DE2513929A1

DE2513929A1 - Immobilisierung mikrobiologischer zellen

Info

Publication number: DE2513929A1
Application number: DE19752513929
Authority: DE
Inventors: Roger Peter Nelson
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1974-03-27
Filing date: 1975-03-26
Publication date: 1975-10-09
Also published as: NO750867L; FI54608B; AT342541B; DD119598A5; YU70975A; NL7503319A; PH12137A; CS194220B2; CH610908A5; US3957580A; HU173101B; IN140732B; CA1036087A; SE7502470L; FI750890A; NO144220C; AR207971A1; TR19298A; IE40705B1; LU72150A1

Description

Immobilisierung mikrobiologischer Zellen

Die Erfindung bezieht sich auf polymere Enzymprodukte. Im spezielleren bezieht sich die Erfindung auf immobilisierte mikrobiologische Zellen und deren Herstellung.»

Enzyme sind ihrem hohen Spezifitätsgrad bei vielen chemischen Reaktionen konventionellen Katalysatoren weit überlegen. Bis vor kurzem jedoch haben einzige Faktoren, wie die hohen Isalierungskosten, die Neigung zur Instabilität, wenn die Enzyme aus dem Milieu der ganzen Zelle herausgenommen werden, und die Erhältlichkeit nur in löslicher Form, die Verwendung von Enzymen stark eingeschränkt.

Die Immobilisierung van Enzymen durch Bindung an ein festes oder Einschluß in einem festen Trägermaterial haben dazu beigetragen, diese Schwierigkeiten zu überwinden und die Verwendung von Enzymen wirtschaftlicher zu gestalten. Die verschiedenen physikalischen und chemischen Methoden zur Immobilisierung werden in Berichten, wie "Immobilized Enzymes" von D.R.Zaborsky (CRS Press, 1973), erörtert.

Eine Immobilisierung der ganzen Zelle selbst zur Ausschaltung der Enzymisolierung und zur Überwindung der Stabilitätsprobleme

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ist ebenfalls angewendet worden. Bis jetzt jedoch ist die Benutzung dieses üJegs auf physikalische Immobilisierungsmethoden begrenzt geblieben. Typische Beispiele sind die Adsorption von Zellen von Streptotnyces phaeachramogenes, die aktive Glukoseisomerase enthalten, auf rückgebildeten Hautkallagan ( Biotech. & Bioeng.,XA/, Seite 565 (1973) und der Geleinschluß von Pilzzellen, die Hydroxylaseenzym zur Umwandlung der Verbindung S in Cortisol enthalten (Scientific American, März 1971, Seite 30). Diese Immobilisierungsmethoden verhindern jedoch nicht die Loslösung der Zellen von dem Trägermittel. Die Art der Bindungskräfte ist derart, daß die Reaktionsbedingungen stark eingeschränkt sein können, um eine solche Loslösung, die mit dem Uerlust enzymatischer Aktivität und einer möglichen Kontamination des Verfahrensverlaufs verbunden ist, zu verhindern oder auf ein Hleinstmaß zurückzuführen.

Ziel der Erfindung ist daher ein beständigeres ZellimmDbilisierungssystem.

Es ist nun gefunden worden, daß mikrobiologische Zellen durch chemische kovalente Bindung der Zellen an eine Matrix aus wasserunlöslichem teilchenförmigen Polymerisat wirksam immobilisiert werden können. Die chemische Bindung kann entweder mit dem zuvor gebildeten Polymerisat oder mit reaktionsfähigem Monomer vor der Polymerisation erreicht werden. Außerdem verhindert eine Behandlung der Zellen mit einem polyfunktionellen Vernetzungsmittel vor, während oder nach dem Binden einen Enzymverlust der Zelle.

Gemäß der Erfindung wird ein Präparat vorgeschlagen, das mikrobiologische Zellen enthält, die an eine Matrix aus wasserunlöslichem teilchenförmigen! Polymerisatkovalent gebunden sind.

Es wird außerdem ein Verfahren zur Immobilisierung mikrobiologischer Zellen vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß mikrobiologische Zellen mit Bindungsgruppen für ein Polymerisat unter Bildung kovalenter Bindungen mit einer Matrix aus wasserunlöslichem teil-

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chenförmigen Polymerisat umgesetzt werden.

Bei Durchführung der Erfindung werden intakte mikrobiolagiache Zellen an wasserunlösliches teilchenförmiges Polymerisat durch reaktionsfähige Gruppen an dem Polymerisat chemisch gebunden· Dbuohl zur Zeit die Bildung einer chemischen kovalanten Bindung von isolierten Enzymen an ein Polymerisat bekannt ist, ist die Feststellung, daß ganze Zellen als solche, die die Quelle von Enzymen sind und eine größere Größenordnung als Enzyme haben, ebenfalls in wirksamer Weise durch chemische kavalente Bindung immobilisiert werden können, ist in der Tat überraschend. Eins solche Bindung wird häufig durch Umsetzung von Zellarainogruppen mit den reaktionsfähigen Polymarisatsubstituenten Zustandekommen. Außerdem stehen auch andere Gruppen, wie z_oB. Hydroxyl- und Sulfhydrylgruppen, in den Zellen zur Verfügung und können eine Rolle in dem Bindungsmechanismus spielen, und zwar, weil mit Aminogruppen reagierende Polymerisataubatituenten, wie z.B. Epoxid-, Halogencarbonyl- und Halogenmethylcarbonylgruppen, auch gegenüber Hydroxyl- und Sulfhydrylgruppen, die in den Zellen vorhanden Bind, reaktionsfähig sind.

Die Bindung kann entweder vor ader nach der Polymerisatbildung zustandegebracht werden. In dem erstellen Fall werden die Zellen mit einem polymerisierbaren äthylenisch ungesättigten Monomeren mit einer reaktionsfähigen Gruppe und einem Initiatorsyatem in Berührung gebracht. In dem letzteren Fall werden die Zellen direkt mit einem teilchenförmigen Polymerisat mit einer reaktionsfähigen Gruppe in Berührung gebracht· Zu diesen Polymerisaten gehören natürliche und synthetische organische Polimerisate.

Zu polymerisierbaren äthylenisch ungesättigten Monomeren und von diesen herstammenden Polymerisaten, die für die Durchführung der Erfindung entweder nach der Uor- oder Nachbindetechnik geeignet sind, gehören solche mit der Formel I

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	C	H₂ = C- ^R1	oder	Chlor	ist
worin	R. Wasserstoff	, Methyl	Q I		Q I
	D I	O I	-C-R	2 oder	-C
und üJ	S-Cl, <f3	S -Cl,
	ν—/ α	I α

worin R„ Kalogen,

Azido,

2,3-Epaxypropoxy,

2,3-Epithiopropaxy,

N-C 2,3-Epoxypropyl)amino

N"^(p-Dia2oniumchlorid)phenyl7 amino,

Acryloyloxy,

niedrigeres -Alkoxycarbonyloxy oder

Benzolsulfonyloxy ist, X Sauerstoff oder NR₃ ist, worin R₃ LJasserstoff oder

Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, Y Alkylen mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen ist, π eine ganze Zahl von 1 ader 2 ist, Z Halagenacetyl,

2-(if,6-Dichlor)-B-triazinyl_f

p-ToluDlsulfonyl,

p-(Halogenmethyl)benzoyl oder

Cyano ist und X¹ gleich X ist unter der Voraussetzung, daß, uienn Z p-To luolsulfonyl ist, X¹ Sauerstoff ist.

Für die Bindung werden Monomere und Polymerisate bevorzugt, die Epoxid-jHalogencarbonyl- und Halagenmethylcarbanylgruppen enthalten. Besonders geeignet sind solche Polymerisate, die die reaktionsfähigen Monomeren 2,3-Epoxypropylmethacrylat (Glycidylmethaorylat), 2,3 - Epithiopropylmethacrylat, Methacryloylchlorid und Bromaoetyl -

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hydroxyäthylmethacrylat enthalten·

In dem Fall, in dam die Monomeren und Polymerisate nichtreaktionsfähige funktioneile Gruppen enthalten, wie z.B. uienn R_ in der obigen Monomerformel I Hydroxy ist oder Z in dieser Formel I Wasserstoff ist, können die funktioneilen Gruppen in reaktionsfähige Substituenten nach bekannten Methoden umgewandelt werden. Dieses erfordert häufig die Verwendung multifunktioneller Reaktionsmittel niedrigen Molekulargewichts. So können, wenn R„ in der Formel I Hydroxy ist, die Carboxylgruppen des Monomeren oder Polymerisate durch Umsetzung mit einem geeigneten Carboxylgruppen-aktivierenden Reaktionsmittel aktiviert werden, wie z.B. mit Carbodiimid, z.B« Dicyclohexyl-Darbodiimid oder Äthylmorpholinocarbodiimid, N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-S'-sulfonat (Woodward's Reagens H), Heteniminen, wie z.B. Pentamethylenketencyclohexylimin, acetylenischen Äthern, z_oB. Mthoxyacetylen, Hexahalogencyclotriphosphatriazinen, N-Hydroxyphthalimid oder N-Hydroxysuccinimid und anderen Reaktionsmitteln, die zur Bildung einer Peptidbindung benutzt werden. Wenn Z in der Formel I Wasserstoff ist, können die Monomer- oder Polymerisathydroxylgruppen gleichfalls nach Standardverfahren mit Halogen-Z, insbesondere Bromacetylbromid, Cyanbromid und 2-Amino-ⁱf,6-dichlor-1,3,5-triazin aktiviert werden.

Das Immobilisierungsverfahren ist auf mikrobiologische Zellen, wie z,B. Bakterien, Hefen, Actinomyces und Pilze anwendbar. Bevorzugte Zellen sind solche, in denen die Hauptenzymsysteme Oxidoreductasen sind, insbesondere solche, wie z.B. Glucoseoxidase, die keine löslichen Cofaktoren erfordern, Hydrolysen, wie z.B.ofc, ß-Amylasen und Peptidasen und insbesondere Penicillinacylase, Lyasen, vorzugsweise solche, die Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindungen brechen und insbesondere solche, wie z.B. Phenylalaninammoniaklyase und Aaparaginatammoniaklyase, die Kohlenstoff»Stickstoff-Bindung brechen, und Isomerasen, wie z_oB. Racemasen, Epimerisan, cis-trans- -Isomerasen und insbesondere Glucoseeisomerase. Zu bevorzugten Bak-

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teriengattungen gehören Pseudomonas, Xanthomonaa, Acetabacter, Alcanigenes, Flavobacterium, Escherichia, Aerobacter, Erwinia, Serratia, Proteus, Micracoccus, Sacina, Lactobacillus, Bacillus, IMocardia, Streptomyces und Garnynebacterium· Zu bevorzugten PiIz- und Hefegattungen gehören Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, Mucar, Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Glomerella, Rhizopus, Saccharomycea, Gonidiobolus, Bysaochlamys, Candida, Ghaetamium, Trichaderma, Septoria, Caprinus, IMeuraspora, Humucola und Trichoaporano Die bevorzugte Actinamyceagattung iat Micrcpolyspora. Besonders bevorzugte Arten sind Escherichia coil, Bacterium cadaveris, Proteus rettgeri, Rhadotorula gracilis, Penicillium chryaogenum und Aspergillus niger.

Die kovalente Bildung der Zellen an das reaktionsfähige Polymerisat ader die Bindung an das reaktionsfähige Monomer, gefolgt von der Polymerisation oder Copolymeriaation des Monomeren, findet im wäßrigen Medium statt· Obwohl die Temperatur zum Binden an das Polymerisat oder Monomer Dder für die Polymerisation nach dem Binden an das Monomer innerhalb eines großen Bereichs variiert werden kann, ist der bevorzugte Bereich 5 bis 5Q⁰C und insbesondere 10 bis 3D⁰C. Die zur Herstellung der Bindung erforderliche Zeitdauer hängt von dem System und der zur Herstellung der Bindung angewandten Temperatur ab, liegt aber normalerweise in dem Bereich von 0,5 bis 35 Stunden. Die bevorzugte Zeitdauer zur Herstellung der Bindung an das Polymerisat beträgt 15 bis 30 Stunden und an das Monomer 1 bis 5 Stunden, Die Polymerisation sind normalerweise in 1 bis 6 Stunden beendet. Das Geuiichtsverhältnia von dem Polymerisat zu den Zellen (bezogen auf das Trockengewicht) kann erheblich variiert werden, und das bevorzugte Verhältnis beträgt 0,1 bis 25 und vorzugsweise 0,5 bis k.

üJenn die Zellen an das reaktionsfähige Monomer gebunden sind, wird die nachfolgende wäßrige Additionspolymerisation mit einem oder mehreren Comonomeren oder ohne ein Comonomer oder mehrere Coraonc-

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in Gegenwart von difunkticinellen Vernetzungsmonomeren und einem Initiatory stem durchgeführt. Irgendwelche Comonomeren, Vernetzungsmanomeren und Initiatorsysteme, die üblicherweise bei disaein Polymerisationatyp benutet werden und die enzyraatiaohe Aktivität der Zellen nicht zerstören, können dafür in einfacher Weise angeuiendet werden.

Geeignete Comonoraeren sind z.B. Acrylsäure, oc-ChloracrylsMure, Methacrylsäure und der Glycidyl-niedrigere-alkylester, N,N-(di-8ub8t.)-Aminaalkylester, Amide, mit niedrigerem Alkyl substituierte Amide, methylolaubatituierte Amide, N-manosubstituierte Amincalkylamide und I\l,N-disubstituierte Aminoalkylamide davon, Styrol, Butadien und Isopren. Zu bevorzugten Comonomeren gehören Styrol, Acrylsäure, [J2-Hydraxy-3-(1- |j»-methylpiperazinylj )-propylj methacrylat und insbeaondere Methylmethacrylat.

Eine große Vielfalt von Vernetzungsmanomeren, die dem Endprodukt den Charakter eines dreidimensionalen Netzwerks und Idaaserunlüalichkeit verleihen, können angewendet werden, wie z.B_o Acrylmanoraeren oder Olefinverbindungen und andere bekannte Verbindungen· Typische Monomeren dafür sind 1,3-Butylendiacrylat, Äthylenglykoldimethacrylat, 1,6-Hexamethylendiacrylat, 1,3-Butylendimethacrylat, Äthylendiacrylat, Diäthylenglykoldimethacrylat, N,rJ'-Mathylenbisacrylaraid, Neopentylglykoldimethacrylat, 1,1,1-Trimethyloläthantriroethacrylat und Divinylbenzol. Ein bevorzugtes Vernetzungsmonomer ist Ν,Ν'-Methylenbiaacrylamid.

Die Polymerisations-· und Capalymeriaationsreaktion werdea durch freie Radikale initiiert. Geeignete frei-radikaliache Initiatorsysteme sind solche, die freie Radikale mit einer geeigneten Geschwindigkeit für die Polymerisation ader Copolymerisation unter den wagen der ülärmeempfindlichkeit des Zellenzymteils erforderlichen milden Bedingungen bilden. Redoxyinitiatorsysterne werden aus diesem Grund bevorzugt. Beispiele für solehe Systeme sind Preoxyverbindungen, wie z.B. Ammonium-,Natrium- oder Kaliumpersulfat, Benzoyl-

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peroxid und Di-(sek.-butyl)peraxydicarbanat in Kombination mit einem Reduktionsmittel, uie z.B. Natriumthiosulfat, IMatriummetabisulfit, Eisen-II-ammoniurnsulfathexahydrat, Dimethylaminopropionitril oder Riboflavin. Ein bevorzugtes Initiatoraystem ist Dimethylaminopropionitril-Ammaniumpersulfat.

Die Zusammensetzung des Polymerisats kann erheblich variieren, wobei die bevorzugte Zusammensetzung in Mol-%, bezogen auf die gesamten Monomeren, 15 bis 90 % zellreaktionsfähigem Monomeren, 0 bis 60 % Comonomeren und 1D bia kO % Vernetzungsmonomeren entsprichto Diese Verhältnisse werden bevorzugt, gleich ob die Zellen an das Monomer oder an das zuvor gebildete Polymerisat gebunden werden.

In bestimmten Fällen werden die Zellen mit einem polyfunktionellen Vernetzungsmittel behandelt, um einen Enzymverlust der Zellen herabzusetzen. Obwohl der genaue ablaufende Mechanismus nicht völlig geklärt ist, wird angenommen, daß eine Klasse der polyfunktionellen Reaktionsmittel mit den Aminogruppen der Zellmembranen reagiert und diese dadurch vernetzt, wodurch die Porosität der Zellmembran in wirksamer Weise verringert wird; die andere Klasee erreicht dieses Ergebnis durch Aktivierung der in der Zellmeabran vorhandenen Carboxylgruppen, die dann mit Merabranaminogruppen durch Bildung von Amidbindung reagieren. Zu typischen Beispielen für die erste Klasse gehören Reaktionsmittel wie Hethyglyaxal (Pyruvaldehyd), Glyoxal, Hydroxyadipaldehyd, Cyanursäurechlorid, tetraazotiertes o-Dianisidin, bisdiazotiertes Benzidin, 1_f3-DifluQr-if_t6-dinitrbbenzol, Toluol-Zjit-diisocyanat und insbesondere Qlutaraldehyd, während zu der zweiten Klasee Reaktionsmittel gehören, wie Äthylchlorformiat und wasserlösliche Carbodiimide, z_oB. 1-Äthyl-3-(3^ldimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid.

Die Zellen können entweder vor dem Binden, während des Bindens oder nach dem Binden an das reaktionsfähige Monomer oder Polymerisat behandelt werden. üJie beim Binden der Zellen wird die Behandlung in

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wäßrigem Medium vorgenommen. Obwohl die Zellen innerhalb eines breiten temperaturbereich^ wirksam behandelt werden können,beträgt der bevorzugte Bereich dafür 5 bis 5D⁰C und insbesondere 1D bis 3D^QC. Je nach der angewandten Temperatur und dem benutzten Mittel erfordert die Behandlung normalerweise 0,5 bis 1D Stunden, vorzugsweise 2 bis k Stunden. Die erforderliche Menge des Mittels kann erheblich schwanken, beträgt aber im allgemeinen 1 bis 5D Gew.-% der Zellen (auf Trockenbasis) und vorzugsweise 5 bis 25 Gew.-% der Zellen.

Die beschriebene Zellimmobilisierung durch chemische kovalente Bindung an wasserunlösliches Polymerisat, gegebennenfalls unter Behandlung der Zellen, um einen Enzymverlust der Zellen auf ein Kleinstmaß zurückzuführen, führt zu einem haltbaren immobilisierten Enzymsystem, ohne daß es erforderlich ist, ein gewünschtes Enzym zu isolieren. Wegen der Beständigkeit und der leicht filtrierbaren Teilchenform kann das Produkt in wirksamer Weise bei wäßrigen katalytischen chemischen Prozessen verwendet werden, bei denen entweder ansatzweise oder kontinuierlich unter Rückführung von Material gearbeitet wird.

Ausführungsformen der Erfindung werden in den nachfolgenden Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Zu 8Q g Glycidylmethacrylat plus 1,0 Liter Wasser wurden unter Rühren 30 g IM₁IM '-Methylenbisacrylamid gegeben. Nach dem Rühren des Gemischs für 15 Minuten bei Raumtemperatur wurden 10 g Methylmethacrylat zugegeben und wurde das Gemisch auf etwa 5⁰G abgekühlt und Stickstoffgas in das kalte Gemisch für 15 Minuten geblasen,. Dann wurden 20 ml Dimethylaminopropionitril und 2 g Ammoniumpersulfat zugegeben« Das Gemisch wurde unter Stickstoff bei 10 C gerührt, bis die Polymerisation begann, und wurde dann eine weitere Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt und schließlich 2 Stunden stehengelassen. Etwa 750 ml Wasser wurden der erhaltenen festen Substanz zugegeben, und das Gemisch wurde stark gerührt, um

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das Polymerisat zu zerteilBn. Die feste Substanz wurde abfiltriert, mit üiaaser gewaschen und an der Luft getrocknet, und es wurden 120 g weißes teilchenförmiges Polymerisat erhalten.

Eine Aoniger (NRRL-3;Pfizer Kultur FD 2if5^)-Fermentationsbrühe, die unter aeroben Unterwasserbedingungen bei 33⁰C und einem pH-ldert von 5,8-7,0 auf Glucosesubstrat gezüchtet worden war, wurde filtriert, und die Zellen wurden mit üJasser gewaschen und zu einer halbtrocknen Paste verpreßt. Die Zellen (25D g, 55 g trocken) wurden in eine Lösung eingetragen, die 22 g 25-Gew.-%iges wäßriges Glutaraldehyd in 10D0 ml QJasser enthielt. Der pH-tüert der Suspension wurde auf 6,2 eingestellt, und die Suspension wurde 1 3/k Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die festen Substanzen wurden abfiltriert und mit üJasser gewaschen und ergaben 1Oi* g von feuchten behandelten Zellen, die 76 % der ursprünglichen Glucoseoxidase-Aktivität besaßen.

Eine Suspension von 32 g feuchten behandelten Zellen und 16 g des Glycidylmethacrylatpolymerisats in 240 ml Wasser wurde 30 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Die festen Substanzen wurden mit Wasser gewaschen und ergaben 126 g feuchte immobilisierte Zellen, die 58 % der Glucoseoxidase-Aktivität der ursprünglichen unbehandelten Zellen aufwiesen.

Beispiel 2

Zu einer Aufschlämmung von 600 mg von wie in dem Beispiel 1 zubereiteten feuchten behandelten A.niger-Zellen (23 Einheiten Glucoseoxidase-Aktivität/100 mg) in 20 ml Acetonitril wurden gleichzeitig 600 mg Methacryloylchlorid und *tDO mg Triäthylamin gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt und dann in 20 ml Wasser eingetragen (wobei Ein pH-Lüert von 6,03 erhalten wurde). Zu dem wäßrigen Gemisch wurden unter Stickstoff 1,3 g NjN'-Methylenbisacrylamid, 750 mg Methylmethacrylat und 300 mg Acrylsäure gegeben. Der pH-üJert des Gemisches wurde auf 6,7 eingestellt, und das Gemisch wurde dann mit 0,5 ml Dimethylaminopropionitril und 250 mg Ammoniakpersul-

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fat bBhandBlt. Nach 2 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit weitsren 150 mg Ammaniumpersulfat behandelt und für eine Stunde gerührt. Ein gleiches Volumen Wasser wurde dem Reaktiansgemisch zugegeben, und das Gemisch aurde zentrifugiert. Der Rückstand wurde filtriert und mit Wasser gewaschen, und es wurden 32,25 g feuchte immobilisierte Zellen Erhalten, die 78 % der GlucDseoxidase-Aktivität der ursprünglichen unbehandelten Zellen auf-UlESEn.

Beispiel 3

Die feuchten immobilisierten Zellen des Beispiels 1 (47,3 g) wurden in 100 ml einer wäßrigen Lösung eingetragen, die 10 g Glucose enthielt, und das Gemisch wurde unter Belüften 21 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Eine 99%ige Umwandlung zu einem Gemisch von Gluconsäure und delta-Gluconolaceton wurde erzielt , und 75 % der ursprünglichen Enzymaktivität war erhalten geblieben.

Diese Oxidation konnte unter Verwendung von 30 g der feuchten immobilisiBrten Zellen des Beispiels 2 in 20 ml einer wäßrigen Lösung, die 2 g Glucose enthielt, unter Erziekung einsr vergleichbaren Umwandlung und Erhalt einer vergleichbaren EnzymaktivitMt wiedsrholt werdsn.

BeispJBl k

Eine Proteus rettgeri (ATCG 9250; Pfizer Kultur FD 18470-76-60)-Fermentationsbrühe, die unter aeroben Unterwasserbedingungen bei 28^DC und einem pH-üJert von 6,8-7,0 auf Milchkaseinsubstrat gezüchtet worden war, wurde zentrifugiert, und die Zellen wurden erneut in üJasssr aufgeschlämmt und zu einer halbtrocknen Paste verpreßt. Zu einer Aufschlämmung der feuchten Zellen (7,5 g Trockengewicht) in 100 ml üJasser wurden k g 25-Gew.-%iger wäßriger Glutaraldehyd gegeben. Das Gemisch wurde bei einem pH-Uert von 7,0 3 Stunden gerührt und dann zentrifugisrt. Die bEhandelten Zellen wurden erneut in 100 ml Wasser suspendiert, und

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7,5 g des Glycidylmethacrylatpolymerisats des Beispiels 1 wurden unter Rühren zugegebene Das Gemisch luurde bei einem pH-Wert van 7,0 bei Raumtemperatur 3D Minuten gerührt. Die festen Substanzen uurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und als feuchter Kuchen bis zur Verwendung aufbewahrt. Die immobilisierten Zellen enthielten 65 % der Aktivität der ursprünglichen unbehandelten Zellen, gemessen durch die Umwandlungageschwindigkeit von Penicillin G in 6-AminDpenicillinsäure.

Beispiel 5

Zu einer Aufschlämmung van 2D g (5,0 g trocken) der immobilisierten Proteus rettgeri-Zellen des Beispiels k in 5OD ml Wasser bei einem pH-Wert von B₁D und 37^DC wurden 5 g Kalium-Penicillin G gegeben. Der pH-Wert der Aufschlämmung wurde bei B₁D durch eingestellte Zugabe von 1-normaler IMaDH gehalten. Die Hydrolyse war nach 3 Stunden beendet. Die immobilisierten Zellen wurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und als feuchter Kuchen für eine weitere V/erwendung aufbewahrt. Das Filtrat wurde mit 2-normaler HGl auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und mit Äthylacetat extrahiert. Der pH-Wert der erhaltenen wäßrigen Schicht wurde mit 2-normaler NaDH auf k_t3 eingestellt, und die wäßrige Schicht wurde konzentriert und abgekühlt und ergab eine weiße kristalline/feste Substanz. Die Kristalle wurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und luftgetracknet und ergaben 2,17 g (75%ige Ausbellte) reine 6-Aminopenicillansäure. Die immobilisierten Zellen behielten noch etwa 5D % der Penicillinacylaae-Aktivität der ursprünglichen immobilisierten Zellen des Beispiels h nach 20 Hydrolysezyklen·

Beispiel 6

Zu einem Gemisch von 3,6 g Bromacetylhydraxyäthylmethaorylat in 15 ml Wasser wurden unter Rühren des Getnischs unter Stickstoff 375 mg I\l_fi\l!-Methylenbisacrylamid gegeben. Das Gemisch wurde auf 5^DC abgekühlt und mit D,25 ml Dimethyläminopropionitrol und 3B mg Ammoniumpersulfat behandelt. Das Gemisch wurde

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langsam hei Raumtemperatur gerührt, bis die Polymerisation begann. Der Rührer wurde dann abgestellt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden stehengelassen. Die erhaltene Aufschlämmung wurde mit 25 ml Wasser verdünnt und filtriert. Der Kuchen wurde mit lüasser gewaschen und luftgetrocknet und ergab 3,7 g teilchenförmiges Material.

Feuchte ausgedrückte Proteus rettgeri-Zellen, die wie in dam Beispiel k gezüchtet und isoliert worden waren (10 g, 2 g trocken), wurden in eine Lösung eingetragen, die 0,8 g 25-Gew·- %igen wäßrigen Glutaraldehyd in 5D ml Wasser enthielt. Der pH-üJert der Suspension wurde auf 7,0 eingestellt, und die Suspension wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann zentrifugiert. Die behandelten Zellen wurden erneut in 50 ml Uasser aufgeschlämmt und zu einer halbtrocknen Paste verpreßt.

Eine Suspension von 10 g der behandelten Zellen und 20 g des Bromacetylhydraxyäthylmethacrylatpolymerisats in 120 ml Wasser wurde 30 Stunden bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 7,0 gerührt. Das Gemisch wurde filtriert, und der Kuchen wurde mit Wasser gewaschen und ergab 36,8 g feuchte immobilisierte Zellen mit 75 % der Penicillinacylase-Aktivität der ursprünglichen unbehandelten Zellen.

Beispiel 7

Zu einer Aufschlämmung von UG g der feuchten immobilisierten Zellen des Beispiel 6 in 5OD ml Wasser bei einem pH-Wert von 8,0 und 37^DC wurden 5 g Kalium-Penicillin G gegeben. Der pH-Wert der Aufschlämmung wurde bei 8,0 durch eingestellte Zugabe von 1-normaler NaOH gehalten, und die Hydrolyse wurde nach 3 Stunden beendet. Die immobilisierten Zellen wurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und dann als feuchter Kuchen bis zum weiteren Gebrauch aufbewahrt. Der pH-Wert des Filtrats wurde mit 2-normaler HCl auf 2 eingestellt, und das Filtrat wurde mit Äthylacetat extrahiert. Der pH-Wert der erhaltenen wäßrigen Schicht wurde auf k,3 mit 2-normaler IMaOH eingestellt und die wäßrige

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Schicht wurde konzentriert und abgekühlt und ergab kristalline 6-Aminopenicillansäure·

Beispiel B

Eine Suspension von 25 g feuchten behandelten A.niger-Zellen wie in dem Beispiel 1 sowie 2 g Glycidylmethacrylat in 60 ml Wasser wurde 17 Stunden bei 7°C gerührt. Die Suspension wurde dann zu einem Gemisch von 2,2 g PJ₁IM¹-Methylenbisacrylamid, 2 ml Styrol, 450 mg Methylmethacrylat, 0,5 ml Dimethylaminopropionitril und 1,5 g 2-Hydroxy-3-(1- [V-methylpiperazinyl] )-propyl methacrylat in 40 ml Wasser bei einem pH-Uert von 6,8 gegeben. Das Gemisch wurde unter Stickstoff mit 200 mg Ammnniumpersulfat behandelt und für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt· Die festen Bestandteile des Reaktionsguts wurden abfiltriert und mit Wasser gewaschen, und es wurden 43,6 g feuchte immobilisierte Zellen mit 75 % der Glucoseoxidase-Aktivität der ursprünglichen unbehandelten Zellen erhalten.

Beispiel 9

Die feuchten immobilisierten Zellen des Beispiels B (2B,3 g) wurden in 200 ml einer wäßrigen Lösung eingetragen, die 20 g Glucose enthielt, und das Gemisch wurde unter Belüften 21 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde eine BO %ige Ausbeute von einem Gemisch von Glucansäure und delta-Glucanolaceton erhalten. Die nach dar Umsetzung erhaltene Aufschlämmung wurde filtriert, und die festen Substanzen wurden mit Wasser gewaschen und ergaben 28 g feuchte immobilisierte Zellen mit B2 % der ursprünglichen Enzymaktivität.

Beispiel 10

Eine Suspension von 5 g feuchter ausgedrückter Proteus rettgeri-Zellen, gezüchtet und isoliert wie in dem Beispiel 4, und 10 g Glycidylmethacrylatpolymerisat des Beispiels 1 in 65 ml Wasser wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde filtriert, und der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen und

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ergab 26,9 g feuchtB immabilisiertB Zellen mit 62 % der anfänglichen Peniclllinacylase-Aktivität.

Die immobilisierten Zellen (25 g, 1 g Trockenzellgewicht) wurden in eine Lösung eingetragen, die 0,^ g 25-Gem.-?6igen wäßrigen Glutaraldehyd in 50 ml Wasser enthielt· Der pH-Uert der Suspension wurde auf 7,D eingestellt, und die Suspension wurde
3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Aufschlämmung wurde
filtriert, und der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen und ergab 23,2 g feuchte behandilte immobilisierte Zellen mit 79 % der Penicillinacylase-Aktivität der anbehandelten immobilisierten Zellen.

Beispiel 11

Zu einer Aufschlämmung von 12 g der feuchteö behandelten immobilisierten Zellenzubereitung des Beispiels 10 in 100 ml Uasser bei einem pH—Wert von 8,0 und 37^QG wurde 1 g Kalium-Penicillin G gegeben· Der pH-üJert des Reaktionsgemische wurde bei 8,0 durch eingestellte Zugabe von 1-normaler NaQH gehalten, und die Umsetzung wurde nach 3 Stunden beendet. Das immobilisierte ZaIlnraterial wurde filtriert, mit Uasser gewaschen und als feuchter Kuchen bie zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Der pH-QJert des Filtrats wurde auf 2 mit 2-normaler HCl eingestellt, und das
Filtrat wurde dann mit Äthylacetat extrahiert. Der pH-üJert der erhaltenen wäßrigen Schicht wurde mit 2-normaler NaQH auf k,3
eingestellt, und die Schicht wurde konzentriert und abgekühlt
und ergab kristalline 6-Aminopenicillansäure·

Beispiel 12

Eine Suspension von A.nigervZellen (20 g, k g trockne Zellen), die wie in dem Beispiel 1 gezüchtet und isoliert worden waren, und 8üg Glycjcdylmethacrylai in 100 ml üJasser wurde auf einen
pH-lüert von 7,5 eingestellt und 18 Stunden bei Raumtemperatur
geschüttelt· N₁IM- Methylenbisacrylamit (1,5 g ) wurde zugegeben, und die erhaltene Aufschlämmung wurde 15 Minuten unter Stick -

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stoff gerührt, dann auf 5 C abgekühlt, mit 150 mg Ammoniumpersulfat plus 1ml Dimethylaminopropianitril behandelt und bei Umgebunstemperatur 3 Stunden gerührt. Die festen Bestandteile des Reaktionsgemische wurden abfiltriert und mit Uasser gewaschen und ergaben 71 g feuchte immobilisierte Zellen mit 62 % der ursprünglichen Glucoseoxidase-Aktivität.

Die immobilisierten ZellennC 18 g, 1g Trockenzellgewicht) wurden in eine Lösung eingetragen, die 0,4 g 25-Gew.-%igen wäßrigen Glutaraldehyd in 1DD ml Uasser enthielt. Der pH-Wert der Suspension uurde auf 7,0 eingestellt, und die Suspension ujurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die festen Substanzen UUrdan, abfiltriert und mit Uasser gewaschen und ergaben 17,3 g feuchte behandelte immobilisierte Zellen mit 75 % der Glucoseaxidase-Aktivität, die in den immobilisierten Zellen vor der Behandlung mit Glutaraldehyd vorhanden gewesen war.

Beispiel 13

Die feuchten behandelten immobilisierten Zellen (14 g) des Beispiels 12 wurden in 15 ml einer wäßrigen Lösung eingetragen, die 1,5 g Glucose enthält, und das Gemisch wurde unter Belüften 21 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei eine Umwandlung in Gluconsäure stattfand und eine Enzymaktivität erhalten wurde, die den betreffenden Uerten des Beispiels 3 entsprechen.

Beispiel 14

Rhodotorula gracilis-Zellen (NRRL Y1D91; Pfizer Kultur FD 6521) wurden aus einer Permentationsbrühe, in der die Hultur unter aeroben Unterwasserbedingungen bei 2S°C und einem pH-Uert von 6,8-7,D auf Glucosesubstrat gezüchtet worden war, durch Zentrifugieren isoliert. 50 g gewaschene Zellen in 250 ml Uasser wurden mit 5 g Glycidylmethacrylatpolymerisat des Beispiels behandelt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 20 Stunden gerührt. Die Suspension wurde filtriert, und der Filterkuchen wurde mit Uasser gewaschen und ergab 63 g feuchte immobilisierte Zellen, die 49 % der ursprünglichen Phenylalaninammoniaklyase-Aktivität auf-

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wiesen.

Beispiel 15

Eine Suspension van 14,74 g feuchter immobilisierter Zellen des Beispiels 14 in 3D ml Wasser, das 2,25 g trans-Zimtsäure, 652 g Ammoniumchlorid und 3,3 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid enthielt, wurde auf einen pH-Lüert von 9,5 eingestellt. Das Bemisch wurde bei 37^DC 18 Stunden geschüttelt und ergab eine etwa 90%ige Ausbeute von L-Phenylalanin, bezogen auf die wiedergewonnene Zimtsäure. Die festen Substanzen des Reaktionsgemische wurden abfiltriert und mit Wasser gewaschen und ergaben 14 g feuchte immobilisierte Zellen mit 77 % ihrer ursprünglichen Phenylalaninammoniaklyase-Aktivität. Das L-Phenylalanin wurde aus dem Filtrat nach Standardmethoden isoliert.

Beispiel 16

Eine Suspension von 40 g gewaschener Rhadotorula gracilis-Zellen, die wie in dem Beispiel 14 gezüchtet und isoliert worden waren, plus 8 g Glycidylmethacrylat in 80 ml Wasser wurde auf einen pH-üJert von 7,2 eingestellt und bei Raumtemperatur 1,5 Stunden gerührt. Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid (1,5 g) wurde zugegeben, und die erhaltene Aufschlämmung wurde unter Stickstoff 10 Minuten gerührt, dann auf 5^DC abgekühlt, mit 150 mg Ammoniumpersulfat plus 1 mg Dimethylaminopropionitril behandelt und bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Die nach der Umsetzung erhaltene Aufschlämmung wurde mit Wasser verdünnt und filtriert. Der Polymerisatkuchen wurde mit Wasser gewaschen und ergab 62,3 g feuchte immobilisierte Zellen mit 44 % der ursprünglichen Phenylalaninammoniaklyase-Aktivität-,

Beispiel 17

Eine Suspension von 15 g feuchter immobilisierter Zellen des Beispiels 16 in 30 ml Wasser, das 1,12 g trans-Zimtsäure, 320 mg Ammoniumchlorid und 1,6 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid enthielt, wurde auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt. D_as Gemisch wurde bei 37^DC 18 Stunden geschüttelt, wobei eine L-Phenyl-

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alaninbildung erzielt wurde, die der des Beispiels 15 entsprach·

Beispiel 18

Eine Suspension von 15 g feuchten ausgedrückten Proteus rettgeri-Zellen, die ujie in dem Beispiel k gezüchtet und isoliert worden waren, und 3D g Glycidylmethacrylatpolymerisat des Beispiels 1 in 1GD ml lilasser wurde bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 7 18 Stunden gerührt. Die Suspension wurde dann zentrifugiert, und die festen Substanzen wurden mit LJasser gewaschen, und es wurden 1DD g feuchte immobilisierte Zellen mit 1DD % der ursprünglichen Penicillinaoylase-Aktivität erhalten.

Zu einer Aufschlämmung von 25 g der feuchten immobilisierten Zellen in 7D ml Wasser bei einem pH-Wert von 8,0 und 37°C wurde 1 g Kalium-Penicillin B gegeben. Die Hydrolyse, die bei einem pH-Wert von 8,D durch eingestellte Zugabe von 1-normaler NaDH durchgeführt wurde, war nach 3 Stunden beendet. Die Aufschlämmung wurde dann filtriert, und die immobilisierten Zellen wurden mit Wasser gewaschen und als feuchter Kuchen für eine weitere Uerwndung aufbewahrt. Die Wirksamkeit dieser Zellen für die Bildung von 6-Aminopenicillansäure war jedoch nicht so groß wie die Wirksamkeit der immobilisierten Zellen des Beispiels k_t weil die Zellen nur 15 % der Penicillinacylase-Aktivität der ursprünglichen Zellen nach nur 2 Hydrolyse-Zyklen zurückbehielten.

Beispiel 19

Zu 25 g 2-Hydroxyäthylmethacrylat in 1DD ml Wasser wurden 12,5 g Cyanbromid, gelöst in 1DD ml Wasser, gegeben. Der pH-Wert des Bemischs wurde sofort mit 5-normaler IMaDH auf 11 eingestellt, wodurch die Reaktionstemperatur auf 46⁰G erhöhte, und dann bei diesem pH-Wert gehalten, bis keine weitere Base erforderlich war. Das Bemisch wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt, der pH-Wert des Bemischs wurde auf 6,5 eingestellt, und das Bemisch wurde dann mit einer Aufschlämmung von 5D g gefriergetrockneten Proteus rettgeri-Zellen, die vor dem Trocknen wie in dem Beispiel 4 gezüchtet und isoliert worden waren, in 5DD ml Wasser

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behandelt· Die erhaltene Suspension uiurde b5 Minuten gerührt. Dann wurden 25 g Acrylamid und 2,5 g N₁IM¹-Methylenbisacrylamid zugegeben, und die Suspension wurde 15 Minuten gerührt, auf ^⁰G abgekühlt und mit k ml Dimethylaminapropionirtil plus i*25 mg AmmaniumperBulfat behandelt. Das Polymerisationsgemisch konnte sich dann auf Raumtemperatur abkühlen und wurde 1 Stunde stehen gelassen. Das Gemisch wurde dann unter Benutzung eines Waring Mischers durchgemischt und zentrifugiert. Die gelartigen abzentri fugierten festen Substanzen wurden in Wasser erneut suspen diert, erneut zentrifugiert, mit Wasser gewaschen und gefrier getrocknet und ergaben 112 g trockene immobilisierte Zellen mit 19 % der ursprünglichen Penicillinacylase « Aktivität,

Beispiel 2D

Zu einer Suspension von 20 g feuchten ausgedrückten Proteus rettgeri-Zellen, die wie in dem Beispiel h gezüchtet und iso liert worden waren, in 80 ml Wasser wurden 1 g 25~gew,-%iger wäßriger Glutaraldehyd und 10 g Glycidylmethacrylat gegeben. Der pH-Wert der Suspension wurde auf 6,8 eingestellt, und die Suspension wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Ge misch wurde dann unter Stickstoff mit 1,9 g IM₁IM¹ - Methylenbis acrylamid und 2 ml Dimethylaminopropionitril behandelt, auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und mit 200 mg Ammoniumperaul fat behandelt. Die erhaltene Suspension wurde 1/2 Stunde gerührt und dann 1 1/2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die festen Bestandteile wurden abfiltriert und mit Wasser gewaschen und ergaben 81,3 g feuchte immobilisierte Zellen mit 5k % der ursprünglichen Penicillinaoylase-Aktivität der unbehandelten Zellen,

Die feuchten immobilisierten Zellen waren zur Umwandlung von Kalium-Penicillin G in 6-Aminopenicillansäure, wie in dem Beispiel 7 beschrieben ist, mit vergleichbaren Ergebnissen

geeignet.

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Seispiel 21

Eine Bacterium cadaveris (ATCC 9760; Pfizer Kultur FD 24016)-Fermentationsbrühe, die durch Züchten unter aeroben Unterwasserbedingungen bei 2B⁰C und einem pH-Ldert von 6-8 Proteinhydrolysatsubstrat erhalten worden war, wurde zentrifugiert, und die Zellen wurden erneut in Wasser aufgeachlämmt und zu einer halbtrocknen Paste verpreßt. Zu der Aufschlämmung der feuchten Zellen (7,5 g Trockengewicht) in 100 ml Wasser wurden k g 25-Geu.-%iger wäßriger Glutaraldehyd gegeben. Das Gemisch wurde etwa 2 Stunden bei einem pH-Wert von 7 gerührt und dann zentrifugiert. Die behandelten Zellen wurden erneut in 100 ml Wasser suspendiert, und 7,5 g Glycidylmethacrylatpolymerisat des Beispiels 1 wurden unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wurde bei einem pH-Wert von etwa 7,0 und Raumtemperatur 30 Stunden gerührt. Die festen Bestandteile wurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und als feuchter Kuchen bis zur Verwendung aufbewahrte

Beispiel 22

Fumarsäure (120 g) wurde zu 140 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid gegeben. Der pH-Wert des Gemischs wurde mit Ammoniumhydroxid auf 8,5 eingestellt, und das Volumen des Reaktionsgemische wurde mit Wasser bis zu 600 ml aufgefüllt. Immobilisierte Zellen des Beispiels 21, enthaltend 7000,u Asparaginatammoniaklyase-Aktivität, wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37 C k Stunden gerührt. Die nach der Umsetzung erhaltene Aufschlämmung wurde filtriert, und der pH-Wert des Filtrats wurde mit Schwefelsäure auf 2,8 eingestellt, um Asparaginsäure auszufällen.

Patentansprüche

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Claims

Patentansprüche

1. Immobilisierte mikrobiologische Zellen enthaltendes Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen an eine Matrix aus wasserlöslichem teilchenförmigen! Polymerisat kovalent gebunden sind.

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die kovalente Bindung zwischen Zellaminogruppen und mit Aminogruppen reagierenden PDlymerisatsubstituenten besteht.

3. Präparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Substituenten aus einer der Epoxidgruppen, Halogencarbonylgruppen und Halogenmethylcarbonylgruppen bestehen.

k. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen eines der Enzyme Glucoseoxidase, Penicillinacylase, Phenylanalinammoniaklyase, Asparaginatammoniaklyase enthalten.

5. Uerfahren zur Immobilisierung mikrobiologischer Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß mikrobiologische Zellen mit Bindungsgruppen für ein Polymerisat unter Bildung kovalenter Bindungen mit einer Matrix aus wasserunlöslichem teilchenförmigen! Polymerisat umgesetzt werden.

B. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminogruppen in der Zelle mit Substituenten, die mit Aminogruppen reagieren, unter Bildung kDualenter Bindungen umgesetzt werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit einem gebildeten Polymerisat in Berührung gebracht werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit einem äthylenisch ungesättigten Monomeren umgesetzt

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werden, das dann polymerisiert wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit einem polyfunktianellen Vernetzungsmittel umgesetzt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung mit dem Vernetzungsmittel vor der die kovalente Bindung bildenden Umsetzung durchgeführt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 und 1G, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel Glutaraldehyd ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in einem wässrigen Medium mit Glycidylmethacrylatmonomer unter Bildung kcvalenter Bindungen umgesetzt werden und das Monomer dann in Gegenwart von NjlM'-Methylen-bisacrylamidmanomer und Dimethylaminopropionitril-Ammoniumpersulfat polymerisiert uird.

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