DE2440011C2 - Method and reagent for determining the enzyme-kinetic concentration of a substrate - Google Patents
Method and reagent for determining the enzyme-kinetic concentration of a substrateInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymkinetischen Bestimmung der Konzentration eines Substrates, insbesondere eines in Blutserum oder Blutplasma gelösten oder suspendierten Substrates, bei welchem wenigstens ein oder mehrere spezifischeis) Enzym(e) zugesetzt und die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion gemessen wird. Die Erfindung betrifft ferner Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens. Die Bedeutung der Erfindung liegt insbesondere auf den Gebieten der klinischen Chemie, Biochemie, Lebensmittelchemie und Pharmazie.The invention relates to a method for the enzyme kinetic determination of the concentration of a Substrate, in particular a substrate dissolved or suspended in blood serum or blood plasma, at which at least one or more specific enzyme (s) are added and the rate the enzymatic reaction is measured. The invention also relates to reagents for implementation of the procedure. The importance of the invention lies in particular in the fields of clinical chemistry, Biochemistry, food chemistry and pharmacy.
Enzymatisch katalysierte Umsetzungen sind besonders bei der Analyse biologischer Flüssigkeiten, die eine komplizierte Zusammensetzung aufweisen, wegen ihrer Substrat-Spezifität bei der Reaktion und wegen ihrer hohen Empfindlichkeit bevorzugt. Viel-Enzymatically catalyzed conversions are particularly important in the analysis of biological fluids, which have a complicated composition because of their substrate specificity in the reaction and preferred because of their high sensitivity. A lot-
ach ist eine genaue Substratbestimmung nur auf ;nzymatischem Wege möglich.A precise determination of the substrate is only possible by enzymatic means.
In der Routine werden Substratkonzentrationsbestimmungen bei enzymatisch katalysierter Umsetzung bisher üblicherweise als Endwertbestircmung durchgeführt. Bei der Endwertbestimmung wird ein Parameter vor und nach der Umsetzung gemessen und daraus die Differenz gebildetSubstrate concentration determinations are carried out in the routine in the case of enzymatically catalyzed conversion, up to now usually carried out as a final value determination. When determining the final value, a parameter is measured before and after implementation from this the difference is formed
Eine Ausnalsne bildet die Harnsäurebestimmung nach der Kageyama-Methode, bei der zwei Enzyme zugegeben werden. Kinetisch gemessen wird jedoch der langsam ablaufende nichtenzymatische Teilschritt, so daß es sich um ein grundsätzlich anderes Verfahren handelt. Diese bekannte Methode benötigt einen erheblichen Zeitaufwand, da Messungen nach 6 und 12 Minuten erfolgen müssen. Daher ist dieses Verfahren aufwendig, zumal eine erhöhte Temperatur von 37°C aufrechterhalten werden muß. Es wäre von Vorteil, auch diese Bestimmung bei der für die kinetische Bestimmung von Enzymaktivitäten meist benutzten Meßtemperatur von 25"C und damit mit den bereits vorhandenen Geräten durchführen zu können.The uric acid determination is an exception according to the Kageyama method, in which two enzymes are added. However, it is measured kinetically the slowly running non-enzymatic sub-step, so that it is a fundamentally different process acts. This known method requires a considerable amount of time, since measurements according to 6 and 12 minutes must be done. Hence this procedure expensive, especially since an increased temperature of 37 ° C must be maintained. It would be advantageous to also use this determination for the kinetic Determination of enzyme activities mostly used measuring temperature of 25 "C and thus with the to be able to carry out already existing devices.
Eine weitere Ausnahme stell» die Glucosebestimmung mit Glucose-Oxidase dar, welche enzymkinetisch mit routineüblichen Photometern durchführbar ist, weil der Wert der Michaelis-Konstanten für die Umsetzung außergewöhnlich günstig liegt.Another exception is the determination of glucose with glucose oxidase, which can be carried out enzyme-kinetically with routine photometers is because the value of the Michaelis constant for that Implementation is exceptionally convenient.
Gegenüber der Endwertbestimmung hat eine kinetische Bestimmung von Substratkonzentrationen, bei der die zeitliche Änderung eines Parameters im Verlaufe einer Reaktion gemessen wird, wesentliche Vorteile: Compared to the determination of the final value, a kinetic determination of substrate concentrations has at which measures the change in a parameter over time in the course of a reaction, significant advantages:
1. Der Zeitbedarf ist jeweils verglichen mit dem entsprechenden Endwertverfahren geringer.1. The time required is lower in each case compared to the corresponding final value method.
2. Ein Probenleerwert ist meist entbehrlich; damit wird die Zahl der Arbeitsschritte beim Ansetzen der Testlösungen, der Verbrauch an Probenmaterial und Reagenzien sowie gegebenenfalls der Geräte- und der on-line-Aufwand bei der Computerauswertung reduziert.2. A sample blank is usually unnecessary; in order to the number of work steps when preparing the test solutions, the consumption of sample material and reagents and, if applicable, the equipment and on-line costs involved in the Computer evaluation reduced.
3. Die Substratbestimmung kann mit den üblichen Geraten füi die Enzymaktivitätsbestimmung erfolgen. Damit ist auch die simultane Durchführung bisher aus gerätetechnischen Gründen schwer kombinierbarer Bestimmungen möglich. 4<i 3. The substrate can be determined using the usual equipment for determining enzyme activity. In this way, it is also possible to carry out determinations that were previously difficult to combine for technical reasons. 4 <i
4. Die Verwendung von Einwegküvetten, durch deren Einsatz Verschleppungsfehler bei der photometrischen Messung und Spülvorgänge entfallen, ist uneingeschränkt möglich, weil durch unterschiedliche Eigenextinktionen der Küvetten keine s° Fehler auftreten könnten.4. The use of disposable cuvettes, the use of which eliminates carry-over errors in the photometric measurement and rinsing processes, is possible without restrictions because no s ° errors could occur due to different self-absorbances of the cuvettes.
Trotz all dieser offensichtlichen Vorteile sind bisher enzymkinetische Substratbestimmungen in der Routine nicht üblich und nur in Ausnahmefällen sinnvoll durchführbar. Die bekannten enzymkinetischen Techniken (»initial rate«, »time-fixed«) spielen nur in der Forschung eine Rolle; ihnen ist gemeinsam, daß nur sehr kleine Substratkonzentrationen eingesetzt und damit nur sehr kleine Substratumsätze gemessen werden können.Despite all of these obvious advantages, enzyme-kinetic substrate determinations have so far been routine not common and only useful in exceptional cases. The known enzyme kinetic techniques ("Initial rate", "time-fixed") only play a role in research; what they have in common is that only very small substrate concentrations are used and therefore only very small substrate conversions are measured can be.
Die Beschränkung auf sehr kleine Substratkonzentrationen in der Testlösung ist deshalb notwendig, weil sich nur so eine direkte Proportionalität zwischen der Konzentration des nachzuweisenden Substrats und der Reaktionsgeschwindigkeit, d. h. eine lineare Eichkurve ergibt, die für einfache Routinebestimmun-σρη oefnrdert werden muß.The restriction to very small substrate concentrations in the test solution is therefore necessary, because there is only such a direct proportionality between the concentration of the substrate to be detected and the rate of reaction, d. H. results in a linear calibration curve which is suitable for simple routine determination must be changed.
Für die Geschwindigkeit enzymatisch katalysierter Reaktionen gilt nämlich die Michaelis-Menten-Gleichung The Michaelis-Menten equation applies to the speed of enzymatically catalyzed reactions
ν =ν =
CS + K-MC S + KM
(υ = Reaktionsgeschwindigkeit; vmax - Maximalgeschwindigkeit im Bereich der Substratsättigung; cs = Substratkonzentration; KM = Michaelis-Konstante). (υ = reaction speed; v max - maximum speed in the area of substrate saturation; c s = substrate concentration; K M = Michaelis constant).
Auf Grund dieser Gleichung kann sich eine Proportionalität zwischen Reaktionsgeschwindigkeit ν und Substratkonzentration cs nur ergeben, wenn cs sehr klein gegenüber KM ist. Das Glied cs im Nenner darf dann vernachlässigt werden, so daß sich kinetisch eine Reaktion pseudo-erster Ordnung ergibt. Wie theoretische Betrachtungen zeigen, darf cs maximal 0,2 KM sein, um für kinetische Bestimmungen den analytischen Fehler noch tolerierbar zu halten.On the basis of this equation, a proportionality between the reaction rate ν and the substrate concentration c s can only result if c s is very small compared to K M. The term c s in the denominator can then be neglected, so that kinetically a pseudo-first order reaction results. As theoretical considerations show, c s may be a maximum of 0.2 K M in order to keep the analytical error still tolerable for kinetic determinations.
KM ist nun für die meisten Reaktionen selbst sehr klein und liegt in der Größenordnung 10~3 bis 10~7 Mol/l. Daraus ergibt sich, daß die Messung nach den bisherigen Verfahren auf den Einsatz außerordentlich kleiner Substratkonzentrationen beschränkt ist. For most reactions, K M is itself very small and is of the order of 10 -3 to 10 7 mol / l. It follows that the measurement according to the previous methods is limited to the use of extremely low substrate concentrations.
Man hat versucht, dieser Schwierigkeit dadurch zu begegnen, daß man Enzyme mit einem möglichst hohen Wert PJr KM einsetzt. Die zur Verfugung stehende Auswahl ist jedoch gering, und die KM-Werte sind auch im günstigsten Fall für praxisgerechte Substratbestimmungen in der Regel zu niedrig (eine Ausnahme bildet wie oben erwähnt die Glucosebestimmung mit GOD).Attempts have been made to counter this difficulty by using enzymes with a PJr K M value as high as possible. The selection available is small, however, and the K M values are generally too low, even in the best case for practical substrate determinations (an exception, as mentioned above, is the glucose determination with GOD).
Aus dem Gesagten ergeben sich für die bekannten enzymkinetischen Verfahren folgende Nachteile:From what has been said, the following disadvantages result for the known enzyme kinetic processes:
1. Es sind außerordentlich präzise, hochaufiösende und teure Meßgeräte notwendig, da der Meßausschlag bei sehr kleinen Substratumsätzen im Schwankungsbereich der herkömmlichen Geräte, z. B. Photometer, liegt.1. There are extremely precise, high-resolution and expensive measuring devices necessary because the measurement deflection with very small substrate sales in the fluctuation range of conventional devices, z. B. photometer is located.
2. Es kann nur der niedrige Teil des Konzentrationsspektrums der Proben ohne Vorverdünnung erfaßt werden; eine Vorverdünnung bedingt weitere Fehler und zwingt zur Wiederholung der Analyse.2. Only the low part of the concentration spectrum of the samples can be used without pre-dilution be detected; a pre-dilution causes further errors and forces to repeat the Analysis.
3. Schmutzpartikeln und Luftblasen können das Meßergebnis sehr stark verfälschen; in der Routine kann die erforderliche extrem saubere Arbeitsweise nicht immer gewährleistet werden.3. Dirt particles and air bubbles can greatly falsify the measurement result; in the routine the required extremely clean working method cannot always be guaranteed.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine einfache, auch für die Routine geeignete enzymkinetische Bestimmung von Substratkonzentrationen zu ermöglichen und die bisherigen Verfahren dahingehend zu verbessern, daß sie allgemein anwendbar werden und Messungen in praxisgerechten Zeiten zulassen, sowie einen größeren Konzentrationsbereich ohne zusätzliche Vorverdünnung zu erfassen gestatten.The invention is based on the object of providing a simple enzyme kinetic which is also suitable for routine use To enable determination of substrate concentrations and the previous methods to that effect to improve them so that they are generally applicable and measurements in practice-oriented times and allow a larger concentration range to be recorded without additional pre-dilution.
Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man durch Zugabe mindestens eines auf den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der enzymatischen Substratumsetzung abgestimmten kompetitiven Inhibitors das Verhältnis von Substratkonzentrationcs zur scheinbaren Michaelis-Konstanten K'M auf < 0,2: 1 bringt und dadurch die Bedingungen einer Reaktion pseudo-erster Ordnung einstellt, die Mischung homogenisiert, in vorbestimmten Zeitabstän-In a method of the type mentioned at the outset, this object is achieved according to the invention in that, by adding at least one competitive inhibitor tailored to the rate-determining step of the enzymatic substrate conversion, the ratio of the substrate concentration c s to the apparent Michaelis constant K ' M is <0.2: 1 brings and thereby sets the conditions of a reaction pseudo-first order, the mixture is homogenized, at predetermined time intervals
den die Änderung eines für die Umsetzung spezifischen Reaktionsparameters bestimmt und daraus die Substratkonzentration ermittelt.which determines the change in a specific reaction parameter for the conversion and from this the substrate concentration determined.
Vorzugsweise wird das Verhältnis von c5 zu K'M auf einen Wert unter 0,05:1, insbesondere unter 0,01 :1 gebracht.The ratio of c 5 to K ' M is preferably brought to a value below 0.05: 1, in particular below 0.01: 1.
Unter »kompetitiven Inhibitoren« werden im Rahmen der Erfindung zwei Gruppen von Stoffen verstanden :In the context of the invention, “competitive inhibitors” are understood to mean two groups of substances :
a) Stoffe, die (nach dem Massenwirkungsgesetz) mit dem Substrat um das Enzym reversibel konkurrieren, dabei aber nicht oder nur vernachlässigbar langsam umgesetzt werden (kompetitive Inhibitoren im herkömmlichen Sinn).a) substances that (according to the law of mass action) reversibly compete with the substrate for the enzyme, but not or only negligibly slowly implemented (competitive inhibitors in the conventional sense).
b) Stoffe, die das Substrat reversibel binden und dadurch seine freie Konzentration (nach dem Massen wirkungsgesetzt) vermindern, wobei der Substrat Inhibitor-Komplex unter Einwirkung des Enzyms nicht umgesetzt wird.b) Substances that bind the substrate reversibly and thereby its free concentration (after the mass action set), the substrate inhibitor complex under the action of the Enzyme is not converted.
Bevorzugt werden als geeignete kompetitive Inhibitoren Stoffe gewählt, die einem der Ausgangsstoffe und/oder einem der Endprodukte der geschwindigkeitsbestimmenden Reaktion strukturverwandt sind, jedoch nicht von dem in dieser Reaktion verwendeten Enzym umgesetzt werden.As suitable competitive inhibitors, substances are preferably chosen which are one of the starting substances and / or one of the end products of the rate-determining reaction are structurally related, however, cannot be converted by the enzyme used in this reaction.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die Messung durch einen größeren Substratumsatz präziser. Es kann mit einfachen Mitteln gearbeitet werden. Ein Meßzeitraum kann vorteilhaft im Bereich von 0,5 bis 3 Minuten liegen. Die Proportionalität zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und Substratkonzentration wird soweit angenähert, daß eine für analytische Zwecke ausreichende Genauigkeit erreicht wird.In the method according to the invention, the measurement becomes more precise through a greater substrate turnover. It can be worked with simple means. A measurement period can advantageously be in the range of 0.5 up to 3 minutes. The proportionality between reaction rate and substrate concentration is approximated to such an extent that an accuracy sufficient for analytical purposes is achieved.
Die Vielseitigkeit und Anpassungsfähigkeit des Verfahrens wird gegenüber bekannten Verfahren dadurch erheblich verbessert, daß über das Verhältnis der Konzentrationen von Substrat zu Enzym zu kompetitivem Inhibitor eine für analytische Zwecke ausreichende Empfindlichkeit für die Messung, auch bei geringerer Substratkonzentration, eingestellt und die Messung in einem praktisch günstigen Zeitraum durchgeführt werden kann.The versatility and adaptability of the method compared to known methods is thereby Significantly improves that on the ratio of the concentrations of substrate to enzyme to competitive Inhibitor a sufficient sensitivity for the measurement for analytical purposes, even with lower substrate concentration, set and the measurement in a practically favorable period of time can be carried out.
In diesem Zusammenhang sieht eine zweckmäßige Ausführungsform vor, daß einerseits die Proportionalität zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und höheren Substratkonzentrationen durch Zugabe des Inhibitors verbessert und andererseits die Verminderung der Reaktionsgeschwindigkeit durch Erhöhung der Enzymkonzentration kompensiert wird. Eine Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit könnte auch durch Erhöhung der Reaktionstemperatur erreicht werden.In this context, an expedient embodiment provides that on the one hand the proportionality between reaction rate and higher substrate concentrations by adding the Inhibitor improves and, on the other hand, the reduction of the reaction rate by increasing it the enzyme concentration is compensated. An increase in the reaction speed could also can be achieved by increasing the reaction temperature.
Trotz Einsatz eines kompetitiven Inhibitors wirkt sich die Erhöhung der Enzymkonzentration günstig aus, wenn die Empfindlichkeit angehoben werden und in gleicher Meßzeit ein größerer Umsatz erfaßt werden soll, der seinerseits zu einer Verbesserung der Proportionalität zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und Substratkonzentration in der Probe führt. Vor allem braucht die Erhöhung der Enzymkonzentration nicht mit einer unverhältnismäßig kurzen Meßzeit erkauft zu werden, da die Geschwindigkeit der Reaktion in flexibler Weise durch Wahl der Konzentration des kcmpeiiriven inhibitors gesteuert "vvcrdcn kanu. Es ergibt sich damit der entscheidende Vorteil, bei höheren Suhstratkonzentrationen in einer praktischen nen. Insbesondere ist es möglich, durch geeignete Wahl der Probenmenge, der Konzentration des Enzyms und der Konzentration des Inhibitors den gesamten relevanten Konzentrationsbereich eines Sub-Despite the use of a competitive inhibitor, increasing the enzyme concentration has a beneficial effect off when the sensitivity is increased and a greater conversion is recorded in the same measuring time should, in turn, to improve the proportionality between reaction speed and Leads to substrate concentration in the sample. Above all, there is no need to increase the enzyme concentration to be bought with a disproportionately short measuring time, since the speed of the reaction in more flexibly controlled by the choice of the concentration of the kcmpeiiriven inhibitor "vvcrdcn kanu. It This results in the decisive advantage, in the case of higher concentrations of Suhstrat in a practical nen. In particular, it is possible, through a suitable choice of the amount of sample, the concentration of the Enzyme and the concentration of the inhibitor covers the entire relevant concentration range of a sub-
strates in der Probe ohne vorherige oder nachträgliche Verdünnung messen zu können.being able to measure strates in the sample without prior or subsequent dilution.
Die Fachwelt ist an der Möglichkeit, diesen Effekt der kompetitiven Inhibitoren für enzymkinetische Bestimmungen auszunutzen, bislang vollkommen vorbeigegangen. Der Effekt kann nachträglich dadurch erläutert werden, daß in den Nenner der oben beschriebenen Michaelis-Menten-Gleichung ein zusätzlich additives Glied eingeführt wird:The professional world is interested in the possibility of this effect of competitive inhibitors for enzyme kinetic Exploiting provisions has so far been completely bypassed. The effect can be retrospective be explained that in the denominator of the Michaelis-Menten equation described above, an additional additive term is introduced:
+K+ K
· Cs · Cs
Cl C l
Ki K i
wobeiwhereby
K1 =K 1 =
Ls; L s;
wenn das Substrat gebunden wird, undwhen the substrate is bonded, and
ν — ν -
c'fc? c 'fc?
C1- ■ c,C 1 - ■ c,
wenn das Enzym gebunden wird.when the enzyme becomes bound.
c, = Konzentration des Inhibitors,
cs, = Konzentration des Substrat/Inhibitor-Komplexes,
c, = concentration of the inhibitor,
c s , = concentration of the substrate / inhibitor complex,
cs = Konzentration des freien Substrats,
cE, — Konzentration des Enzym/Inhibitor-Kom- c s = concentration of the free substrate,
c E , - concentration of the enzyme / inhibitor com-
plexes,
cE = Konzentration an freiem Enzym.plexes,
c E = concentration of free enzyme.
Weil der Term KM + KM ■ C1- K1 (scheinbare Michaelis-Konstante K'M) stets größer als KM ist, kann die Proportionalität zwischen Reaktionsgeschwindigkeit ρ und Substratkonzentration cs in einem definierten Zeitraum bei höheren Substratkonzentrationen erreicht werden, als dies ohne Zugabe eines kompetitiven Inhibitors möglich ist.Because the term K M + K M ■ C 1 - K 1 (apparent Michaelis constant K ' M ) is always greater than K M , the proportionality between reaction rate ρ and substrate concentration c s can be achieved in a defined period of time at higher substrate concentrations, than is possible without the addition of a competitive inhibitor.
Die Konzentration des freien Enzyms und das Verhältnis cE,/cE bzw. csilcs werden so auf die Substratkonzentration abgestimmt, daß bei ausreichender Proportionalität in einer angemessenen Zeit mit ausreichender Empfindlichkeit gemessen werden kann Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung besteht darin die Empfindlichkeit nicht nur über die Substrat- unc Enzymkonzentration, sondern auch über die Konzentration des kompetitiven Inhibitors steuern zu können Unter diesem Gesichtspunkt wird vorteilhaft ein« zum sicheren Nachweis kleiner Substratkonzentrationen ausreichende Empfindlichkeit über das Verhältnis der Konzentrationen voa Substrates 2^ En zymc£ zu kompetitivem Inhibitor c; eingestelltThe concentration of the free enzyme and the ratio c E , / c E or c si lc s are matched to the substrate concentration in such a way that, given sufficient proportionality, measurements can be carried out in a reasonable time with sufficient sensitivity. A significant advantage of the invention is the sensitivity be able to control not only over the substrate unc enzyme concentration, but also on the concentration of the competitive inhibitor From this viewpoint, a "for reliably detecting small concentrations of substrate is advantageously sufficient sensitivity over the ratio of the concentrations VOA substrate 2 ^ En zymc £ to uncompetitive inhibitor c ; set
Wenn ein eventuell anhaltender Leerschleich nich abgewartet werden soll, kann er zweckmäßig durcr Aufnahme eines Leerwertes korrigiert werden.If you do not want to wait for a possibly persistent sneak, it can be expediently carried out Recording of a blank value can be corrected.
Die Messung wird zweckmäßig unmittelbar nacl Homogenisierung der Mischung und Ausgleich eine eventuell auftretenden Temperatursprungs bevorzug nach der »timefixed«-Technik ausgeführt. Dabei winThe measurement is expediently carried out immediately after the mixture has been homogenized and balanced Any temperature jump that may occur is preferably carried out using the »timefixed« technique. Thereby win
S5 im Bereich der Reaktion pscsds-crstcr Ordasng bc allen Messungen in einer Analysenserie in einer glei chen Zeitspanne nach einer bestimmten gewählteiS 5 in the area of the reaction pscsds-crstcr Ordasng bc all measurements in an analytical series in the same time span after a certain selected
w 3Y-C?! f?i5»iSr i. VorsugaWivv:· SSL HäJSu der 4~ο?ί w 3 YC ?! f? i5 »iSr i. VorsugaWivv: · SSL HäJSu der 4 ~ ο? Ί
ten gewählten Zeit eine Mittelung der Meßwerte in der Zeitspanne für die Messung oder eine kinetische Zweipunktmessung am Anfang und Ende der Zeitspanne oder eine Bestimmung der Momentangeschwindigkeit zu einem festen Zeitpunkt, z. B. durch Bestimmung des Steigungswinkels der Meßkurve, vorgenommen. Die Zeitspanne kann innerhalb der Reaktion vom Typ erster Ordnung beliebig, muß jedoch für alle Messungen in einer Analysenserie gleich gewählt werden. Es können daher praktische und kurze Meßzeiten gewählt werden. Vor allem ist es möglich, eine zweckmäßige, auch kurze Meßzeit nach der »time fixed«-Technik ausgeführt. Dabei wird fangsgeschwindigkeit zu ermitteln (»initial rate«-Technik). ·5The selected time is an averaging of the measured values in the time span for the measurement or a kinetic one Two-point measurement at the beginning and end of the period or a determination of the current speed at a fixed point in time, e.g. B. by determining the slope angle of the measurement curve, performed. The period of time can be any, must, within the reaction of the first order type however, the same can be selected for all measurements in an analysis series. It can therefore be practical and short measuring times can be selected. Above all, it is possible to have an expedient, even short, measuring time carried out according to the »time fixed« technique. In doing so, the initial rate is to be determined ("initial rate" technique). · 5
Unter bestimmten Umständen kann es günstig sein, nicht nur einen Inhibitor, sondern mehrere Inhibitoren einzusetzen.In certain circumstances it may be beneficial to have not just one inhibitor but several inhibitors to use.
Es ist möglich, das erfindungsgemäße Verfahren auf mehrstufige Reaktionen anzuwenden, wobei nicht alle Teilschritte enzymatisch katalysiert zu sein brauchen. Beispielsweise kann das nachzuweisende Substrat in einem geschwindigkeitsbestimmenden enzymatischen Schritt umgesetzt werden, an den sich eine schnelle nichtenzymatische Indikatorreaktion anschließt. In diesem Fall wird der Inhibitor der ersten (enzymatischen) Reaktion zugesetzt. Analog kann man vorgehen, wenn auch die Indikatorreaktion enzymatisch katalysiert wird. Jetzt gibt es jedoch eine zweite Möglichkeit, indem man vor der eigentlichen Messung die erste Stufe quantitativ ablaufen läßt und ihre Reaktionsprodukte damit speichert; anschließend wird die zweite Stufe unter Zusatz eines auf die zweite Stufe abgestimmten Inhibitors kinetisch verfolgt.It is possible to apply the process according to the invention to multistage reactions, but not all sub-steps need to be enzymatically catalyzed. For example, the substrate to be detected can be implemented in a rate-limiting enzymatic step to which a rapid non-enzymatic indicator reaction follows. In this case, the inhibitor becomes the first (enzymatic) reaction added. One can proceed in a similar manner, albeit the indicator reaction is enzymatic is catalyzed. Now, however, there is a second option by getting ahead of the real one Measurement lets the first stage run quantitatively and thus saves its reaction products; subsequently the second stage is followed kinetically with the addition of an inhibitor tailored to the second stage.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform wird ein auf den Meßansatz abgestimmter Puffer verwendet. Im Hinblick auf in verschiedenen Fällen mögliche Teilreaktionen wird dabei der pH-Wert des Puffers so gewählt, daß er möglichst mit dem pH-Geschwindigkeits-Maximum in bezug zur gesamten Reaktionsgeschwindigkeit des Meßansatzes übereinstimmt und den K „-Wert des Enzyms nicht merklich erniedrigt.In a particularly advantageous embodiment, a buffer tailored to the measurement approach is used. With regard to partial reactions that are possible in various cases, the pH value of the Buffer chosen so that it as possible with the pH rate maximum in relation to the overall reaction rate of the measurement approach and the K "value of the enzyme is not noticeable humiliated.
Ein besonders überraschender Effekt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht ferner darin, daß eventuell in der Probe bereits vorhandene Inhibitoren, welche die Analysenergebnisse verfälschen können, durch Erhöhung der Inhibitorkonzentration in den Hintergrund gedrängt werden können. Derartige Störeffekte spielen in der Praxis eine nicht unbedeutende Rolle, da beispielsweise viele im Blutserum von Patienten vorhandene Pharmaka inhibitiv wirken können. Auch natürlich vorkommende Begleitstoffe haben häufig eine Inhibitorwirkung. Das erfindungsgemäße Verfahren eröffnet darni« einen Weg, auch in solchen Fällen korrekte Analysenergebnisse zu erhalten, in denen ein unbekannter Inhibitor in nicht bekannter Menge vorhanden istA particularly surprising effect of the method according to the invention is that possibly Inhibitors already present in the sample, which can falsify the analysis results, can be pushed into the background by increasing the inhibitor concentration. Such Disruptive effects play a not insignificant role in practice, since, for example, many in the blood serum of Pharmaceuticals available to patients can have an inhibitory effect. Also naturally occurring accompanying substances often have an inhibitory effect. The method according to the invention opens up a way, also in To obtain correct analysis results in such cases, in which an unknown inhibitor is not in known amount is available
Eine weitere Ausgestaltung des erfindungsgemäSen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des zu bestimmenden Substrats verwendet wird, welche bereits einen kompetitiven Hemmeffekt auf das zur Bestimmung verwendete Enzym ausübt. Vorzugsweise wird hierbei der absichtlich zugesetzte kompetitive Inhibitor in einer Menge eingesetzt, welche eine 60- bis 95%ige Hemmung des Enzyms hervorruft. Djf bcstzs -^rgt&bsr» werden hsöfc&v teas s'halten^ ,«,, wenn die zu bestimmende ouostratiosung bereite einen Hemmeffekt auf das zur Bestimmung verwendete Enzym ausübt, welcher eine bis zu 50% ige Hemmung des Enzyms hervorruft.Another embodiment of the method according to the invention is characterized in that a solution of the substrate to be determined is used which already has a competitive inhibiting effect on the enzyme used for the determination. The intentionally added competitive inhibitor is preferably used in an amount which causes 60 to 95% inhibition of the enzyme. Djf bcstzs - ^ rgt & bsr » will hsöfc & v teas s',« ,, if the ouostratiosung to be determined has an inhibiting effect on the enzyme used for the determination, which causes up to 50% inhibition of the enzyme.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur enzymkinetischen Substratbestimmung in Gegenwart unbekannter Inhibitoren durch Zusatz bekannter Inhibitorer in bekannter Menge ist höchst überraschend und überwindet das Vorurteil der Fachwelt, daß kinetische Substratbestimmung in Gegenwart unbekanntei Hemmstoffe nicht möglich seien. So ist es. aus Analytical Chemistry, 31, S. 980 (1959) bekannt, daß das Vorhandensein von hemmenden Aktivitäten für die enzymkatalysierte Reaktion das schwerwiegendste Problem der enzymatischen Substratbestimmung darstellt und sich eine solche Bestimmung nicht durchführen läßt, wenn unbekannte und unspezifische Hemmstoffe vorhanden sind. Besonders wird darauf hingewiesen, dafi auch Hemmstoffe selbst nicht mehr bestimmt werden können, wenn sie andere hemmende Verunreinigungen enthalten.The inventive method for enzyme-kinetic substrate determination in the presence of unknown Inhibitors by adding known inhibitors in known amounts is extremely surprising and overcomes the prejudice of experts that kinetic substrate determination in the presence is unknown Inhibitors are not possible. That's the way it is. from Analytical Chemistry, 31, p. 980 (1959) that the presence of inhibiting activities for the enzyme-catalyzed reaction is the most serious problem represents the enzymatic substrate determination and such a determination cannot be carried out, when unknown and unspecific inhibitors are present. It is particularly pointed out that Even inhibitors themselves can no longer be determined if they have other inhibitory impurities contain.
Für die Durchführung dieser Ausführungsform des Verfahrens gelten die obigen Angaben in gleicher Weise. Zweckmäßig wird jedoch in einem Vorversuch bei einer unbekannten Probe festgestellt, ob sie bereits hemmende Aktivitäten enthält, welche das Enzym zu nicht mehr als 50% zu hemmen vermögen. Dies läßt sich einfach durchführen durch Zusatz einer bekannten Menge Substrat und einer bekannten Enzymaktivität. Werden kinetisch oder durch Endwertbestimmung wenigstens 50% des zugesetzten Substrates wiedergefunden, so läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren anwenden, ohne daß ein merklich größerer Fehler als bei Durchführung der Messung in einer hemmstoffifreien Lösung in Betracht gezogen werden muß. Liegt die Wiederfindung erheblich unter 50%, so läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren immer noch durchführen, es muß jedoch ein etwas größerer Fehler in Kauf genommen werden. Im letzteren Fall ist es zweckmäßig, mit der Menge der absichtlich zugesetzten Inhibitormenge bis an die obere Grenze des anwendbaren Hemmungsbereiches zu gehen, die bei etwa 95% liegt. Bei Fremdhemmungen unter 40% wird vorzugsweise eine solche Menge an kompetitivem Inhibitor eingesetzt, daß eine Enzymhemmung zwischen 65 und 85% erzielt wird.The above statements apply equally to carrying out this embodiment of the method Wise. Appropriately, however, it is determined in a preliminary test in the case of an unknown sample whether it is already contains inhibitory activities which the enzyme are not able to inhibit more than 50%. This leaves easily performed by adding a known amount of substrate and a known enzyme activity. If at least 50% of the added substrate is found kinetically or by determining the final value, the method according to the invention can thus be used without a noticeably larger one Errors should be considered when taking the measurement in an inhibitor-free solution got to. If the recovery is considerably below 50%, the method according to the invention can always be used still carry out, but a somewhat larger error must be accepted. In the latter case it is advisable to use the amount of the intentionally added amount of inhibitor up to the upper limit of the applicable inhibition range, which is around 95%. In the case of external inhibitions below 40% such an amount of competitive inhibitor is preferably used that an enzyme inhibition between 65 and 85% is achieved.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Reagenz zur enzymkinetischen Bestimmung der Konzentration eines Substrates nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Ein derartiges Reagenz enthält ein System zur enzymatischen Messung dieses Substrates und ist gekennzeichnet durch einen Gehalt an wenigstens einem kompetitiven Inhibitor für die zu messende Enzymsubstratreaktion. Grundsätzlich geeignet für dieses Reagenz sind die bekannten Systeme zur enzymatischen Substratbestimmung nach der Endwertmethode, die in vielen Formen im Handel erhältlich sind. Das erfindungsgemäße Reagenz enthält neben einem derartigen System zusätzlich wenigstens einen kompetitiven Inhibitor. Inhibitor und Enzym können dabei in Form eines gemeinsamen Komplexes vorliegen, der eine zusätzliche Stabilisierung des Enzyms analog zur Substratstabilisierung eines Enzyms bewirkt The invention also relates to a reagent for the enzyme-kinetic determination of the concentration of a substrate according to the method according to the invention. Such a reagent contains a system for the enzymatic measurement of this substrate and is characterized by a content of at least a competitive inhibitor for the enzyme substrate reaction to be measured. Basically suitable for this reagent are the known systems for enzymatic substrate determination according to the final value method, which are commercially available in many forms. The reagent according to the invention contains besides such a system additionally at least one competitive inhibitor. Inhibitor and enzyme can present in the form of a common complex that provides additional stabilization of the enzyme effected analogously to the substrate stabilization of an enzyme
Ein System zur enzvmatischen Messung eines Substrates enthält im allgemeinen ein für das Substrat spezifisches Enzym, einen auf dieses Enzym abgerfnsiaten J^^s^^wk gegebenenfalls /'«faktorcs und/oder Hüisenzyme und/oder* Stabilisatoren. UnterA system for enzymatic measurement of a substrate generally includes one for the substrate specific enzyme, one dependent on this enzyme J ^^ s ^^ wk possibly / '«faktorcs and / or chicken enzymes and / or * stabilizers. Under
609 624'307609 624,307
Cofaktoren werden hierbei Coenzyme, darunter auch als Coenzyme wirksame Metallionen, und Cosubstrate verstanden.Coenzymes, including metal ions that act as coenzymes, and cosubstrates are cofactors Roger that.
Die erfindungsgemäßen Reagenzien oder Reagenzienkombinationen können sowohl in Form von Lösungen als auch in Form von lyophilisierten, gefriergetrockneten Gemischen vorliegen. Eine besonders günstige Ausführungsform ergibt sich bei Abpackung von lyophilisierten Reagenzien in Einwegküvetten, welche nach Zugabe eines Lösungsmittels (z. B. des Puffers) sofort gebrauchsfertig sind und nach Durchführung der Bestimmung fortgeworfen werden.The reagents or combinations of reagents according to the invention can be in the form of solutions as well as in the form of lyophilized, freeze-dried mixtures. A special one A favorable embodiment is obtained when lyophilized reagents are packaged in disposable cuvettes, which are immediately ready for use after adding a solvent (e.g. the buffer) and after execution to be thrown away from the destiny.
Zur näheren Erläuterung der Erfindung sollen die nachfolgenden Beispiele dienen, welche eine Harnsäurebestimmung und eine Glucosebestimmung im einzelnen wiedergeben. In analoger Weise können beispielsweise Triglyzerid mittels der Glyzerokinase-Methode, Harnstoff mittels der Urease/Gl DH-Methode, Cholesterin mittels der Cholesterin-Dehydrogenase-Methode oder Lactat mittels der LDH-Methode bestimmt werden. Weitere enzymatische Bestimmungen, welche erfindungsgemäß kinetisch durchführbar sind, finden sich z. B. in H. U. B e r g m e y e r, Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie Weinheim, 1974.The following examples, which determine uric acid, are intended to provide a more detailed explanation of the invention and detail a glucose determination. In an analogous manner, for example, triglyceride using the glycerokinase method, Urea using the urease / Gl DH method, cholesterol using the cholesterol dehydrogenase method or lactate can be determined using the LDH method. Further enzymatic determinations which can be carried out kinetically according to the invention can be found, for. B. in H. U. B e r g m e y e r, Methods of enzymatic analysis, Verlag Chemie Weinheim, 1974.
Photometrische Harnsäurebestimmung nach der ungekoppelten Uricase-ReaktionPhotometric uric acid determination based on the uncoupled uricase reaction
Dabei läuft die bekannte Umsetzung ab:The known implementation takes place:
Harnsäure + 2 H2O + O2
UricaseUric acid + 2 H 2 O + O 2
Uricase
-> Allantoin + CO2 + H2O2 -> allantoin + CO 2 + H 2 O 2
3535
4040
4545
EC 1.7.3.3EC 1.7.3.3
Meßgröße ist die Extinktion der Harnsäure nahe deren Absorptionsmaximum bei 293 nm.The measured variable is the extinction of uric acid near its absorption maximum at 293 nm.
Geräteequipment
Ein Enzymmeßplatz (Photometer mit Filter Hg 302 nm, Multiplier und Spektrallampe), Pipetten bzw. Probe-Reagenz-Dosierer.An enzyme measuring station (photometer with filter Hg 302 nm, multiplier and spectral lamp), pipettes or Sample reagent dispenser.
ReagenzienReagents
1. Kaliumthiocyanat,1. potassium thiocyanate,
2. Hexnsäure,2. hexic acid,
3. Lithiumcarbonate3. Lithium carbonates
4. 0,1 Mol/l Boratpuffer, pH 9,5,4. 0.1 mol / l borate buffer, pH 9.5,
5. Uricase 5 U/ml (hergestellt aus Schweineleber).5. Uricase 5 U / ml (made from pig liver).
Arbeitsweise
Ermittlung des HemmtypsWay of working
Determination of the type of inhibition
50 μΐ Standardlösung mit 0,178-037-0,476 0,595-0,733-0,892-1,19mMol/1 Harnsäure (durch Verdünnen einer Stammlösung von 5,95 mMol/1 Harnsäure in 54 mMol/1 Lithiumcarbonat mit bidesL Wasser) werden mit 500 μΐ Puffer ohne Inhibitor bzw. mit 500 μΐ 103 mMol/1 Kaliumthiocyanat Puffer in der Küvette (Schichtdicke 1,00 cm) auf 25° C inkubiert und die Reaktion durch Zumischen von 50 μΐ 1 + 10 mit bidest Wasser verdünnter Uricase gestartet. 20 Sekunden nach Reaktionsstart wird registriert: Papiervorschub 2cm/Mnu, Spreizung 20 cm für E=O — L Mit einem Winkelmeßgerät wird der ... ^yinkd β vsc*der ZstssVse jeweils zu %egas»»> -beghm gemessen. Die itcaprokwerte aer tan a werden als Ordinate gegen die zugehörigen reziproken Harnsäurekonzentrationen aufgetragen (Lineweaver-Burk-Diagramm). Durch die jeweils mit bzw. ohne Kaliumthiocyanat-Zusatz erhaltenen Punkte wird die Ausgleichsgerade gelegt. Bei Vorliegen eines kompetitiven Hemmtyps muß die Verlängerung der Geraden die Ordinate im gleichen Punkt schneiden.50 μΐ standard solution with 0.178-037-0.476 0.595-0.733-0.892-1.19 mmol / 1 uric acid (by diluting a stock solution of 5.95 mmol / 1 uric acid in 54 mmol / 1 lithium carbonate with two liters of water) with 500 μ buffer without Inhibitor or incubated with 500 μΐ 103 mmol / 1 potassium thiocyanate buffer in the cuvette (layer thickness 1.00 cm) at 25 ° C and started the reaction by adding 50 μΐ 1 + 10 Uricase diluted with distilled water. 20 seconds after the start of the reaction, the following is recorded: paper feed 2cm / Mnu, spread 20 cm for E = O - L With an angle measuring device, the ... ^ yinkd β vsc * of the ZstssVse is measured at% egas »»> -beghm. The itcaprok values aer tan a are plotted as the ordinate against the associated reciprocal uric acid concentrations (Lineweaver-Burk diagram). The best-fit straight line is drawn through the points obtained with or without the addition of potassium thiocyanate. If there is a competitive type of inhibition, the extension of the straight line must intersect the ordinate at the same point.
Optimierung der TestbedingungenOptimization of the test conditions
50 μΐ der Standardlösungen inkubiert man mil 500 μΐ 825tnMol/l Kaliumthiocyanat in Puffer aul 25° C, startet durch Zugabe von 50 μΐ unverdünnter Uricase und mißt wie vorstehend. Zur Ermittlung dei scheinbaren Michaelis-Konstante werden die Reziprokwerte der tangensa als Ordinate, die reziproken molaren Substratkonzentrationen im Testansatz als Abszisse aufgetragen. Die scheinbare Michaelis-Konstante ergibt sich als negativer Reziprok wert der Abszissenschnittpunkte der Regressionsgeraden (Einsetzen geeigneter kleiner Werte Tür l/c^danachgraphische Auswertung). Der Wert der scheinbaren Michaelis-Konstanten K'M ist wichtig für die Beurteilung dei maximal in den Test einsetzbaren Harnsäurekonzentration, die möglichst kleiner als 0,05 K'M sein soll50 μl of the standard solutions are incubated with 500 μl of 825 nmol / l potassium thiocyanate in buffer at 25 ° C., start by adding 50 μl of undiluted Uricase and measure as above. To determine the apparent Michaelis constant, the reciprocal values of the tangensa are plotted as the ordinate, the reciprocal molar substrate concentrations in the test batch as the abscissa. The apparent Michaelis constant results as the negative reciprocal value of the intersection points of the abscissa of the regression line (insertion of suitable small values door 1 / c ^ subsequent graphic evaluation). The value of the apparent Michaelis constant K ' M is important for assessing the maximum uric acid concentration that can be used in the test, which should be less than 0.05 K' M as possible
Ergebnisse und DiskussionResults and discussion
Mit dem Literaturwert 17 μΜοΙ/1 Harnsäure für die Michaelis-Konstante der aus Schweineleber gewonnenen Uricase (T. O. Tifi'any et al. Anal. Chem.45 171^-23 [1973]) ergibt sich eine maximal einsetzbare Konzentration von 0,85 μΜοΙ/l Harnsäure, wenn das Verhältnis cs/KM = 0,05 für die Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit zugrunde gelegt wird. Gehl man von einem Testvolumen von 600 μΐ aus, muß dei eingesetzte Serumanteil auf 0,85 μΐ beschränkt werden, um bis zu einem Gehalt von 0,6 mMol/1 Harnsäure im Serum ohne zusätzliche Vorverdünnung messen zu können. Abgesehen davon, daß das Serum vorverdünnt werden muß, weil sich ein so geringes Volumen von 0,85 μΐ nicht direkt genau dosieren läßt, läßt sich unter diesen Bedingungen selbst für das Endwertverfahren an der unteren Normalwertgrenze für Humanseren (0,12 mMol/1 Harnsäure) nur eine Extinktion von 0,002 erreichen, bezogen auf den Extinktionskoeffizienten der Harnsaure 12,6 αη2/μΜο1 bei 293 mn (Boehringer Mannheim GmbH, Testfibel, 3. Aufl. 1969, Abschnitt Harnsäure). Das Verfahren ist für eine kinetische Bestimmung zu unempfindlich.The literature value 17 μΜοΙ / 1 uric acid for the Michaelis constant of uricase obtained from pig liver (TO Tifi'any et al. Anal. Chem. 45 171 ^ -23 [1973]) results in a maximum usable concentration of 0.85 μΜοΙ / l uric acid, if the ratio c s / K M = 0.05 is used to determine the initial speed. If a test volume of 600 μΐ is assumed, the serum portion used must be limited to 0.85 μΐ in order to be able to measure up to a level of 0.6 mmol / 1 uric acid in the serum without additional pre-dilution. Apart from the fact that the serum has to be pre-diluted because such a small volume of 0.85 μl cannot be dosed precisely, under these conditions, even for the final value method, the lower normal value limit for human sera (0.12 mmol / l uric acid ) only achieve an extinction of 0.002, based on the extinction coefficient of uric acid 12.6 αη 2 / μ Μο1 at 293 mn (Boehringer Mannheim GmbH, Testfibel, 3rd edition 1969, section uric acid). The method is too insensitive for a kinetic determination.
Durch Verwendung bakterieller Uricase läßt siel die Anfangskonzentration zwar um den Faktor« steigern. Eine hinreichende Empfindlichkeit ergibt sich jedoch nur, wenn der erste. Meßpunkt bereits 4 Sekunden nach Reaktionsstart aufgenommen und ein »time fixedw-Intervall >1,5 Minuten gewählt wird (Tiffany, a.a.O.).By using bacterial uricase, the initial concentration can be reduced by the factor « increase. However, sufficient sensitivity is only achieved if the first. Measuring point already 4 seconds after the start of the reaction and a »time fixedw interval> 1.5 minutes is selected (Tiffany, op. Cit.).
Mit Kaliumthiocyanat wurde ein geeigneter kompetitiver (gleicher Ordinatenschnittpunkt bei der Auftragung nach Lineweaver-Burk bei gleicher Enzymaktivität) Inhibitor gefunden, der bei einer Konzentration von 687 mMol/1 Testlösung eine scheinbare Michaelis-Konstante von 1 mMol/1 ergab. Damit errechnet sich bei einem Einsatz von 50 μΐ unverdünnte^Probe und einem Testvolumen von 600μ1 ein cs/^ Ar1" er ί von 0,G5 für die Konzentration Ό,ο mMoi/ί Harnsäure in der Probe, so daß hinsichtlich Empfindtichkeü und Lineantät^der Eiehkurye die VorausäcLoSjigonlür esa enüä35es Riw«inevena3ien gegeben erscheinen.With potassium thiocyanate, a suitable competitive (same ordinate intersection when plotting according to Lineweaver-Burk with the same enzyme activity) inhibitor was found, which at a concentration of 687 mmol / l test solution gave an apparent Michaelis constant of 1 mmol / l. With a use of 50 μΐ undiluted ^ sample and a test volume of 600 μ1, a c s / ^ Ar 1 "er ί of 0. G5 for the concentration Ό, ο mMoi / ί uric acid in the sample, so that with regard to sensitivity and Lineantät ^ the Eiehkurye the VoräcLoSjigonlür esa enüä35es Riw «inevena3ien appear given.
In Übereinstimmung mit dieser Berechnung wurde für die Winkelablesung bei 20 Sekunden Proportionalität zwischen dem tangens und Konzentrationen bis 0,6 m Mol/l Harnsäure in Wasser mit einem Fehler von —3% für den höchsten Gehalt gefunden, der toleriert werden kann, wenn man an die übertragung der Bedingungen auf die Serumanalyse denkt. Der Winkel betrug an der unteren Normalwertgrenze unter den Bedingungen etwa 8°, so daß die Empfindlichkeit des Verfahrens auch für kleine Substratkonzentrationen ausreicht.Consistent with this calculation, the angle reading at 20 seconds was proportional between the tangent and concentrations up to 0.6 m mol / l uric acid in water with an error of -3% found for the highest salary that can be tolerated when considering the transfer thinks of the conditions on the serum analysis. The angle was at the lower limit of normal value under the conditions about 8 °, so that the sensitivity of the method even for small substrate concentrations sufficient.
Die für wäßrige Harnsäurelösungen gefundenen Bedingungen können damit für die Serumanalyse beibehalten werden. Allerdings sollte vor Zugabe der Uricase der Leerschleich abgewartet werden, der durch eine Oxydation der im Serum in variabler Menge enthaltenen Ascorbinsäure bedingt ist.The conditions found for aqueous uric acid solutions can thus be retained for the serum analysis will. However, the Leerschleich should be awaited before adding the Uricase, the is caused by an oxidation of the ascorbic acid contained in the serum in variable amounts.
Durch Erhöhung der Inhibitorkonzentration kann der lineare Meßbereich ausgedehnt und die Richtigkeit bei höheren Harnsäure-Konzentrationen gesteigert werden, wobei gleichzeitig die Empfindlichkeit durch übergang auf die Meßwellenlänge 293 nm und/ oder weitere Erhöhung der Enzymaktivität und/oder Erhöhung der Temperatur verbessert werden sollte.By increasing the inhibitor concentration, the linear measuring range can be expanded and the accuracy at higher uric acid concentrations are increased, while at the same time the sensitivity by changing over to the measuring wavelength 293 nm and / or further increasing the enzyme activity and / or Increase in temperature should be improved.
Photometrische Bestimmung der Glucose nach der Glucose-Dehydrogenase-MethodePhotometric determination of glucose using the glucose dehydrogenase method
Es läuft die bekannte Umsetzung ab:The known implementation takes place:
Mutarotase
α-Glucose /^-GlucoseMutarotase
α-glucose / ^ - glucose
(EC 5.1.3.3)(EC 5.1.3.3)
Glucose-DehydrogenaseGlucose dehydrogenase
/i-D-Glucose +/ i-D-glucose +
(EC 1.1.1.47)(EC 1.1.1.47)
->· Gluconsäure + NADH ■+■ H'-> · Gluconic acid + NADH ■ + ■ H '
Geräteequipment
Ein Enzymmeßplatz (kinetische Bestimmungen), ein Substratmeßplatz (Endwertbestimmungen), Pipetten bzw. Probe-Reagenz-Dosierer (Mikroliterbereich), geeichte Vollpipetten (Milliliterbereich). — LaborpH-Meter. — Tischrechner mit Programm für Mittelwert, Standardabweichung und Variationskoeffizient sowie Sonderprogramm für lineare Regression, Korrelationskoeffizient und Streuung um die Regressionsgerade. An enzyme measuring station (kinetic determinations), a substrate measuring station (final value determinations), pipettes or sample-reagent dispenser (microliter range), calibrated volumetric pipettes (milliliter range). - Laboratory pH meter. - Desktop calculator with program for mean value, standard deviation and coefficient of variation as well as special program for linear regression, correlation coefficient and scatter around the regression line.
ReagenzienReagents
1. Kaliumthiocyanat,1. potassium thiocyanate,
2. Kaliumchlorid,2. potassium chloride,
3. Dinatriumsalz der Äthylendinitrilotetraessigsäure, 3. disodium salt of ethylenedinitrilotetraacetic acid,
4. D(+)-Glucose, wasserfrei, puriss-,4. D (+) - glucose, anhydrous, puriss-,
5. waßr. Glucosestandardlösung,5. aq. Glucose standard solution,
6. Nicotinandd-adenin-diniicleotid, freie Säure (150mg/ml H2O),6. Nicotinandd-adenine-diniicleotid, free acid (150mg / ml H 2 O),
7. »Blutzucker, GlucDH-Methode«.7. "Blood sugar, GlucDH method".
Lösungen "
1. Puffer: 120mMol/l Phosphatpuffer, pH 7,6,Solutions "
1. Buffer: 120 mmol / l phosphate buffer, pH 7.6,
lTji j Jl. T »....,..■ -ττΛ-η l Tji j Jl. T »...., .. ■ -ττΛ-η
«·- T? nil 11«· - T? nil 11
Dehydrogenase tmd Mutarotase in Paffer, hergestellt entsprechend Begleitzettel der Probepak-Dehydrogenase and Mutarotase in Paffer according to the accompanying slip of the sample package
3. Stabilisiertes Puffer-Enzym-Inhibitor-Gemisch: Lösung mit 825 mMol Kaliumthiocyanat und 55 mMol Dinatriumsalz der Äthylendinitrilotetraessigsäure im Liter Puffer-Enzym-Gemisch. pH-Wert: 6,6.3. Stabilized buffer-enzyme-inhibitor mixture: solution with 825 mmol potassium thiocyanate and 55 mmol of the disodium salt of ethylenedinitrilotetraacetic acid in a liter of buffer-enzyme mixture. pH value: 6.6.
ArbeitsweiseWay of working
1. Charakterisierung der1. Characterization of the
Glucose-Dehydrogenase-AktivitätGlucose dehydrogenase activity
20 μΐ 1 + 10 mit Puffer verdünntes Puffer-Enzym-Gemisch wurde mit 500 μΐ 280 mMol Glucose/1 Puffer (bei höheren Glucosekonzentrationen Substrathemmung) auf 25° C inkubiert und die Geschwindigkeit der Extinktionszunahme über 3 Minuten nach Zumischen von 20 μΐ 150mMol/l NAD® verfolgt.20 μΐ 1 + 10 buffer-enzyme mixture diluted with buffer was with 500 μΐ 280 mmol glucose / 1 buffer (at higher glucose concentrations substrate inhibition) incubated at 25 ° C and the rate of increase in absorbance over 3 minutes after mixing followed by 20 μΐ 150 mmol / l NAD®.
Berechnung und Ergebnis (f = Molextinktion NADH, d = Schichtdicke, EV = Testvolumen, PV = Probevolumen, F = Verdünnungsfaktor) Calculation and result (f = molar absorbance NADH, d = layer thickness, EV = test volume, PV = sample volume, F = dilution factor)
... . IE 103 EV ... IE 10 3 EV
U m\ = --- —j -577 l·
min f · d PV U m \ = --- - j -577 l
min f · d PV
1 n3 1 n 3
S40S40
2. Hemmtyp2. Type of inhibition
100 μΐ Standard mit 27,8-33,3-38,8-44,4-50,0 — 55,5 mMol Glucose/1 wurden in der Küvette mit 500 μΐ folgender Lösungen auf 25°C inkubiert: (a) Puffer-Enzym-Gemisch, 1 + 40 mit Puffer verdünnt,100 μΐ standard with 27.8-33.3-38.8-44.4-50.0 - 55.5 mmol glucose / 1 were incubated in the cuvette with 500 μΐ of the following solutions at 25 ° C: (a) Buffer-enzyme mixture, 1 + 40 diluted with buffer,
(b) 410mMol/l Kaliumthiocyanat in verd. Puffer-Enzym-Gemisch, (c) 620 m Mol/l Kaliumthiocyanat in verd. Puffer-Enzym-Gemisch. (Die thiocyanathaltigen Lösungen wurden jeweils frisch angesetzt.) Durch Zumischen von 20 μΐ 200 m Mol/l NAD® wurde die Reaktion gestartet, 10Sekunden danach registriert: Papiervorschub 5 cm/Min., Spreizung 20 cm für E = O-I.(b) 410 mmol / l potassium thiocyanate in dilute buffer-enzyme mixture, (c) 620 m mol / l potassium thiocyanate in dilute buffer-enzyme mixture. (The thiocyanate-containing Solutions were each freshly prepared.) By adding 20 μΐ 200 m mol / l NAD®, the Response started, registered 10 seconds later: Paper feed 5 cm / min., Spread 20 cm for E = O-I.
Zur Ermittlung des Winkelsa mit der Zeitachse wurde der praktisch lineare Anfangsbereich der Schreiberaufzeichnung ausgewertet, zur Bestimmung des Hemmtyps die Reziprokwerte der Tangens α (für praktische Zwecke identisch mit der Anfangsgeschwindigkeit) als Ordinate und die Reziprokwerte der in den Test eingesetzten millimolaren Glucosekonzentrationen als Abszisse aufgetragen (Lineweaver-Burk-Diagramm). To determine the angle a with the time axis the practically linear starting area of the recorder was evaluated to determine the Inhibition type the reciprocal values of the tangent α (for practical purposes identical to the initial velocity) as the ordinate and the reciprocal values of the millimolar glucose concentrations used in the test plotted as the abscissa (Lineweaver-Burk diagram).
Zur Klärung der Frage, ob das Thiocyanation für die Hemmwirkung verantwortlich ist, wurde Kaliumthiocyanat durch die äquimolare Menge Kaliumchlorid ersetztTo clarify whether the thiocyanate ion for the inhibitory effect is responsible, potassium thiocyanate was replaced by the equimolar amount of potassium chloride replaced
3. Konzentrationsbestimmungen
Allgemeiner Testansatz3. Concentration determinations
General approach to testing
20 μΙ Probe wurde mit 500 μΐ stabilisiertem Puffer-Enzym-Inhibitor-Gemisch in der Küvette auf 25°C inkubiert und die Reaktion durch Zumischen von 20 μΐ NAD® (150 mg/ml H2O) gestartet. 20 Sekunden20 μΙ sample was incubated with 500 μΐ stabilized buffer-enzyme-inhibitor mixture in the cuvette at 25 ° C and the reaction was started by mixing in 20 μΐ NAD® (150 mg / ml H 2 O). 20 seconds
vorschub bei Hg 366 mn und der Schichtdicke 1,00 cm registriert raid der Winkel α jeweils 20 Sekunden nachadvances at Hg 366 mn and a slice thickness of 1.00 cm registered raid the angle α in each case 20 seconds
Berechnung über den Standard mit 5,55 mMol
ülucose/1Calculation using the standard with 5.55 mmol
glucose / 1
5,55 ■5.55 ■
So, Probe = tan M ProbeSo, sample = tan M sample
tan «Slandirdtan «Slandird
Analyse von HumanplasmenAnalysis of human plasmas
Als Proben wurden Humanplasmen eingesetzt, die durch Zentrifugieren von mit Fluorid-EDTA-Benzoesäure-stabilisiertem Venenblut gewonnen worden waren. Human plasmas were used as samples, which were obtained by centrifugation of fluoride-EDTA-benzoic acid-stabilized Venous blood had been obtained.
Parallelanalysen wurden nach der Hexokinase-Endwertmethode mit Enteiweißung nach der Eppendorf-Vorschrift AV707-T durchgeführt; in Abweichung von der Vorschrift wurde über den Standard berechnetParallel analyzes were carried out according to the hexokinase end value method with deproteinization according to the Eppendorf regulation AV707-T performed; in deviation from the rule was beyond the standard calculated
Diskussion der Ergebnisse
Kaliumthiocyanat als kompetitiver Inhibitordiscussion of the results
Potassium thiocyanate as a competitive inhibitor
F i g. 1 zeigt ein Lineweaver-Burk-Diagramm (Ordinate: reziproker Anstieg der Extinktions-Zeit-Kurve 10 Sekunden nach Reaktionsstart; Abszisse: reziproke millimolare Glucosekonzentration im Test). Die Verlängerungen der ohne Inhibitorzusatz (a), bei Zusatz von 33OmMoI K.SCN/1 Testlösung (b) sowie bei Zusatz von 500 mMol KSCN/1 Testlösung (c) gefundenen Geraden schneiden die Ordinate praktisch im gleichen Punkt, während sich der Abszissenschnittpunkt mit steigender Inhibitorkonzentration dem Ursprung nähert, was für den kompetitiven Hemmtyp charakteristisch ist.F i g. 1 shows a Lineweaver-Burk diagram (ordinate: reciprocal increase in the absorbance-time curve 10 seconds after the start of the reaction; Abscissa: reciprocal millimolar glucose concentration in the test). The extensions of the without inhibitor addition (a), with addition of 33OmMoI K.SCN / 1 test solution (b) as well as at Addition of 500 mmol KSCN / 1 test solution (c) found Straight lines intersect the ordinate at practically the same point, while the abscissa intersect approaches the origin with increasing inhibitor concentration, which is for the competitive inhibitor type is characteristic.
2020th
Meßbereich und EmpfindlichkeitMeasuring range and sensitivity
In F i g. 2 a und 2b sind Eichkurven dargestellt, die sich ergeben, wenn man die scheinbare Michaeliskonstante durch Inhibitorzusatz auf 5OmMoI Glucose 1 einstellt: einmal für die Steigung der Extinktions-Zeit-Kurve 20 Sekunden nach Reaktionsstart, ?.um anderen für die fixed-time-Intervalle 60 bzw. 300 Sekunden, jeweils wiederum 20 Sekunden nach Reaktionsstart (Papiervorschub 10cm/min; Meßwellenlänge Hg 366 nm).In Fig. 2 a and 2b are calibration curves which result if the apparent Michaelis constant is reduced to 50 mM glucose by adding inhibitors 1 sets: once for the slope of the extinction-time curve 20 seconds after the start of the reaction, on the other hand for the fixed-time-intervals 60 resp. 300 seconds, again 20 seconds after the start of the reaction (paper feed 10 cm / min; measuring wavelength Hg 366 nm).
Für die praktische Durchführung des Verfahrens sind folgende Punkte wesentlich:The following points are essential for the practical implementation of the procedure:
1. Toleriert man einen Fehler von 3% weit oberhalb der Normalwertgrenze (etwa 5mMol/l Probe), liegt die Verdünnungsgrenze für die Winkelablesung bzw. das kleinere »time fixed«-lntervall bei 50mMol/l und damit sogar günstiger als bei verschiedenen herkömmlichen Endwertverfahren.1. If an error of 3% is tolerated well above the normal value limit (approx. 5 mmol / l sample), is the dilution limit for the angle reading or the smaller "time fixed" interval at 50mmol / l and thus even cheaper than with various conventional final value methods.
Im Falle des 300-Sekunden-Intervalls reicht die Linearität der Eichkurve bis etwa 20mMol/l aus. Unter Beibehaltung der Bedingungen kann man über diesen Wert aber nur wenig hinausgehen, weilIn the case of the 300 second interval, this is sufficient Linearity of the calibration curve up to about 20mmol / l. While maintaining the conditions you can go over but go only a little beyond this value because
2. die Extinktionsdifferenz für den Meßbereich routineüblicher Photometer zu groß wird, :tumal wenn man bei mechanisierter Messung die Eigenextinktionen der Proben beachten muß. Durch Änderung der Testbedingungen (z. B. höhere Inhibitorkonzentration, kleinere Probenmenge) kann die Empfindlichkeit jedoch herabgesetzt und zugleich der erfaßbare Konzentrationsbereich ausgedehnt werden.2. The extinction difference for the measuring range of routine photometers is too large: tumal if one has to consider the self absorbances of the samples with mechanized measurement. By change the test conditions (e.g. higher inhibitor concentration, smaller sample size) can affect the sensitivity however, the concentration range can be reduced and at the same time the detectable concentration range extended.
Im Falle der Winkelablesung muß die Empfindlichkeit gesteigert werden, was z. B. durch Messung näher am NADH-Absorptionsmaximum und/oderIn the case of angular reading, the sensitivity must be increased, which z. B. by measurement closer to the NADH absorption maximum and / or
durch Verminderung der Papiervorschubgeschwindigkeit geschehen kann. Auch bei dem 60-Sekunden-Intervall wird die Empfindlichkeit vorzugsweise erhöht. Die Empfindlichkeitsreserven des Verfahrens sind so groß, daß der einsetzbare Konzentrationsbereich auch bei kurzer Meßdauer nur von dem Meßbereich des Photometers bzw. der Ablesegrenze routineüblicher Winkelmeßgeräte limitiert wird. Eine Steigerung der Enzymkonzentration über die Angabe des Reagenzienherstellers hinaus ist dabei nicht notwendig. can be done by reducing the paper advance speed. Even with the 60 second interval the sensitivity is preferably increased. The sensitivity reserves of the procedure are so large that the usable concentration range only depends on the measurement range, even with a short measurement period of the photometer or the reading limit of routine angle measuring devices is limited. One It is not necessary to increase the enzyme concentration beyond the specifications of the reagent manufacturer.
Richtigkeit und PräzisionCorrectness and Precision
Die Richtigkeit des Verfahrens wurde an Hand der Wiederfindungsrate, durch Vergleichsmessungen mit der Hexokinase-Endwertmethode und mit Kontrollseren überprüft.The correctness of the procedure was verified on the basis of the recovery rate, by means of comparative measurements the hexokinase final value method and checked with control sera.
Die WiederSndungsrate (Tab. I) ist als sehr gut zu bezeichnen. Für die Parallelmessung mit der Hexokinase-Endwertmethode wurde Plasma eingesetzt, weil die Glucose-Dehydrogenase-Reaktion aus noch ungeklärter Ursache gehemmt wird, wenn in größerem Ausmaß Blutzellen in den Testansatz gelangen. (Vorversuche ergaben jedoch, daß die kinetische Bestimmung unter modifizierten Bedingungen auch mit überstand nach Enteiweißung durchgeführt werden kann, so daß eine Vollblut-Analyse ebenfalls möglich ist.) Die direkte Verwendung von Plasma (bzw. Serum) kommt einer schnellen Durchführung der Messung sowie allgemein simultanen kinetischen Bestimmungen mit anderen Substraten bzw. Enzymen entgegen.The recovery rate (Tab. I) can be described as very good. For the parallel measurement with the hexokinase end value method, plasma was used because the glucose-dehydrogenase reaction is inhibited for reasons that are still unknown if a large amount of blood cells get into the test mixture. (However, preliminary tests showed that the kinetic determination can also be carried out under modified conditions with supernatant after deproteinization, so that a whole blood analysis is also possible.) The direct use of plasma (or serum) means that the measurement can be carried out quickly and in general counteracts simultaneous kinetic determinations with other substrates or enzymes.
Wiederfindungsraten bei Einwaage von GlucoseRecovery rates after weighing in glucose
in Qualtrolin Qualtrol
Konzentrationsangaben in mMol Glucose 1 ProbeConcentration data in mmol glucose 1 sample
Aus den Ergebnissen der an 60 Humanplasmen (Konzentrationsbereich etwa 4 bis 16 mMol/1 Plasma, vgl. Fi g. 3, welche die Korrelation der Glucosebestimmung nach der direkten kinetischen Bestimmung und der indirekten Hexokinase-Endwertmethode zeigt) durchgeführten Vergleichsuntersuchungen errechnete sich die Regressionsgerade y = 0,1255 + 0,9272 x, der signifikant von Null verschiedene Korrelationskoeffizient r= +0,9965 und die Streuung um die Regressionsgerade Sxy = 0,2085. Nach diesen Werten besteht zwischen beiden Verfahren eine enge Korre lation. Die Ergebnisse für die kinetische Bestimmunj liegen jedoch — praktisch konzentrationsunabhängij — durchschnittlich 7% tiefer als die über den gleichet Standard berechneten Konzentrationswerte der End wertmethode. Dieser Unterschied steht mit dem Vo lumenverdrängi'ügseffekt bei Enteiweißung in Ein klang.The regression line y was calculated from the results of the comparative tests carried out on 60 human plasmas (concentration range approx. 4 to 16 mmol / l plasma, cf. = 0.1255 + 0.9272 x, the correlation coefficient significantly different from zero r = +0.9965 and the scatter around the regression line S xy = 0.2085. According to these values, there is a close correlation between the two methods. The results for the kinetic determination are, however - practically independent of the concentration - on average 7% lower than the concentration values of the final value method calculated using the same standard. This difference is consistent with the volume displacement effect during deproteinization.
Interessant ist ein Vergleich mit den zugehöriget Werten der Vollblutanalyse aus der Routine, die naclA comparison with the associated values of the whole blood analysis from the routine, which nacl
/IO/ IO
der Hexokinase-Endwertmethode mit Enteiweißung ermittelt wurden. Dabei lag der zur Berechnung verwendete Faktor 2,5% unter dem für wäßrige Glucose-Lösungen »theoretisch« gültigen. Gegenüber der kinetischen Analyse ergab sich ein durchschnittliches Minus von 14%, gegenüber der Plasma-Analyse nach den; Hexokinase-Endwertverfahren sogar von etwa 20%.the hexokinase final value method with deproteinization were determined. The one used for the calculation was there Factor 2.5% below that "theoretically" valid for aqueous glucose solutions. Opposite the kinetic Analysis showed an average minus of 14% compared to the plasma analysis the; Hexokinase final value method even of about 20%.
Analyse von KontrollserenAnalysis of control sera
Konzentrationsangaben und Standardabweichungen in mMo! Glucose/1Concentration data and standard deviations in mMo! Glucose / 1
Die an fünf Kontrollseren nach dem kinetischen Verfahren gefundenen Glucosekonzentrationen lagen bis auf Precinorm S stets etwas höher als die deklarierten Sollwerte (Tab. 2). Das mit Hyland-Control-Serum erhaltene Ergebnis kann vielleicht mit tiefen Sollwerten erklärt werden, wie sie für die Glucose-Oxidase-Methode typisch sind.The glucose concentrations found on five control sera by the kinetic method were With the exception of the Precinorm S, it is always slightly higher than the declared target values (Tab. 2). The one with Hyland Control Serum The result obtained can perhaps be explained with low setpoints, such as those for the glucose oxidase method are typical.
DeklariertDeclared
χ 3c ± 2sχ 3c ± 2s
Hyland Control Serum II 11,4')Hyland Control Serum II 11.4 ')
MonitrolII 11,62JMonitrolII 11.6 2 J
Precinorm S 5,95Precinorm S 5.95
Pathotrol 13,92IPathotrol 13.9 2 I.
Labtrol 5,1S2)Labtrol 5.1S 2 )
1I Glucose-Oxitiase. 1 I glucose oxidase.
2I HK G6P-DH-Endwertmethode mit Enteiweißung. 2 I HK G6P-DH final value method with deproteinization.
GefundenFound
10,5—12,2 10,7—12,5 5,35— 6,55 13,2—14,6 4,80— 5,5010.5-12.2 10.7-12.5 5.35-6.55 13.2-14.6 4.80-5.50
12 12 12 12 12 VK 12 12 12 12 12 VK
In Tabelle 2 ist zugleich die an Kontrollseren gefundene Präzision in der Serie angegeben, die nach unseren Erfahrungen mit der ebenfalls manuell durchgeführten Hexokinase-Endwertmethode vergleichbar ist.Table 2 also shows the precision found on control sera in the series that is after comparable to our experience with the hexokinase final value method, which was also carried out manually is.
Die Präzision von Tag zu Tag wurde an Precinorm S zu VK = 3,4% ermittelt.The precision from day to day was determined to Precinorm S to CV = 3.4%.
Die erzielbare Ausschaltung des störenden Einflusses von Fremdinhibitoren zeigen die in den nachstehend aufgeführten beiden Tabellen für zwei verschiedene Enzyme und jeweils zwei verschiedene Inhibitoren ermittelten Meßwerte.The elimination of the disruptive influence of external inhibitors that can be achieved is shown in the following listed two tables for two different enzymes and two different each Inhibitors determined measured values.
Kinetische Glucose-Bestimmung mit GlucDHKinetic glucose determination with GlucDH
(mMol)(mmol)
(uMol)(µmol)
Hemmunginhibition
82 3482 34
Die Tabellen 3 und 4 zeigen, d;aß der jeweils in einei Menge, die eine Hemmung von mindestens 60% her vorruft, vorliegende Inhibitor den Einfluß des zweiter Inhibitors, der in einer wenigen als 50% Hemmunj hervorrufenden Menge vorliegit, völlig unterdrück und nur die Hemmung des überwiegenden Inhibitor! zum Zuge kommt.Tables 3 and 4 show that each of the Amount that provokes an inhibition of at least 60%, the present inhibitor has the effect of the second Inhibitor, which is present in an amount that is less than 50% inhibiting, completely suppresses and only the inhibition of the predominant inhibitor! comes into play.
Kinetische Glucose-Blestimmung
mit Glucose-DehydrogenaseKinetic glucose measurement
with glucose dehydrogenase
Es wurde folgender TestansaU verwendet:The following test solution was used:
0,12MoI Phosphatpuffer, pH = 7,6,
40 mMol Sulfosalicylsäure,0.12Mol phosphate buffer, pH = 7.6,
40 mmol sulfosalicylic acid,
55 mMol EDTA,
15OmMoINAD,55 mmol EDTA,
15OmMoINAD,
0,86 mMol - 2,59 mMol Glucose,
1,8 U Glucose-Dehydrogenase,
,65 0,31 Mol KSCN bzw.0.86 mmol - 2.59 mmol glucose,
1.8 U glucose dehydrogenase,
, 65 0.31 mol KSCN or
l,4nMol Phloretin.1.4 nmoles of phloretin.
Die Meßwerte zeigt nachstehende Tabelle 5.The measured values are shown in Table 5 below.
4141
1818th
Glucose Ohne Inhibitor 031 Mol KSCNGlucose Without Inhibitor 031 Mol KSCN
(mMol) I E/min %Hem- 1 E/min %Hem-[S] mung mung(mmol) I U / min% inhibition 1 U / min% inhibition
1,4 nMol Phloretin1.4 nmoles of phloretin
I E/min % Hemmung Glucose Ohne Inhibitor 38.SmMoIKSCN 14 nMolI U / min% inhibition of glucose Without inhibitor 38.SmMoIKSCN 14 nmol
PhloretinPhloretin
ImMc!)ImMc!)
75,4
54,0
40,6
31,175.4
54.0
40.6
31.1
10,5 8,0 4,510.5 8.0 4.5
77,5 80,6 80,3 85,577.5 80.6 80.3 85.5
62,5 45,5 30,0 24,062.5 45.5 30.0 24.0
17,1 15,8 26,0 22,817.1 15.8 26.0 22.8
0,31 Mol KSCN + 1,4 nMol Phloretin .1 £/min 16,0 1.0,5 7,00.31 moles KSCN + 1.4 nmoles phloretin. £ / min 16.0 1.0.5 7.0
% Hemmung 78,8 3,45 2,59 1,72 1,29 0,86% Inhibition 78.8 3.45 2.59 1.72 1.29 0.86
5,0 Beispiel 55.0 Example 5
80,6 82,7 83,980.6 82.7 83.9
Kinetische Glucose-Bestimmung mit Glucose-DehydrogenaseKinetic glucose determination with glucose dehydrogenase
Es wurde folgender Testansatz verwendet: 90 mMol Phosphatpuffer, pH = 7,6, 40 mMol Sulfosalicylsäure, 55 mMol EDTA,The following test batch was used: 90 mmol phosphate buffer, pH = 7.6, 40 mmol sulfosalicylic acid, 55 mmol EDTA,
4,65 mMol NAD,4.65 mmol NAD,
0,86—3,45 mMol Glucose, 95 mU Glucose-Dehydrogenase,
38,5 mMol KSCN,
14 nMol Phloretin.0.86-3.45 mmol glucose, 95 mU glucose dehydrogenase, 38.5 mmol KSCN,
14 nmoles of phloretin.
Die Versuchsergebnisse zeigt Tabelle 6. Tabelle 6The test results are shown in Table 6. Table 6
Beispiel 6 Hemmung der Uricase Es wurde folgender Testansatz verwendet:Example 6 Inhibition of Uricase The following test approach was used:
96 mMol Boratpuffer, pH = 9,5, 114 — 7,6 (iMol Harnsäure, 29 mU Uricase/ml, 0,5 Mol KSCN, 0,02 mMol Xanthin.96 mmol borate buffer, pH = 9.5, 114 - 7.6 (iMol uric acid, 29 mU uricase / ml, 0.5 mol KSCN, 0.02 mmol xanthine.
Die Versuchsergebnisse zeigt Tabelle 7, TabelleThe test results are shown in Table 7, Table
Uricase Ohne Inhibitor 0,5 Mol KSCN 0,02 mMolUricase without inhibitor 0.5 mol KSCN 0.02 mmol
XanthinXanthine
(μΜοΙ) ΙΕ/min % Hem- ΙΕ/min %Hem- ΙΕ/min %Hem-[S] mung mung mung(μΜοΙ) ΙΕ / min% Hem- ΙΕ / min% Hem- ΙΕ / min% Hem- [S] mung mung
Phloretin14 nmoles
Phloretin
Hem-U 38
Hem-
45mung 7.6
45
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