DE2513929A1 - Immobilisierung mikrobiologischer zellen - Google Patents
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Description
Immobilisierung mikrobiologischer Zellen
Die Erfindung bezieht sich auf polymere Enzymprodukte. Im spezielleren
bezieht sich die Erfindung auf immobilisierte mikrobiologische Zellen und deren Herstellung.»
Enzyme sind ihrem hohen Spezifitätsgrad bei vielen chemischen
Reaktionen konventionellen Katalysatoren weit überlegen. Bis vor kurzem
jedoch haben einzige Faktoren, wie die hohen Isalierungskosten, die Neigung zur Instabilität, wenn die Enzyme aus dem Milieu der ganzen
Zelle herausgenommen werden, und die Erhältlichkeit nur in löslicher
Form, die Verwendung von Enzymen stark eingeschränkt.
Die Immobilisierung van Enzymen durch Bindung an ein festes oder
Einschluß in einem festen Trägermaterial haben dazu beigetragen, diese Schwierigkeiten zu überwinden und die Verwendung von Enzymen
wirtschaftlicher zu gestalten. Die verschiedenen physikalischen und chemischen Methoden zur Immobilisierung werden in Berichten,
wie "Immobilized Enzymes" von D.R.Zaborsky (CRS Press,
1973), erörtert.
Eine Immobilisierung der ganzen Zelle selbst zur Ausschaltung der
Enzymisolierung und zur Überwindung der Stabilitätsprobleme
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ist ebenfalls angewendet worden. Bis jetzt jedoch ist die Benutzung
dieses üJegs auf physikalische Immobilisierungsmethoden begrenzt geblieben.
Typische Beispiele sind die Adsorption von Zellen von Streptotnyces phaeachramogenes, die aktive Glukoseisomerase enthalten,
auf rückgebildeten Hautkallagan ( Biotech. & Bioeng.,XA/, Seite 565
(1973) und der Geleinschluß von Pilzzellen, die Hydroxylaseenzym zur
Umwandlung der Verbindung S in Cortisol enthalten (Scientific American,
März 1971, Seite 30). Diese Immobilisierungsmethoden verhindern jedoch nicht die Loslösung der Zellen von dem Trägermittel. Die
Art der Bindungskräfte ist derart, daß die Reaktionsbedingungen stark
eingeschränkt sein können, um eine solche Loslösung, die mit dem Uerlust enzymatischer Aktivität und einer möglichen Kontamination
des Verfahrensverlaufs verbunden ist, zu verhindern oder auf ein
Hleinstmaß zurückzuführen.
Ziel der Erfindung ist daher ein beständigeres ZellimmDbilisierungssystem.
Es ist nun gefunden worden, daß mikrobiologische Zellen durch chemische
kovalente Bindung der Zellen an eine Matrix aus wasserunlöslichem
teilchenförmigen Polymerisat wirksam immobilisiert werden können. Die chemische Bindung kann entweder mit dem zuvor gebildeten
Polymerisat oder mit reaktionsfähigem Monomer vor der Polymerisation erreicht werden. Außerdem verhindert eine Behandlung der Zellen mit
einem polyfunktionellen Vernetzungsmittel vor, während oder nach dem
Binden einen Enzymverlust der Zelle.
Gemäß der Erfindung wird ein Präparat vorgeschlagen, das mikrobiologische
Zellen enthält, die an eine Matrix aus wasserunlöslichem teilchenförmigen! Polymerisatkovalent gebunden sind.
Es wird außerdem ein Verfahren zur Immobilisierung mikrobiologischer
Zellen vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß mikrobiologische Zellen mit Bindungsgruppen für ein Polymerisat unter Bildung
kovalenter Bindungen mit einer Matrix aus wasserunlöslichem teil-
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chenförmigen Polymerisat umgesetzt werden.
Bei Durchführung der Erfindung werden intakte mikrobiolagiache
Zellen an wasserunlösliches teilchenförmiges Polymerisat durch reaktionsfähige
Gruppen an dem Polymerisat chemisch gebunden· Dbuohl zur Zeit die Bildung einer chemischen kovalanten Bindung von isolierten
Enzymen an ein Polymerisat bekannt ist, ist die Feststellung, daß ganze Zellen als solche, die die Quelle von Enzymen sind und eine
größere Größenordnung als Enzyme haben, ebenfalls in wirksamer Weise
durch chemische kavalente Bindung immobilisiert werden können, ist in
der Tat überraschend. Eins solche Bindung wird häufig durch Umsetzung von Zellarainogruppen mit den reaktionsfähigen Polymarisatsubstituenten
Zustandekommen. Außerdem stehen auch andere Gruppen, wie zoB.
Hydroxyl- und Sulfhydrylgruppen, in den Zellen zur Verfügung und können eine Rolle in dem Bindungsmechanismus spielen, und zwar, weil
mit Aminogruppen reagierende Polymerisataubatituenten, wie z.B.
Epoxid-, Halogencarbonyl- und Halogenmethylcarbonylgruppen, auch
gegenüber Hydroxyl- und Sulfhydrylgruppen, die in den Zellen vorhanden Bind, reaktionsfähig sind.
Die Bindung kann entweder vor ader nach der Polymerisatbildung zustandegebracht
werden. In dem erstellen Fall werden die Zellen mit einem polymerisierbaren äthylenisch ungesättigten Monomeren mit einer
reaktionsfähigen Gruppe und einem Initiatorsyatem in Berührung gebracht.
In dem letzteren Fall werden die Zellen direkt mit einem teilchenförmigen Polymerisat mit einer reaktionsfähigen Gruppe in
Berührung gebracht· Zu diesen Polymerisaten gehören natürliche und synthetische organische Polimerisate.
Zu polymerisierbaren äthylenisch ungesättigten Monomeren und von diesen
herstammenden Polymerisaten, die für die Durchführung der Erfindung entweder nach der Uor- oder Nachbindetechnik geeignet sind,
gehören solche mit der Formel I
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C |
H2 = C-
R1 |
oder | Chlor | ist | |
worin | R. Wasserstoff | , Methyl | Q I |
Q I |
|
D I |
O I |
-C-R | 2 oder | -C | |
und üJ | S-Cl, <f3 | S -Cl, | |||
ν—/ α |
I α |
||||
worin R„ Kalogen,
Azido,
2,3-Epaxypropoxy,
2,3-Epithiopropaxy,
N"^(p-Dia2oniumchlorid)phenyl7 amino,
niedrigeres -Alkoxycarbonyloxy oder
Benzolsulfonyloxy ist,
X Sauerstoff oder NR3 ist, worin R3 LJasserstoff oder
Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, Y Alkylen mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen ist,
π eine ganze Zahl von 1 ader 2 ist,
Z Halagenacetyl,
2-(if,6-Dichlor)-B-triazinylf
p-ToluDlsulfonyl,
p-(Halogenmethyl)benzoyl oder
Cyano ist
und X1 gleich X ist unter der Voraussetzung, daß, uienn Z p-To
luolsulfonyl ist, X1 Sauerstoff ist.
Für die Bindung werden Monomere und Polymerisate bevorzugt, die
Epoxid-jHalogencarbonyl- und Halagenmethylcarbanylgruppen enthalten.
Besonders geeignet sind solche Polymerisate, die die reaktionsfähigen Monomeren 2,3-Epoxypropylmethacrylat (Glycidylmethaorylat),
2,3 - Epithiopropylmethacrylat, Methacryloylchlorid und Bromaoetyl -
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hydroxyäthylmethacrylat enthalten·
In dem Fall, in dam die Monomeren und Polymerisate nichtreaktionsfähige
funktioneile Gruppen enthalten, wie z.B. uienn R_ in der
obigen Monomerformel I Hydroxy ist oder Z in dieser Formel I Wasserstoff
ist, können die funktioneilen Gruppen in reaktionsfähige Substituenten
nach bekannten Methoden umgewandelt werden. Dieses erfordert häufig die Verwendung multifunktioneller Reaktionsmittel niedrigen
Molekulargewichts. So können, wenn R„ in der Formel I Hydroxy
ist, die Carboxylgruppen des Monomeren oder Polymerisate durch Umsetzung
mit einem geeigneten Carboxylgruppen-aktivierenden Reaktionsmittel
aktiviert werden, wie z.B. mit Carbodiimid, z.B« Dicyclohexyl-Darbodiimid
oder Äthylmorpholinocarbodiimid, N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-S'-sulfonat
(Woodward's Reagens H), Heteniminen, wie z.B. Pentamethylenketencyclohexylimin, acetylenischen Äthern, zoB. Mthoxyacetylen,
Hexahalogencyclotriphosphatriazinen, N-Hydroxyphthalimid
oder N-Hydroxysuccinimid und anderen Reaktionsmitteln, die zur Bildung
einer Peptidbindung benutzt werden. Wenn Z in der Formel I Wasserstoff ist, können die Monomer- oder Polymerisathydroxylgruppen
gleichfalls nach Standardverfahren mit Halogen-Z, insbesondere
Bromacetylbromid, Cyanbromid und 2-Amino-if,6-dichlor-1,3,5-triazin
aktiviert werden.
Das Immobilisierungsverfahren ist auf mikrobiologische Zellen, wie
z,B. Bakterien, Hefen, Actinomyces und Pilze anwendbar.
Bevorzugte Zellen sind solche, in denen die Hauptenzymsysteme Oxidoreductasen sind, insbesondere solche, wie z.B. Glucoseoxidase,
die keine löslichen Cofaktoren erfordern, Hydrolysen, wie z.B.ofc,
ß-Amylasen und Peptidasen und insbesondere Penicillinacylase,
Lyasen, vorzugsweise solche, die Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindungen
brechen und insbesondere solche, wie z.B. Phenylalaninammoniaklyase
und Aaparaginatammoniaklyase, die Kohlenstoff»Stickstoff-Bindung
brechen, und Isomerasen, wie zoB. Racemasen, Epimerisan, cis-trans-
-Isomerasen und insbesondere Glucoseeisomerase. Zu bevorzugten Bak-
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teriengattungen gehören Pseudomonas, Xanthomonaa, Acetabacter,
Alcanigenes, Flavobacterium, Escherichia, Aerobacter, Erwinia,
Serratia, Proteus, Micracoccus, Sacina, Lactobacillus, Bacillus,
IMocardia, Streptomyces und Garnynebacterium· Zu bevorzugten PiIz-
und Hefegattungen gehören Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces,
Mucar, Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Glomerella,
Rhizopus, Saccharomycea, Gonidiobolus, Bysaochlamys, Candida,
Ghaetamium, Trichaderma, Septoria, Caprinus, IMeuraspora, Humucola
und Trichoaporano Die bevorzugte Actinamyceagattung iat Micrcpolyspora.
Besonders bevorzugte Arten sind Escherichia coil, Bacterium cadaveris, Proteus rettgeri, Rhadotorula gracilis,
Penicillium chryaogenum und Aspergillus niger.
Die kovalente Bildung der Zellen an das reaktionsfähige Polymerisat
ader die Bindung an das reaktionsfähige Monomer, gefolgt von der Polymerisation oder Copolymeriaation des Monomeren, findet
im wäßrigen Medium statt· Obwohl die Temperatur zum Binden an das Polymerisat oder Monomer Dder für die Polymerisation nach dem
Binden an das Monomer innerhalb eines großen Bereichs variiert werden kann, ist der bevorzugte Bereich 5 bis 5Q0C und insbesondere
10 bis 3D0C. Die zur Herstellung der Bindung erforderliche Zeitdauer
hängt von dem System und der zur Herstellung der Bindung angewandten Temperatur ab, liegt aber normalerweise in dem Bereich
von 0,5 bis 35 Stunden. Die bevorzugte Zeitdauer zur Herstellung der Bindung an das Polymerisat beträgt 15 bis 30 Stunden und an
das Monomer 1 bis 5 Stunden, Die Polymerisation sind normalerweise
in 1 bis 6 Stunden beendet. Das Geuiichtsverhältnia von dem Polymerisat
zu den Zellen (bezogen auf das Trockengewicht) kann erheblich variiert werden, und das bevorzugte Verhältnis beträgt 0,1
bis 25 und vorzugsweise 0,5 bis k.
üJenn die Zellen an das reaktionsfähige Monomer gebunden sind, wird
die nachfolgende wäßrige Additionspolymerisation mit einem oder
mehreren Comonomeren oder ohne ein Comonomer oder mehrere Coraonc-
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in Gegenwart von difunkticinellen Vernetzungsmonomeren und
einem Initiatory stem durchgeführt. Irgendwelche Comonomeren,
Vernetzungsmanomeren und Initiatorsysteme, die üblicherweise
bei disaein Polymerisationatyp benutet werden und die enzyraatiaohe
Aktivität der Zellen nicht zerstören, können dafür in einfacher Weise angeuiendet werden.
Geeignete Comonoraeren sind z.B. Acrylsäure, oc-ChloracrylsMure,
Methacrylsäure und der Glycidyl-niedrigere-alkylester, N,N-(di-8ub8t.)-Aminaalkylester,
Amide, mit niedrigerem Alkyl substituierte Amide, methylolaubatituierte Amide, N-manosubstituierte
Amincalkylamide und I\l,N-disubstituierte Aminoalkylamide davon,
Styrol, Butadien und Isopren. Zu bevorzugten Comonomeren gehören Styrol, Acrylsäure, [J2-Hydraxy-3-(1- |j»-methylpiperazinylj )-propylj
methacrylat und insbeaondere Methylmethacrylat.
Eine große Vielfalt von Vernetzungsmanomeren, die dem Endprodukt
den Charakter eines dreidimensionalen Netzwerks und Idaaserunlüalichkeit
verleihen, können angewendet werden, wie z.Bo Acrylmanoraeren
oder Olefinverbindungen und andere bekannte Verbindungen· Typische Monomeren dafür sind 1,3-Butylendiacrylat, Äthylenglykoldimethacrylat,
1,6-Hexamethylendiacrylat, 1,3-Butylendimethacrylat,
Äthylendiacrylat, Diäthylenglykoldimethacrylat, N,rJ'-Mathylenbisacrylaraid,
Neopentylglykoldimethacrylat, 1,1,1-Trimethyloläthantriroethacrylat
und Divinylbenzol. Ein bevorzugtes Vernetzungsmonomer
ist Ν,Ν'-Methylenbiaacrylamid.
Die Polymerisations-· und Capalymeriaationsreaktion werdea durch
freie Radikale initiiert. Geeignete frei-radikaliache Initiatorsysteme
sind solche, die freie Radikale mit einer geeigneten Geschwindigkeit für die Polymerisation ader Copolymerisation unter
den wagen der ülärmeempfindlichkeit des Zellenzymteils erforderlichen
milden Bedingungen bilden. Redoxyinitiatorsysterne werden aus diesem
Grund bevorzugt. Beispiele für solehe Systeme sind Preoxyverbindungen,
wie z.B. Ammonium-,Natrium- oder Kaliumpersulfat, Benzoyl-
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peroxid und Di-(sek.-butyl)peraxydicarbanat in Kombination mit
einem Reduktionsmittel, uie z.B. Natriumthiosulfat, IMatriummetabisulfit,
Eisen-II-ammoniurnsulfathexahydrat, Dimethylaminopropionitril
oder Riboflavin. Ein bevorzugtes Initiatoraystem
ist Dimethylaminopropionitril-Ammaniumpersulfat.
Die Zusammensetzung des Polymerisats kann erheblich variieren, wobei die bevorzugte Zusammensetzung in Mol-%, bezogen auf die
gesamten Monomeren, 15 bis 90 % zellreaktionsfähigem Monomeren,
0 bis 60 % Comonomeren und 1D bia kO % Vernetzungsmonomeren
entsprichto Diese Verhältnisse werden bevorzugt, gleich ob die
Zellen an das Monomer oder an das zuvor gebildete Polymerisat gebunden werden.
In bestimmten Fällen werden die Zellen mit einem polyfunktionellen
Vernetzungsmittel behandelt, um einen Enzymverlust der Zellen
herabzusetzen. Obwohl der genaue ablaufende Mechanismus nicht
völlig geklärt ist, wird angenommen, daß eine Klasse der polyfunktionellen
Reaktionsmittel mit den Aminogruppen der Zellmembranen
reagiert und diese dadurch vernetzt, wodurch die Porosität der Zellmembran in wirksamer Weise verringert wird; die
andere Klasee erreicht dieses Ergebnis durch Aktivierung der in
der Zellmeabran vorhandenen Carboxylgruppen, die dann mit Merabranaminogruppen
durch Bildung von Amidbindung reagieren. Zu typischen
Beispielen für die erste Klasse gehören Reaktionsmittel wie Hethyglyaxal
(Pyruvaldehyd), Glyoxal, Hydroxyadipaldehyd, Cyanursäurechlorid, tetraazotiertes o-Dianisidin, bisdiazotiertes
Benzidin, 1f3-DifluQr-ift6-dinitrbbenzol, Toluol-Zjit-diisocyanat
und insbesondere Qlutaraldehyd, während zu der zweiten Klasee
Reaktionsmittel gehören, wie Äthylchlorformiat und wasserlösliche Carbodiimide, zoB. 1-Äthyl-3-(3ldimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid.
Die Zellen können entweder vor dem Binden, während des Bindens oder
nach dem Binden an das reaktionsfähige Monomer oder Polymerisat behandelt werden. üJie beim Binden der Zellen wird die Behandlung in
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wäßrigem Medium vorgenommen. Obwohl die Zellen innerhalb eines breiten temperaturbereich^ wirksam behandelt werden können,beträgt
der bevorzugte Bereich dafür 5 bis 5D0C und insbesondere
1D bis 3DQC. Je nach der angewandten Temperatur und dem benutzten
Mittel erfordert die Behandlung normalerweise 0,5 bis 1D Stunden, vorzugsweise 2 bis k Stunden. Die erforderliche Menge des Mittels
kann erheblich schwanken, beträgt aber im allgemeinen 1 bis 5D Gew.-% der Zellen (auf Trockenbasis) und vorzugsweise 5 bis 25
Gew.-% der Zellen.
Die beschriebene Zellimmobilisierung durch chemische kovalente
Bindung an wasserunlösliches Polymerisat, gegebennenfalls unter
Behandlung der Zellen, um einen Enzymverlust der Zellen auf ein Kleinstmaß zurückzuführen, führt zu einem haltbaren immobilisierten
Enzymsystem, ohne daß es erforderlich ist, ein gewünschtes Enzym zu isolieren. Wegen der Beständigkeit und der leicht
filtrierbaren Teilchenform kann das Produkt in wirksamer Weise bei wäßrigen katalytischen chemischen Prozessen verwendet werden,
bei denen entweder ansatzweise oder kontinuierlich unter Rückführung von Material gearbeitet wird.
Ausführungsformen der Erfindung werden in den nachfolgenden Beispielen
erläutert.
Zu 8Q g Glycidylmethacrylat plus 1,0 Liter Wasser wurden unter
Rühren 30 g IM1IM '-Methylenbisacrylamid gegeben. Nach dem Rühren
des Gemischs für 15 Minuten bei Raumtemperatur wurden 10 g Methylmethacrylat zugegeben und wurde das Gemisch auf etwa 50G
abgekühlt und Stickstoffgas in das kalte Gemisch für 15 Minuten
geblasen,. Dann wurden 20 ml Dimethylaminopropionitril und 2 g
Ammoniumpersulfat zugegeben« Das Gemisch wurde unter Stickstoff bei
10 C gerührt, bis die Polymerisation begann, und wurde dann eine
weitere Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt und schließlich 2 Stunden stehengelassen. Etwa 750 ml Wasser wurden der erhaltenen
festen Substanz zugegeben, und das Gemisch wurde stark gerührt, um
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das Polymerisat zu zerteilBn. Die feste Substanz wurde abfiltriert,
mit üiaaser gewaschen und an der Luft getrocknet, und es wurden
120 g weißes teilchenförmiges Polymerisat erhalten.
Eine Aoniger (NRRL-3;Pfizer Kultur FD 2if5^)-Fermentationsbrühe,
die unter aeroben Unterwasserbedingungen bei 330C und einem
pH-ldert von 5,8-7,0 auf Glucosesubstrat gezüchtet worden war,
wurde filtriert, und die Zellen wurden mit üJasser gewaschen und
zu einer halbtrocknen Paste verpreßt. Die Zellen (25D g, 55 g trocken) wurden in eine Lösung eingetragen, die 22 g 25-Gew.-%iges
wäßriges Glutaraldehyd in 10D0 ml QJasser enthielt. Der pH-tüert
der Suspension wurde auf 6,2 eingestellt, und die Suspension wurde 1 3/k Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die festen
Substanzen wurden abfiltriert und mit üJasser gewaschen und ergaben
1Oi* g von feuchten behandelten Zellen, die 76 % der ursprünglichen
Glucoseoxidase-Aktivität besaßen.
Eine Suspension von 32 g feuchten behandelten Zellen und 16 g des Glycidylmethacrylatpolymerisats in 240 ml Wasser wurde 30
Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Die festen Substanzen wurden mit Wasser gewaschen und ergaben 126 g
feuchte immobilisierte Zellen, die 58 % der Glucoseoxidase-Aktivität der ursprünglichen unbehandelten Zellen aufwiesen.
Zu einer Aufschlämmung von 600 mg von wie in dem Beispiel 1
zubereiteten feuchten behandelten A.niger-Zellen (23 Einheiten Glucoseoxidase-Aktivität/100 mg) in 20 ml Acetonitril wurden
gleichzeitig 600 mg Methacryloylchlorid und *tDO mg Triäthylamin
gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt und dann in 20 ml Wasser eingetragen (wobei Ein pH-Lüert von
6,03 erhalten wurde). Zu dem wäßrigen Gemisch wurden unter Stickstoff 1,3 g NjN'-Methylenbisacrylamid, 750 mg Methylmethacrylat
und 300 mg Acrylsäure gegeben. Der pH-üJert des Gemisches wurde auf 6,7 eingestellt, und das Gemisch wurde dann
mit 0,5 ml Dimethylaminopropionitril und 250 mg Ammoniakpersul-
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fat bBhandBlt. Nach 2 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit
weitsren 150 mg Ammaniumpersulfat behandelt und für eine Stunde
gerührt. Ein gleiches Volumen Wasser wurde dem Reaktiansgemisch
zugegeben, und das Gemisch aurde zentrifugiert. Der Rückstand
wurde filtriert und mit Wasser gewaschen, und es wurden 32,25 g feuchte immobilisierte Zellen Erhalten, die 78 % der GlucDseoxidase-Aktivität
der ursprünglichen unbehandelten Zellen auf-UlESEn.
Die feuchten immobilisierten Zellen des Beispiels 1 (47,3 g) wurden in 100 ml einer wäßrigen Lösung eingetragen, die 10 g
Glucose enthielt, und das Gemisch wurde unter Belüften 21 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Eine 99%ige Umwandlung zu einem
Gemisch von Gluconsäure und delta-Gluconolaceton wurde erzielt ,
und 75 % der ursprünglichen Enzymaktivität war erhalten geblieben.
Diese Oxidation konnte unter Verwendung von 30 g der feuchten
immobilisiBrten Zellen des Beispiels 2 in 20 ml einer wäßrigen
Lösung, die 2 g Glucose enthielt, unter Erziekung einsr vergleichbaren
Umwandlung und Erhalt einer vergleichbaren EnzymaktivitMt wiedsrholt werdsn.
BeispJBl
k
Eine Proteus rettgeri (ATCG 9250; Pfizer Kultur FD 18470-76-60)-Fermentationsbrühe,
die unter aeroben Unterwasserbedingungen bei 28DC und einem pH-üJert von 6,8-7,0 auf Milchkaseinsubstrat gezüchtet
worden war, wurde zentrifugiert, und die Zellen wurden erneut in üJasssr aufgeschlämmt und zu einer halbtrocknen Paste
verpreßt. Zu einer Aufschlämmung der feuchten Zellen (7,5 g Trockengewicht) in 100 ml üJasser wurden k g 25-Gew.-%iger wäßriger
Glutaraldehyd gegeben. Das Gemisch wurde bei einem pH-Uert von 7,0 3 Stunden gerührt und dann zentrifugisrt. Die bEhandelten
Zellen wurden erneut in 100 ml Wasser suspendiert, und
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7,5 g des Glycidylmethacrylatpolymerisats des Beispiels 1 wurden
unter Rühren zugegebene Das Gemisch luurde bei einem pH-Wert
van 7,0 bei Raumtemperatur 3D Minuten gerührt. Die festen Substanzen uurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und als feuchter
Kuchen bis zur Verwendung aufbewahrt. Die immobilisierten Zellen enthielten 65 % der Aktivität der ursprünglichen unbehandelten
Zellen, gemessen durch die Umwandlungageschwindigkeit von Penicillin G in 6-AminDpenicillinsäure.
Zu einer Aufschlämmung van 2D g (5,0 g trocken) der immobilisierten
Proteus rettgeri-Zellen des Beispiels k in 5OD ml Wasser
bei einem pH-Wert von B1D und 37DC wurden 5 g Kalium-Penicillin
G gegeben. Der pH-Wert der Aufschlämmung wurde bei B1D durch
eingestellte Zugabe von 1-normaler IMaDH gehalten. Die Hydrolyse
war nach 3 Stunden beendet. Die immobilisierten Zellen wurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und als feuchter Kuchen für
eine weitere V/erwendung aufbewahrt. Das Filtrat wurde mit
2-normaler HGl auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und mit
Äthylacetat extrahiert. Der pH-Wert der erhaltenen wäßrigen Schicht wurde mit 2-normaler NaDH auf kt3 eingestellt, und die
wäßrige Schicht wurde konzentriert und abgekühlt und ergab eine weiße kristalline/feste Substanz. Die Kristalle wurden abfiltriert,
mit Wasser gewaschen und luftgetracknet und ergaben 2,17 g
(75%ige Ausbellte) reine 6-Aminopenicillansäure. Die immobilisierten
Zellen behielten noch etwa 5D % der Penicillinacylaae-Aktivität der ursprünglichen immobilisierten Zellen des Beispiels
h nach 20 Hydrolysezyklen·
Zu einem Gemisch von 3,6 g Bromacetylhydraxyäthylmethaorylat
in 15 ml Wasser wurden unter Rühren des Getnischs unter Stickstoff
375 mg I\lfi\l!-Methylenbisacrylamid gegeben. Das Gemisch
wurde auf 5DC abgekühlt und mit D,25 ml Dimethyläminopropionitrol
und 3B mg Ammoniumpersulfat behandelt. Das Gemisch wurde
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langsam hei Raumtemperatur gerührt, bis die Polymerisation begann.
Der Rührer wurde dann abgestellt, und das Reaktionsgemisch
wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden stehengelassen. Die erhaltene Aufschlämmung wurde mit 25 ml Wasser verdünnt
und filtriert. Der Kuchen wurde mit lüasser gewaschen und luftgetrocknet
und ergab 3,7 g teilchenförmiges Material.
Feuchte ausgedrückte Proteus rettgeri-Zellen, die wie in dam
Beispiel k gezüchtet und isoliert worden waren (10 g, 2 g
trocken), wurden in eine Lösung eingetragen, die 0,8 g 25-Gew·-
%igen wäßrigen Glutaraldehyd in 5D ml Wasser enthielt. Der
pH-üJert der Suspension wurde auf 7,0 eingestellt, und die Suspension
wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann zentrifugiert. Die behandelten Zellen wurden erneut in 50 ml
Uasser aufgeschlämmt und zu einer halbtrocknen Paste verpreßt.
Eine Suspension von 10 g der behandelten Zellen und 20 g des
Bromacetylhydraxyäthylmethacrylatpolymerisats in 120 ml Wasser
wurde 30 Stunden bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 7,0 gerührt. Das Gemisch wurde filtriert, und der Kuchen wurde mit
Wasser gewaschen und ergab 36,8 g feuchte immobilisierte Zellen
mit 75 % der Penicillinacylase-Aktivität der ursprünglichen unbehandelten Zellen.
Zu einer Aufschlämmung von UG g der feuchten immobilisierten
Zellen des Beispiel 6 in 5OD ml Wasser bei einem pH-Wert von 8,0 und 37DC wurden 5 g Kalium-Penicillin G gegeben. Der pH-Wert
der Aufschlämmung wurde bei 8,0 durch eingestellte Zugabe von
1-normaler NaOH gehalten, und die Hydrolyse wurde nach 3 Stunden
beendet. Die immobilisierten Zellen wurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und dann als feuchter Kuchen bis zum weiteren
Gebrauch aufbewahrt. Der pH-Wert des Filtrats wurde mit 2-normaler
HCl auf 2 eingestellt, und das Filtrat wurde mit Äthylacetat
extrahiert. Der pH-Wert der erhaltenen wäßrigen Schicht wurde auf k,3 mit 2-normaler IMaOH eingestellt und die wäßrige
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Schicht wurde konzentriert und abgekühlt und ergab kristalline
6-Aminopenicillansäure·
Eine Suspension von 25 g feuchten behandelten A.niger-Zellen
wie in dem Beispiel 1 sowie 2 g Glycidylmethacrylat in 60 ml
Wasser wurde 17 Stunden bei 7°C gerührt. Die Suspension wurde dann zu einem Gemisch von 2,2 g PJ1IM1-Methylenbisacrylamid,
2 ml Styrol, 450 mg Methylmethacrylat, 0,5 ml Dimethylaminopropionitril
und 1,5 g 2-Hydroxy-3-(1- [V-methylpiperazinyl] )-propyl
methacrylat in 40 ml Wasser bei einem pH-Uert von 6,8 gegeben.
Das Gemisch wurde unter Stickstoff mit 200 mg Ammnniumpersulfat
behandelt und für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt·
Die festen Bestandteile des Reaktionsguts wurden abfiltriert und mit Wasser gewaschen, und es wurden 43,6 g feuchte immobilisierte
Zellen mit 75 % der Glucoseoxidase-Aktivität der ursprünglichen
unbehandelten Zellen erhalten.
Die feuchten immobilisierten Zellen des Beispiels B (2B,3 g)
wurden in 200 ml einer wäßrigen Lösung eingetragen, die 20 g Glucose enthielt, und das Gemisch wurde unter Belüften 21 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde eine BO %ige Ausbeute von einem Gemisch von Glucansäure und delta-Glucanolaceton erhalten.
Die nach dar Umsetzung erhaltene Aufschlämmung wurde filtriert,
und die festen Substanzen wurden mit Wasser gewaschen und ergaben 28 g feuchte immobilisierte Zellen mit B2 % der
ursprünglichen Enzymaktivität.
Eine Suspension von 5 g feuchter ausgedrückter Proteus rettgeri-Zellen,
gezüchtet und isoliert wie in dem Beispiel 4, und 10 g Glycidylmethacrylatpolymerisat des Beispiels 1 in 65 ml Wasser
wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde filtriert, und der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen und
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ergab 26,9 g feuchtB immabilisiertB Zellen mit 62 % der anfänglichen
Peniclllinacylase-Aktivität.
Die immobilisierten Zellen (25 g, 1 g Trockenzellgewicht) wurden
in eine Lösung eingetragen, die 0,^ g 25-Gem.-?6igen wäßrigen
Glutaraldehyd in 50 ml Wasser enthielt· Der pH-Uert der Suspension
wurde auf 7,D eingestellt, und die Suspension wurde
3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Aufschlämmung wurde
filtriert, und der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen und ergab 23,2 g feuchte behandilte immobilisierte Zellen mit 79 % der Penicillinacylase-Aktivität der anbehandelten immobilisierten Zellen.
3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Aufschlämmung wurde
filtriert, und der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen und ergab 23,2 g feuchte behandilte immobilisierte Zellen mit 79 % der Penicillinacylase-Aktivität der anbehandelten immobilisierten Zellen.
Zu einer Aufschlämmung von 12 g der feuchteö behandelten immobilisierten
Zellenzubereitung des Beispiels 10 in 100 ml Uasser bei einem pH—Wert von 8,0 und 37QG wurde 1 g Kalium-Penicillin G
gegeben· Der pH-üJert des Reaktionsgemische wurde bei 8,0 durch
eingestellte Zugabe von 1-normaler NaQH gehalten, und die Umsetzung
wurde nach 3 Stunden beendet. Das immobilisierte ZaIlnraterial
wurde filtriert, mit Uasser gewaschen und als feuchter Kuchen bie zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Der pH-QJert des
Filtrats wurde auf 2 mit 2-normaler HCl eingestellt, und das
Filtrat wurde dann mit Äthylacetat extrahiert. Der pH-üJert der erhaltenen wäßrigen Schicht wurde mit 2-normaler NaQH auf k,3
eingestellt, und die Schicht wurde konzentriert und abgekühlt
und ergab kristalline 6-Aminopenicillansäure·
Filtrat wurde dann mit Äthylacetat extrahiert. Der pH-üJert der erhaltenen wäßrigen Schicht wurde mit 2-normaler NaQH auf k,3
eingestellt, und die Schicht wurde konzentriert und abgekühlt
und ergab kristalline 6-Aminopenicillansäure·
Eine Suspension von A.nigervZellen (20 g, k g trockne Zellen),
die wie in dem Beispiel 1 gezüchtet und isoliert worden waren, und 8üg Glycjcdylmethacrylai in 100 ml üJasser wurde auf einen
pH-lüert von 7,5 eingestellt und 18 Stunden bei Raumtemperatur
geschüttelt· N1IM- Methylenbisacrylamit (1,5 g ) wurde zugegeben, und die erhaltene Aufschlämmung wurde 15 Minuten unter Stick -
pH-lüert von 7,5 eingestellt und 18 Stunden bei Raumtemperatur
geschüttelt· N1IM- Methylenbisacrylamit (1,5 g ) wurde zugegeben, und die erhaltene Aufschlämmung wurde 15 Minuten unter Stick -
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stoff gerührt, dann auf 5 C abgekühlt, mit 150 mg Ammoniumpersulfat
plus 1ml Dimethylaminopropianitril behandelt und bei
Umgebunstemperatur 3 Stunden gerührt. Die festen Bestandteile
des Reaktionsgemische wurden abfiltriert und mit Uasser gewaschen
und ergaben 71 g feuchte immobilisierte Zellen mit 62 % der ursprünglichen Glucoseoxidase-Aktivität.
Die immobilisierten ZellennC 18 g, 1g Trockenzellgewicht) wurden
in eine Lösung eingetragen, die 0,4 g 25-Gew.-%igen wäßrigen
Glutaraldehyd in 1DD ml Uasser enthielt. Der pH-Wert der Suspension
uurde auf 7,0 eingestellt, und die Suspension ujurde
3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die festen Substanzen UUrdan,
abfiltriert und mit Uasser gewaschen und ergaben 17,3 g feuchte behandelte immobilisierte Zellen mit 75 % der Glucoseaxidase-Aktivität,
die in den immobilisierten Zellen vor der Behandlung mit Glutaraldehyd vorhanden gewesen war.
Die feuchten behandelten immobilisierten Zellen (14 g) des Beispiels
12 wurden in 15 ml einer wäßrigen Lösung eingetragen, die 1,5 g Glucose enthält, und das Gemisch wurde unter Belüften
21 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei eine Umwandlung in Gluconsäure stattfand und eine Enzymaktivität erhalten wurde,
die den betreffenden Uerten des Beispiels 3 entsprechen.
Rhodotorula gracilis-Zellen (NRRL Y1D91; Pfizer Kultur FD 6521)
wurden aus einer Permentationsbrühe, in der die Hultur unter
aeroben Unterwasserbedingungen bei 2S°C und einem pH-Uert von 6,8-7,D auf Glucosesubstrat gezüchtet worden war, durch Zentrifugieren
isoliert. 50 g gewaschene Zellen in 250 ml Uasser wurden mit 5 g Glycidylmethacrylatpolymerisat des Beispiels
behandelt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 20 Stunden gerührt.
Die Suspension wurde filtriert, und der Filterkuchen wurde mit Uasser gewaschen und ergab 63 g feuchte immobilisierte Zellen, die
49 % der ursprünglichen Phenylalaninammoniaklyase-Aktivität auf-
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wiesen.
Eine Suspension van 14,74 g feuchter immobilisierter Zellen des
Beispiels 14 in 3D ml Wasser, das 2,25 g trans-Zimtsäure,
652 g Ammoniumchlorid und 3,3 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid
enthielt, wurde auf einen pH-Lüert von 9,5 eingestellt.
Das Bemisch wurde bei 37DC 18 Stunden geschüttelt und ergab
eine etwa 90%ige Ausbeute von L-Phenylalanin, bezogen auf die
wiedergewonnene Zimtsäure. Die festen Substanzen des Reaktionsgemische wurden abfiltriert und mit Wasser gewaschen und ergaben
14 g feuchte immobilisierte Zellen mit 77 % ihrer ursprünglichen
Phenylalaninammoniaklyase-Aktivität. Das L-Phenylalanin
wurde aus dem Filtrat nach Standardmethoden isoliert.
Eine Suspension von 40 g gewaschener Rhadotorula gracilis-Zellen,
die wie in dem Beispiel 14 gezüchtet und isoliert worden waren, plus 8 g Glycidylmethacrylat in 80 ml Wasser wurde auf
einen pH-üJert von 7,2 eingestellt und bei Raumtemperatur 1,5
Stunden gerührt. Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid (1,5 g) wurde zugegeben,
und die erhaltene Aufschlämmung wurde unter Stickstoff 10 Minuten gerührt, dann auf 5DC abgekühlt, mit 150 mg Ammoniumpersulfat
plus 1 mg Dimethylaminopropionitril behandelt und bei
Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Die nach der Umsetzung erhaltene
Aufschlämmung wurde mit Wasser verdünnt und filtriert. Der Polymerisatkuchen wurde mit Wasser gewaschen und ergab
62,3 g feuchte immobilisierte Zellen mit 44 % der ursprünglichen
Phenylalaninammoniaklyase-Aktivität-,
Eine Suspension von 15 g feuchter immobilisierter Zellen des Beispiels 16 in 30 ml Wasser, das 1,12 g trans-Zimtsäure, 320 mg
Ammoniumchlorid und 1,6 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid enthielt,
wurde auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt. Das Gemisch
wurde bei 37DC 18 Stunden geschüttelt, wobei eine L-Phenyl-
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alaninbildung erzielt wurde, die der des Beispiels 15 entsprach·
Eine Suspension von 15 g feuchten ausgedrückten Proteus rettgeri-Zellen,
die ujie in dem Beispiel k gezüchtet und isoliert worden
waren, und 3D g Glycidylmethacrylatpolymerisat des Beispiels 1
in 1GD ml lilasser wurde bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von
7 18 Stunden gerührt. Die Suspension wurde dann zentrifugiert, und die festen Substanzen wurden mit LJasser gewaschen, und es wurden
1DD g feuchte immobilisierte Zellen mit 1DD % der ursprünglichen
Penicillinaoylase-Aktivität erhalten.
Zu einer Aufschlämmung von 25 g der feuchten immobilisierten Zellen in 7D ml Wasser bei einem pH-Wert von 8,0 und 37°C wurde
1 g Kalium-Penicillin B gegeben. Die Hydrolyse, die bei einem
pH-Wert von 8,D durch eingestellte Zugabe von 1-normaler NaDH
durchgeführt wurde, war nach 3 Stunden beendet. Die Aufschlämmung wurde dann filtriert, und die immobilisierten Zellen wurden
mit Wasser gewaschen und als feuchter Kuchen für eine weitere
Uerwndung aufbewahrt. Die Wirksamkeit dieser Zellen für die Bildung von 6-Aminopenicillansäure war jedoch nicht so groß
wie die Wirksamkeit der immobilisierten Zellen des Beispiels kt
weil die Zellen nur 15 % der Penicillinacylase-Aktivität der ursprünglichen Zellen nach nur 2 Hydrolyse-Zyklen zurückbehielten.
Zu 25 g 2-Hydroxyäthylmethacrylat in 1DD ml Wasser wurden 12,5 g
Cyanbromid, gelöst in 1DD ml Wasser, gegeben. Der pH-Wert des Bemischs wurde sofort mit 5-normaler IMaDH auf 11 eingestellt,
wodurch die Reaktionstemperatur auf 460G erhöhte, und dann
bei diesem pH-Wert gehalten, bis keine weitere Base erforderlich war. Das Bemisch wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt, der
pH-Wert des Bemischs wurde auf 6,5 eingestellt, und das Bemisch wurde dann mit einer Aufschlämmung von 5D g gefriergetrockneten
Proteus rettgeri-Zellen, die vor dem Trocknen wie in dem Beispiel 4 gezüchtet und isoliert worden waren, in 5DD ml Wasser
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behandelt· Die erhaltene Suspension uiurde b5 Minuten gerührt.
Dann wurden 25 g Acrylamid und 2,5 g N1IM1-Methylenbisacrylamid
zugegeben, und die Suspension wurde 15 Minuten gerührt, auf ^0G
abgekühlt und mit k ml Dimethylaminapropionirtil plus i*25 mg
AmmaniumperBulfat behandelt. Das Polymerisationsgemisch konnte
sich dann auf Raumtemperatur abkühlen und wurde 1 Stunde stehen gelassen.
Das Gemisch wurde dann unter Benutzung eines Waring Mischers durchgemischt und zentrifugiert. Die gelartigen abzentri fugierten
festen Substanzen wurden in Wasser erneut suspen diert, erneut zentrifugiert, mit Wasser gewaschen und gefrier getrocknet
und ergaben 112 g trockene immobilisierte Zellen mit 19 % der ursprünglichen Penicillinacylase « Aktivität,
Zu einer Suspension von 20 g feuchten ausgedrückten Proteus
rettgeri-Zellen, die wie in dem Beispiel h gezüchtet und iso liert
worden waren, in 80 ml Wasser wurden 1 g 25~gew,-%iger
wäßriger Glutaraldehyd und 10 g Glycidylmethacrylat gegeben. Der pH-Wert der Suspension wurde auf 6,8 eingestellt, und die
Suspension wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Ge misch
wurde dann unter Stickstoff mit 1,9 g IM1IM1 - Methylenbis acrylamid
und 2 ml Dimethylaminopropionitril behandelt, auf
einen pH-Wert von 7 eingestellt und mit 200 mg Ammoniumperaul fat
behandelt. Die erhaltene Suspension wurde 1/2 Stunde gerührt und dann 1 1/2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die
festen Bestandteile wurden abfiltriert und mit Wasser gewaschen und ergaben 81,3 g feuchte immobilisierte Zellen mit 5k % der
ursprünglichen Penicillinaoylase-Aktivität der unbehandelten Zellen,
Die feuchten immobilisierten Zellen waren zur Umwandlung von
Kalium-Penicillin G in 6-Aminopenicillansäure, wie in dem Beispiel
7 beschrieben ist, mit vergleichbaren Ergebnissen
geeignet.
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Seispiel 21
Eine Bacterium cadaveris (ATCC 9760; Pfizer Kultur FD 24016)-Fermentationsbrühe,
die durch Züchten unter aeroben Unterwasserbedingungen
bei 2B0C und einem pH-Ldert von 6-8 Proteinhydrolysatsubstrat
erhalten worden war, wurde zentrifugiert, und die Zellen wurden erneut in Wasser aufgeachlämmt und zu
einer halbtrocknen Paste verpreßt. Zu der Aufschlämmung der
feuchten Zellen (7,5 g Trockengewicht) in 100 ml Wasser wurden k g 25-Geu.-%iger wäßriger Glutaraldehyd gegeben. Das Gemisch
wurde etwa 2 Stunden bei einem pH-Wert von 7 gerührt und dann zentrifugiert. Die behandelten Zellen wurden erneut in 100 ml
Wasser suspendiert, und 7,5 g Glycidylmethacrylatpolymerisat
des Beispiels 1 wurden unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wurde bei einem pH-Wert von etwa 7,0 und Raumtemperatur 30 Stunden
gerührt. Die festen Bestandteile wurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und als feuchter Kuchen bis zur Verwendung aufbewahrte
Fumarsäure (120 g) wurde zu 140 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid
gegeben. Der pH-Wert des Gemischs wurde mit Ammoniumhydroxid
auf 8,5 eingestellt, und das Volumen des Reaktionsgemische
wurde mit Wasser bis zu 600 ml aufgefüllt. Immobilisierte Zellen des Beispiels 21, enthaltend 7000,u Asparaginatammoniaklyase-Aktivität,
wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37 C k Stunden gerührt. Die nach der Umsetzung erhaltene
Aufschlämmung wurde filtriert, und der pH-Wert des Filtrats
wurde mit Schwefelsäure auf 2,8 eingestellt, um Asparaginsäure auszufällen.
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Claims (12)
1. Immobilisierte mikrobiologische Zellen enthaltendes Präparat,
dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen an eine Matrix aus wasserlöslichem
teilchenförmigen! Polymerisat kovalent gebunden sind.
2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die kovalente
Bindung zwischen Zellaminogruppen und mit Aminogruppen reagierenden
PDlymerisatsubstituenten besteht.
3. Präparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Substituenten
aus einer der Epoxidgruppen, Halogencarbonylgruppen und
Halogenmethylcarbonylgruppen bestehen.
k. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zellen eines der Enzyme Glucoseoxidase, Penicillinacylase,
Phenylanalinammoniaklyase, Asparaginatammoniaklyase enthalten.
5. Uerfahren zur Immobilisierung mikrobiologischer Zellen, dadurch
gekennzeichnet, daß mikrobiologische Zellen mit Bindungsgruppen für
ein Polymerisat unter Bildung kovalenter Bindungen mit einer Matrix aus wasserunlöslichem teilchenförmigen! Polymerisat umgesetzt werden.
B. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminogruppen
in der Zelle mit Substituenten, die mit Aminogruppen reagieren,
unter Bildung kDualenter Bindungen umgesetzt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 und 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zellen mit einem gebildeten Polymerisat in Berührung gebracht
werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 und 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zellen mit einem äthylenisch ungesättigten Monomeren umgesetzt
5OSC41 /U994
werden, das dann polymerisiert wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zellen mit einem polyfunktianellen Vernetzungsmittel umgesetzt
werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung
mit dem Vernetzungsmittel vor der die kovalente Bindung bildenden
Umsetzung durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 und 1G, dadurch gekennzeichnet,
daß das Mittel Glutaraldehyd ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen
in einem wässrigen Medium mit Glycidylmethacrylatmonomer unter Bildung
kcvalenter Bindungen umgesetzt werden und das Monomer dann in Gegenwart
von NjlM'-Methylen-bisacrylamidmanomer und Dimethylaminopropionitril-Ammoniumpersulfat
polymerisiert uird.
509841/0
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