebildeten Gesamtproteins, die aus Malignin besteht. Hierin soll unter einem "großdimensionierten Wachstumsbehälter" ein solcher verstanden werden, bei dem das Verhältnis von Behältervolumen zu dem Volumen des Gesamtmediums mit den gemäß den Methoden des Beispiels 3 verwendeten Zellen größer als etwa 8:1, z.B. 7:1 bis 10:1, ist. Das Beispiel 5A beschreibt ein Verhältnis von etwa 8:1.Example 5A shows that the growth of artificial cancer cell cultures in large-sized growth containers surprisingly an increased proportion of the generated malignin, i.e. an increase in the percentage of the total protein formed, which consists of malignin. Here, under a "large-scale growth container" one such can be understood in which the ratio of container volume to the volume of the total medium with cells used according to the methods of Example 3 is greater than about 8: 1, e.g., 7: 1 to 10: 1. Example 5A describes a ratio of about 8: 1.

Beispiel 6Example 6

Herstellung von Target-Reagentien aus Recogninen.Production of target reagents from recognins.

Astrocytin, hergestellt wie in Beispiel 2 oben, oder Malignin, hergestellt wie in Beispiel 5 oben, wird mit einem Träger unter Bildung eines Target-Reagens in einen Komplex überführt.Astrocytin, made as in Example 2 above, or Malignin, made as in Example 5 above complexed with a carrier to form a target reagent.

Bei der bevorzugter! Ausführungsform wird Astrocytin oder Malignin in einem 0,15 M NaHrjPO^-Citratpuffer mit einem pH-Wert von 4,0 aufgelöst. Ein Bromacetylharz, z.B. Bromacetylcellulose (BAC), mit 1,0 bis 1,5 mÄquiv. Brom/g Cellulose, gelagert in der Kälte, wird in 0,15 M NaH₂PO^-PUffer mit einem pH-Wert von 7,2 vorbereitet. Der Puffer wird auf einen pH-Wert von 4 eingestellt, indem die Pufferlösung mit dem pH-Wert von 7,2 abgegossen und indem 0,15 M NaH₂PO,-Citratpuffer mit einem pH-Wert von 4,0 zugefügt wird. Die Astrocytin- oder Malignin-Lösung und die BAC-Lösung werden miteinander (Verhältnis BAC zu Recognin 10:1) 30 Stunden bei Raumtemperatur verrührt und dann zentrifugiert.At the preferred! Embodiment astrocytin or malignin is dissolved in a 0.15 M NaHrjPO ^ citrate buffer with a pH of 4.0. A bromoacetyl resin such as bromoacetyl cellulose (BAC) at 1.0 to 1.5 meq. Bromine / g cellulose, stored in the cold, is prepared in 0.15 M NaH ₂ PO ^ buffer with a pH of 7.2. The buffer is adjusted to a pH of 4 by pouring off the buffer solution with a pH of 7.2 and by adding 0.15 M NaH ₂ PO, citrate buffer with a pH of 4.0. The astrocytin or malignin solution and the BAC solution are stirred together (ratio of BAC to Recognin 10: 1) for 30 hours at room temperature and then centrifuged.

Es wird bevorzugt, daß alle Stellen auf dem BAC, die für eine Bindung mit dem Recognin verfügbar sind, ge-It is preferred that all sites on the BAC that are available for binding with the Recognin are

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bunden werden. Dies kann wie folgt erreicht werden. Das überstehende Produkt von der unmittelbar vorhergehenden Stufe wird lyophilisiert und der Proteingehalt wird bestimmt, um die Menge von Astrocytin oder Malignin, die nicht mit dem BAC in einen Komplex überführt worden ist, zu ermitteln. Das komplexierte BAC-Astrocytin (oder BAC-Malignin) wird in einem 0,1 M Bicarbonatpuffer mit einem pH-Wert von 8,9 wieder suspendiert und 24 Stunden bei 4⁰C gerührt, um die Bildung von chemischen Bindungen zwischen dem BAC und dem Astrocytin oder Malignin zu gestatten. Nach den 24 Stunden wird die Suspension zentrifugiert und das überstehende Produkt wird auf Protein analysiert. Das komplexierte BAC-Astrocytin oder BAC-Malignin wird nun in 0,05 M Aminoäthanol - 0,1 M Bicarbonatpuffer mit einem pH-Wert von 8,9 resuspendiert, um gegebenenfalls nichtumgesetztes Brom zu blockieren. Die Suspension wird zentrifugiert und das überstehende Produkt wird aufbewahrt, jedoch aufgrund des Vorhandenseins von Aminoäthariol nicht analysiert. Die Entfernung des gesamten, ungebundenen Astrocytins oder Malignins wird sodann durch Zentrifugeerung und Resuspendierung für drei Waschstufen in 0,15 M NaCl, bis in einem Spektrophotometer bei 266 m/u keine Absorption mehr gemessen wird, bewerkstelligt. Der BAC-Astrocytin- oder BAC-Malignin-Komplex wird nun in 8 M Harnstofflösung 2 Stunden bei 38°c verrührt, zentrifugiert, sodann mit 8 M Harnstofflösung gewaschen (normalerweise reicht ein dreimaliges Waschen aus), bis in der Waschflüssigkeit bei 266 m/u keine Absorption mehr gezeigt wird. Sodann wird der Komplex zweimal mit 0,15 M NaCl gewaschen, um den Harnstoff zu entfernen. Der Komplex wird hierauf bei 37°C in 0,25 M Essigsäure 2 Stunden lang gerührt, um seine Stabilität zu demonstrieren. Es wird zentrifugiert und das überstehende Produkt wird bei 266 m /u untersucht, wobei keine Absorption vorhanden sein sollte. Dieses chemisch komplexierte BAC-Astrocytin oder BAC-Malignin ist daher stabil, und es kann nunmehr als Reagens bei den unten beschriebenen Methoden verwendet werden. In dieser Form eines stabilenbe bound. This can be achieved as follows. The supernatant from the immediately preceding step is lyophilized and the protein content is determined to determine the amount of astrocytin or malignin that has not been complexed with the BAC. The complexed BAC astrocytin (or BAC malignin) is resuspended in a 0.1 M bicarbonate buffer with a pH value of 8.9 and ^{stirred for 24 hours at 4 0} C in order to form chemical bonds between the BAC and the To allow astrocytin or malignin. After the 24 hours, the suspension is centrifuged and the supernatant is analyzed for protein. The complexed BAC astrocytin or BAC malignin is now resuspended in 0.05 M aminoethanol - 0.1 M bicarbonate buffer with a pH of 8.9 in order to block any unreacted bromine. The suspension is centrifuged and the supernatant is saved but not analyzed due to the presence of aminoethariol. All unbound astrocytin or malignin is then removed by centrifugation and resuspension for three washing stages in 0.15 M NaCl until no more absorption is measured in a spectrophotometer at 266 m / u. The BAC-astrocytin or BAC-malignin complex is then stirred in 8 M urea solution for 2 hours at 38 ° C, centrifuged, then washed with 8 M urea solution (normally washing three times is sufficient) until the wash liquid at 266 m / u no more absorption is shown. The complex is then washed twice with 0.15 M NaCl to remove the urea. The complex is then stirred at 37 ° C in 0.25 M acetic acid for 2 hours to demonstrate its stability. It is centrifuged and the supernatant is examined at 266 m / u, where there should be no absorption. This chemically complexed BAC astrocytin or BAC malignin is therefore stable and it can now be used as a reagent in the methods described below. In this form of a stable

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Reagens,wird es als synthetisch hergestellter Komplex bezeichnet, dessen physikalische und chemische Eigenschaften den stabilen, zellgebundenen Vorläufer von Astrocytin oder Malignin nachahmen, wenn er sich in einem reaktiven Potentialzustand mit den Serumkomponenten befindet. Zur Lagerung wird das Target-Reagens zentrifugiert und mit 0,15 M NaH₂PO^-PUffer mit einem pH-Wert von 7,2 neutral gewaschen.Reagent, it is referred to as a synthetic complex, the physical and chemical properties of which mimic the stable, cell-bound precursor of astrocytin or malignin when it is in a reactive potential state with the serum components. For storage, the target reagent is centrifuged and _{washed neutral with 0.15 M NaH 2} PO ^ buffer with a pH of 7.2.

Tärget-Reagentien können aus anderen bromacetylligandierten Trägern, außer Cellulose, z.B. bromacetylierten Harzen oder sogar Filterpapier, hergestellt werden.Tärget reagents can be made from other bromoacetyl-liganded Carriers other than cellulose, e.g. bromoacetylated Resins or even filter paper.

Beispiel 7Example 7

Herstellung von Antiseren gegenüber Astrocytin, Malignin und Target.Production of antisera against astrocytin, malignin and target.

Antiseren gegenüber Astrocytin, Malignin oder Target-Reagentien können hergestellt werden, wenn man in einem Säugetier eine Antikörper-Reaktion gegen diese induziert. Hierzu hat sich folgende Arbeitsweise als zufriedenstellend erwiesen. Antisera to astrocytin, malignin, or target reagents can be made by looking into induces an antibody response against them in a mammal. The following procedure has proven to be satisfactory for this purpose.

1 mg Recognin (Astrocytin oder Malignin) wird zusammen mit Standard-Freund-Adjuvans in die Zehenkissen von männlichen weißen Kaninchen injiziert. Sodann erfolgt die gleiche Injektion intraperitoneal eine Woche später, erneut intraperitoneal 10 Tage und, erforderlichenfalls, 3 Wochen später. Spezifische Antikörper können in dem Blutserum dieser Kaninchen schon eine Woche bis 10 Tage nach der ersten Injektion entdeckt werden. Dieselbe Verfahrensweise wird bei dem Target-Antigen angewendet, wobei man diejenige Menge an Target injiziert, die 1 mg Astrocytin oder Malignin, bestimmt durch die Folin-Lowry-Proteinbestimmung, enthält. .1 mg of Recognin (astrocytin or malignin) is put into the toe cushions of injected male white rabbit. The same injection is then given intraperitoneally one week later, again intraperitoneally 10 days and, if necessary, 3 weeks later. Specific antibodies can be found in the blood serum these rabbits can be detected as early as a week to 10 days after the first injection. Same procedure is applied to the target antigen, injecting the amount of target that 1 mg of astrocytin or Contains malignin as determined by the Folin-Lowry Protein Assay. .

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Der spezifische Antikörper gegenüber Astrocytin wird als Anti-Astrocytin bezeichnet. Der spezifische Antikörper gegenüber Malignin wird als Anti-Malignin bezeichnet. Gleichermaßen wird der spezifische Antikörper gegenüber Target-Reagens als Anti-Target bezeichnet.The specific antibody to astrocytin is called anti-astrocytin. The specific antibody versus malignin is called anti-malignin. Likewise, the specific antibody is opposed to Target reagent referred to as anti-target.

Diese Antikörper zeigen eindeutig bei Standard-Ouchterlony-Geldiffuionstests für Antigen-Antikörper Reaktionen mit spezifischen, einzigen, scharfen Reaktionslinien, die mit ihrem spezifischen Antigen gebildet werden.These antibodies show clearly on standard Ouchterlony gel diffusion tests for antigen-antibody reactions with specific, single, sharp reaction lines, which are formed with their specific antigen.

Das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern im Serum kann auch durch den quantitativen Standard-Präzipitintest für Antigen-Antikörper-Reaktionen getestet werden. Gute, quantitative Präzipitin-Kurven werden erhalten und daraus können die Mikrogramme des spezifischen Antikörpers errechnet werden.The presence of specific antibodies in the serum can also be determined by the standard quantitative precipitin test tested for antigen-antibody reactions. Good quantitative precipitin curves are obtained and from this, the micrograms of the specific antibody can be obtained can be calculated.

Ein weiterer Beweis für das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern in dem Serum kann durch Absorption des spezifischen Antikörpers Anti-Astrocytin auf Bromacetylcellulose-Astrocytin (BAC-Astrocytin), wie es oben hergestellt wurde, erhalten werden. Das Antiserum, das spezifisches Anti-Astrocytin enthält, kann mit BAC-Astrocytin umgesetzt werden. Wenn das Serum über BAC-Astrocytin geleitet wird, dann binden sich nur die spezifischen Antikörper gegenüber Astrocytin an ihr spezifisches Antigen Astrocytin. Da Astrocytin kovalent an Bromacetylcellulose gebunden ist, ist nunmehr der spezifische Antikörper, Anti-Astrocytin, an das BAC-Astrocytin gebunden, um BAC-Astrocytin-Anti-Astrocytin (BACA-Anti-Astrocytin) herzustellen. Dies wird dadurch bewiesen, daß man den Rest des Serums' testet, welches von BAC-Astrocytin freigewaschen worden ist. Bei der Standard-Ouchterlony-Diffusion bleiben nun keine Antikörper in dem Serum zurück, die sich mit dem Astrocytin umsetzen könnten. Es wird daher die Schlußfolgerung gezogen, daß alleFurther evidence of the presence of specific antibodies in the serum can be obtained from absorption of the specific antibody anti-astrocytin to bromoacetylcellulose-astrocytin (BAC-astrocytin) as prepared above. The antiserum, the specific one Contains anti-astrocytin, can be converted with BAC-astrocytin. When the serum passed through BAC astrocytin then only the specific antibodies against astrocytin bind to their specific antigen astrocytin. Since astrocytin is covalently bound to bromoacetyl cellulose, the specific antibody, anti-astrocytin, is now bound to the BAC-astrocytin to produce BAC-astrocytin-anti-astrocytin (BACA-anti-astrocytin). this will proved by testing the remainder of the serum which has been washed free of BAC astrocytin. In the With standard Ouchterlony diffusion, no antibodies remain in the serum that react with the astrocytin could. It is therefore concluded that all

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spezifischen Antikörper (Anti-Astrocytin), von denen zuvor gezeigt wurde, daß sie in dem Serum vorhanden waren, nun von dem BAC-Astrocytin absorbiert worden sind. Weiterhin, wenn das Anti-Astrocytin von seiner Bindung an BAC-Astrocytin freigesetzt ist, dann ist es hierdurch von allen verunreinigenden Antikörpern frei isoliert worden. Diese Freigabe von Anti-Astrocytin kann in der Weise erzielt werden, daß man das gekuppelte BACA-Anti-Astrocytin mit 0,25 M Essigsäure (4°C, 2 Stunden) wäscht, wobei, wie oben gezeigt _f wurde, die BAC-Astrocytin-Bindung nicht aufgebrochen wird.specific antibodies (anti-astrocytin) previously shown to be present in the serum have now been absorbed by the BAC astrocytin. Furthermore, when the anti-astrocytin is released from binding to BAC-astrocytin, then it has thereby been isolated from any contaminating antibodies. This release of Anti-Astrocytin can be obtained in such a manner that (° C, 2 hours 4) washing the BACA-Anti-Astrocytin coupled with 0.25 M acetic acid, was _f as shown above, the BAC-Astrocytin -Binding is not broken.

Ein weiterer Beweis für das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern in dem Serum kann durch Adsorption des spezifischen Antikörpers Anti-Malignin auf dem oben hergestellten Bromacetylcellulose-Malignin (BAC-Malignin) erhalten werden. Das das spezifische Anti-Malignin enthaltende Antiserum kann mit BAC-Malignin umgesetzt werden« Wenn das Serum über BAC-Malignin geleitet wird, dann binden sich nur die spezifischen Antikörper für das Malignin an ihr spezifisches Antigen Malignin. Da Malignin kovalent an Bromacetylcellulose gebunden ist, ist nunmehr der spezifische Antikörper Anti-Malignin an das BAC-Malignin gebunden, um BAC-Malignin-Anti-Malignin (BACM-Anti-Maligriin) herzustellen. Dies wird dadurch bewiesen, daß man den Rest des Serums, welches von BAC-Malignin freigewaschen worden ist, testet. Bei der Standard-Ouchterlony-Diffusion bleiben keine Antikörper in dem Serum zurück, die sich mit dem Malignin umsetzen. Es wird daher die Schlußfolgerung gezogen, daß alle spezifischen Antikörper (Anti-Malignin), von denen zuvor gezeigt wurde, daß sie in dem Serum vorhanden sind, von dem BAC-Malignin absorbiert worden sind. Wenn weiterhin das Anti-Malignin von seiner Bindung an BAC-Malignin freigesetzt wird, dann ist es hierdurch frei von allen verunreinigenden Antikörpern isoliert worden. Diese Freisetzung von Anti-Malignin kann erreicht werden, indemFurther evidence of the presence of specific antibodies in the serum can be through adsorption of the specific antibody anti-malignin on the bromoacetylcellulose malignin (BAC-malignin) prepared above can be obtained. The antiserum containing the specific anti-malignin can be converted with BAC-malignin « If the serum is passed over BAC malignin, then only the specific antibodies for the malignin bind their specific antigen malignin. Since malignin is covalently bound to bromoacetyl cellulose, it is now the specific one Antibody anti-malignin bound to the BAC-malignin to form BAC-malignin-anti-malignin (BACM-anti-malignin) to manufacture. This is evidenced by the fact that the rest of the serum which has been washed free of BAC malignin is, tests. Stick with the standard Ouchterlony diffusion no antibodies in the serum to react with the malignin. It is therefore concluded that that any specific antibody (anti-malignin) previously shown to be present in the serum have been absorbed by BAC malignin. If the anti-malignin continues from its binding to BAC-malignin is released, it has thereby been isolated free of any contaminating antibodies. These Release of anti-malignin can be achieved by

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man den BACM-AnIi-Malignin-Komplex mit 0,25 M Essigsäure (4⁰C, 2 Stunden) wäscht, wobei, wie oben gezeigt wurde, die BAC-Malignin-Bindung nicht aufbricht.washing the BACM-anii-Malignin complex with 0.25 M acetic acid (4 ⁰ C, 2 h), with, as shown above, does not break the BAC-Malignin bond.

Die Antikörper gegenüber Target zeigen klar bei Standard-Ouchterlony-Geldiffusionstests für Antigen-Antikörper Reaktionen mit spezifischen einzigen Reaktionslinien, die mit Target gebildet werden, welche eine Identitätslinie mit der Linie der Reaktion gegenüber Anti-Astrocytin-oder Anti-Malignin-Antiseren (d.h. diejenigen, die zu der Injektion von Astrocytin oder Malignin selbst gebildet worden sind) zeigen. Einige Kaninchen, so wurde festgestellt, haben vor der Injizierung mit Target schon Gehalte an AntiTarget in ihrem Blut. Diese Anti-Target-Substanzen führen, wenn sie spezifisch mit dem Target-Reagens, wie es bei Tests mit Humanseren beschrieben wird, umgesetzt werden, zu der Bildung von ungefähr äquivalenten Mengen der zwei* Typen von TAG, S-TAG und P-TAG, (vergl. die folgenden Beispiele).The antibodies to target show clearly in standard Ouchterlony gel diffusion tests for antigen antibodies Reactions with specific single reaction lines, which are formed with target that has a line of identity with the line of reaction to anti-astrocytin or Anti-malignin antisera (i.e. those related to the injection formed by astrocytin or malignin itself). Some rabbits have been found to have AntiTarget levels in your blood before the injection with Target. These anti-target substances lead to when specifically reacted with the target reagent as described in testing human sera, too the formation of approximately equivalent amounts of the two * types of TAG, S-TAG and P-TAG, (see the following examples).

Beispiel 8Example 8

Entdeckung von malignen Tumoren durch in vitro erfolgende quantitative Bildung von an Target haftenden Globulinen (Target-Attaching-Globulins) (TAG) von biologischen Flüssigkeiten. Discovery of malignant tumors through in vitro quantitative formation of globulins adhering to the target (Target-Attaching-Globulins) (TAG) of biological fluids.

Gemäß Beispiel 6 hergestelltes Target-Reagens wird gewaschen, um ungebundenes Recognin, das aufgrund von Zersetzungen vorhanden sein kann, zu entfernen. Die folgende Verfahrensweise ist hierbei zufriedenstellend. Das Target-Reagens wird 2 Stunden bei 37⁰C mit Essigsäure gerührt, zentrifugiert und das überstehende Produkt wird dekantiert. Die optische Dichte des überstehenden Produktes wird bei 266 m/u abgelesen. Wenn irgendeine Absorption vorliegt, dann wird das Waschen wiederholt, bis kein weiteres Material solubilisiert wird. Das Target wird sodann in phosphatgepufferterTarget reagent prepared according to Example 6 is washed to remove unbound recognin which may be present due to decomposition. The following procedure is satisfactory. The target reagent is ^{stirred with acetic acid at 37 °} C. for 2 hours, centrifuged and the supernatant product is decanted. The optical density of the supernatant product is read off at 266 m / u. If there is any absorption, then the washing is repeated until no further material is solubilized. The target is then buffered in phosphate

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Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,2 resuspendiert. (Standard-S-TAG und F-TAG, gereinigt von vorhergehenden Reaktionen von Humanserum durch die untenstehende Verfahrensweise, können, wenn verfügbar, als Referenzstandardproben bei dem Test des Target-Reagens verwendet werden sowie Kaninchengesamtserum, bei dem bestimmt wurde, daß es S-TAG und F-TAG durch andere Target-Zubereitungen enthält.) Resuspended saline at pH 7.2. (Standard S-TAG and F-TAG, purified from previous ones Reactions of human serum by the procedure below can be used as reference standard samples, if available can be used in the assay of the target reagent as well as total rabbit serum determined to be it contains S-TAG and F-TAG from other target preparations.)

Die Bestimmung der Langsam-Bindung (S-TAG) wird wie folgt durchgeführt. Es sollte kein gefrorenes Serum verwendet werden, das mehr als einige wenige Tage gelagert worden ist. Das Serum wird sorgfältig aus frischerhaltenem Gesamtblut oder einer anderen Körperflüssigkeit nach bekannten Standardverfahrensweisen hergestellt. Die folgende Verfahrensweise hat sich als zufriedenstellend erwiesen. Blut wird durch 2stündiges Stehenlassen bei Raumtemperatur in einem Glasreagenzglas gerinnen gelassen. Die Gerinnsel werden von den Wänden mit einem Glasrührstab abgetrennt und das Blut wird eine Minimalzeit von 2 Stunden (oder über Nacht) bei 4°C stehengelassen. Die Gerinnsel v/erden von dem Serum durch 45minütiges Zentrifugieren bei 20 000 _vU/min und 4⁰C abgetrennt. Das Serum wird in ein Zentrifugenrohr dekantiert und es wird erneut 45 Minuten bei 2000 U/min und 4⁰C zentrifugiert. Das Serum wird dekantiert und eine 1%ige Lösung von Methiolat (1 g in 95 ml V/asser und 5 ml 0,2 M Bicarbonatpuffer mit einem pH-Wert von 10) wird bis zu einem Ausmaß von 1% des Volumens des Serums zugesetzt.The determination of slow binding (S-TAG) is carried out as follows. Frozen serum that has been stored for more than a few days should not be used. The serum is carefully prepared from freshly obtained whole blood or other body fluid according to standard known procedures. The following procedure has been found to be satisfactory. Blood is allowed to clot by standing for 2 hours at room temperature in a glass test tube. The clots are separated from the walls with a glass stir bar and the blood is allowed to stand for a minimum of 2 hours (or overnight) at 4 ° C. The clots v / ground of the serum by centrifugation for 45 minutes at 20 000 _V. U / min and separated 4 ⁰ C. The serum is decanted into a centrifuge tube and centrifuged again at 2000 rpm and 4 ^° C. for 45 minutes. The serum is decanted and a 1% solution of methiolate (1 g in 95 ml v / water and 5 ml 0.2 M bicarbonate buffer with a pH of 10) is added to an extent of 1% of the volume of the serum .

Die Serumproben, die nach den obigen oder anderen Verfahrensweisen hergestellt worden sind, werden jeweils in einer Menge von 0,2 ml zu jeweils 0,25 ml aliquoten Teilen eines Target-Suspensionsreagens gegeben, welches pro 0,25 ml Target-Reagens 100 bis 200/Ug Recognin enthält Es wird eine doppelte Bestimmung durchgeführt. Die Suspen-The serum samples prepared by the above or other procedures are each added in an amount of 0.2 ml to each 0.25 ml aliquot of a target suspension reagent which contains 100 to 200 / Ug Recognin per 0.25 ml target reagent A double determination is carried out. The suspen-

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sion wird bei 4°C so gemischt, daß eine KlumpenbiIdling vermieden wird. So kann z.B. eine kleine Kautschukkappe, die rasch geschüttelt wird, 1 bis 2 Sekunden lang verwendet werden, worauf die Röhrchen leicht schräggestellt in einem Thomas-Schüttler etwa 2 Stunden lang oder mehr geschüttelt werden können. Das Target-Reagens und das daran gebundene Protein werden von dem Serum abgetrennt. Eine Verfahrensweise, die sich als zufriedenstellend erwiesen hat, ist die folgende. Die Rohre werden sodann 20 Minuten bei 4°C und 2000 U/min zentrifugiert und das überstehende Produkt wird dekantiert. Der Klumpen, der durch die Zentrifugierung gebildet wird, wird dreimal durch Wiedervermischen und Schütteln bei Raumtemperatur mit 0,2 bis 0,3 ml 0,15 M Kochsalzlösung gewaschen. Es wird zentrifugiert und die überstehenden Produkte werden verworfen.sion is mixed at 4 ° C so that a lump formation is avoided will. For example, a small rubber cap that is shaken quickly can be used for 1 to 2 seconds whereupon the tubes, tilted slightly, are shaken in a Thomas shaker for about 2 hours or more can be. The target reagent and the protein bound to it are separated from the serum. A procedure which has been found to be satisfactory is the following. The tubes are then kept at 4 ° C for 20 minutes and 2000 rpm centrifuged and the supernatant is decanted. The lump produced by centrifugation is formed three times by remixing and shaking at room temperature with 0.2-0.3 ml of 0.15M Washed saline. It is centrifuged and the supernatant products are discarded.

Das Protein, das an das Target angeheftet bleibt, wird davon abgespalten und quantitativ bestimmt. So werden z.B. 0,2 ml 0,25 M Essigsäure zugegeben und die Suspension wird 1 bis 2 Stunden in einem Inkubator von 37⁰C geschüttelt. Die Rohre werden 30 "Minuten bei 2000 U/min und 4°C zentrifugiert. Das überstehende Produkt wird sorgfältig dekantiert, um eine Übertragung von Teilchen zu vermeiden, und die optische Dichte des überstehenden Produktes wird bei 280 m/u abgelesen. Der Wert der optischen Dichte wird durch einen Faktor von.1,46 dividiert, wodurch die Mikrogramme pro ml Serumprotein (S-TAG)- erhalten werden. Doppelbestimmungen sollten.nicht mehr als 5% variieren. Jede beliebige, andere Verfahrensweise, die zur Bestimmung des Proteingehalts geeignet ist, kann verwendet werden, z.B. die Bestimmung nach Folin-Lowry. Die Standards müssen jedoch spezifiziert werden, um den Bereich der Kontroll- und Tumorwerte von S-TAG-minus F-TAG-Konzentration zu bestimmen.The protein that remains attached to the target is split off from it and quantified. For example, 0.2 ml of 0.25 M acetic acid are added and the suspension is ^{shaken in an incubator at 37 °} C. for 1 to 2 hours. The tubes are centrifuged for 30 "minutes at 2000 rpm and 4 ° C. The supernatant product is carefully decanted to avoid transfer of particles, and the optical density of the supernatant product is read at 280 m / u. The value of the optical density is divided by a factor of 1.46 to give the micrograms per ml of serum protein (S-TAG) - duplicate determinations should not vary by more than 5% . Any other method suitable for determining protein content can be used, such as the Folin-Lowry determination, but standards must be specified to determine the range of control and tumor values from S-TAG minus F-TAG concentration.

Die Bestimmung der Schnell-Bindung (F-TAG) wird wie folgt durchgeführt. Es sollte kein gefrorenes Serum ver-The determination of the quick attachment (F-TAG) is carried out as follows. Do not use frozen serum

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wendet werden, das langer als einige wenige Tage gelagert ist. Das Serum wird sorgfältig aus frischerhaltenem Gesamtblut oder einer anderen Körperflüssigkeit nach Standardverfahrensweisen hergestellt. Die in diesem Beispiel für die Serumherstellung angegebene Verfahrensweise ist zufriedenstellend. stored for longer than a few days is. The serum is carefully prepared from freshly obtained whole blood or other body fluid using standard procedures manufactured. The procedure given in this example for the preparation of serum is satisfactory.

Serumproben, die nach dem obigen oder anderen Verfahren hergestellt worden sind, werden bei 4⁰C 10 Minuten weniger als die Gesamtzeit stehengelassen, über die die S-TAG-Serumbestimmungen in Kontakt mit dem obigen Target-Reagens gelassen wurden (z.B. 1 Stunde 50 Minuten, wenn eine "2 Stunden"-S-TAG-BeStimmung gemacht wurde). Diese Verfahrensweise gleicht die Temperaturvorgeschichte der S-TAG- und F-TAG-BeStimmungen aus.Serum samples that have been prepared by the above or another method are left to stand at 4 ^° C. for 10 minutes less than the total time for which the S-TAG serum determinations were left in contact with the above target reagent (e.g. 1 hour 50 minutes if a "2 hour" S-DAY determination has been made). This procedure compensates for the temperature history of the S-TAG and F-TAG determinations.

Es werden 0,2 ml-Proben des hinsichtlich der Temperatur ins Gleichgewicht gebrachten Serums zu jeweils 0,25 ml aliquoten Teilen des Target-Suspensionsreagens gegeben, welches 100 bis 200/ug Recognin pro 0,25 ml Target-Reagens enthält. Es wird eine doppelte Bestimmung durchgeführt. Die Suspension wird sodann bei 4°C ungefähr 10 Minuten lang in einer Weise vermischt, daß eine Pelletbildung vermieden wird. So kann z.B. eine kleine Kautschukkappe, die rasch geschüttelt wird, 1 bis 2 Sekunden lang verwendet werden, worauf die leicht schräg angeordneten Rohre in einem Thomas-Schüttler ungefähr 10 Minuten lang geschüttelt werden. Das Target-Reagens und das daran gebundene Protein werden von dem Serum abgetrennt. Eine Verfahrensweise, die sich als zufriedenstellend erwiesen hat, ist die folgende. Die Rohre werden sodann bei 2000 U/min und 4⁰C 20 Minuten lang zentrifugiert und das überstehende Produkt wird dekantiert. Der durch das Zentrifugieren gebildete Klumpen wird dreimal gewaschen, indem er mit 0,2 bis 0,3 ml 0,15 M Kochsalzlösung bei Raumtemperatur wieder-0.2 ml samples of the temperature equilibrated serum are added to each 0.25 ml aliquot of the target suspension reagent containing 100 to 200 µg of recognin per 0.25 ml of target reagent. A double determination is carried out. The suspension is then mixed at 4 ° C for about 10 minutes in a manner that avoids pellet formation. For example, a small rubber cap that is quickly shaken can be used for 1 to 2 seconds, after which the slightly inclined tubes are shaken in a Thomas shaker for approximately 10 minutes. The target reagent and the protein bound to it are separated from the serum. One procedure which has been found to be satisfactory is as follows. The tubes are then centrifuged at 2000 rpm and 4 ^° C. for 20 minutes and the supernatant product is decanted. The lump formed by centrifugation is washed three times by rinsing it with 0.2 to 0.3 ml of 0.15 M saline solution at room temperature.

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vermischt und geschüttelt wird. Sodann wird zentrifugiert und die überstehenden Produkte werden verworfen.is mixed and shaken. It is then centrifuged and the supernatant products are discarded.

Das Protein, das an das Target angeheftet bleibt, wird davon abgespalten und quantitativ bestimmt. Die oben in diesem Beispiel zur Bestimmung der S-TAG-Konzentration beschriebene Verfahrensweise ist zufriedenstellend. Es kann auch jede andere Verfahrensweise verwendet werden, die zur Bestimmung des Proteingehalts geeignet ist, z.B. die Folin-Lowry-Bestimmung. Die Standards müssen jedoch so spezifiziert sein, daß sie den Bereich der Kontroll- und Tumorwerte der S-TAG- minus F-TAG-Konzentration erfassen.The protein that remains attached to the target is split off from it and quantified. The above The procedure described in this example for determining the S-TAG concentration is satisfactory. It can any other procedure suitable for determining the protein content can also be used, e.g. the Folin-Lowry determination. However, the standards must be specified in such a way that they cover the area of control and Record tumor values of the S-TAG minus F-TAG concentration.

Die Endergebnisse werden als /Ug TAG/ml Serum ausgedrückt und sie sind gleich S-TAG minus F-TAG. Die TAG-Werte bei Patienten ohne Gehirntumor und anderen Kontrollproben erstrecken sich derzeit von Null (oder einer negativen Zahl) bis zu 135/Ug/ml Serum. Bei allen Ergebnissen mit mehr als 100/Ug/ml ist eine wiederholte Bestimmung angezeigt. Einige andere Tumoren können hohe TAG-Werte ergeben, insbesondere wenn sekundäre (metastatische) Tumore in dem Gehirn vorhanden sind. Die TAG-Werte von Patienten mit Gehirntumor erstrecken sich derzeit von 136 bis 500 /Ug oder mehr/ml Serum. Bei der ersten "Blind"-Untersuchung von 50 Blutproben nach den Verfahrensweisen dieses Beispiels unter Verwendung eines aus Astrocytin und Bromacetylcellulose hergestellten Target-Reagens wurden 11 von 11 Gehirntumoren und 28 von 32 Normalen korrekt identifiziert. Einer der vier angenommenen Normalen (d.h. eine Kontrollperson ohne Gehirntumor)hatte einen Krebs der Schilddrüse, gehabt, der offensichtlich einige Jahre zuvor erfolgreich behandelt worden war. Die drei restlichen Normalen waren Personen im Alter von 60 bis 70, die einen schlechten Gesundheitszustand hatten und die möglicherweise einen noch nicht erkannten Krebs hatten. Von den restlichen sieben Proben wurden drei von drei Fällen Hodgkin¹scher KrankheitThe final results are expressed as / Ug TAG / ml serum and they are equal to S-TAG minus F-TAG. The TAG values in patients without a brain tumor and other control samples currently range from zero (or a negative number) to 135 / Ug / ml serum. A repeated determination is indicated for all results with more than 100 / Ug / ml. Some other tumors can give high TAG values, especially when secondary (metastatic) tumors are present in the brain. The TAG values of patients with brain tumors currently range from 136 to 500 / Ug or more / ml of serum. The first "blind" examination of 50 blood samples following the procedures of this example using a target reagent made from astrocytin and bromoacetyl cellulose correctly identified 11 out of 11 brain tumors and 28 out of 32 normals. One of the four assumed normals (ie a control person without a brain tumor) had had a cancer of the thyroid gland that had apparently been successfully treated a few years earlier. The three remaining normals were people aged 60 to 70 who were in poor health and who may have had an as-yet-unrecognized cancer. Of the remaining seven samples were three of three cases Hodgkin disease shear ¹

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richtig,identifiziert. Eine Probe im Tumorbereich (136 bis 500/Ug TAG/ml) entsprach einem Patienten mit einer schweren Gliose, und drei Proben im Nicht-Tumorbereich (0 bis 135/ug TAG/ml) entsprachen Patienten, die eine ungewisse intercraniale Massendiagnose, jedoch keinen Tumor, ein Osteosarkom (einen Nicht-Gehirntumor) und ein melanotisches Sarkom (einen Nicht-Gehirntumor) hatten.correct, identified. A sample in the tumor area (136 up to 500 / Ug TAG / ml) corresponded to a patient with severe gliosis and three samples in the non-tumor area (0 to 135 / ug TAG / ml) corresponded to patients who had an uncertain mass intercranial diagnosis but no tumor, an osteosarcoma (a non-brain tumor) and a melanotic one Have had sarcoma (a non-brain tumor).

Nach den Verfahrensweisen dieses Beispiels wurde eine nachfolgende Untersuchung unter Verwendung eines Target-Reagens, hergestellt aus Malignin, bei den malignen Gehirntumoren und allen Normalen durchgeführt.Following the procedures of this example, a subsequent test was carried out using a Target reagent, made from malignin, performed on malignant brain tumors and all normals.

Eine weitere, nach den Verfahrensweisen dieses Beispiels durchgeführte Untersuchung erstreckte die Gesamtzahl der untersuchten Humanserumproben von 50 auf 114. Die Eignung dieser Produkte und Verfahrensweisen ist in Tabelle V gezeigt, die die Ergebnisse dieser Tests angibt.Another examination, performed according to the procedures of this example, extended the total number of human serum samples tested from 50 to 114. The suitability of these products and procedures is shown in Table V. showing the results of these tests.

Beispiel 9 - , Example 9 -,

Diagnose von Tumorzellen durch Immunofluoreszenz.Diagnosis of tumor cells by immunofluorescence.

Es ist gezeigt worden, daß die Verbindungen Anti-Astrocytin, Anti-Malignin und S-TAG sich bevorzugt an Tumorzellen anheften. Diese Spezifizität gestattet die Verwendung dieser Verbindungen zur Diagnose von Tumorzellen in histologischen Schnitten, indem man Farbstoffe oder radioaktive Substanzen mit Anti-Astrocytin, Anti-Malignin oder S-TAG kombiniert. Es können Standard-Markierungstechniken hierzu verwendet werden. Eine geeignete Verfahrensweise unter Verwendung von S-TAG ist z.B. die folgende.The compounds anti-astrocytin, anti-malignin and S-TAG have been shown to preferentially stick to each other Attach tumor cells. This specificity allows these compounds to be used to diagnose tumor cells in histological sections by adding dyes or radioactive substances with anti-astrocytin, anti-malignin or S-TAG combined. Standard marking techniques can be used for this purpose. A suitable practice using S-TAG is, for example, as follows.

Eine Verfahrensweise, die sich als zufriedenstellend erwiesen hat, ist ein modifiziertes St.Marie-Verfahren. Proben von menschlichem Gehirntumor werden eingefroren und 5/U dicke Abschnitte werden herausgeschnitten. Diese werdenOne procedure which has been found to be satisfactory is a modified St. Marie procedure. Human brain tumor specimens are frozen and sections 5 / U thick are excised. These will

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in einem feuchten Behälter 4 bis 8 Wochen bei -7O⁰C gelagert, bevor sie angefärbt werden. Das Konjugat kann ein Standard-Antiserum, z.B. Ziegen-Anti-Kaninchen-Konjugat sein. Das Konjugat wird durch bekannte Techniken mit fluoreszierenden oder anderen Markierungssubstanzen markiert. Fluorescin-markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-Kon jugat, wie es im Handel erhältlich ist, kann hierzu verwendet werden. Als Fluoreszenz-Technik wurde eine Standardtechnik angewendet, bei der eine 1:200 bis 1:400 Lösung von TAG etwa 30 Minuten oder mehr auf dem Tumorschnitt inkubiert wurde. Sodann wurde gewaschen, um nichtangeheftetes TAG zu entfernen. Drei Waschungen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung haben sich als zufriedenstellend erwiesen. Sodann wird eine Konjugatinhibiening mit einem fluorescin-markierten Konjugat, gefolgt von Wäschen durchgeführt, woran sich eine mikroskopische Untersuchung anschließt. Normale Zellen und ihre Prozesse werden nicht sowohl in den Tumorschnitten als auch .in den Kontrollschnitten von normalen Nicht-Tumorgehirnen angefärbt. Eine Fluoreszenz is.t^hell in Tumorglialzellen und ihren Prozessen vorhanden.stored in a moist container for 4 to 8 weeks at -7O ⁰ C before they are stained. The conjugate can be a standard antiserum, for example goat anti-rabbit conjugate. The conjugate is labeled with fluorescent or other labeling substances by known techniques. Fluorescine-labeled goat anti-rabbit conjugate, as is commercially available, can be used for this purpose. A standard technique was used as the fluorescence technique in which a 1: 200 to 1: 400 solution of TAG was incubated on the tumor section for about 30 minutes or more. This was followed by washing to remove any unattached TAG. Three washes with phosphate buffered saline have been found to be satisfactory. A conjugate inhibition with a fluorescine-labeled conjugate is then carried out, followed by washes, followed by a microscopic examination. Normal cells and their processes are not stained both in the tumor sections and in the control sections of normal non-tumor brains. Fluorescence is brightly present in tumor glial cells and their processes.

Beispiel 10Example 10

Beschreibung der cytotoxischen Wirkung von Anti-Astrocytin, Anti-Malignin und S-TAG gegenüber Tumorzellen, "die in einer Gewebekultur wachsen.Description of the cytotoxic effects of anti-astrocytin, Anti-malignin and S-TAG against tumor cells, "the in one Grow tissue culture.

Es können Standardtests zur Bestimmung der Cytotoxizität verwendet werden. Im allgemeinen wird die Anzahl der Zellen in einer festen Zellkammer, die gewöhnlich so angeordnet ist, daß sie etwa 100 lebende Zellen enthält, gezählt. Diese Zellen werden sodann mit dem zu testenden Mittel behandelt und die Anzahl der Zellen, die noch am Leben sind, wird gezählt.Standard tests can be used to determine cytotoxicity. In general, the number will be of cells in a solid cell chamber, which is usually so is arranged to contain about 100 living cells, counted. These cells are then mixed with the test Agent is treated and the number of cells that are still alive is counted.

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Bei einem Standard-Cytotoxizitätstest der gemäß Beispiel 8 erhaltenen S-TAG-Lösung gegenüber Zellen in einer Gewebekultur, die von einem Patienten mit einem Glioblastom vom 3. bis 4. Grad erhalten worden waren, die als glialer Herkunft gut charakterisiert waren, ergab S-TAG das Absterben aller Zellen in der Zellkammer selbst in hoher Verdünnung von 1:100 und 1:1000, was nur 0,2 und 0,02/Ug S-TAG/ml Lösung entspricht. Ähnliche Ergebnisse werden mit hohen Verdünnungen von Anti -Astro cy tin und Anti-Malignin erhalten.In a standard cytotoxicity test of the S-TAG solution obtained according to Example 8 against cells in a tissue culture obtained from a patient with 3rd to 4th degree glioblastoma identified as of glial origin were well characterized, S-TAG revealed the death of all cells in the cell chamber itself high dilution of 1: 100 and 1: 1000, which is only 0.2 and 0.02 / Ug S-TAG / ml of solution. Similar results are obtained with high dilutions of anti-astro cy tin and anti-malignin.

Sowohl die in Beispiel 9 gezeigte Spezifizität als auch die in Beispiel 10 gezeigte Cytotoxizität sind für die therapeutischen Möglichkeiten von Anti-Astrocytin, Anti-Malignin und S-TAG für menschliche Gehirntumoren hoch relevant. Diese therapeutischen Anwendungszwecke kommen zu den praktischen Diagnosemoglichkeiten von beiden dieser Erscheinungen für Tumorgewebe hinzu, das bei. Operationen entfernt worden ist, das jedoch eine Diagnose durch histologische Untersuchungen erfordert, wie es hierin bereits gezeigt wurde.Both the specificity shown in Example 9 and the cytotoxicity shown in Example 10 are for the therapeutic possibilities of anti-astrocytin, anti-malignin and S-TAG for human brain tumors highly relevant. These therapeutic uses come to the practical possibilities of diagnosing both of these phenomena for tumor tissue. Operations has been removed, but which requires diagnosis by histological examination, as described herein was shown.

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Tabelle VTable V

NormaleNormal

Maligne Gehirntumoren primärMalignant brain tumors primary

Andere maligne Tumoren, Gehirn-Sekundärer schein .Other malignant tumors, brain secondary sham.

Andere maligne
Tumoren, keine
Gehirns ekundärerscheinungen Other malignant
Tumors, none
Brain phenomena ekundär

UnbestimmteIndefinite

Cerebraldia-Cerebraldia

gnosegnosis

Serum Serum Serum Serum TAG TAG TAG TAG /ug/ml /ug/ml /Ug/ml /Ug/mlSerum Serum Serum Serum DAY DAY DAY DAY / µg / ml / µg / ml / Ug / ml / Ug / ml

Serumserum

TAG
/ug/ml DAY
/ µg / ml

Serum TAG /ug/ml Serum TAG / µg / ml

Serum
TAG
/ug/mlserum
DAY
/ µg / ml

co oo co cnco oo co cn

124124 1919th 5454 6565 113113 5555 2727 113113 105105 5151 41·41 · 130130 130130 8282 2121 7979 127127 4444 2727 6161 3838 127127 2121 123123 100100 3131 00 1414th 125125 00 1414th 2020th 30.30th 125125 6262 4141 250^Ί 250 ^Ί 118118 3838 3434 39-39- 89₅ 89 ₅ 9393 9393 363¹ 363 ¹ 99ο99ο 2121 4848 44th 13j13y 00 2020th 3131 120120 8282 4242 77th 1616 2020th 3434 • 58• 58 2020th 5555 7676 2424 113113 00 4848 6262 7272 8585 8989 8989

270270

257257

188188

205₇ 205 ₇

157'157 '

³¹14
^{442 31} 14
⁴⁴²

1313th

Serumserum

TAG /ug/ml DAY / µg / ml

165 144-165 144-

13 20913 209

75 18475 184

27 110 19227 110 192

10 10 11 11 12 1510 10 11 11 12 15

459 397 236 137 298 397 241 241 217 147 127 185 253 253 565 277 137 78 138 650 160459 397 236 137 298 397 241 241 217 147 127 185 253 253 565 277 137 78 138 650 160

Unter diese Bezeichnung fallen Normale, nicht-tumorbedingte medizinische und chirurgische Störungen; 1-sehr krank; nichtdiagnostiziert; 2-extra-intercraniale Gehirnmasse, nichtdiagnostiziert; 3-ausgeprägte Gliose; 4-malignes Melanom; 5-Osteosarkom; 6-Gehirnzystenflüssigkeit; 7-Adenocarcinom des Kolons; 8-Gastrectomie; 9-Kopfschmerzen; 10-Emphysem; 11-Polymyalgie; 12-Kolonkrebs; 13-Konvulsionen; 14-Prostatakrebs, Sekundärerscheinungen in den Knochen; 15-klinisch normal, 18 Monate früher, als dieses abnormale Serum TAG erhalten wurde: nunmehr haben sich schwere Kopfschmerzen sowie ein Verlust des Geschmacks und des Geruchs entwickelt.This designation includes normal, non-tumor-related medical and surgical disorders; 1-very sick; undiagnosed; 2-extra-intercranial brain mass, undiagnosed; 3-pronounced gliosis; 4 malignant melanoma; 5 osteosarcoma; 6-brain cyst fluid; 7-adenocarcinoma of the colon; 8 gastrectomy; 9-headache; 10 emphysema; 11-polymyalgia; 12 colon cancer; 13 convulsions; 14-prostate cancer, secondary manifestations in the bones; 15-clinically normal, 18 months earlier than this abnormal serum TAG was received: now have severe headache as well as a loss of taste and smell.

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Beispiel 11Example 11

Hydrolytische Abspaltung der Recognine.Hydrolytic cleavage of the recognins.

Eine Lösung von Recognin,in diesem Falle entweder Astrocytin oder Malignin, mit einem pH-Wert zwischen 1 und 2 wird in der Kälte stehengelassen. Nach 7 bis 14 Tagen zeigt die TLG-Chromatographie, daß das Molekulargewicht des Produkts um ungefähr 200 vermindert worden ist. Wenn die Lösung länger stehengelassen wird, dann werden weitere Einheiten mit einem Molekulargewicht von ungefähr 200 alle 7 bis 10 Tage abgespalten. Somit wird das Molekulargewicht des Astrocytins von 8000 und das Molekulargewicht des Malignins von 10 000 in jedem Fall aufeinanderfolgend um ungefähr 200 Einheiten vermindert.A solution of Recognin, in this case either Astrocytin or Malignin, with a pH between 1 and 2 is left standing in the cold. After 7 to 14 days TLG chromatography shows that the molecular weight of the product has been reduced by approximately 200. if the solution is allowed to stand longer, then more units with a molecular weight of about 200 will all Split off for 7 to 10 days. Thus, the molecular weight of astrocytin becomes 8,000 and the molecular weight of Malignins of 10,000 successively decreased by approximately 200 units in each case.

Die physikochemischen Eigenschaften des Astrocytins werden von jedem Produkt bis auf ein Molekulargewicht von ungefähr 4000 hinunter beibehalten. Die physikochemischen Eigenschaften des Malignins werden von jedem Produkt bis zu einem Molekulargewicht von ungefähr 5000 hinunter beibehalten. Dies wird durch Ouchterlony-Geldiffusionstests gegen Anti-Astrocytin und Anti-Malignin gezeigt. ^l The physicochemical properties of astrocytine are retained for each product down to a molecular weight of approximately 4,000. The physicochemical properties of malignin are retained for each product down to a molecular weight of about 5000. This is shown by Ouchterlony gel diffusion tests against anti-astrocytin and anti-malignin. ^l

Diese Spaltung kann auch enzymatisch, beispielsweise mit Trypsin oder anderen Proteinasen, unter Erzielung ähnlicher Ergebnisse durchgeführt werden.This cleavage can also be achieved enzymatically, for example with trypsin or other proteinases similar results can be carried out.

Die Molekulargewicht dieser Verbindungen, die durch hydrolytische Abspaltung der Recognine hergestellt worden sind, können ungefähr durch die folgenden Formeln definiert werden:The molecular weight of these compounds produced by hydrolytic cleavage of the Recognine can be roughly defined by the following formulas:

Für Produkte mit den physikochemischen Eigenschaften von Astrocytin; 400 + 200 χ = Y.For products with the physicochemical properties of astrocytin; 400 + 200 χ = Y.

Für Produkte mit den physikochemischen Eigenschaften von Malignin; 5000 + 200 χ = Y,For products with the physicochemical properties of malignin; 5000 + 200 χ = Y,

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260625?260625?

- 5ο -- 5ο -

Darin bedeutet Y das Molekulargewicht des Produkts und χ eine ganze Zahl von 0 bis 19.Y is the molecular weight of the product and χ is an integer from 0 to 19.

Beispiel 12Example 12

Herstellung eines künstlichen Gewebes oder Organs mit Recogninen.Manufacture of an artificial tissue or organ with recognins.

Ein Rohr aus Kunststoff, Metall oder einem anderen geeigneten starren Material mit starrer Wand wird in eine hochkonzentrierte (d.h. 10 mg/ml) viskose Recogninlösung, in diesem Falle entweder von Astrocytin oder Malignin, eingetaucht oder damit imprägniert, bis alle Oberflächen vollständig mit dem Recognin beschichtet sind. Alternativ kann die Recogninlösung auch durch und um das Rohr herum unter Druck geleitet werden, bis alle Oberflächen vollständig beschichtet sind. Das Rohr wird sodann in Luft oder im Vakuum getrocknet oder lyophilisiert. Der Beschichtun^aprozeß wird mehrfach wiederholt, um mehrfache molekulare Schichten des Recognin-Überzugs aufzubauen.A pipe made of plastic, metal or other suitable rigid material with a rigid wall is inserted into a highly concentrated (i.e. 10 mg / ml) viscous Recognin solution, in this case either astrocytin or malignin, immersed or impregnated with it until all surfaces are completely coated with the Recognin. Alternatively, the Recognin solution can also be passed through and around the pipe under pressure until all surfaces are completely coated are. The tube is then dried or lyophilized in air or vacuum. The coating process is repeated several times to build up multiple molecular layers of the Recognin coating.

Das Rohr ist nun bereit, um in eLie Höhlung oder in ein Gewebe eingebracht zu werden, die oder das Astrocytin- oder Malignin-artige Vorläufer in dem benachbarten Gewebe oder Flüssigkeit eines lebenden Säugetiers enthält. Dieses künstliche Gewebe oder Organ kann dazu verwendet werden, um eine Reaktion mit Fremdsubstanzen, die ohne einen Recognin-Überzug stattfinden würde, zu minimalisieren oder zu eliminieren.The tube is now ready to go into eLie cavity or to be introduced into a tissue that contains astrocytin or contains malignin-like precursors in the adjacent tissue or fluid of a living mammal. This artificial tissue or organ can be used to react with foreign substances without a Recognin coating would take place to minimize or eliminate.

Künstliche Gewebe oder Organe mit anderen geometrischen Formen können in gleicher Weise hergestellt werden.Artificial tissues or organs with other geometric shapes can be made in the same way will.

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Die Figur zeigt, daß die erhöhte Kolbengröße zu ungefähr der verdreifachten Verhältnismenge des Malignin-Produktes führt.The figure shows that the increased flask size approximately tripled the proportion of malignin product leads.

Die Figur zeigt auch die Beziehung zwischen Malignin und der Malignität. Die unterbrochen gezeichnete Linie stellt eine ideale lineare Beziehung dar. Diese gezeigte Beziehung ist sicherlich nicht trivial, da die Verhältnismenge des vorhandenen Malignins zunimmt, wenn die Zellen in ihrem Y/achstum weniger beschränkt (pathologisch) werden. Die nor- <· male in situ-Recognin-Funktion steht, wie zuvor angegeben wurde, mit der Kontaktinhibierung des Zellwachstums in Beziehung. Je pathologischer das Wachstum der malignen Zellen ist, eine desto geringere Kontaktinhibierung findet statt und umso mehr wird das Malignin das vorherrschende Protein.The figure also shows the relationship between malignin and the malignancy. The broken line represents represents an ideal linear relationship. The relationship shown is certainly not trivial, since the set of the existing malignin increases when the cells are less restricted (pathological) in their axis. The nor- <· male in situ recognize function is related, as previously indicated, to contact inhibition of cell growth. The more pathological the growth of the malignant cells, the lower the inhibition of contact and the more malignin becomes the predominant protein.

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Claims (1)

PatentansprücheClaims 1. Verfahren zur Herstellung von Astrocytin, dadurch gekennzeichnet, daß man Gehirngliomtumorgewebe unter wiederholter Aufbrechung des Gewebes mit einem neutralen Puffer extrahiert, um Proteinfraktionen aufzulösen bzw. zu solubilisieren, aus dem resultierenden Extrakt der aufgelösten bzw. solubilisierten Proteine die Fraktion mit einem pK-Bereich von etwa 1 bis 4 abtrennt und daß man daraus ein Produkt mit einem Molekulargewicht von etwa 8000 isoliert.1. Process for the production of astrocytin, thereby characterized in that brain glioma tumor tissue with repeated disruption of the tissue with a neutral buffer extracted to dissolve protein fractions or to solubilize, from the resulting extract of the dissolved or solubilized proteins separates the fraction with a pK range of about 1 to 4 and that a Product isolated with a molecular weight of about 8,000. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe der Abtrennung der Fraktion mit einem pK-Bereich von etwa 1 bis 4 in der Weise durchführt, daß man den Extrakt der aufgelösten bzw. solubilisierten Proteine in eine chromatographische Säule gibt und mit steigend sauren Lösungsmitteln eluiert.2. The method according to claim 1, characterized in that the step of separating the fraction with a pK range from about 1 to 4 carried out in such a way that the extract of the dissolved or solubilized proteins in a chromatographic column and eluted with increasing acidic solvents. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Isolierung in der Weise durchführt, daß man das Eluat filtriert, um eine Fraktion zu erhalten, die Astrocytin enthält und daß man das Astrocytin daraus durch eine Dünnschichtgelchromatographie abtrennt.3. The method according to claim 2, characterized in that that the isolation is carried out in such a way that the eluate is filtered to obtain a fraction which Contains astrocytin and that the astrocytin is separated therefrom by thin-layer gel chromatography. 4. Astrocytin, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Weise erhalten worden ist, daß man Gehirngliomt.umorgewebe unter wiederholter Aufbrechung des Gewebes mit einem neutralen Puffer extrahiert, um Proteinfraktionen aufzulösen bzw. zu solubilisieren, aus dem resultierenden Extrakt der aufgelösten bzw. solubilisierten Proteine die Fraktion mit einem pK-Bereich von etwa 1 bis 4 abtrennt und daß man daraus ein Produkt mit einem Molekulargewicht von etwa 8000 isoliert.4. Astrocytin, characterized in that it has been obtained in such a way that one brain gliomt.umor tissue extracted with repeated disruption of the tissue with a neutral buffer in order to dissolve protein fractions or to solubilize, from the resulting extract of the dissolved or solubilized proteins, the fraction with a pK range of about 1 to 4 is separated and that one a product with a molecular weight of about 8,000 was isolated therefrom. 609835/1070609835/1070 5. Astrocytin, dadurch gekennzeichnet, daß es mit seinem spezifischen Antikörper bei quantitativen Präzipitin- bzw. Koagülintests und Ouchterlony-Geldiffusionstests ein Einzellinienpräzipitat bzw. einen Einzellinienniederschlag bildet, daß es in Wasser und wäßrigen Lösungen mit einem sauren oder neutralen pH-Wert löslich und bei einem alkalischen pH-Wert unlöslich ist, daß es eine Wellenlänge des spektropho tome tr i sehen Absorptionspeaks von 280 m /a hat und daß es ein Molekulargewicht von etwa 8000 aufweist.5. Astrocytin, characterized in that it forms a single line precipitate or a single line precipitate with its specific antibody in quantitative precipitin or coagulin tests and Ouchterlony gel diffusion tests that it is soluble in water and aqueous solutions with an acidic or neutral pH and at an alkaline pH is insoluble, that it has a wavelength of the spectropho tome tr i see absorption peaks of 280 m / a and that it has a molecular weight of about 8000. (6y Astrocytin nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es ungefähr die folgende Aminosäurenzusammensetzung hat:(6y astrocytin according to claim 4 or 5, characterized in that that it has approximately the following amino acid composition: Ungefähre Anzahl der Reste Approximate number of remains Asparaginsäure 9Aspartic acid 9 Threonin 5Threonine 5 Serin 6Serine 6 Glutaminsäure . 13Glutamic acid. 13th Prolin 4Proline 4 Glycin 6Glycine 6 Alanin 9Alanine 9 Valin 4Valine 4 1/2 Cystein 21/2 cysteine 2 Methionin 1Methionine 1 Isoleucin 2Isoleucine 2 Leucin 8Leucine 8 Tyrosin 2Tyrosine 2 Phenylalanin 3Phenylalanine 3 Lysin 8Lysine 8 Histidin ' 2Histidine '2 Arginin __4Arginine __4 ungefähre Gesamtzahl 88approximate total 88 609835/1070609835/1070 wobei die Aminosäuren Cysteinsäure, Hydroxyprolin, Norleucin, Ammoniak, Isodesmosin, Desmosin, Hydroxylysin, Lysinonorleucin und γ-Aminobuttersäure in erfaßbaren Mengen nicht vorhanden sind.where the amino acids cysteic acid, hydroxyproline, norleucine, Ammonia, isodesmosine, desmosine, hydroxylysine, lysinonorleucine and γ-aminobutyric acid are not present in measurable quantities are. 7. Astrocytin nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es dazu imstande ist, mit Bromacetylcellulose unter Bildung von Bromacetylcellulose-Astrocytin einen Komplex zu bilden und nach Injizierung in Säugetiere die spezifischen Antikörper Anti-Astrocytin zu bilden, wobei das Anti-Astrocytin in vitro gegenüber Gehirnttimorzellen toxisch ist und eine Fluoreszenz von Gliomzellen ergibt, wenn eine Kupplung mit Fluoreszein durchgeführt wird.7. astrocytin according to any one of claims 4 to 6, characterized in that it is able to with bromoacetyl cellulose to form a complex to form bromoacetylcellulose-astrocytin and after injection into mammals to form the specific antibodies anti-astrocytin, wherein the anti-astrocytin in vitro against brain timor cells is toxic and gives fluorescence of glioma cells when coupled with fluorescein will. 8. Verfahren zur Herstellung von Malignin, dadurch gekennzeichnet, daß man künstliche Krebszellen, die in einer Fermentationskultur gewachsen sind, mit einem neutralen Puffer unter wiederholter Aufbrechung der Gewebe, um die8. A process for the production of malignin, characterized in that that artificial cancer cells, which have grown in a fermentation culture, can be mixed with a neutral Buffer with repeated disruption of the tissues in order to obtain the Proteinfraktionen aufzulösen bzw. zu solubilisieren, extrahiert, aus dem resultierenden Extrakt die Fraktion mit einem pK-Bereich von etwa 1 bis 4 abtrennt und daß man daraus das Produkt mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 gewinnt.To dissolve or solubilize protein fractions, extract the fraction from the resulting extract a pK range of about 1 to 4 and that the product with a molecular weight of about 10,000 wins. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe der Abtrennung der Fraktion mit einem pK-Bereich von etwa 1 bis 4 in der Weise durchführt, daß man den Extrakt der aufgelösten bzw. solubilisierten Proteine in eine chromatographische Säule gibt und mit steigend sauren Lösungsmitteln eluiert.9. The method according to claim 8, characterized in that the step of separating the fraction with a pK range from about 1 to 4 carried out in such a way that the extract of the dissolved or solubilized proteins in a chromatographic column and eluted with increasing acidic solvents. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Isolierung in der Weise durchführt, daß man das Eluat filtriert, um eine Fraktion zu erhalten, die10. The method according to claim 9, characterized in that that the isolation is carried out in such a way that the eluate is filtered to obtain a fraction which 609835/1070609835/1070 - ⁶¹ - 260625?- ⁶¹ - 260625? Methionin 2Methionine 2 Isoleucin 4Isoleucine 4 Leucin 8 Tyrosin . 3Leucine 8 Tyrosine. 3 Phenylalanin 3Phenylalanine 3 Lysin 6Lysine 6 Histidin 2Histidine 2 Arginin __5Arginine __5 ungefähre Gesamtzahl 89approximate total number 89 wobei die Aminosäuren Cysteinsäure, Hydroxyprolin, Norleucin, Ammoniak, Isodesmosin, Desmosin, Hydroxylysin, Lysinonorleucin und γ-Aminobuttersäure in erfaßbaren Mengen nicht vorhanden sind.where the amino acids cysteic acid, hydroxyproline, norleucine, Ammonia, isodesmosine, desmosine, hydroxylysine, lysinonorleucine and γ-aminobutyric acid in detectable Quantities are not available. 14. Malignin nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es dazu imstande ist, mit Bromacetylcellulose unter Bildung von Bromacetylcellulose-Malignin einen Komplex zu bilden und nach Injizierung in Säugetiere die spezifischen Antikörper. Anti-Malignin zu bilden, wobei das Anti-Malignin in vitro gegenüber Gehirntumorzellen toxisch ist und eine Fluoreszenz von Gliomzellen ergibt, wenn eine Kupplung mit Fluoreszein durchgeführt wird.14. Malignin according to any one of claims 11 to 13, characterized in that it is capable of doing so with bromoacetyl cellulose to form a complex to form bromoacetylcellulose malignin and after injection into mammals the specific antibodies. Anti-malignin form, the anti-malignin being used in vitro against brain tumor cells is toxic and gives fluorescence of glioma cells when coupling with fluorescein is performed. 15. Verfahren zur Herstellung von langsam am Target haftendem Globulin (S-TAG), dadurch gekennzeichnet, daß man Blutserum oder eine andere Körperflüssigkeit mit Bromacetylcellulose-Astrocytin oder Bromacetylcellulose-Malignin ungefähr 2 Stunden oder mehr bei niedriger Temperatur, um Zersetzungsreaktionen zu vermeiden, umsetzt und daß man das resultierende Material mit verdünnter Säure behandelt, um daraus S-TAG abzuspalten.15. Process for the production of globulin (S-TAG) which adheres slowly to the target, characterized in that one Blood serum or other body fluid containing bromoacetylcellulose astrocytin or bromoacetylcellulose malignin approximately 2 hours or more at low temperature in order to avoid decomposition reactions, and that one the resulting material is treated with dilute acid to cleave S-TAG therefrom. "609835/1070"609835/1070 Astrocytin enthält, und daß man das Astrocytin daraus durch eine DUnnschichtgelchromatographie abtrennt.Contains astrocytin, and that you can get the astrocytin from it a thin layer gel chromatography separates. 11. Malignin, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Weise hergestellt worden ist, daß man künstliche Krebszellen, die in einer Fermentationskultur gewachsen sind, mit einem neutralen Puffer unter wiederholter Aufbrechung der Gewebe, um die Proteinfraktionen aufzulösen bzw. zu solubilisieren, extrahiert, aus dem resultierenden Extrakt die Fraktion mit einem pK-Bereich von etwa 1 bis 4 abtrennt und daß man daraus das Produkt mit einem Molekulargewicht von etwa11. Malignin, characterized in that it has been produced in such a way that one artificial cancer cells that grown in a fermentation culture with a neutral buffer with repeated disruption of the tissues in order to to dissolve or solubilize the protein fractions, extract the fraction from the resulting extract a pK range of about 1 to 4 and that the product with a molecular weight of about 10 000 gewinnt.10,000 wins. 12. Malignin, dadurch gekennzeichnet, daß es mit seinem spezifischen Antikörper bei quantitativen Präzipitin- bzw. Koagulintests und Ouchterlony-Geldiffusionstesti* ^ein Einzellinienpräzipitat bzw. einen Einzelliniennieder-schlag bildet, daß es in Wasser und wäßrigen Lösungen mit Einern sauren oder neutralen pH-Wert löslich und bei eineai alkalischen pH-Wert unlöslich ist, daß es eine Wellenlänge des spektro-12. Malignin, characterized in that it is with its specific antibody in quantitative precipitin or Coagulin tests and Ouchterlony gel diffusion tests a single line precipitate or a single line precipitate forms that it is acidic in water and aqueous solutions or soluble at neutral pH and at an alkaline pH insoluble is that there is a wavelength of the spectro- photometrisehen Absorptionspeaks von 280 m /u. hat "und daß es ein Molekulargewicht von etwa 10 000 aufweist.photometric absorption peaks of 280 m / u. and that it has a molecular weight of about 10,000. 13. Malignin nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß es ungefähr die folgende Aminosäuronzusammensetzung hat:13. Malignin according to claim 11 or 12, characterized in that that it has approximately the following amino acid composition Has: Ungefähre Anzahl der Reste Approximate number of remains Asparaginsäure 9Aspartic acid 9 Threonin 5Threonine 5 Serin 5Serine 5 Glutaminsäure 13Glutamic acid 13 Prolin 4Proline 4 Glycin ⁶ Glycine ⁶ Alanin 9Alanine 9 Valin - ⁶ Valine - ⁶ 1/2 Cystein 609835/1070 ¹ ·■■ ■-=■1/2 cysteine 609835/1070 ¹ · ■■ ■ - = ■ 16. Langsam am Target haftendes Globulin (S-TAG), dadurch gekennzeichnet, daß es in der Weise hergestellt worden ist, daß man Blutserum oder eine andere Körperflüssigkeit mit Bromacetylcellulose-Astrocytin oder Bromacetylcellulose-Malignin ungefähr 2 Stunden oder mehr bei niedriger Temperatur, um Zersetzungsreaktionen zu vermeiden, umsetzt und daß man das resultierende Material mit verdünnter Säure behandelt, um daraus S-TAG abzuspalten.16. Globulin slowly adhering to the target (S-TAG), characterized in that it has been produced in the manner is that blood serum or another body fluid with bromoacetylcellulose-astrocytin or bromoacetylcellulose-malignin about 2 hours or more at a low temperature to avoid decomposition reactions and treating the resulting material with dilute acid to cleave S-TAG therefrom. 17. Langsam am Target haftendes Globulin (S-TAG), dadurch gekennzeichnet, daß es in wäßrigen gepufferten Lösungen löslich ist, daß es mit Astrocytin oder Malignin bei Ouchterlony-Geldiffusionstests ein Einzellinienpräzipitat bzw. einen Einzellinienniederschlag bildet, daß es durch Cellophanmembranen nicht dialysierbar ist, daß es durch Milliporenfilter zurückgehalten wird , welche Moleküle mit einem Molekulargewicht von über 25 000 zurückhalten, daß es Molekulargewichte in unterschiedlichen Aggregationszuständen, bestimmt durch eine Dünnschichtgelchromatographie von ungefähr 50 000 und Vielfachen davon im Makroglobulinbereich, besitzt und daß es eine Wellenlänge des spektrophotometrisehen Absorptionspeaks von 280 m/U aufweist.17. Globulin slowly adhering to the target (S-TAG), characterized in that it is in aqueous buffered solutions What is soluble is that there is a single line precipitate with astrocytin or malignin in Ouchterlony gel diffusion tests or a single line precipitate that it is not dialyzable through cellophane membranes that it is through Millipore filters are retained, which retain molecules with a molecular weight of over 25,000 that es molecular weights in different states of aggregation, determined by thin layer gel chromatography of about 50,000 and multiples thereof in the macroglobulin range, and that it has a wavelength of spectrophotometry Has absorption peaks of 280 m / U. 18. Verfahren zur Herstellung von schnell am Target haftendem Globulin (F-TAG), dadurch gekennzeichnet, daß man Blutserum oder eine andere Körperflüssigkeit mit Bromacetylcellulose-Astrocytin oder Bromacetylcellulose-Malignin ungefähr 10 Minuten bei niedriger Temperatur, um Zersetzungsreaktionen zu vermeiden, umsetzt und daß man das resultierende Material mit verdünnter Säure behandelt, um daraus F-TAG abzuspalten.18. A method for the production of globulin (F-TAG) which adheres quickly to the target, characterized in that one blood serum or another body fluid containing bromoacetylcellulose-astrocytin or bromoacetylcellulose-malignin about 10 minutes at low temperature in order to avoid decomposition reactions, and that one treated the resulting material with dilute acid to cleave F-TAG therefrom. 609835/1070609835/1070 19. Schnell am Target haftendes Globulin (F-TAG), dadurch gekennzeichnet, daß es in der Weise hergestellt worden ist, daß man Blutserum oder eine andere Körperflüssigkeit mit Bromacetylcellulose-Astrocytin oder Bromacetylcellulose-Malignin ungefähr 10 Minuten bei niedriger Temperatur, um Zersetzungsreaktionen zu- vermeiden, umsetzt und daß man das resultierende Material mit verdünnter Säure behandelt, um daraus F-TAG abzuspalten.19. Globulin (F-TAG) adhering quickly to the target, characterized in that it has been produced in this way is that blood serum or another body fluid with bromoacetylcellulose-astrocytin or bromoacetylcellulose-malignin about 10 minutes at low temperature in order to avoid decomposition reactions, and that one treated the resulting material with dilute acid to cleave F-TAG therefrom. 20. Schnell am Target haftendes Globulin (F-TAG), dadurch gekennzeichnet, daß es in wäßrigen gepufferten Lösungen löslich ist, daß es mit Astrocytih oder Malignin bei Ouchterlony-Geldiffusionstests ein Einzellinienpräzipitat bzw. einen Einzellinienniederschlag bildet, daß es durch Cellophanmembranen nicht dialysierbar ist, daß es durch Milliporenfilter zurückgehalten wird, welche Moleküle mit einem Molekulargewicht von über 25 000 zurückhalten, daß es Molekulargewichte in unterschiedlichen Aggregationszuständen, bestimmt durch eine Dünnschichtgelchromatographie von ungefähr 50 000 und Vielfachen davon im Makroglobulinbereich, besitzt und daß es eine Wellenlänge des spektrophotometrisehen Absorptionspeaks von 280 m/u. aufweist.20. Globulin (F-TAG) adhering quickly to the target, characterized in that it is soluble in aqueous buffered solutions, that it forms a single-line precipitate or a single-line precipitate with Astrocytih or malignin in Ouchterlony gel diffusion tests, so that it cannot be dialyzed through cellophane membranes that it is retained by millipore filters which retain molecules with a molecular weight of over 25,000, that it has molecular weights in different aggregation states, determined by thin-layer gel chromatography, of approximately 50,000 and multiples thereof in the macroglobulin range, and that it has a spectrophotometric absorption peak wavelength of 280 m / u. having. 21. Verfahren zur Erfassung von Krebstumoren in lebenden Säugetieren, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration von S-TAG und F-TAG bestimmt, die durch ein bekanntes Volumen des Blutserums des Säugetiers oder einer anderen Körperflüssigkeit erzeugt worden ist.21. Method for the detection of cancerous tumors in living Mammals, characterized in that the concentration of S-TAG and F-TAG is determined by a known Volume of the mammalian blood serum or other body fluid has been generated. 22. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es die physikochemisehen Eigenschaften von Astrocytin hat und daß es ein Molekulargewicht besitzt, das ungefähr durch die Formel22. Product, characterized in that it has the physico-chemical properties Has properties of astrocytin and that it has a molecular weight approximated by the formula 4000 + 200X = Y4000 + 200X = Y B09835/1070B09835 / 1070 definiert ist, worin Y das Molekulargewicht des Produkts und X eine ganze Zahl von O bis 19 bedeutet.where Y is the molecular weight of the product and X is an integer from 0-19. 23. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es die physikochemisehen Eigenschaften von Malignin hat und daß es ein Molekulargewicht besitzt, das ungefähr durch die Formel23. Product, characterized in that it has the physico-chemical properties Has properties of malignin and that it has a molecular weight approximated by the formula 5000 + 200 X=Y5000 + 200 X = Y definiert ist, worin Y das Molekulargewicht des Produkts und X eine ganze Zahl von 0 bis 19 bedeutet.where Y is the molecular weight of the product and X is an integer from 0-19. 24. Verfahren zur Herstellung von Anti-Astrocytin, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Säugetier eine Antikörperreaktion gegenüber Astrocytin induziert.24. Process for the preparation of anti-astrocytin, characterized in that an antibody reaction is carried out in a mammal induced against astrocytin. 25. Verfahren zur Herstellung von Bromacetylcellulose-Recognin, dadurch gekennzeichnet, daß man Recognin mit Bromacetylcellulose in geeigneter Weise vermischt, daß ein Komplex gebildet wird, wobei man das Recognin aus der Gruppe Astrocytin und Malignin auswählt.25. A process for the preparation of bromoacetylcellulose-Recognin, characterized in that one Recognin with bromoacetylcellulose mixed in a suitable manner that a complex is formed, the Recognin being selected from the group Selects astrocytin and malignin. 26. Verfahren zur Herstellung von Bromacetylcellulose-Recognin-Anti-Recognin, dadurch gekennzeichnet, daß man Anti-Recognin mit Bromacetylcellulose-Recognin in geeigneter Weise, daß ein Komplex gebildet wird, umsetzt, wobei man das Recognin aus der Gruppe Astrocytin und Malignin auswählt.26. Process for the production of bromoacetylcellulose-Recognin-Anti-Recognin, characterized in that anti-recognin with bromoacetylcellulose-recognin in a suitable Way that a complex is formed, converts the Recognin from the group Astrocytin and Malignin selects. 27. Verfahren zur Herstellung von Anti-Recognin, dadurch gekennzeichnet, daß man Bromacetylcellulose-Recognin-Anti-Recognin durch eine hydrolytische Behandlung mit einer Säure oder einem Proteinaseenzym dekomplexiert, wobei man das Recognin aus der Gruppe Astrocytin und Malignin auswählt,27. A process for the preparation of anti-recognin, characterized in that bromoacetylcellulose-recognin-anti-recognin decomplexed by hydrolytic treatment with an acid or a proteinase enzyme, whereby one selects the Recognin from the group astrocytin and malignin, 609835/1 070609835/1 070 -3. HAi 1375-3. HAi 1375 Samuel Bogoch * 1203 AW/MYSamuel Bogoch * 1203 AW / MY (Neuer) Patentanspruch 30(New) claim 30 30. Mittel zur Erhöhung der Ausbeute an TAG-Produkten von Säugetieren, dadurch gekennzeichnet, daß es eine immunologisch wirksame Dosis eines Stoffs aus der Gruppe Recognine, Anti-Recognine und mit Trägern in einen Komplex überführte Recognine enthält.30. Means for increasing the yield of TAG products from mammals, characterized in that there is an immunological effective dose of a substance from the group Recognine, Anti-Recognine and complexed with carriers Contains Recognine. 609835/1070609835/1070 28. Verfahren zur Herstellung von Anti-Malignin, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Säugetier eine Antikörperreaktion gegenüber Malignin induziert.28. Process for the manufacture of anti-malignin, thereby characterized in that an antibody response to malignin is induced in a mammal. 29. Verfahren zur Diagnose des Vorhandenseins von glialen Tumorzellen in histologisehen Schnitten, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stoff aus der Gruppe fluoreszein-kombiniertes bzw. -konjugiertes TAG und fluoreszein-kombiniertes bzw. -konjugiertes Anti-Recognin auf den Schnitt aufbringt, wobei eine Fluoreszenz nur mit den glialen Tumorzellen auftritt und wobei man das Recognin aus der Gruppe Astrocytin und Malignin auswählt.29. A method for diagnosing the presence of glial tumor cells in histological sections, characterized in that that a substance from the group fluorescein-combined or -conjugated TAG and fluorescein-combined or -conjugated anti-recognin is applied to the incision, fluorescence occurring only with the glial tumor cells and wherein the recognin is selected from the group astrocytin and malignin. E.j von Säugetieren, dadurch gekennzeichnet^-daß^fianeine immunologisch wirksame Dosj^^-eines^Stoffes aus der Gruppe Recognine, ^Anti^Reciignine und mit Trägern in einen Komplex i—Ej of mammals, characterized ^ -that ^ fianeine immunologically effective Dosj ^^ - a ^ substance from the group Recognine, ^ Anti ^ Reciignine and with carriers in a complex i - 31. Recognine, dadurch gekennzeichnet, daß sie dazu imstande sind, nach Injektion in Säugetiere Anti-Recognine zu erzeugen, wobei die Anti-Recognine gegenüber Tumorzellen' in vitro toxisch sind und in Tumorzellen bei der Kupplung mit Fluoreszein eine Fluoreszenz ergeben.31. Recognine, characterized in that they are capable of anti-Recognine after injection into mammals produce, the anti-recognins being toxic to tumor cells' in vitro and in tumor cells with the coupling Fluorescein give a fluorescence. 32. Verfahren zur Herstellung von Malignin, dadurch gekennzeichnet, daß man den Malignin-Vorlaufer in einer Fermentationskultur von künstlichen Krebszellen herstellt, daß man eine den Malignin-Vorläufer enthaltende Rohfraktion herstellt, daß man aus der Malignin enthaltenden Rohfraktion ein gereinigtes Maligninprodukt herstellt und daß man die Fermentationskultur der künstlichen Krebszellen in großdimensionierten Wachstumsbehältern züchtet. 32. A process for the production of malignin, characterized in that that the malignin precursors in a fermentation culture of artificial cancer cells that a crude fraction containing the malignin precursor is produced produces that a purified malignin product is produced from the crude fraction containing malignin and that the Fermentation culture of the artificial cancer cells grows in large-sized growth containers. 609835/1070609835/1070 33. Verfahren zur Herstellung von Recogninen, dadurch gekennzeichnet, daß man normales oder erkranktes Gewebe mit
einem neutralen Puffer unter wiederholter Aufbrechung des
Gewebes, um die Proteinfraktionen aufzulösen oder zu solubilisieren, extrahiert, aus dem resultierenden Extrakt der aufgelösten bzw. solubilisierten Proteine die Fraktion mit einem pK-Bereich von etwa 1 bis 4 abtrennt und dall man daraus ein Produkt mit einem Molekulargewicht von etwa 3000 bis33. A process for the production of Recogninen, characterized in that normal or diseased tissue with
a neutral buffer with repeated breaking of the
Tissue, in order to dissolve or solubilize the protein fractions, extracted from the resulting extract of the dissolved or solubilized proteins, the fraction with a pK range of about 1 to 4 and then a product with a molecular weight of about 3000 to 25 000 isoliert.25,000 isolated. 34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe der Abtrennung der Fraktion mit einem pK-Bereich von etwa 1 bis 4 in der Weise durchführt, daß man
den Extrakt der aufgelösten bzw. solubilisierten Proteine
in eine chromatographische Säule gibt und. mit steigend
sauren Lösungsmitteln eluiert.34. The method according to claim 33, characterized in that the step of separating the fraction with a pK range of about 1 to 4 is carried out in such a way that
the extract of the dissolved or solubilized proteins
in a chromatographic column and. with increasing
acidic solvents eluted. 35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß man die Isolierung in der Weise durchführt, daß man das Eluat filtriert, um eine Fraktion zu erhalten-, die Recognin enthält und daß man das Recognin daraus _tdurch eine Dünnschichtgelchromatographie abtrennt.35. A method according to claim 34, characterized in that the isolation is carried out in a manner that is filtered, the eluate containing a fraction to erhalten-, the Recognin and that the Recognin thereof _t are separated by a Dünnschichtgelchromatographie. 36. Recognin, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Weise hergestellt worden ist, daß man normales oder erkranktes Gewebe mit einem neutralen Puffer unter wiederholter Aufbrechung des Gewebes, um die Proteinfraktionen aufzulösen oder zu solubilisieren, extrahiert, aus dem resultierenden Extrakt der aufgelösten bzw. solubilisierten Proteine die Fraktion mit einem pK-Bereich von etwa 1 bis 4 abtrennt und daß man daraus ein Produkt mit einem Molekulargewicht von etwa36. Recognin, characterized in that it has been produced in such a way that one normal or diseased tissue with a neutral buffer with repeated disruption of the tissue to dissolve the protein fractions or to solubilize, extracted the fraction from the resulting extract of the dissolved or solubilized proteins with a pK range of about 1 to 4 and that a product with a molecular weight of about 3000 bis 25 000 isoliert.3,000 to 25,000 isolated. 37. Recognin, dadurch gekennzeichnet, daß es mit seinem spezifischen Antikörper bei quantitativen Präzipitin- bzw.37. Recognin, characterized in that it with its specific antibody in quantitative precipitin or 609835/1070609835/1070 Koagulintests und Ouchterlony-Geldiffusionstests ein Einzellinienpräzipitat bzw. einen Einzellinienniederschlag bildet, daß es in Wasser und wäßrigen Lösungen mit einem sauren oder neutralen pH-Wert löslich und bei einem alkalischen pH-Wert unlöslich ist, daß es eine Wellenlänge des spektrophotometrischen Absorptionspeaks von 280 m ,u hat und daß es ein Molekulargewicht von etwa 3000 bis 25 000 aufweist.Coagulin tests and Ouchterlony gel diffusion tests a single line precipitate or a single line precipitate that it forms in water and aqueous solutions with an acidic or neutral pH is soluble and insoluble at an alkaline pH that it is a wavelength of spectrophotometric Has absorption peaks of 280 µm and that it has a molecular weight of about 3,000 to 25,000. 608835/1070608835/1070