DE2551004A1

DE2551004A1 - Glukoseanalyse

Info

Publication number: DE2551004A1
Application number: DE19752551004
Authority: DE
Inventors: Don Norman Gray; Melvin Hubert Keyes; Chung Chang Young
Original assignee: Owens Illinois Inc
Current assignee: OI Glass Inc
Priority date: 1975-11-13
Filing date: 1975-11-13
Publication date: 1977-05-26

Description

Glukoseanalyse
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung und Analyse von Glukose. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Analyse von Glukose in physiologischen Medien, wie zum Beispiel Elut und Urin, und anderen wäßrigen Proben, die von medizinischem und industriellem Interesse sind.
Im medizinischen Bereich liegt ein großer Bedarf an einem schnellen und genauen analytischen Verfahren zur Bestimmung von Glukose im Blutserum heutzutage vor. Als Ergebnis der jüngsten Fortschritte in der Enzym-Chemie wurde der Entwicklung analytischer Methoden für Glukose, die auf der enzymatischen Oxidation von Glukose in Gegenwart von Glukose-Oxidase basieren, viel Aufmerksamkeit gewidmet. Die Reaktion läuft entsprechend folgender Gleichung ab: Glukose + Sauerstoff Glukose-Oxidase Glukonsäure + Wasserstoffperoxid.
Diese Gleichung ist eine Vereinfachung des komplexen Gleichgewichtes, das zwischen den Alpha- und Beta-Anomeren der Glukose, Wasserstoffperoxid, Glukolacton, und Glukonsäure in Gegenwart von Glukose-Oxidase vorliegt, und zeiot, daß die Glukose als Funktion des Sauerstoffverbrauches oder der Zunahme an Wasserstoffperoxid oder Glukonsäure gemessen werden kann, Viele Verfahren, die auf dieser Gleichung beruhen, sind bisher beschrieben worden. Wie aus der folgenden Erläuterung deutlich wird, unterliegen diese Verfahren einer oder mehreren ernstlichen Beschränkungen, die ihre Verwendung im klinischen Labor beeinträchtigen. Viele dieser Ausführungsarten beinhalten einen Massentransport von entweder Sauerstoff oder Glukose durch eine semipermeable Membran und durch eine Membran-Flüssigkeit-Grenzfläche und sind dadurch nur mit Einschränkungen anwendbar.
Ein solches Verfahren ist beschrieben in dem Artikel "An Enzyme Electrode for the Amperometric Determination of Glucose" von G. G, Guilbault und G.J. Lubrano in Analytica Chimica Acta 64, (1973) Seiten 439-455. Dieser Artikel beschreibt ein Enzym-Elektrodenverfahren zur Bestimmung- von Glukose durch direkte amperometrische Messung von Wasserstoffperoxid. Die Enzymelektrode ist so aufgebaut, daß Glukose-Oxidase in oder unter einer glukosepermeablen Membran auf einer polarographischen Elektrode immobilisiert wird. Wenn diese Elektrode in eine Glukoselösung gebracht wird, diffundiert Glukose durch die Membran, wo sie durch die Glukose-Oxidase oxidiert wird, um Wasserstoffperoxid zu ergeben.
Während diese Vorrichtunq für viele Zwecke geeignet ist, ist sie von sich aus durch die Permeation der Glukose durch die Membran begrenzt. Außerdem macht die Immobilisierung der Glukose-Oxidase direkt auf der Elektrode eine Auswechslung oder Instandsetzung der vollständigen Elektrodenanordnung notwendig, im Fall daß die Glukose-Oxidase denaturiert wird.
Dies kann in einem modernen analytischen Labor, wo einige Hundert Blutproben täglich bearbeitet werden, zeitraubend und teuer sein.
US-Patent 3 539 455 offenbart ein anderes polarographisches Membran-Elektrodenverfahren zur Glukoseanalyse. Nach dieser Ausführungsart durchdringt die Glukose der Probe eine Membran, um mit einer Menge einer Lösung löslicher Glukoseoxidase zu reagieren, um Wasserstoffperoxid zu erzeugen, das polarographisch gemessen wird. Diese Arbeitsweise ist meinbranabhängig und entsprechend beschränkt und setzt keine immobilisierten Enzyme ein.
Viele andere polarographische Membranverfahren sind vorgeschlagen worden, bei denen die enzymatische Oxidation von Glukose zu Glukonsäure und Wasserstoffperoxid als Funktion der verbrauchten Sauerstoffmenge gemessen wird. Solche Verfahren verwenden normalerweise eine Sauerstoffelektrode mit einer Membran des Typs, der im US-Patent 2 913 836 offenbart worden ist. Solche Verfahren werden in den US-Patenten 3 512 517; 3 542 662; sowie in den Artikeln "A New Principle of Enzymatic Analysis" von H.U.
Bergmeyer und A. Hagen aufgezeigt, die in der Z. Anal. Chem.
261, 333-336, (1972) erschienen sind; sowie "The Enzyme Electrode" von S.J. Updike und G.P. Hicks, erschienen in Nature, Vol. 214, 986-988, (1967); Studies on Conditions for the Polarographic Determination of Glucose with Glucose Oxidase" von M. Jemmali und R. Rodriquez-Kabana, erschienen in Clinica Chimica Acta 42 (1972) 153-159; und "Immobilized Enzymes A Prototype Apparatus for Oxidase Enzymes in Chemical Analysis Utilizing Covalently Bound Glucose Oxidase" von M.K.
Weibel, W. Dritschilo, H.J. Bright und A.E. Humphrey, erschienen in Analytical Biochemistry 52, 402-414 (1973).
Diese Meßverfahren sind von sich aus durch die Diffusion des Sauerstoffs durch eine permiselektive Membran begrenzt.
Im US-Patent 3 707 455 wird eher ein potentiometrisches als ein polarografisches Verfahren gezeigt, bei dem die Glukose eine Membran zur Reaktionskammer durchdringt, die lösliche Glukose-Oxidase enthält, und die entstandene Zunahme an Glukonsäure wird potentiometrisch ermittelt.
Andere Ausführungsarten von allgemeinerem Interesse, die die Glukose als Funktion verschiedener sekundärer chemischer Reaktionen messen, werden in den US-Patenten 3 591 480; 3 623 960; 3 770 607 offenbart, sowie in den Artikeln "Electrochemical-Enzymatic Analysis of Blood Glucose and Lactate" von D.L. Williams, A.R. Doig, Jr., und A. Korosi, erschienen in Analytical Chemistry, Vol. 42, No. 1, (1970); "Ion-Electrode Based Automatic Glucose Analysis System?1 von R.A. Lienado und G.A. Rechnitz, erschienen in Analytical Chemistry, Vol. 45, No. 13, (1973); und Enzyme Electrode for Glucose Based on an Iodide Membrane Sensor" von G. Nagy, L.H. Von Storp und G.G. Guilbault, erschienen in Analytical Chimica Acta, 66, (1973), 443-455.
Bei den oben beschriebenen bekannten polarografischen Systemen zur Messung von Glukose, bei denen Wasserstoffperoxid direkt bestimmt wird, wird immer eine Membran wegen der möglichen Beeinflussung und der Vergiftung der Elektrode mit Fremdstoffen aus der Probe benötigt. Die vorliegende Erfindung sieht ein analytisches Verfahren für Glukose durch direkte polarografische Bestimmung von Wasserstoffperoxid vor, das keine Membran benötigt.
Bei der vorliegenden Erfindung durchläuft eine geringe Menge der Glukoseprobe, verglichen mit dem Volumen eines beständig fließenden wäßrigen, gepufferten Verdünnungsstroms, durch eine Reaktionskammer, die eine Schicht immobilisierter Glukoseoxidase enthält, wo sie zu Wasserstoffperoxid oxidiert wird, während sie die Schicht durchdringt oder durchsickert. Die Reaktionskammer besitzt einen Probeneinlaß und einen Reaktionsprodukt-Auslaß. Der Strom des Reaktionsproduktes führt von der Kammer zu einer polarografischen Zelle. Dies bewirkt eine kurze Berührungszeit zwischen den Elektroden und der Glukoseprobe, und eine Elektrodenbeeinflussung und Vergiftung ist nicht wesentlich, so daß eine Membran nicht benötigt wird. Die Elektrode spricht sehr viel schneller an, und die Empfindlichkeit und die Reproduzierbarkeit sind bei der vorliegenden Erfindung gesteigert, vergl-ichen mit den Verfahren, die durch einen Membran-Diffusionsschritt beschränkt sind.
Dementsprechend bewältigt die vorliegende Erfindung diese Nachteile des Standes der Technik dadurch, daß sie eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Oxidation von Glukose schafft, bei denen die Glukose in einer Schicht immobilisierter Glukoseoxidase unter Bildung von Masserstoffperoxid und Glukonsäure oxidiert, danach das entstandene Wasserstoffperoxid in einer polarographischen Zelle direkt polarographisch bestimmt und anschließend der polarographische Meßwert auf- das Glukoseäquivalent der ursprünglichen Probe umgerechnet wird.
Eines der wesentlichen Merkmale der vorliegenden Erfindunq liegt darin, daß die Schicht der immobilisierten Glukose-Oxidase physikalisch von der polarographischen Zelle getrennt ist. Dies stellt eine bedeutende Verbesserung gegenüber den oben besprochenen Typen von Enzymelektroden dar, bei denen Wasserstoffperoxid eine Membran durchdringen muß, die den Fühlteil der polarographischen Elektrode abschirmt.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Zeichnungen näher beschrieben.
Es zeigen: Fig. 1 ein schematisches Flie-ßdiagramm eines Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung: Fign. 2 und 3 schematische Fließdiagramme, die die Einzelheiten von polarographischen Zellen, die in Verbindung mit Fig. I verwendet werden können, zeigen.
Nach Fiq.. 1 strömt eine wäßrige Probe, die Glukose enthält, in eine Reaktionskammer, die eine Schicht immobilisierter Glukose-Oxidase enthält, wo die Probe genügend lange bei ausreichender Temperatur gehalten wird, um die Glukose zu Glukonsäure und Wasserstoffperoxid zu oxidieren. Die Reaktionskammer ist mit einem Probeneinlaß und einem Reaktionsprodukt-Auslaß ausgerüstet.
Kennzeichaenderweise läuft diese Oxidation innerhalb weniger Sekunden bis 30 Minuten oder langer bei TemPeraturen im Bereich von 0°C bis etwa 500C vollständig ab. Eine Zei-tspanne von weniger als 1 Minute bei Paumtemperatur reicht normalerweise zur Oxidation der Glukose aus.
Da die Glukose-Oxidase ihre beste Wirkung zur Oxidation von Glukose im; pH-Bereich von 4 bis 8 hat, wird die Glukose-Probe vor dem Kontakt mit der Glukose-Oxidase mit einem wäßrigen Verdünner verdünnt, der gepuffert ist, um zu verhindern, daß sein pH-Wert aus dem pH-Bereich auswandert, in welchem die Glukose-Oxidase ihre beste Wirkung zur Oxidation von Glukose hat, Vorzugsweise liegt zwecks nuten Wirkungsgrad der Oxidation der Glukose durch Glukose-Oxidase der pH-Wert des gepufferten Verdünners im Bereich von etwa 5 bis 7. Als Verdünner besonders geeignet sind wäßrige, gepufferte Lösungen von Natriumacetat und Essigsäure, Andere geeignete Puffer sind unter anderem Natriumcitrat und wasserlösliche Phosphate und Phthalat-Salze in 0,001 bis 0,5-molarer Konzentration.
Der für diese Oxidationsreaktion benötigte Sauerstoff wird durch die Sauerstoff-Konzentration, die normalerweise in der Glukoseprobe und dem gepufferten Verdünner bei Raumtemperatur gelöst ist, geliefert. Bei dieser Konzentration liegt normalerweise genügend Sauerstoff vor, um ausreichend Glukose für eine verläßliche und reproduzierbare polarographische Erfassung zu oxidieren. Es ist nicht notwendig, daß die gesamte Glukose unter Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert wird. Es ist lediglich notwendig, daß die prozentuale Umwandlung verläßlich und von einem Standard auf unbekannte Proben innerhalb einer gegebenen Anzahl von Laborbedingungen reproduzierhar ist.
Auf diese Weise schafft ein reproduzierbarer Wert einer 60°igen Umwandlung von Glukose eine genaue polarographische Ansprache zum Zweck der Kalibrierung und Analyse. Bei der bevor zugten Ausführungsform wird im wesentlichen die gesamte Glukose oxidiert um Wasserstoff@eroxid zu bilden so daß jeder mögliche Fehler durch Veränderung der Umwandlungsrate von Probe zu Probe beseitigt ist. Um eine solche vollständige Umwandlung von Glukose zu erreichen, kann gewünschtenfalls Zusatz-Sauerstoff aus einer äußeren Quelle (z.B. eine Einblasvorrichtung für Sauerstoff oder ein Sauerstoff enthaltendes Gas) in die Probe eingeführt werden, obwohl dies selten erforderlich ist, Geringe Schwankungen können in der Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der Glukoseprobe und im gepufferten Verdünner als eine Funktion der Veränderungen im Druck oder der Temperatur auftreten. Solche Schwankungen sind unbedeutend, und die Gegenwart von ausreichendem Sauerstoff wird sichergestellt, wenn das Nachweisverfahren1 die Probenmenge und die Konzentrationen, die hier spezifiziert worden sind, verwendet werden. Dies ist ein bedeutender Vorteil gegenüber den Verfahren, die den Glukosegehalt als Funktion der Sauerstoff-Abnahme messen.
Das Verhältnis der Verdünnung der Glukoseprobe im gepufferten Verdünner verändert sich mit der Konzentration der Glukose in der Probe. Bei physiologischen Medien, wie zum Beispiel Blut und Urin, die eine unbekannte Konzentration innerhalb des erwarteten Konzentrationsbereiches besitzen, ist eine Verdünnung von 2,5 Mikroliter der Probe in einem Strom des gepufferten Vordünners, der mit einer Geschwindigkeit von 0,1 bis 5 und vorzugsweise 0,1 bis 2 ml pro Minute fließt, für eine bedeutsame polarografische Empfindlichkeit geeignet. Normalerweise wird wegen der Wirksamkeit und der Wirtschaftlichkeit eine geringe Glukoseprobe (z.B. ungefähr 2 bis 10 Mikroliter) in den Strom des gepufferten Verdünners eingespritzt, der mit einer Geschwindigkeit von 0,1 bis 10 ml pro Minute beim Eintritt in die Schicht der immobilisierten Glukose-Oxidase fließt.
Der gepufferte Verdünner wird durch eine kleine Dosierpumpe üblicher Bauart zum Fließen gebracht.
Es ist wünschenswert, zusätzlich zum Puffern Salze hinzuzufügen, wie z.B. Kaliumchlorid oder Natriumchlorid, die dazu dienen, ein Referenzpotential zu bilden, wenn Silber-Silberchlorid-Referenzelektroden eingesetzt werden, die die Probe als Füll-Lösung verwenden. Ein Bakterien-Inhibitor kann mit dem gepufferten Verdünner vereinigt worden, um die Beeinflussung durch Bakterien zu verringern.
Jedes der bekannten Verfahren zur Immobilisierung von Glokose-Oxidase auf einem unlöslichen Träger unter Bildung einer Schicht immobilisierter Glukose-Oxidase kann bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann Glukose-Oxidase kovalent an einen porösen Glasträger mit einem amino-funktionellen Silan-Kupplungsreagenz gebunden sein, wie in dem Artikel "Immobilized Enzymes: A Prototype Apparatus for Oxidase Enzyme in Chemical Analysis Utilizing Covalently Bound Glucose Oxidase" von M.K. Weibel et al, erschienen in Analytical Biochemistry, 52, 402-414 (1973) offenbart worden ist; Glukose-Oxidase kann auf einer Fullkörpersäule immobilisiert werden, wie im Artikel "A New Principle of Enzymatic Analysis" von H.V. Bergmeyer und A. Hagh,erschienen in Z. Anal. Chem. 261, 333-336 (1972) beschrieben wird; Glukose-Oxidase kann in Polyacryl-Polymeren immobilisiert werden, wie in dem Artikel "Enzyme Electrodes for Glucose Based on an lodide Membrane Sensor von G. Nagy et al, erschienen in Analytica Chemica Acta, 66, (1973), 443-455 beschrieben wird; Glukose-Oxidase kann in einem Polyacrylamid-Gel immobilisiert werden, wie im Artikel "An Enzyme Electrode for the Amperometric Determination of Glucose" von G. Guilbault et al, erschienen in Analytica Chemica Acta 64, (1973), 439-455 or im US-Patent 3 542 662 beschrieben wird; Glukose-Oxidase immobilisiert auf Nickelkieselerdcaluminiumoxid, wie im Artikel "Immobilization of Glucose Oxidase on Nickel-Silica-Alumina" von W.M. Herring et al, erschienen in Biotechnology and Bioengineering, Vol.
XIV, Seiten 975-984, (1972) beschrieben wird; ebenfalls kann Glukose-Oxidase mit Bromcyan immobilisiert werden entsprechend dem Verfahren des US-Patentes 3 645 852 "Method of Binding Water-soluble Proteins and Water-soluble Peptides to Waterinsoluble Polymers Using Cyanogen Halide" von R. Axen, J.
Porath und E. Ernbach. Die Offenbarungen dieser Vorveröffentin lichungen sind nunmehr mittels Bezug/dieser Anmeldung aufgenommen Deshalb ist es in der Technik bekannt, die Schicht immobilisierter Glukose-Oxidase unter Auswahl der Trägermaterialien zu bilden, wi.e z.B. poröses Glas; in Partikeln auftretendes und vorzugsweise poröse feuerfeste Oxid, wie z.B. Aluminiumoxid, Titanoxid, Zirkonoxid, Siliziumoxid, Magnesiumoxid, Magnesiumsilikat und Thoriumoxid; Glasmasse; in Partikeln auftretendes Porzellan; verdichtete und gesinterte feuerfeste Oxide; Ton; wasserunlösliche Polymere, und daß die Glukose-Oxidase darauf durch chemische oder physikalische Mittel immobilisiert wird.
Es ist lediglich erforderlich, daß die Schicht für die Probe durchlässig sein muß, während eine im Verhältnis zum Volumen große Fläche geschaffen wird, um einen ausreichenden Kontakt zwischen der Glukose-Oxidase und der Glukoseprobe sicherzustellen. Eine dichte Schicht von Glukose-Oxidase, die auf einem inerten In Partikeln auftretenden, porösen, fibrösen oder gelartigen Träger immobilisiert wird, wird für diesen Zweck bevorzugt. Wenn in Partikeln auftretende feuerbeständige Oxide verwendet werden, sind Partikelgröße und prozentuale Durchlässigkeit nicht besonders kritisch, solange ein ausreichender Kontakt zwischen Glukose und Glukos-Oxidase geschaffen wird. Es hat sich herausgestellt, daß eine Volumendurchlässigkeit im Bereich von ungefähr 10 bis ungefähr 60% mit einem Durchschnittsdurchmesser der Porengröße im Bereich von ungefähr 0,01 bis 10 Mikron wirksam und ohne waheres erhältlich ist . In Partikeln auftretende feuerbeständige Oxide, die einen Durchmesser der Partikelgröße im Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 1000 Mikron besitzen, sind ohne weiferes mit einem Durchmesser der Partikelgröße im Bereich von ungefähr 100 Mikron bis 400 Mikron erhältlich und für die vorliegenden Absichten sehr zweckmäßig.
Nach der Oxidation der Glukose in der Schicht der immobilisierten Glukose-Oxidase fließt die entstandene Reaktionsmischung zur polarografischen Zelle.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird der wäßrige gepufferte Verdünner kontinuierlich durch die Reaktionskammer gepumpt, die die Schicht der immobilisierten Glukose-Oxidase und die polarografische Zelle enthält. Die Glukoseprobe wird mit einer Injektionsnadel in die Schicht der immobilisierten Glukose-Oxidase durch eine Einspritzöffnung eingespritzt, die in der Form eines Mischventils mit einem Gummidiaphragma bedeckt sein kann.
Während die Glukose das Bett der immobilisierten Glukose-Oxidase durchfließt und durchdringt, wird sie zu Wasserstoffperoxid und Glukonsäure oxidiert, die als Reaktionsprodukte in der Probe bleiben. Diese Reaktionsmischung fließt dann in die polarogra fische Zelle, wo Wasserstoffperoxid polarografisch durch direkten Kontakt mit den polarografischen Elektroden nachgewiesen wird. Die polarografische Ansprache aus der Messung von Wasserstoffperoxid wird durch eine Strommeßvorrichtung gemessen, wie z.B. einen Stromschreiber. Dieser Wert wird dann auf das Glukoseäquivalent der ursprünglichen Probe umgerechnet.
Das Glukoseäquivalent der ursprünglichen Probe wird normalerweise in mg Glukose/100 ml (d.h. mg-Prozent) der Probe angegeben.
Diese Einheiten sind bei klinischen Anwendungen üblich.
Zwei Ausführungsarten der in Fig. 1 aufgezeigten polarografischen Zelle werden schematisch in den Figuren 2 und 3 gezeigt. Diese Zellen werden 'lDurchfluß"-Zellen genannt, da die in der Analyse befindliche Probe kontinuierlich durch die Zelle fließt.
In Fig. 2 ist der Zellkörper 10 aus einem festen inerten elektrisch isolierenden Material aufgebaut, wie z.B. Glas oder Kunststoff. Polymethyl-Methacrylat-Kunststoffe haben sich für diesen Zweck als sehr zufriedenstellend erwiesen. Der Zellkörper 10 ist mit einem engen Durchgang 11 versehen, durch den die Probe der Reaktionsmischung, die Wasserstoffperoxid enthält, in den Zellhohlraum 15 fließt. Der Hohlraum 15 ist so bemessen, daß ein wirksamer Kontakt zwischen der Probe und den polarografischen Elektroden sichergestellt wird, während das Totvolwnen möglichst gering gehalten wird. Die in den Beispielen verwendete Zelle ist aus Kunststoff und besitzt einen Hohlraum von ungefähr 0,25 cm Breite, 1,25 cm Länge und ungefähr 0,05 cm Tiefe.
Die Elektroden sind von der Oberseite der Zelle eingeführt und sind entlang der Längsrichtung angebracht.
In Fig. 2 ist ein Satz von zwei polarografischen Elektroden 12 und 13 im Zellkörper 10 angebracht, so daß die Fühlspitzen der Elektroden in direktem Kontakt mit der Probe im Hohlraum 15 sind. Die Elektrode 12 fungiert sowohl als Gegenelektrode wie auch als Referenzelektrode. Die Elektrode 12 ist von üblicher Bauart und kann ein Silberdraht, der mit Silberchlorid übereine zogen ist, oder Kalomel-Elektrode sein. Bevorzugt wird eine Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode, da die zu messende Probe als Referenzelektroden-Füllösung fungieren konn, indem Chloridionen darin eingetragen werden. Die anderen Typen der Referenzelektroden, die ihre eigene abgefüllte Füllösung verwenden, können, wenn es gewünscht wird, verwendet werden.
Die Elektrode 12 ist mit einer Quelle eines konstanten Gleichstrompotentials verbunden (normalerweise ungefähr o,6 Volt), wie bei der üblichen Polarografie. Die Elektrode 13 ist eine Arbeitselektrode in Form von Platin, Palladium, Gold, Graphit oder Kohlenstoff oder einem anderen inerten leitenden Material.
Das Wasserstoffperoxid in der Probe depolarisiert leicht po larografische Elektroden, und der Stromfluß, der durch die Strommeßvorrichtung bei einer vorgegebenen angelegten Spannung gemessen wird, ist proportional zur Wasserstoffperoxid-Konzentration. Dieser Stromfluß wird umgerechnet auf das Glukose äquivalent der ursprünglichen Probe. In der in Fig. 2 gezeigten polarografischen Zelle muß die Referenzelektrode auch als Gegenelektrode fungieren und nimmt an der Redox-Reaktion, die in der Zelle stattfindet, teil. Der IR- Spannungsabfall wird nicht kompensiert, und die Potentialdifferenz zwischen der Referenzelektrode und der Arbeitselektrode kann sich ändern.
Die Zelle der Fig. 3 wird bevorzugt gegenüber der Zelle der Fig. 2. In der Zelle der Fig. 2 ist die Referenzelektrode die einzig andere Elektrode im Stromkreis, so daß der Strom gezwungen wird, durch sie zu fließen. Dieses kann eine Veränderung in der Potentialdifferenz zwischen den Elektroden aufgrund des IR-Spannungsabfalls durch die Probe bewirken. Außerdem wird der Silberchlorid-Überzug, wenn eine Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode verwendet wird, schließlich durch die Redex-Reaktion angegriffen. Dementsprechend ist die Verwendung einer solchen Zelle, auch wenn die Elektrode dicht an der Arbeitselektrode liegt, nicht so genau wie die Zelle der Fig. 3.
Wenn die Zelle der Fig. 3 in einem Routinelabor verwendet wird, kann ein Spitzenwert-Detektor und eine Proben- und Halteschaltung verwendet werden uin den höchsten Strom über einer Grundlinie des Stroms zu messen, und diese Differenz ist dann proportional zur Wasserstoffperoxid-Konzentration in der Probe und ist deshalb proportional zur Glukosekonzentration.
Bei einer bevorzugten polarografischen Zelle, die in Fig. 3 gezeigt wird, ist die polarografische Zelle potentiostatisch.
Dies ist die sogenannte "Dreielektroden-Polarographie", sie in dem Artikel "The Renaissance in Polarographic and Voltammetric Analysis" von Jud B. Flato offenbart worden ist, erschienen in Analytical Chemistry, Vol. 44, September 1972, deren Lehren hier durch Bezug aufgenommen worden sind.
Fig. 3 zeigt einen Zellkörper 10 und einen Hohlraum 15, wie die Zelle der Fig. 2. Die Zelle der Fig. 3 ist mit einer Referenzelektrode 23 in Form eines Silberdrahtes ausgerüstet, der mit Silberchlorid überzogen ist und so dicht wie möglich an der Arbeitselektrode 21, die aus einem Platindraht besteht, liegt.
Die angelegte Spannung (+ 0,6 Volt Gleichspannung) wird am Eingang des Steuerungsverstärkers 30 angelegt, mit dem die Referenzelektrode 23 ebenfalls durch den spannungsfolger 31 verbunden ist. Der Ausgang des Steuerungsverstärkers 30 ist mit der Gegenelektrode 20 verbunden, die aus Platindraht besteht. Durch diesen Aufbau ist gewährleistet, daß im wesentlichen kein Strom durch die Referenzelektrode 23 fließt und ausreichend Kompensationsspannung an der Gegenelektrode 20 anliegt, um die Spannungsdifferenz zwischen der Referenzelektrode 23 und der Arbeitselektrode 21 aufrechtzuerhalten. Die Arbeitselektrode 21 ist mit einer kleinen üblichen Strommeßvorrichtung verbunden, die eine Strommessung vorsieht, die auf das Glukoseäquivalent der ursprünglichen Probe umgerechnet wird. Andere übliche Elektroden, wie sie in Verbindung mit Fig. 2 beschrieben worden sind, können bei der Ausführungsart der Fig. 3 verwendet werden, falls es gewünscht wird.
In den folgenden Beispielen sind alle Teile Gewichtstoile, alle Prozente Gewichtsprozente, und alle Temperaturen sind in °C, wenn es nicht anders angedeutet wird.
Beispiel 1 Teil A Immobilisierte Glukose-Oxidase auf Aluminiumoxid-Pulver 1 g zerteilten Aluminiumoxids wird gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen. Das zerteilte Aluminiumoxid besitzt eine Partikelgröße im Bereich von minus 40 bis + 70 mesh (US-Siebe) und einen durchschnittlichen Durchmesser der Porengröße von 0,1 bis 0,2 Mikron.
50 mg Glukose-Oxidase (mit einer angegebenen Aktivität von 140 i.E./mg) wird dem nassen zerteilten Aluminiumoxid in 40 ml einer wäßrigen Lösung zugefügt, die auf einen pH von 5>5 mit einem Standardpuffer gepuffert worden ist, der eine Mischung von Kaliumdihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogen0 phosphat enthält. Die entstandene Mischung wird für eine halbe Stunde bei 6 bis 80C leicht gerührt, um das Enzym zu sorbieren.
Zu dieser Mischung wird ein Vernetzungsreagenz hinzugefügt, das durch Vermischung von 20 ml Methanol, 10 ml destilliertem Wasser, 0,15 ml konzentrierter Salzsäure, 0,08 ml Diaminopropan und 0,02 ml Dibromäthan gebildet wird. Die vereinigte Mischung von Aluminiumoxid, Glukose-Oxidase und dem Benetzungsreagenz wird leicht mit einem magnetischen Rührer bei 6 bis 80C über Nacht gerührt , um die Glukose-Oxidase auf dem Aluminiumoxid zu immobilisieren. Die entstandene immobilisierte Glukose-Oxidase/ Alumiumoxid-Zusammensetzung wird mit ungefähr 2 1 destilliertem Wasser gewaschen und in destilliertem Wasser aufbewahrt.
Teil B Eichung der immobilisierten Glukose-Oxidase/Aluminiumoxid-Zusammensetzung zur Die katalytische Aktivität der immobilisierten Glukose-Oxidase/ Aluminiumoxid-Zusammensetzung des Teils A wird aus der gemessenen Geschwindigkeit der Oxidation von ß-D-Glukose zu Glukonsäure durch Parabenzochinon in Gegenwart der Glukose-Oxidase/Aluminiumoxid-Zusammensetzung berechnet. Die Reaktion wird durch folgende Gleichung dargestellt: ß-D-Glukose+Parabenzochinon+H2O Glukose-Oxidase Glukonsäure + Hydrochinon.
Die Reaktion wird anhand der potentiometrischen Messung der Konzentrationsveränderung des Hydrochinons mit der Zeit verfolgt. Eine Platin-Detektorelektrode wird mit einer Doppelverbindungs-Kalomel-Silber/Silberchlorid-Referenzelektrode verwendet. Standardlösungen zur Eichung des Elektrodensystems werden aus Hydrochinon mit ungefähr 100 molarem Überschuß von Parabenzochinon, das ebenfalls in den wäßrigen Lösungen vorliegt, hergestellt. Eine Eichkurve wird dadurch gezeichnet, daß die Hydrochinonkonzentration gegen die Millivolt-Ableswerte des Potentiometers aufgetragen werden.
Das Reaktionsmedium, in dem die Oxidation der Glukose stattfindet ist eine wäßrige Lösung, die 0,1-molar an Dextrose ist und 0,01-molar an Phosphat-Puffer bei einem pH von 5>5 ist. Es wird über Nacht gerührt, um sicherzustellen, daß das Gleichgewicht zwischen den Alpha- und Beta-D-Glukoseformen erreicht ist. Es wird ausreichend Parabenzochinon und Hydrochinon hinzugefügt, um die endgültige Lösung 1,0 x 10-² molar und 1,0 x 10-4 molar in bezug auf die letzwren Komponenten zu machen. Eine bekannte enge der Glukose-Oxidase/Aluminiumoxid-Zusammensetzung wird zu einem bestimmten Volumen des Reaktionsmediums hinzugefügt, und die Veränderung des Potentials der in der Lösung eingetauchten Elektrode wird mit der Zeit unter Verwendung des oben beschriebenen Elektrodensystems verfolgt.
Aus den Nillivolt-Ablesewerten wird die entsprechende Hydrochinonkonzentration aus der Eichkurve bestimmt und ein Diagramm der Konzentration der Versuchslösung gegen die Zeit hergestellt. Die Aufangsneigung dieser Kurve stellt die Oxidationsgeschwindigkeit der p-D-Glukose dar die durch das immobilisierte Enzym katalysiert worden ist. Die Aktivität wird dann aus folgender Beziehung berechnet: Aktivität = Oxidations@eschwindigkeit Aluminiumoxid-Volumen Bei Verwendung dieses Eichverfahrens stellt sich heraus daß die Clukose-Oxidase/Aluminiumoxid-Zusammensetzung des Teils A eine Aktivität von 995 i.E. Glukoso-Oxidase pro ml der Glukose=Oxidase/Aluminimumoxid-Zusammensetzung besitzt. 10 Tage später, nachdem die Zusammensetzung in destilliertem Wasser bei 4°C aufbewahrt worden ist, ist die Aktivität 825 i.E.
Glukose-Oxidase pro ml der Glukose-Oxidasc/Aluminiumoxid-Zusammensetzung.
Eine internationale Einheit einer biologischen Aktivität ist als diejenige Menge eines aktiven Enzyms festgelegt worden, die ein Substrat zu einem Produkt mit einer Geschwindigkeit von einem Mikromol pro Minute umwandelt.
Teil C Herstellung einer Schicht immobilisierter Glukose-Oxidase zur Verwendung in Fig. 1 Eine Glassäule wird aus einem 50 mm Borsilikat-Glasrohr mit einem Innendurchmesser von 2,8 mm und einem Außendurchmesser von 6 min hergestellt. Eine 400 mesh Nylonscheibe wird an einem Ende der Säule angebracht. Die immobilisierte Glukose-Oxidase/ Aluminiumoxid-Zusammensetzung des Teils A wird darin eingetragen, um das Rohr zu füllen. Das Glukose-Oxidase/Aluminiumoxid wird durch die Schwerkraft in der Säule dicht eingetragen, und das andere Ende der Säule wird ebenfalls mit einer 400 mesh Nylonscheibe versehen, nachdem die Säule gefüllt worden ist. Das Volumen der Glukose-Oxidase/Aluminiumoxid-Zusammensetzung beträgt ungefähr 0,3 ccm.
Die Säulenenden werden dann mit Kunststoffverbindungsrohren versehen, von denen eines T-förmig zur Probeneinspritzung ist.
Das Einspritzungs-T wird mit einer Gummimembran zur Probeneinspritzung mit einer Injektionsnadel versehen.
Teil D Analyse der Glukose Ein gepuffert Verdünner für die Glukoseprobe wird hergestellt aus: 50 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von 2-Chlor-4- Phenylphenol; 10 ml von 1,0-normalem Kaliumchlorid; 8,2 g (0,1 Mol) Natriumacetat; ausreichend 1,0 molare Essigsäure, um den pH auf 5,6 einzustellen; und zusätzlich Wasser, um einen Liter Lösung herzustellen. Der Puffer ist auf diese Weise ungefähr 0,1-molar an Acetat, 0,01-molar and Kaliumchlorid und enthält eine Spur des Bakterizids 2-Chlor-4-Phenylphenol.
Die polarografische Zelle ist die in Fig. 3 gezeigte und ist schon oben beschrieben worden. Die Elektroden sind mit einem polarografischen Analysator verbunden.
Die zur Eichung der polarografischen Zelle verwendete Standardlösung ist eine 0,01 molare wäßrige Glukoselösung, die 0,1 molar an Natriumchlorid als Referenzelektroden-Füllösung ist.
Beide Chemikalien sind als Reagenzien geeignet. Die Standerdlösung wird weit vor dem Gebrauch hergestellt, um ein chemisches Gleichgewicht sicherzustellen. D.h. im allgemeinen klinischen Sprachgebrauch, daß dieser Standard eine Glukose-Konzentration von 180 mg Glukose pro 100 ml der Probe (d.h. 180 mg-% Glukose) darstellt.
Der gepufferte Verdünner wird durch die in Fig. 1 beschriebene Vorrichtung mit einer Geschwindigkeit von 1,0 m1 pro Minute gepumpt. Dieses ergibt. einen Grundlinienstrom von annähernd einem Nanoampere, Eine 3,0 Mikroliter Probe der 0,1 molaren Glukose-Standardlösung wird mit einer Injektionsnadel durch das Einspritzungs-T in die Säule des immobilisierten Enzyms eingespritzt, wie in Fig. 1 gezeigt wird. Der Strom steigt schnell auf einen Höchststrom von 250 Nanoampere über einen 10-Sekunden-Zeitraum an, und nimmt schnell über einen 30-Sekunden-Zeitraum auf einen Wert ab, der sich dem Grundlinienwert nähert. Der Eichfaktor von Strom zur Konzentration ist deshalb 1,39 Nanoampere pro mg-% Glukose für eine 3 Mikroliter-Probe.
Zehn getrennte 3,0 Mikroliter-Proben einer Standard-Blutserumprobe (die @@@ @3,5 mg % Glukose angegeben ist) werden nacheinander in den Strom des gepufferten Verdünner eingespritzt, der in die Schicht der immobilisierten Glukose-Oxidase fließt1 und das entstandene Peroxid wird wie oben polarografisch analysiert, und die entsprechenden Strommachlauf-Ablesewerte werden aufgezeichnet. Unter Verwendung des Eichfaktors wird der Strom auf die Konzentration umgerechnet; es stellte sich heraus, daß die Proben einen Durchschnittswert von 80 mg Glukose/100 ml Probe (80 mg-%) mit einem Abweichungskoeffizienten von 0,7% enthielten.
Eine zweite, ungewöhnliche Standardblutscrum-Probe (mit 197 mg Glukose-Gehelt angegehen) wird in der oben beschriebenen Vorgangsweise analysiert. Von den gesamten 20 Analysen ergibt sich ein Durchschnittswert von 200,5 mg Glukose/100 ml mit einem Standardabweichungskoeffizienten von 1,3%.
Beispiel II Teil A Herstellung von immobilisierter Glukose-Oxidase 5 g in Partikeln vorliegenden Aluminiumoxids, das eine Partikelgröße im Bereich von -70 bis + 80 mesh (US-Sieb) und einen durchschnittlichen Porendurchmesser von 0,1 bis 0,2 Mikron besitzt, wird durch zweistündiges Erhitzen bei 10600C getrocknet. Nach dem Abkühlen wird das Aluminiumoxid in 1-normaler Salzsäure für 2 bis 4 Stunden eingeweicht und mit destilliertem Wasser gewaschen, um absorbierte Luft zu entfernen. Das gewaschene Aluminiumoxid wird mit ungefähr 10 ml eines 0,01 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) in ein Becherglas gebracht.
Glukose-Oxidase wird wie im Beispiel I (250 mg) zu dem in Partikeln auftretenden Aluminiumoxid mit genügend destilliertem Wasser hinzugefügt, um das Volumen der Mischung auf ungefähr 40 ml zu bringen. Die Glukose-Oxidase/Aluminiumoxid-Mischung wird mit einem Magnetrührer bei Raumtemperatur für ungefähr eine halbe Stunde leicht gerührt.
EinVnetzungsreagenz wird aus 20 ml Methanol, 10 ml Wasser, 0,15 ml konzentrierter Salzsäure, 0,05 ml Diaminopropan und 3 ml einer 10 Gew.-%-Lösung von Glutaraldehyd hergestellt.
Dieses Reagenz wird tropfenweise zur Glukose-Oxidase/Aluminiumoxid-Mischung wie oben beschrieben hinzugefügt. Der Zusatz wird bei Raumtemperatur vorgenommen, und die fertige Reaktionsmischung wird über Nacht bei OOC stehengelassen. Dann wird sie in einem 0,001 molaren Phosphatpuffer (pH 5,5) gewaschen und in destilliertem Wasser bis zur Probe aufbewahrt.
Der Probenablauf ist der gleiche wie im Beispiel I, Teil B beschrieben worden ist. Es ergab sich eine Aktivität von ungefahr 150 i.E. pro ml von Glukose-Oxidase/Aluminiumoxid-Zusammensetzung.
Teil B Glukose-Analyse Eine Schicht immobilisierter Glukose-Oxidase wird, wie im Beispiel I beschrieben worden ist, unter Verwendung der Glukose-Oxidase/Aluminiumoxid-Zusammensetzung, die oben im Teil A beschrieben worden ist, hergestellt.
Das Verfahren für das analytische System ist im wesentlichen das gleiche wie das im Teil D des Beispiels I.
Die Fließgeschwindigkeit dos gepufferten Verdünneisbeträgt 1,0 ml pro Minute; er hat die gleiche Zusammensetzung wie im Beispiel I. Eine 3,0 Mikroliter Standard-Glukoselösung (die 180 mg % Gllikose enthält) ergibt einen Ablesewert von 590 Nanoampere. Der Eichfaktor ist deshalb 3,28 Nanoampere pro mg-% Glukose für die 3 Mikroliter-Probe.
Zehn getrennte 3,0 Mikroliter-Proben einer Standard-Blutserumprobe (mit 83,5 mg Glukose/100 ml angegeben) werden nacheinander in die Schicht der immobilisierten Glukose-Oxidase wie oben beschrieben, eingespritzt, und die entsprechenden Stromablesewerte werden aufgezeichnet. Unter Verwendung des Eichfaktors zur Umrechnung des Stroms auf die Glukose-Konzentration werden die Proben analysiert, und man ethäll einen Durchschnittswert von 82 mg Glukose pro 100 ml mit einem Abweichungskoeffizienten von 1,5%.
Eine zweite, ungewöhnliche, Standard-Blutserumprobe (die 197 mg o Glukose enthalten soll) wird wie oben beschrieben analysiert.
Aus einer Summe von zehn Versuchen wird ein Durchschnittswert von 197,2 mg Glukose/100 ml mit einem Standard-Abweichungskoeffizienten von 1,0% erhalten.
Beispiel III Teil A Herstellung immobilislerter Glukose-O@idase 5 g in Partikeln @orliegenden Aluminiumoxids, das eine Partikelgröße im Bereich von -60 bis +70 mesh (US-Sieb) und einen durchschnittlichen Porendurchmesser von 0,1 bis 0,2 Mikron besitzt werden auf 1150°C für zwei Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das in Partikeln votliegende Aluminiumoxid über Nacht in 1-normaler Salzsäure aufgeweicht. Dann wird es mit destilliertem Wasser gewaschen und in ein Becherglas mit 50 ml eines 0,001-molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) für eine halbe Stunde gebracht, bevor 25 ml der Glukose-Oxidase-Lösung hinzugefügt wenn. Die Glukose-Oxidase (Asperilligus niger) ist in der Technik in einer gepufferten Lösung (pH 4,0) erhältlich und besitzt eine angegebene Aktivität von 1000 i.E./ml.
Die entstandene Glukose-Oxidase/Aluminiumoxid-Mischung wird für eine halbe S-tunde bei 3 bis 80C leicht gerührt.
Ein Vernetzungsresgenz wird durch Vermischen von 20 ml Methanol, 0,01 ml Diaminopropan, 0,15 ml konzentrierter Salzsäure, 0,03 ml Dibromäthan und 10 ml Wasser hergestellt. Dieses Reagenz wird mit einer Geschwindigkeit von 0,15 bis 0,20 ml pro Minute zur Glukose-Oxidase/Aluminiumoxid-Mischung hinzugefügt, während mit einem Magnetrührer leicht gerührt wird und die Temperatur bei 3 bis 80C für 16 bis 20 Stunden gehalten wird. Die entstandene immobilisierte Glukose-Oxidase/Aluminiumoxid-Zusammensetzung wird mit 2 1 destilliertem Wasser gewaschen und in destilliertem Wasser bis zur Probe aufbewahrt.
Die Probendurchführung ist die gleiche wie die, die im Beispiel I beschrieben worden ist. Die Aktivität der Probe beträgt 2.300 i.E./ml immobilisierter Glukose-Oxidase/Aluminiumoxid-Zusammensetzung.
Teil B Glukose-Analyse Eine Schicht immobilisierter Glukose-Oxidase wird wie im Beispiel I beschrieben unter Verwendung der Glukose-Oxidase/ Aluminiumoxid-Zusammensetzung,die im Teil A oben beschrieben worden ist, hergestellt. Das Volumen der Säule beträgt jedoch in diesem Fall nur 0,2 com.
Das Standardisierungsverfahren für das analytische System ist im wesentlichen das gleiche wie das im Teil D des Beispiels I.
Die Fließgeschwindigkeit des gepufferten Verdünner der Zusammensetzung des Beispiels I beträgt 0, ml pro Minute. Eine 2,5 Mikroliter-Probe des Glukose-Standards, der 180 mg % von Glukose enthält, ergibt einen Strom von 150 Nanoampere. Der Eichfaktor beträgt deshalb 0,83 Nanoampere pro mg-% Glukose für die 2,5 Mikroliter-Probe.
Neun getrennte 2,5 Mikroliter-Proben einer Standardblutprobe werden nacheinander in die Schicht der immobilisierten Glukose-Oxidase wie oben beschrieben eingespritzt, und der entsprechende Stromablesewert wird aufgezeichnet. Unter Verwendung des Eichfaktors zur Umrechnung des Stroms auf die Konzentration ergibt sich für die Proben ein Durchschnittswert von 79,7 mg Glukose/ 100 ml mit einem Standardabweichungskoeffizienten von 1,5%. Der angegebene Wert beträgt 83,5 mg Glukose/100 ml.
Eine zweite, abweichende Standardblutserumprobe, die 197 mg ing Glukose enthält, wird wie oben beschrieben analysiert. Aus einer Summe von 11 Versuchen wird ein Durchschnit-tswert von 205,6 mg Glukose/100 ml mit einem Standardabweichungskoeffizienten von 1,3% erhalten.
Man erhält ähnliche Ergebnisse bei der oben beschriebenen Verfahrensweise für die Glukoseanalyse, wenn die Schicht immobilisierter Glukose-Oxidase dadurch hergestellt wird, daß die Glukose-Oxidase auf einem vernetztem Polydextran hergestellt wird.
Eine 1,25 g Probe von Polydextran wird mit 2 1 destilliertem Wasser gewaschen und ein einheitliches Gel wird durch Vermischen mit Wasser hergestellt. 4 g Brom@yan werden in einem Mörser zerstoßen und schnell zum Polydextran-Gel überführt.
Der pH des dispergierten Gels wird schnell auf ungefähr 10,5 mit einer 3-normalen Hydroxid-Lösung eingestellt und bei diesem pH durch den allmählichen Zusatz von weiterem 3-normalen Natriumhydroxid aufrechterhalten.
In Abständen wird zerstoßenes Eis, das aus entionisiertem Wasser hergestellt worden ist, hinzugefügt, um die Temperatur der Reaktionsmischung bei ungefähr 200 zu halten. Die Einführung von Base wird eingestellt, wenn keine weitere Veränderung im pH auftritt und die Bromzyan-Kristalle verbraucht worden sind. Die Mischung wird kontinuierlich während der Reaktion gerührt. Insgesamt werden ungefähr 13 ml einer Natriumhydroxid-Lösung benötigt.
Eine große Eismenge wird hinzugefügt, und die Mischung wird zu einem gesinterten Glasfilter-Trichter überführt, Das Produkt wird unter Vakuum gewaschen, wobei zuerst 300 ml eines 0,01-molaren Tri-Hydroxymethyl-Aminomethan-Puffers (mit HCl auf einen pH 7 eingestellt) und dann 300 ml eines 0,01 molaren Phosphatpuffers (pH 5,6) verwendet werden. Beide Waschlösungen wurden vorher in einem Eisbad gekühlt. Der Boden des Filtertrichters wird dann mit einem Stück eines Wachs filmes geschlossen.
Zu dem entstandenen durch Bromzyan aktivierten Polydextran, das noch auf dem Filtertrichter ist, wird eine kalte Lösung von 50 mg Glukose-Oxidase in 20 ml eines 0,01 molaren Phosphatpuffers (pH 5,6) hinzugefügt. Das entstandene Produkt wird mit einer Glas stange auf dem Filtertrichter gerührt und dann zu einem Becherglas überführt. Das Waschen des durch Bromzyan aktivierten Polydextrans und das anschließende Vermischen mit der Glukose-Oxidase-Lösung auf dem Trichter wird sehr schnell vorgenommen, d.h. in einer Gesamtzeit von ungefähr 90 Sekunden.
Die Glukose-Oxidase/Polydextran-Mischung wird dann mit einem Magnetrührer für 16 bis 20 Stunden bei 0°C leicht gerührt.
Sie wird dann mit 1 bis 2 1 von destilliertem Wasser gewaschen und in einem 0,1 molaren Phosphatpuffer, pH 5,6, aufbewahrt.
Nach 65 Tagen beträgt die Aktivität 450 i.E./ml Glukose-Oxidase Polydextran-Gelzusammensetzung. Die Glukose-Oxidase/Polydextran Gelzusammensetzung wird in eine Säule dicht eingefüllt zur die Glukoseproben werden wie in Beispiel I analysiert.
Ähnliche Ergebnisse werden ebenfalls bei der oben beschriebenen Vorgangsweise zur Glukoseanalyse erhalten, wenn die immobilisierte Enzymschicht Glukose-Oxidase umfaßt, die auf einem porösen in Partikeln auftretenden Anionen-Austauscherharz immobilisiert worden ist. Das verwendete Harz ist die Chloridform eines Styrol-Divinylbenzol-Copolymers mit Austauschgruppen eines quarternären Aminions.
Eine 250 mg Probe eines Anionenharzes wird mit 30 ml einen 0,1 molaren Natriumboratpuffers (pH 8,5) kräftig gerührt.
Sie wird dann für 20 Minuten bei 12000-facher Erdanzichung zentrifugiert. Überschüssiges wird dekantiert'und der Weschvorgang wird zweimal wiederholt. Die Endwäsche wird ill der gleichen Weise unter Verwendung eines 0,1-molaren Accet@tpuffers, pH 5,0, durchgeführt.
Das gewaschene Harz wird in ungefähr 50 ml des Acetatpuffers dispergiert und für 15 bis 20 Minuten bei 5 bis 100C leicht gerührt, bevor 100 mg Glukose-Oxidase in kleinen Schritten hinzugefügt wird. Zu dieser Mischung wird dann 0,5 ml Dibrompropan, das in 2 ml Aceton aufgelöst ist, hinzugefügt. Die Endmischung wird dann für eine Stunde bei 5 bis 100C leicht gerührt. Das Reaktionsprodukt wird bei 120-facher Erdanziehung zentrifugiert und Überschüssiges verworfen. Die Glukose-Oxidaso-Ionenaustauscherharz-Zusammensetzung wird weiter mit 40 ml einer Acetatpufferlösung (pH 5,0) behandelt, die 0,05 Molar in 2-Aminoäthanol ist. Es wird für eine Stunde bei 0° gerührt, filtriert und mit 1 bis 2 1 destilliertem entionisiertem Wasser gewaschen, in dem es dann anschließend bei 4°C autbewahrt wird.
Nach einer Woche beträgt die Aktivität 15 i.E./ml immobilisierter Glukose-Oxidase/Harz-Zusammensetzung. Die Gelzusammensetzung wird in eine Säule eingetragen, und die Glukoseproben werden wie in Beispiel I analysiert.

Claims

n 5 p r ii c h e Verfahren zur Glukosebestimmung in einer wäßrigen Probe, die Glukose enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einem wäßrig gepufferten Verdünner, der auf einen pH im Bereich von ungefähr 4 bis ungefähr 8 gepuffert ist, verdünnt wird, daß die verdünnte Probe in eine Schicht von Glukose-Oxidase, die auf einem festen Träger immobilisiert ist, übergeleitet wird, daß die verdünnte Probe mit der Glukose Oxidase eine zur Oxidation der Glukose ausreichende Zeit lang in Kontakt gehalten wird, um Wasserstoffperoxid zu bilden, daß die entstandene Reaktionsmischung aus der Schicht entfernt wird, daß die entstandene Reaktionsmischung zu einem direkten Kontakt mit einem Satz polarografischer Elektroden übergeleitet wird, daß während des direkten Kontaktes mit den polarografischen Elektroden das Wasser stoffperoxid in der Reaktionsmischung polarografisch bestimmt wird, um einen elektrischen Strom herzustellen, der proportional zur Wasserstoffperoxid-Konzentration der Probe ist, daß der elektrische Strom ermittelt wird, und die Stromermittlung auf die Glukose-Konzentration der Probe übertragen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im wesentlichen die gesamte Glukose unter Bildung von Wasser stoffperoxid oxidiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der wäßrig gepufferte Verdünner auf einen pH im Bereich von ungefähr 5 bis 7 gepuffert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Probe, die Glukose enthält, Blutserum ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger ein in Partikeln auftretendes feuerfestes Oxid ist.
6. Vorrichtung zur Glukosebestimmung in einer wäßrigen Probe, die Glukose enthält, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Reaktionskammer umfaßt, die eine Schicht von Glukose-Oxidase enthält, die auf einem festen Träger der Reaktionskammer, die einen Proben Einlaß und einen Reaktionsprodukt-Auslaß besitzt, immobilisiert ist, daß sie eine mit dem Reaktionsprodukt-Auslaß verbundene polarografische Zelle umfaßt, daß die Zelle eine schlauchförmige Probenkammer umfaßt, die einen Probeneinlaß und einen Probenauslaß besitzt, daß die Kammer einen Satz polarografischer Elektroden besitzt, die zur direkten elektrischen Verbindung mit der Probe in der Kammer darin angebracht sind, wobei die Elektroden zur amperometrischen Messung des in der Zelle erzeugten elektrischen Stromes elektrisch verbunden sind.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Elektrodensatz drei Elektroden umfaßt: eine Arbeitseloktrode, eine Gegenelektrode und eine Referenzelektrode.
8. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Elektrodensatz ein Elektrodenpaar umfaßt: eine Referenz~ elektrode und eine Arbeitselektrode.
9. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode Platin ist, daß die Gegenelektrode Platin ist, und daß die Referenzelektrode mit Silberchlorid überzogenes Silber ist.
10. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger ein in Partikeln auftretendes feuerfestes Oxid umfaßt.