DE2522432A1 - PROCEDURE FOR THE FRACTIONAL DETERMINATION OF BONDED AND FREE CHOLESTEROL - Google Patents

Description

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Anmelder: ONO PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITEDApplicant: ONO PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITED

No. 14, 2-chome, Dosho-machi, Higashu-ku, Osaka-shi, Osaka / JapanNo. 14, 2-chome, Dosho-machi, Higashu-ku, Osaka-shi, Osaka / Japan

Verfahren zur fraktionierten Bestimmung von gebundenem und freiem CholesterinMethod for the fractional determination of bound and free cholesterol

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fraktionierten oder stufenweisen Bestimmung von gebundenem und freiem Cholesterin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man gebundenes Cholesterin mit Cholesterolesterase, die durch Pseudomonas fluorescens gebildet wird, hydrolysiert.The invention relates to a method for the fractional or stepwise determination of bound and free Cholesterol, which is characterized in that cholesterol is bound with cholesterol esterase produced by Pseudomonas fluorescens is formed, hydrolyzed.

Cholesterin kommt in lebenden Körpern vielfach vor, einmal als Cholesterin, das an Fettsäure gebunden ist (sog. Cholesterinester) und als freies Cholesterin. Bei der klinischen Untersuchung werden neuerdings Serumlipoide wie Cholesterin und Triglycerid routinemäßig bestimmt, da eine Beziehung zwischen Diabetes oder Arteriosklerose und dem Lipoidmetabolismus besteht (insbesondere nimmt man an, daß die Menge an Cholesterinester die Aktivität von Lecithincholesterinacyltransferase darstellt, die eng mit Arteriosklerose verwandt ist).Cholesterol occurs many times in living bodies, once as cholesterol, which is bound to fatty acids (so-called. Cholesterol esters) and as free cholesterol. Serum lipids such as Cholesterol and triglycerides are routinely determined as a relationship between diabetes or atherosclerosis and the Lipoid metabolism exists (in particular, it is believed that the amount of cholesterol ester increases the activity of lecithin cholesterol acyltransferase which is closely related to arteriosclerosis).

Da gebundenes Cholesterin, d.h. Cholesterin in Form von Fettsäureestern, und freies Cholesterin, das in der 3-Stellung eine Hydroxylgruppe enthält, gleichzeitig vorkommen, wurde das Serumcholesterin beispielsweise quantitativ bestimmt, indem man das Serum mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und der colorimetrischen Analyse wie einer Liebermann-Burchard-Reaktion unterwirft, um das gesamte Cholesterin zu bestimmen. Nachdem die Probe mit dem organischen LösungsmittelSince bound cholesterol, i.e. cholesterol in the form of fatty acid esters, and free cholesterol containing hydroxyl group at the 3-position would coexist for example, quantitatively determining serum cholesterol by extracting the serum with an organic solvent and subjected to colorimetric analysis such as a Liebermann-Burchard reaction to determine the total cholesterol determine. After the sample with the organic solvent

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extrahiert wurde, wird die Probe mit Digitonin behandelt und die erhaltene überstehende Lösung wird der colorimetrischen Analyse unterworfen, um die Menge an gebundenem Cholesterin zu bestimmen und um ebenfalls die Menge an freiem Cholesterin aus dem Unterschied zwischen dem Gesamtcholesterin und dem gebundenen zu berechnen. Jedoch ist bei dem oben beschriebenen colorimetrischen Verfahren die Farbentwicklung bei gebundenem Cholesterin und freiem üblicherweise unterschiedlich und in der Farbtönung werden Unterschiede und Ungleichheiten beobachtet. Um diese Nachteile zu beseitigen, wird gebundenes Cholesterin nach irgendeinem chemischen Verfahren wie durch alkalische Verseifung in freies Cholesteri überführt und dann wird mit Digitonin behandelt und der Niederschlag, der aus verseiftem und nichtverseiftem Cholesterin besteht, wird der Farbreaktion unterworfen, wobei man den Wert für das gesamte Cholesterin oder das Estercholesterin erhält. Dieses Verfahren ist jedoch nachteilig, da komplizierte Verfahrensstufen durchgeführt werden müssen wie die Neutralisation nach der Umsetzung, und dabei kann sich ebenfalls die chemische Struktur des Cholesterins ändern.extracted, the sample is treated with digitonin and the obtained supernatant solution is subjected to colorimetric analysis to determine the amount of bound cholesterol and also to determine the amount of free cholesterol from the difference between total cholesterol and to calculate the bound. However, in the colorimetric method described above, there is color development with bound cholesterol and free usually different and in the color tone differences and Observed inequalities. In order to overcome these drawbacks, bound cholesterol is modified according to some chemical Process such as converted into free cholesterol by alkaline saponification and then treated with digitonin and the Precipitate, which consists of saponified and unsaponified cholesterol, is subjected to the color reaction, whereby one gets the total cholesterol or ester cholesterol value. However, this method is disadvantageous because it is complicated Process steps must be carried out as neutralization after the reaction, and this can also change the chemical structure of the cholesterol.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein fraktioniertes Bestimmungsverfahren für gebundenes und freies Cholesterin zu schaffen, welches die oben beschriebenen Nachteile nicht besitzt.The present invention is therefore based on the object of a fractionated determination method for bound and to create free cholesterol which does not have the disadvantages described above.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fraktionierten Bestimmung von gebundenem und freiem Cholesterin mit Cholesterinesterase, die von einem Mikroorganismus gebildet wird.The invention relates to a method for the fractional determination of bound and free cholesterol with Cholesterol esterase, which is produced by a microorganism.

Bei der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, Cholesterinesterase mit einer starken Aktivität zu verwenden, die hergestellt wird, indem man rohes Enzym, das von Pseudomonas fluorescens gebildet wird und Lipoproteinlipasewirkung hat, mit Ammoniumsulfat fraktioniert, mit DEAE-Cellulose und dann mit Cephadex G-75 behandelt und schließlich an einer CM-Cellu-In the present invention, it is preferred to use cholesterol esterase with a strong activity that is produced by using crude enzyme produced by Pseudomonas fluorescens is formed and has lipoprotein lipase effect, Fractionated with ammonium sulfate, with DEAE cellulose and then treated with Cephadex G-75 and finally on a CM-Cellu-

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lose-Säule auf ungefähr 1/260 reinigt. Bei der Bestimmung des Cholesterins mit dem erhaltenen Enzym wird eine Serumprobe mit Cholesterinesterase, die von Pseudomonas fluorescens gebildet wird, behandelt, um das Cholesterin vollständig zu hydrolysieren, und dann werden die Probe und eine andere Probe, die nicht mit Cholesterinesterase behandelt wurde, beide mit Digitonin behandelt. Der erhaltene Digitoninniederschlag wird dem Lieberman-Burchard-Farbtest unterworfen und dann wird eine colorimetrische Analyse durchgeführt, um den Unterschied zwischen ihnen festzustellen, und somit ist eine fraktionierte, d.h. stufenweise Bestimmung des Cholesterins möglich.loose-column cleans to about 1/260. In determining of the cholesterol with the enzyme obtained is a serum sample with cholesterol esterase produced by Pseudomonas fluorescens is formed, treated to completely hydrolyze the cholesterol, and then the sample and another Sample not treated with cholesterol esterase both treated with digitonin. The digitonin precipitate obtained is subjected to the Lieberman-Burchard color test and then a colorimetric analysis is carried out to determine the difference between them, and thus a fractional, i.e. step-by-step, determination of cholesterol possible.

Man kann auch eine Probe, die mit Cholesterinesterase behandelt wurde, die durch Pseudonnnasfluorescens gebildet wird, und eine andere, nichtbehandelte Probe"mit Digitonid behandeln, und die bei diesem Bestimmungsverfahren erhaltene überstehende Flüssigkeit wird dann für den Farbtest gemäß der Lieberman-Burchard-Reaktion verwendet und colorimetrisch analysiert, um den Unterschied zwischen beiden Lösungen zu bestimmen, und auf diese Weise können gebundenes Cholesterin und freies Cholesterin fraktioniert quantitativ bestimmt werden. Wenn das bei diesem Verfahren enzymatisch gebildete Cholesterin konjugiert bzw. gepaart mit einem Enzym ist wie mit Cholesterinoxidreductase oder Cholesterindehydrogenase kann der Serumcholesterinester in seinem natürlichen Zustand quantitativ bestimmt werden.One can also use a sample that has been treated with cholesterol esterase produced by Pseudonnnasfluorescens. and another, untreated sample "treat with digitonide, and the supernatant obtained in this determination method is then used for the color test according to the Lieberman-Burchard reaction used and colorimetrically analyzed to determine the difference between the two solutions, and in this way can bound Cholesterol and free cholesterol can be determined quantitatively in a fractionated manner. If this is done enzymatically in this process Cholesterol formed conjugated or paired with an enzyme is like with cholesterol oxide reductase or cholesterol dehydrogenase the serum cholesterol ester can be quantified in its natural state.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man die folgenden Vorteile. Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren- kann ohne Extraktion des Cholesterinesters aus Serum mit einem organischen Lösungsmittel durchgeführt werden, da Cholesterinesterase, die von PseudomcnaB flurescens gebildet wird, verwendet wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfach und leicht durchzuführen, verglichen mit dem alkalischen Verseifungsverfahren, das man zur Bestimmung von Cholesterin früher verwendet hat, was aus der folgenden Tabelle hervorgeht.The process of the present invention provides the following advantages. The determination method according to the invention can can be carried out without extraction of the cholesterol ester from serum with an organic solvent, since cholesterol esterase, which is produced by PseudomcnaB flurescens is used. The inventive method is simple and easy to perform compared to the alkaline saponification process, which was previously used to determine cholesterol, as shown in the following table.

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Erfindungsgemäßes Verfahren Alkalisches Verseifungsverfahren Serum Serum Process According to the Invention Alkaline Saponification Process Serum Serum

CholesterinesteraselösungCholesterol esterase solution

1 37°C, 5 Min.1 37 ° C, 5 min.

Extraktion mit Äthanol:ÄtherExtraction with ethanol: ether

(3:1)(3: 1)

Extraktion mit Äthanol:ÄtherExtraction with ethanol: ether

(3:1) Filtration(3: 1) filtration

Verseifung mit KOHSaponification with KOH

40°c, 1 h40 ° C, 1 h

1%ige Essigsäure (Neutralisation) 1% acetic acid (neutralization)

N/N /

DigitoninlösungDigitonin solution

4,4,

Vermischen und ZentrifugierenMix and centrifuge

(Eisessig ν (Eisen(III)-Chloridlösung(Glacial acetic acid ν (iron (III) chloride solution

J (Farbentwicklung) Bestimmung bei 560 m/uJ (color development) determination at 560 m / u

Indikator: Phenolphthalein DigitoninlösungIndicator: phenolphthalein digitonin solution

Vermischen und Zentrifugieren (Eisessig ν
(Eisen(III )-ChloridlösungMix and centrifuge (glacial acetic acid ν
(Iron (III) chloride solution

(Farbentwickl.(Color dev.

4/4 /

Bestimmung bei 560 m/uDetermination at 560 m / u

Aus der obigen Tabelle ist erkennbar, daß Cholesterin in natürlichem Zustand selbst quantitativ bestimmt werden kann, bedingt durch die Verkürzung der Verseifungszeit.From the table above it can be seen that cholesterol in its natural state can itself be determined quantitatively, due to the shortening of the saponification time.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.The following example illustrates the invention.

Beispielexample

2 mg Cholesterinesterase werden in 1 ml Phosphorsäurepufferlösung (pH 7,4, 0,1 M) gelöst und die Lösung wird zu 0,1 ml Serum gegeben. Die Lösung wird bei 37⁰C 5 Minuten geschüttelt,2 mg of cholesterol esterase are dissolved in 1 ml of phosphoric acid buffer solution (pH 7.4, 0.1 M) and the solution is added to 0.1 ml of serum. The solution is ^{shaken at 37 0} C for 5 minutes,

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anschließend mit 3 ml einer Lösungsmittelmischung aus (3:1) Äthanol:Äther extrahiert. Es wird 1 ml 1%ige Digitoninlösung (5O?6ige Alkohollösung) zugegeben und dann wird gemischt und zentrifugiert. Zu dem so erhaltenen Niederschlag werden 3 ml" Eisessig und 2 ml Eisen(III)-Chlorid in Schwefelsäurelösung zugegeben und dann wird die Extinktion bei 560 m/U bestimmt. Zum Vergleich wird nur eine Phosphorsäurepufferlösung auf ähnliche Vieise behandelt und gemessen. Serumproben werden von einer Person entnommen und nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem alkalischen Verseifungsverfahren untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt. Man beobachtet eine' gute Korrelation zwischen ihnen.then with 3 ml of a solvent mixture from (3: 1) Ethanol: ether extracted. 1 ml of 1% digitonin solution is used (5O? 6 alcohol solution) are added and then mixed and centrifuged. 3 ml of glacial acetic acid and 2 ml of iron (III) chloride in sulfuric acid solution are added to the precipitate obtained in this way added and then the extinction is determined at 560 m / rev. For comparison, only a phosphoric acid buffer solution is used treated and measured in similar ways. Serum samples are taken from a person and after investigated the process according to the invention and the alkaline saponification process. The results are in Table I. listed. A good correlation is observed between them.

Tabelle ITable I.

Nr. der Serum- Erfindungsgem.Verfahren Verseifungsverfahren No. of Serum Processes According to the Invention Saponification Process

probe Cholesterin Cholesterin sample cholesterol cholesterol

gebunden frei gebunden frei mg/dl mg/dl mg/dl mg/dlbound free bound free mg / dl mg / dl mg / dl mg / dl

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Claims (2)

■2b22432 Patentansprüche■ 2b22432 claims 1.) Verfahren zur fraktionierten Bestimmung von gebundenem und freiem Cholesterin, dadurch gekennzeichnet, daß man gebundenes Cholesterin mit Cholesterinesterase, gebildet von Pseudomonas fluorescens, hydrolysiert.1.) Method for the fractional determination of bound and free cholesterol, characterized in that that bound cholesterol is hydrolyzed with cholesterol esterase produced by Pseudomonas fluorescens. 2. Verfahren zur fraktionierten Bestimmung von gebundenem und freiem Cholesterin, dadurch gekennzeichnet, daß man gebundenes Cholesterin mit Cholesterinesterase, gebildet von Pseudomonas flurescens, hydrolysiert
und das erhaltene freie Cholesterin quantitativ mit Digitonin ausfällt und gemäß der Liebermann-Burchard-Reaktion bestimmt-,2. A method for the fractional determination of bound and free cholesterol, characterized in that bound cholesterol is hydrolyzed with cholesterol esterase formed by Pseudomonas flurescens
and the free cholesterol obtained is quantitatively precipitated with digitonin and determined according to the Liebermann-Burchard reaction, 509849/0899509849/0899