DE2432518A1

DE2432518A1 - Arzneimittel und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2432518A1
Application number: DE2432518A
Authority: DE
Inventors: Michael Anthony Cawthorne; Joseph Green
Original assignee: Beecham Group PLC
Current assignee: Beecham Group PLC
Priority date: 1973-07-05
Filing date: 1974-07-04
Publication date: 1975-01-30
Also published as: AU7067574A; US4055635A; GB1479268A; CA1030871A; IL45103A0; BE817126A; IE40434L; FR2235699A1; FR2235699B1; JPS5031019A; IL45103A; ZA743934B; ES428053A1; IE40434B1; NL7408985A

Description

Brentford, Middlesex, England

"Arzneimittel und Verfahren zu seiner Herstellung^

Priorität: 5„ «Juli 197J - Großbritannien - Hummer 32 071/73'

Die Erfindung; bezieht sich auf bestimmte Arzneimittel, insbesondere auf fibrinlosende Arzneimittel,

Im Blut liegt eine als Fibrinogen bekannte proteinhaltige Verbindung vor. Unter der Einwirkung eines oder mehrerer Enzyme wird Fibrinogen in Fibrin überführt, die die Grundsubstanz der Blutgerinsel bildet,_; wenn nicht diese Gerinsel durch die Einwirkung, von fibrinlösenden; Enzymen rasch zerteilt oder aufgelost werden,. Man. · nimmt· an, daß dieses Auflösen des Fibrins durch das· Enzym Plasmin (- Fibrinolysin) erfalgen kann,, das selbst durch, eine bestimmte enzyrna tische Einwirkung: auf eine prOteinhaltlge Verbindung, nämlich Plasminogen,, das: selbst Im Blut vorliegt, freigesetzt wird« Daher enthält Blut normalerweise sowohl Fibrinogen als auch Pias-, mlnogen,, welchietzi;ez-_,3 durch die Wirkung eines Äktivators zur Piasminerzeugung abgebaut wird. Das· derart freigesetzte Plasmin

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kann dann das Auflosen des Gerinsel bildenden Fibrins bewirken, das aufgrund des Abbaus des Fibrinogen^ entstanden ist. Die Abbauprodukte des Fibrins sind im Blut lösliche Peptide und vermögen daher Blutgerinsel zu zerteilen.,

Bei Thrombose oder ähnlichen Erkrankungen sind eine oder mehrere dieser Stufen, unwirksam gemacht worden, und es sind zahlreiche Anstrengungen unternommen worden, die Ursache dieser Erkrankungen aufzuklären, ein Zerteilen der Fibrinblutgerinsel zu beschleunigen, die sich gebildet haben können, und fibrinlosende Arzneimittel zu. erzeugen.:

Plasmin Ist ein proteolytlsches Enzym, dessen spezifische Eigenschaft nicht ohne Beziehung zu bestimmten anderen proteolytischen Enzymen ist« Ein derartiges proteolytischest Enzym könnte das fibrinlösende System an drei Stellen beeinflussen:;

(a) Es könnte Fibrinogen zu Fibrin abbauen und dadurch die Bildung _von Blutgerinseln verursachen;

(b) es könnte Fibrin In lösliche Peptidprodufcte auf losen, und

(c) es konnte Plasminogen, zur Bildung: von Plasmin aktivieren,, das die gewünschte Auflösung bewirkt.

Die zuletzt genannte Reaktion durfte die Spaltung; einer einzelnen Arginyl-Valyl-Blndung zur Folge haben. Die aufspaltende Wirkung eines solchen Enzyms wird hier als peptidspaltende AlEtIvItEt bezeichnet.: Eine derartige Aktivität kann in Form einer esterspaltenden Aktivität des Enzyms bei Verbindungen mife niederen Molekulargewichten bestirnt ■ werden und wird üblicherweise spektrophotoraetrisch unter verwendung: synthetischer verbindungen^ wie des Benzoyl-Arglnln-Äthylesters oder des Tosyl-Arglnln-Methy!esters,

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gemessen werden. Eine derartige peptidspaltende Wirkung, die zur Förderung der gewünschten Freisetzung von Plasmin erwünscht ist, ist grundsätzlich von der allgemeinen proteolytischen Aktivität zu trennen, die unerwünscht ist, da sie zu einem unkontrolliertem proteolytischen Abbau in vivo führt. Eine solche allgemeine proteolytische Aktivität kann an der Hydrolyse von reinen Proteinen, wie c.asein, gezeigt werden. Eine derartige Aktivität wird hier als caseinspaltende Aktivität bezeichnet.

Zwei Proteine, die angeblich eine fibrinlösende Aktivität besitzen sollen, sind allgemein erhältlich. Jedoch besitzen sie Nachteile. So wirkt Streptokinase als Antigen, und sogar das gereinigte Enzym greift die Antikörper an, die sich bei Patienten gegen Streptokokkeninfektionen gebildet haben. Bevor daher eine wirksa-

me Therapie begonnen werden kann, muß der Antikörper-Titer neutralisiert werden. Obwohl Streptokinase als Plasminogen-Aktivator wirken dürfte, besitzt sie selbst keinerlei peptide- oder esterspaltende Wirkung. Diese Aktivität kann infolge Bildung eines Komplexes zwischen der Streptokinase und dem Plasminogen und/oder Plasmin vorliegen, wobei die Komplexe als unmittelbare Aktivatoren für weitere Mengen Plasminogen angesehen werden können. Das zweite verfügbare fibrinlösende Enzym ist Urokinase. Obwohl sie nicht als Antigen wirkt, ist sie doch sehr teuer und im allgemeinen nur in kleinen Mengen durch Isolieren aus menschlichem Harn erhältlich. Angeblich soll sie als Plasminogen-Aktivator wirken.

Aufgabe bei vorliegender Erfindung war es daher, ein Enzymsystem ausfindig zu machen, das eine fibrinlösende und/oder plasminogen-

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eine geringe caseinspaltende Wirkung besitzt. Es vmrde nun gefunden, daß die Bildung von wasserlöslichen Komplexen proteolytischer Enzyme, die an polymere Verbindungen gebunden sind, zu den gewünschten Eigenschaften führen kann.

Wasserlösliche Enzymkomplexe sind bereits früher in der Literatur beschrieben worden, doch scheint ihre Verwendung für ^; medizinische Behandlungszwecke bisher noch nicht in Betracht gezogen worden zu sein, insbesondere nicht für solche Zwecke, wo der Komplex in die Bl,utbahn injiziert wird, wie es für eine rasche in vivo-Verteilung von"Blutgerinseln erforderlich ist.

Gegenstand der Erfindung sind.dementsprechend Arzneimittel, die durch einen Gehalt an einem wasserlöslichen Komplex eines kovalent an ein Polymeres gebundenes proteolytisches Enzym gekennzeichnet sind.

Für eine plasminogenaktivierende Wirkung ist das angewendete proteolytische Enzym infolge seiner eindeutigen spezifischen Peptidaseeigenschaft vorzugsweise Trypsin, doch ist die Verwendung ähnlicher Enzyme, wie Chymotrypsin, Bromelain und Papain, vom Standpunkt einer direkten fibrinlösenden Aktivität ebenfalls möglich. Es können auch Komplexe verwendet werden, die aus im

Handel erhältlichen proteolytischen Enzymen hergestellt worden sind,. z.B. Pronasej einem proteolytischen Enzym mit breitem Wirkungsspektrum, das aus Streptomyces griseus isoliert worden ist, und Brinase, die aus Aspergillus oryzae isoliert worden ist. Beide Enzyme besitzen fibrinlösende und plasminogenaktivierende Wir-

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ORlGiHALINSPECTED

kungen.

Das Polymere ist vorzugsweise wasserlöslich und mittels in vivo-Vorgängen verdaubar. Deshalb verwendet man vorzugsweise Polysaccharide, wie Dextran, Dextrine, Cellulose oder Stärke. Dextrane sind bevorzugt, insbesondere mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 500 000, z.B. solche Dextrane, die als "Τ4θ" und "ΐγο" bezeichnet werden.

Gegebenenfalls können die Polysaccharide durch eine Umsetzung mit einem Modifizierungsmittel, z..B. Epichlorhydrin, modifiziert werden. Es können auch carboxymethyl-, hydroxyäthyl- oder aminoäthylmodifizierte Cellulose oder eine teilweise abgebaute Stärke als Polysaccharide verwendet werden. Es ist auch möglich, das Enzym an ein wasserunlösliches Polymer, wie vernetztes Dextran, zu binden und dann den erhaltenen Komplex mittels geeigneter Abbauverfahren wasserlöslich zu machen, z.B. durch eine partielle Hydrolyse oder durch Umsetzen eines vernetzten Dextrans mit Dextranase.

Es ist weiterhin gefunden worden, daß es erfindungsgemäß besonders zweckmäßig ist, als Polymere modifizierte Saccharide oder Oligosaccharide, wie Sucrose, Dextrose oder Lactose, zu verwenden. Ein besonders vorteilhaftes Polymeres ist ein im Handel erhältliches Sucrose-Epichlorhydrin-Mischpolymerisat (FICOLL), insbesondere niif-öinem Molekulargewicht von etwa "400 000·.

Es ist auch möglich, synthetische wasserlösliche Polymere, wie Polymere von Polyvinylalkohol und Mischpolymere von Acrylsäure oder Maleinsäureanhydrid mit Äthylen, Styrol, Methylvinylather,

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Diylnyläther oder Vinylacetat, einzusetzen. Derartige Polymere sind z.B. in der DT-OS 1 9^8 177 und DT-OS 1 9^8 298 und in den OB-PS 1 290 701 und 1 223 28I beschrieben.

Eine zweckmäßige Gruppe von wasserlöslichen Mischpolymerisaten sind die Methylvinyläther-Maleinsäureanhydrid-Mischpolymerisate, insbesondere mit einem Molekulargewicht von etwa 250 000 ("GAN-TREZ AN", insbesondere "GANTREZ AN 119")- Die Maleinsäureanhydrid-Mischpolymerisate können mit dem proteolytischen Enzym entsprechend den allgemeinen Verfahren umgesetzt werden, wie sie in der GB-PS 1 290 701 beschrieben sind. Zum Beispiel kann ein solches Polymerisat in Gegenwart einer starken Pufferlösung oder anderer Mittel, um einen neutralen pH-Wert aufrecht zu erhalten, umgesetzt werden.

Die wasserlöslichen Enzymkomplexe für den erfindungsgemäßen Anwendungsbereich können nach beliebigen bekannten Verfahren zum Anlagern von Enzymen an Polymere hergestellt werden, vorausgesetzt, daß der erhaltene Komplex als wasserlöslich angesehen werden kann. Unter dem Ausdruck "wasserlöslich" wird erfindungsgemäße auch ein solcher Komplex verstanden, der in Wasser dispergierbar ist, um kolloidale Lösungen zu liefern. In solchen Fällen müssen die Teilchen einen Durchmesser unter 2 μ haben. Derartige Umsetzungsverfahren sind z.B. in der GB-PS 1.325 912 beschrieben, einschließlich der Kupplung des proteolytisehen Enzyms an das Polymere unter Verwendung von Reaktionsmitteln, wie Halogencyan, insbesondere Bromcyan, s-Triazonen/ ir.5besondere 2-Amino-4,6-dichlor-s-triazin, Acyl-aziden, Diazoniumverbindungen, z.B. 2-Hydroxy~j5-(p-diazophenyl)-propyläther, organische Cyanate, wie Phenyleyanat, und

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Diorganocarbodiimide. IIü.u_'ig werden derartig- j.„.l.:..u:..:; -:.:.'.:. :■! :.,„.--erst mit dem Polymeren umgesetzt, um bei diesem reaktionsfähige Gruppen zu schaffen, die dann mit dem Enzym reagieren können. In einigen Fällen können die Enzyme zuerst mit dem Polymer umgesetzt werden, z.B. wenn es bestimmte aktive Gruppen, wie Anhydridbindungen, Aminoäthyl-, Hydroxyäthyl- oder Carboxymethyl-Substituenten enthält, oder derart modifiziert worden ist, daß es diese Gruppen aufweist. Dialdehyde, wie Glutaraldehyd und Glyoxal können ebenfalls zur Bildung von Brückgliedern zwischen dem Enzym und dem Polymer eingesetzt werden, vorausgesetzt, daß das Polymere freie Aminogruppen enthält. Um diese Brückenglieder zu verlängern, können aliphatische Diamine zusätzlich zum Dialdehyd mitverwendet werden.

Das Enzym ist an das Polymere in einer solchen Menge gebunden, daß das Gewichtsverhältnis von Polymer zu Enzym innerhalb des Bereiches von 0,1 : 1 bis 100 : 1, vorzugsweise von 2 : 1 bis 50 : 1, liegt.

Es ist, in hohem Maße wünschenswert, daß der wasserlösliche Enzymkomplex, der nach einem der vorbeschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, dann gereinigt wird, so daß er im wesentlichen frei von nicht umgesetztem Enzym ist. Dies ist deshalb erforderlich, weil - wie bereits beschrieben - das freie proteolytische Enzym häufig in vivo unerwünschte Reaktionen zeigt. Zum Beispiel kann es allergische Reaktionen durch eine Umsetzung mit im Blut des Patienten vorhander "ntikörpern hervorrufen. Eine solche Reinigung wird vorzugsweise unter Anwendung physikalischer Trennmethoden durchgeführt, die chemische Stoffe aufgrund unterschiedli-

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ORIGINAL INSPECTED

eher Molekülgröße trennen, denn der Enzymkomplex hat ein viel höheres Molekulargewicht als das freie Enzym. Tatsächlich weist das mit dem Polymerkomplex gebundene Enzym ein Molekulargewicht vorzugsweise von 10 000 bis 500 000 auf. Deshalb werden die für den angegebenen Zweck einzusetzenden Enzymkomplexe vorzugsweise einer Ultrafiltration oder Gelfiltration unterworfen, wodurch die freien Enzyme entfernt werden, die ein bedeutend niedrigeres Molekulargewicht als die entsprechenden Komplexe haben. Ein weiteres Reinigungsverfahren besteht in der Anwendung einer Dialyse.

Wenn das freie Enzym möglicherweise schädliche Antikörper bildet, kann der rohe Enzymkomplex darüber hinaus durch eine Säule geschickt werden, die die gegen das freie Enzym reaktionsfähigen spezifischen Antikörper enthalten und in der solche Antikörper vorher an einem Träger, wie Agarose oder einem vernetzten Dextran, fixiert sind. Das freie Enzym, jedoch nicht der Enzymkomplex, reagiert mit dem fixierten Antikörper, worauf der Enzymkomplex durch die Säule läuft und deshalb wie gewünscht gereinigt wird.

Die Enzymkomplexe werden vorzugsweise sterilisiert, indem sie ein Seitz-Filter passieren, und werden dann in gewünschter Weise in einem gefriergetrockneten, d.h. lyophilisierten Zustand erhalten.

Die Komplexe nach vorliegender Erfindung haben die nachstehenden Vorteile gegenüber den entsprechenden nicht komplexgebundenen Enzymen:

(a) Eine erhöhte biologische Halbwertszeit und/oder

(b) einen niedrigeren Grad einer Plasmahemmung und/oder

(c) eine geringere Fähigkeit, Antikörper zu bilden.

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Die erfindungsgemäßen Arzneimittel liet-^n in ¹⁷VTIr. von Eir.j;el-' sierungen vor, d.h., daß sie eine vorbestimmte Menge des Enzymkomplexes enthalten. Vorzugsweise wird diese Menge in Aktivitätseinheiten angegeben, so daß der Arzt die geeignete Dosis in Abhängigkeit vom Grad der Fibrinolyse verschreiben kann, die er bei dem Patienten zu erreichen wünscht. Dies hängt teilweise von dem Ausmaß seiner Beurteilung ab, ob sich in übermäßiger Menge Fibringerinsel im Blut des Patienten gebildet haben. Deshalb liegen die erfindungsgemäßen Arzneimittel vorzugsweise in verschlossenen
Ampullen vor, die eine vorbestimmte Menge des sterilen, gefriergetrockneten Enzymkomplexes enthalten.

Zum Gebrauch müssen die erfindungsgemäßen fibrinlösenden Arzneimittel in eine für Injektionszwecke geeignete Form überführt
werden, entweder in der Form, wie sie verkauft werden, oder
noch allgemeiner nach Auflösen in einem geeigneten Lösungsmitteil Vorzugsweise werden daher die vorgenannten verschlossenen
Ampullen hergenommen und auf gebrochen, und dann wird deren - Inhalt in sterilem oder pyrrogenfreiem Wasser oder in isotonischer Kochsalzlösung zur Verabreichung durch Injektion in den Blutkreislauf des zu behandelnden Patienten gelöst oder suspendiert. Gegebenenfalls können die Einzelsdosierungen nach ider Erfindung aus vorgefertigten Ampullen bestehen, die Lösungen des Enzymkomplexes einer vorbestimmten Konzentration in Wasser oder isotonischer Kochsalzlösung enthalten. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden deshalb in einer grundsätzlich anderen Weise als die Mundspülmittel nach der DT-OS 1 ^o/lQ ?S8 zubereitet, denn die bekannten Mundsp'ülmittel sind nicht für Injektionszwecke geeignet oder können nicht in injizierbare Lösungen überführt werden, und sie enthalten auch

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keine vorbestimmte Dosis des. Enzymkomplexes.

Die Wirksamkeit einiger Enzymkomplexe für die erfindungsgemäßen Arzneimittel ist in den nachstehenden Beispielen veranschaulicht.

Beispiell

Herstellung eines wasserlöslichen Trypsin-Komplexes 10 g eines Methylvinyläther-Maleinsäureanhydrid-Mischpolymerisats mit einem Molekulargewicht von 250 000 werden zu JiOO ml einer O,2m-Phosphatpufferlösung vom pH J₃ 4 gegeben. Das Gemisch wird etwa 5 Minuten zur Erzeugung einer Suspension gerührt. Dann fügt man eine Lösung von 1 g Trypsin in 4o ml Phosphatpufferlösung zu und rührt das Gemisch 2h Stunden bei 4°C. Die erhaltene Lösung wird nach Verdünnen mit viel entsalztem Wasser durch wiederholtes Ultrafiltrieren durch eine Membran für ein begrenztes Molekulargewicht oder ein Molekulargewicht von 300 000 gereinigt/Dadurch wird nicht umgesetztes Trypsin, das durch die Membran dringt, vom Komplex getrennt, welchletzterer in den Ultrafiltrationszellen zurückbleibt. Dieses Verfahren dient auch zum Abtrennen der Phosphatpufferlösung vom Komplex . Dann wird der Komplex gegen entsalztes Wasser dialysiert. Schließlich wird der Komplex gefriergetrocknet. Man erhält 8,9 g weiße Flocken. Der Proteingehalt des Komplexes wird unter Verwendung von Trypsin als Standard nach der Methode von Lowry und Mitarbeitern bestimmt. Er beträgt Ki ^g

Die peptidespaltende Aktivität des Komplexes" wird aufgrund seiner esterspaltenden Fä:.^ö.ceit gemessen, N-Benzoyl-arginin aus N-3en zoyl-arginin-äthylester freizusetzen. Bei diesem Versuch hatte

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jedes mg des Komplexes eine Aktivität, die 125 ;ag Trypsin äquivalent war. Demzufolge hat der Komplex eine größere esterspaltende Aktivität und auch eine größere peptidespaltende Aktivität je pg Protein als freies Trypsin.

Die caseinspaltende Aktivität des Trypsins und des Komplexes werden nach dem Verfahren von Remmert & Cohen in "j.Biol.Chem." l8l (I9^9)i Seiten 431-448, gemessen. Jedes mg des Komplexes hätte eine Aktivität, die 10 μg des Enzyms äquivalent war. Somit ist die caseinspaltende Aktivität des Komplexes in bezug auf die Aktivität des freien Trypsins herabgesetzt worden.

Die fibrinlösenden Aktivitäten von Trypsin und vom Komplex- werden aufgrund ihrer Fähigkeit gemessen, Plasmagerinsel aufzulösen. Menschliches Plasma, das eine Spur von mit Jod ^ markiertem Fibrinogen enthält, wird mittels Thrombin zum Gerinnen gebracht. Die Gerinsel werden dann in einer Lösung des Enzyms bzw. des Komplexes inkubiert. Es wird dann das aus dem Gerinsel in das Medium freigesetzte markierte Jod ^ gemessen (vgl. Tabelle I). Der Komplex ist verhältnismäßig stärker aktiv als freies Trypsin. Jedes mg des Komplexes ist 320 ug Trypsin äquivalent.

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Tab e. lie I

Vergleich von Trypsin und Trypsin-Komplex Untersuchung ■ Trypsin-Äquivalent Verhältnis ■

Proteingehalt 47 p

esterspaltende Wirkung
auf N-Benzoyl-argininäthylester 125 ug/mg 2,5

Fibrinolyse von Plasmagerinsel 300 pg/mg 7,0

caseinspaltungstest 10 Jig/mg 0,2

Aus der Tabelle I ist ersichtlich, daß der wasserlösliche Enzymkomplex eine fibrinlösende Aktivität besitzt, die 7 mal der des freien Enzyms entspricht, und eine esterspaltende Aktivität aufweist, die 2,5mal derjenigen des freien Enzyms entspricht, jedoch eine caseinspaltende Aktivität, die nur 1/5 derjenigen des freien Enzyms beträgt. Somit ist dargelegt, daß die gewünschte Kombination von Eigenschaften - wie zuvor angegeben - erreicht worden ist.

Beispiel2 Trypsin-Komplex mit Dextran "T²K)" (I)

1 g eines Dextrans mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 4o 000 (gemessen durch Gelfiltration) wird in 10 ml einer 0,1m- " Natriumcarbonatpufferlösung vom pH 9,0 gelöst. Zu dieser Lösung wird 1 g Bromcyan gegeben, das in 30 ml Wasser gelöst ist. Das Gemisch wird bei rlc^uitemperatur gehalten und 10 Minuten gerührt,-währenddessen der pH-Wert durch Zugabe von 2-m Natronlauge auf

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pH 9 konstant gehalten wird.-Nach 10 Minuten wird das Reaktionsgemisch mit 200 ml Aceton versetzt, worauf das mit Bromcyan aktivierte Dextran ausfällt. Der Niederschlag wird abfiltriert und an der Luft getrocknet. Man erhält ein feines Pulver, das sich in Wasser rückständsfrei löst.

105 mg des mit Bromcyan aktivierten Dextrans wird mit 98 mg Trypsin durch Vermischen der Lösungen beider Substanzen in Bicarbonatpufferlösung vom pH 9,0 umgesetzt. Die Mischungen v/erden 16 Stunden langsam bei 4°C gerührt. Dann trennt man den Trypsin-Dextran-KompLex vom freien Trypsin, chromatographisch an einer Säule mit vernetzten! Dextran. Nach dem Gefriertrocknen erhält man den Trypsin-Dextran-Komplex als flockiges weißes Pulver und in einem Gewicht von 22,5 mg.

Der-Komplex hat einen Proteingehalt, der 22 y.g Trypsin je'mg des Komplexes' äquivalent ist. Die fibrinlösende Aktivität des Komplexes wird mit derjenigen von Trypsin durch Messen der Fähigkeit jeder der Lösungen verglichen, während einer lOminütigen

^ I

Inkubationszeit aus durch Thrombin verursachten Plasmagerinseln,

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die mit Jod -Fibrinogen markiert worden sind, die Radioaktivität in die Lösungen übertreten zu lassen (vgl. Tabelle II).

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_i4_

T a be l.l e II

Wirkung von Trypsin und Trypsin-Komplex auf die Fibrinolyse in vitro

1OR freigesetztes J ^J nach lOminü

tiger Inkubation (Auflösung)

Blindversuch	10Ö9
Trypsin 4o ;ig/ml	1737
70 /ig/ml .	2184
100 jag/ml	2279
150 jig/ml	2689
200 /ag/ml	3081
Trypsin-Dextran- Komplex _5Q0 ^_g/ml
(äquiv. 11 ^g Trypsin/ml)	993
1000 /ag/ml (äquiv. 22 ug Trypsin/ml)	2114
2000 jug/ml (äquiv. 44 jig Trypsin/ml)	. 5094

Der Trypsin-Dextran-Komplex hat eine 2,5mal größere fibrinlösende Aktivität auf ein Protein als freies Trypsin, wobei 2 mg des Komplexes annähernd ein 'Scotein äquivalent enthalten, das 4o jig Trypsin entspricht.

Beispiel.3 Pronase-Komplex'mit Dextran "Τ4θ" (I)

6 g Dextran mit einem'Molekulargewicht von etwa 4o 000 werden in 600 ml Wasser gelöst und mittels 2n-Natronlauge auf einen pH 11,00 eingestellt. Dann werden 1,8 g Bromcyan und schließlich weitere Natronlauge zugegeben, um bis zur Beendigung der Reaktion einen pH-Wert von 11,00 aufrecht zu erhalten. Dann wird die Lösung mit-

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tels 2n-Salzsäure auf einen .pH-Wert von 8,5 eingestellt. 200 ml dieser Lösung werden mit 200 mg Pronase vemLscht und l6 Stunden bei 4°C gerührt. Das Produkt wird unter Verwendung einer Membran, die Substanzen mit einem Molekulargewicht über 10 000 zurückhält, auf ein Volumen von etwa 5 ml ultrafiltriert. Nach dem Gefriertrocknen der Lösung erhält man 2,114 g eines weißen Pulvers. Die Reinigung von 1 g-"dieses Pulvers erfolgt mittels Gelfiltration an einer Säule (3 χ 4θ cm) mit vernetztem Dextran und Eluieren mit 0,lm-Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7*0. Die eluierten 'proteinhaltigen Fraktionen werden, bevor die freie Pronase eluiert wird, wie oben angegeben auf ein Volumen von 10 ml ultrafiltriert und dann gefriergetrocknet. Man erhält 0,88 g eines weissen Pulvers.

Der Proteingehalt dieses Pulvers beträgt J>2 μ& Pronase je mg des Komplexes.

Die fibrinlösende Aktivität des -Komplsxe.s wird wie vorstehend beschrieben durch Freisetzen von radioaktiv markierten Peptiden aus Jod -Fibrinogen-enthaltenden menschlichen Plasmagerinseln gemessen. Durch Verwendung von antikoaguliertem menschlichen Plasma anstelle der Pufferlösung im äußeren Medium kann die Plasmainhibierung der fibrinlösenden Enzyme bestimmt werden (Tabelle III).

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	16 -	III	(2,4)	2432518	(2,2)
Tab	eile		(5,8)		(3,2)
Wirkung von Pronase und			(10,5)	eine	(3,4)
Fibrinolyse in vitro	Pronase-Dextran-Komplex auf	(25,4)		(3,6)
			freigesetztes Jod¹²⁵/Min. (30minütige Inku bation in Plasma- Ιο sung)
Blindversuch		(4,2)	683	(4,1)
Pronase 20 ug/ml	freigesetztes Jod¹²⁵/Min. (30minütige Inku bation in Puffer- 'lösung)		962
50 /ig/ml	732	(5,4)	1020	(6,4)
100 /ig/ml	1757	(7,0)	1101	(6,4)
Pronase-Dextran-Komplex	3171	(10,2)		(8,2)
8 /ig/ml	7624		1243
(Pronas e-fiquivalent)
16 /Ug/ml .	1279	1916
32 ^g/ml		I9I6
64 ^ig/ml	1621	2459
2180
3082

(die Zahlenangaben in Klammern geben die Gesamtmenge freigesetates Jod¹²5 in % an)

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Tabelle IV

Wirkung von Pronase-Dextran-Komplex auf eine Fibrinolyse in vitro In Gegenwart von zugegebenem Plasminogen

freigesetztes Joa¹²-^/iAin. j50minütige Inkubation in Pufferlösung in Gegenwart von Plasminogen bei:

0,4 Casein-Ein- 1,6 Casein-Einheiten/ml heiten/ml

Blindversuch	1252	(4,1)	1163	(3,8) .
Pronase-Dextran-Komplex 8 jag/ml	1624 .	(5,3)	1664	(5,4)
(Pronase-A'quivalent) 16 /ig/ml	2031	{6,6)	4323	(14,1)
32 jxg/ml ■	3305	(10,8)	5953	(19,5)
64 ^ug/ml	4173	(13,6)	9221	(30,1)

(die Zahlenangaben in Klammern geben die Gesamtmenge freigesetztes Jod¹²5 in % an)

Die caseinspaltende Aktivität der in Beispiel 10 gemessenen Zubereitung ist annähernd gleich derjenigen, die mit einer äquivalenten Menge unmodifizierter freier Pronase hergestellt worden ist. Es ist jedoch eine ersichtliche Erhöhung beider esterspaltenden Aktivität des Komplexes (Beispiel 9) zu verzeichnen. Bei dieser Zubereitung muß die Wirkung des Zusatzes der Pronase zu Dextran eine Verbindung mit im wesentlichen der gleichen caseinspaltenden Aktivität und fibrinlösenden Aktivität in einer Pufferlösung wie freie Pronase erzeugt werden, doch·mit einer bedeutend stärker herabgesetzten Hemmung der fibrinlösenden Wirkung durch Plasma. Die Wirkung des exogenen Plasminogen auf eine Fibrinolyse mittels des Komplexes zeigt, da3 die Verbindung als Plasminogen-Aktivator wirken kann (Tabelle IV).

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B e i s ρ i e 1 4

Trypsin-Komplex mit Dextran "T²K)" (II)

1 g Dextran vom Molekulargewicht 4θ 000 wird in 100 ml V/asser gelöst und mit 0,5 g Bromcyan bei pH 11,0 wie bereits beschrieben aktiviert. Der pH-Wert der Lösung wird auf 8,5 eingestellt. Dann werden 200 mg Trypsin und 100 mg Benzamidin-hydroehlorid zugegeben > um eine Autolyse zu vermeiden. Die Lösung wird 16 Stunden bei 4°C gerührt und dann in Gegenwart der vorstehend genannten Membranen auf ein Volumen von 10 ml ultrafiltriert. Wie weiterhin vorstehend angegeben worden ist, wird der Komplex an einer Säule mit vernetzten! Dextran gereinigt. Die den Komplex enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, ultrafiltriert und gefriergetrocknet, Man erhält 1,16 g weißes Pulver mit einem Gehalt an 126 ^Ug Protein je mg des Komplexes. Die fibrinlösende Wirkung ist in Tabelle V angegeben.

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Tabelle V

Fibrinlösende Wirkung von Trypsin und Trypsin-Komplex an Dextran "Τ4θ" (II) in vitro

freigesetztes Jod¹²⁵/Min.

(j5Ominütige Inku- (30minütige Inkubation in Puffer- bation in Plasmalösung). lösung)

Blindversuch	Blindversuch	778	(2,20)	1114	(3,1).
Trypsin 25 ug/ml	Trypsin-Dextran-Komplex	2125	(6,0)	-
50 ug/ml	(Trypsin-A'quivalent)	4554	(12,8)	-
75 ug/ml	30 ^ig/ml	4064	(11,4)	-
100 /ig/ml	63 ^g/ml	7665	(21,6)	1166	(3,3)
500 ,ug/ml	126 jag/ml	-		1206	(3,4)
750 ]xg/ml	252 ^g/ml	-		1358	(3,8)
1110	(3,6)	885	(2,8)


1517	(4,9)	-
1462 ■	(4,7)	1006	(3,2)
1937	(6,2)	1084	(3,5)
4836	(15,5)	1280	(4,1)

(die Zahlenangaben in Klammern geben die Gesamtmenge freigesetztes Jod¹²^ m.% an)

Die caseinspaltende Wirkung des Komplexes ist in Fig. 1 dargestellt und beträgt annähernd 60 Prozent derjenigen des freien Trypsins. Bei die-- ■ Beispiel kommt die Reduktion der caseinspaltenden Aktivität auf die Bindung an. Dextran gleich einer Reduktion der fibrinlösenden Aktivität, und es wird eine Retention

409885/128 7:

der Hemmung durch Plasma vermerkt. Die esterspaltende Aktivität ist jedoch erhöht (Beispiel 9).

Beispiels

Chymotrypsin-Komplex an Dextran "Τ4θ"

1 g Dextran vom Molekulargewicht 4θ 000 wird in 100 ml Wasser gelöst und mit 0,5 S Bromcyan bei pH 11,00 wie vorstehend beschrieben vermischt. Nach Beendigung der Reaktion wird der pH-Wert mitteils 2n-Salzsäure und O^m-Natriumbicarbonatlösung auf 8,5 eingestellt. Dann werden 200 mg Chymotrypsin und 200 mg Benzaraidinhydrochlorid zugegeben.. Die Lösung wird 16 Stunden bei 4°C gerührt, dann wie bereits beschrieben auf ein Volumen von 5 ml ultrafiltriert und schließlich an einer Säule mit vernetztem Dextran gereinigt. Die den Komplex enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und dann durch Ultrafiltrieren eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 1,56 g weißes Pulver,mit einem Gehalt an den Puffersalzen und mit einem Proteingehalt von 73 Mg/mg. Die fibrinlösende Aktivität geht aus. Tabelle VI hervor.

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Tabelle!

Fibrinlösende Wirkung von Chymotrypsin und Chymotrypsin-Komplex an Dextran "Τ4θ" in vitro

freigesetztes Jod -\ (30minütige Inkubation in Pufferlösung)

Blindversuch	14,6	/ig/ml	1264	(2,43)
Chymotrypsin 20 }ig/ml	36,5	jUg/ml	1675	(3,22)
50 /ig/ml	. 73,0	Jig/ml	2828	(5,44)
100 ;ig/ml	146,0	jug/ml	4384	(8,44)
200 ug/ml		10801	(20,80)

		1544	(2,97)
		1664	(3,20)
		1839	(3,54)
		2855	(5,49)
Chymotrypsin-Dextran-Komplex
(Chymotrypsin-Äquivalent

(die Zahlenangaben in Klammern geben die Gesamtmenge freigesetztes Jod

¹²^

in % an)

Die caseinspaltende Aktivität des Komplexes (Fig. 2) beträgt annähernd 50 Prozent derjenigen des freien Enzyms und entspricht wie in Beispiel 4 - der verminderten fibrinspaltenden Aktivität.

Beisp. i e 1 6

Trypsin-Komplex an ein Sucrose-Epichlor-Mlschpolymerisat ("FICOIl]') 1 g eines Sucrose-Epichlorhydrin-Miechpolymerisats vom Molekulargewicht 400 000 v.'ii'J in 100 ml Wasser gelöst und dann mit 0,5 g Bromcyan bei pH 11,00' in der bereits beschriebenen Weise akti-

409885/ 1 287

viert. Der pH-V/ert der Lösung wird auf 8,5 eingestellt. Der Lösung werden dann 100 mg Trypsin und 100 rag Benzamidin-hydrochlorid zugegeben. Nach löstündigem Rühren bei 4°C wird die Lösung in der bereits beschriebenen Weise ultrafiltriert und mittels Gelfiltration gereinigt. Nach Ultrafiltrieren und Gefriertrocknen erhält man 0,89 g weißes Pulver mit einem Gehalt an -75 ^g Protein/mg. Die fibrinlösende Aktivität ist in Tabelle VII angegeben.

T a b e 1 1 e VII

Fibrinlösende Wirkung eines Trypsin-Komplexes in vitro (wegen der Trypsin-Aktivität siehe Beispiel 4)

freigesetztes Jod -yMin. (50rainütige Inkubation in Pufferlösung)

Blindversuch	72,	0	/ig/ml	1264	(2,43)
Trypsin-Koiaplex	144'	0	^g/ml
(Trypsin-Ä'quivalent)			ys/mi	2181	(4,20)
			2208	(4,25)
-		29OO	(5,57)

Die caseinspaltende. Aktivität .-des Komplexes (.Fig. 1) beträgt annähernd 40 Prozent derjenigen des freien Enzyms. Die esterspaltende Aktivität (Beispiel 9) ist etwas erhöht.

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Beispiel7 Pronase-Komplex an Dextran "Τ4θ" (II)

1 g Dextran vom Molekulargewicht 4θ 000 wird in 100 ml Wasser gelöst und mit 0,5 g Bromcyan in der bereits beschriebenen Weise umgesetzt. Die Lösung wird auf einen pH 8,5 eingestellt und mit 100 mg Pronase versetzt. Nach lostündigem Rühren bei 4°C wird die Lösung in der bereits beschriebenen Weise ultrafiltriert und mittels Gelfiltration gereinigt. Nach der Gefriertrocknung erhält man 0,99 g weißes Pulver mit einem Gehalt an 51 ug Protein/mg. Die fibrinlösende Aktivität ist in Tabelle VIII angegeben.

T."ab e 1 1 e VIII

Fibrinlösende Wirkung eines Pronase-Komplexes an Dextran "Τ4θ" (II) in vitro in Gegenwart von Pufferlösung und menschlichern Plasma

freigesetztes Jod ^/Min. (30minütige Inkubation)

Pufferlösung Plasma

Blindversuch 1110 (3,6) 885 (2,8) Pronase-Dextran-Komplex

(Pronase-Äq'uivalent) 10 /ig/ml 1385 (4,4)

25 /ig/ml 1559 (5,0) 1499 (4,8)"

50 /ig/ml 1937 (6,2) 1770 (5,7)

100 /ig/ml 2334 (7,5) 2253 (7,2)

(die Zahlenangaben in Klammern geben die Gesamtmenge freigesetztes Jod ^ in % an)

Die Modifikation der Pronase mit Dextran, das in weit stärkerem Maße aktiviert worden ist als das in dem Pronase-Komplex mit Dextran "Τ4θ" (I) verwendete, liefert einen Komplex mit einer fibrinlösenden Aktivität, die nicht durch menschliches Plasma inhibiert

4098 8 5/1287

wird. , **\

B e i s ρ i e 1 8

Pronase-Komplex mit Dextran "T70"

2 g Dextran vom Molekulargewicht 70 000 werden in 200 ml Wasser gelöst und mit 0,5 g Bromcyan bei einem pH-Wert 11,00 aktiviert. Nach Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf 9,0 werden 250 mg Pronase zugegeben. Nach l6stündigem Rühren der Lösung bei 4°C werden 1,82 g L-Lysin zugegeben, um restliche reaktionsfähige Zentren an dem Dextran zu neutralisieren. Dabei wird der pH-Wert auf 9,5 gehalten. Nach 4stündigem Rühren bei 4°C wird die Lösung wie in der vorbeschriebenen Weise auf ein Volumen von 15 ml ultrafiltriert und durch Gelfiltration gereinigt. Nach Ultrafiltrieren und Gefriertrocknen erhält man 1,70 g weißes Pulver mit einem Gehalt an 87 ug Protein/mg des Komplexes. Die fibrinlösende Aktivität ist in Tabelle IX angegeben.

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"■hüllen

Wirkung eines Pronase-Dextran-Komplexes auf eine Fibrinolyse in vitro in Gegenwart einer Pufferlösung und menschlichem Plasma

freigesetztes (30minütige Inkubation)

■ Blindversuch
Pronase-Dextran-Komplex
(Pronase-Äquivalent)

	/ig/ml	Pufferlösung	(2,8)	Plasma	(2,1)
	/ag/ml	917		692	(3,4)
8,7	^g/ml	-	(3,4)	1178	(4,3)
17,4	pg/ml	1116	(4,2)	1385
34,8	/ig/ml	1391		"-	(5,0)
43,5	fig/ml	-	(6,0)	1615	(5,9)
87	1948		1928	(8,6)
174	-	2811

Die Modifikation der Pronase mit Dextran vom Molekulargewicht 70 000 setzt die spezifische fibrinlösende Aktivität des Komplexes im Vergleich mit dem des Beispiels 3 herab, doch wird noch ein Weglassen der Plasmahemmung beobachtet.

Beispiel9

Esterspaltende Aktivität der Enzym-Zubereitungen Um eine Beurteilung der peptidespaltenden 'Aktivität der Komplexe zu geben, wird die esterspaltende Aktivität unter Verwendung von 1 mMol N-Benzoyl-arginin-äthylester (B.A.E.E.) bei pH 8,0 bestimmt. Eine B.A.E.E.-Einheit des Enzyms ruft eine Erhöhung bei der optischen Dichte (0,Oi>Ji^m) von 0,001 in 1 Minute bei 25°C

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hervor.

Tabelle X B.A.E.E.-Einheiten/mg PROTEIN

TRYPSIN 8185

TRYPSIN-Komplex (nach Beispiel 4) II9OO

TRYPSIN-Komplex (nach Beispiel 6) 12000

PRONASE 3350

PRONASE-Komplex (nach Beispiel 7) 8280

Beispiel 10 Caseinspaltende Wirkung der Enzym-Zubereitungen

0,5 ml einer Enzym-Zubereitung verschiedener Konzentrationen werden 1 Stunde bei 37°C mit 2 ml einer 3prozentigen Caseinlösung und in Gegenwart von 2,5 ml einer 0,lm-Natriumphosphatpufferlösung von pH 7,0 inkubiert. Unverdautes Protein wird mittels 2 ml einer lOprozentigen Trichloressigsäure ausgefällt. Der Tyrosingehalt des Überstehenden wird nach dem Verfahren von Lowry Und Mitarbeitern in "J.Biol.Chem." _193 (1951), S. 265, bestimmt. Die optische Dichte ist dann ein Maß für die Menge des durch das Enzym solubilisierte Casein und somi-t ein Maß für die caseinspaltende Wirksamkeit.

Die Ergebnisse von erfihdungsgemaßen bestimmten Enzym-Zubereitungen sind in den Fig. 1 und 2 gezeigt, in denen die optische Dichte (0.D.gc_Onrn) S^eS^{en die} Konzentration des Enzyms bzw. - für die . Komplexe - der äquivalente Enzymgehalt des Komplexes aufgezeichnet ist.

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In Fig. 1 sind die Werte für freies Trypsin durch die Kurve A, ■ die Werte für den Trypsin-Dextran-Komplex des Beispiels 4 durch die Kurve B und die Werte für den Trypsin-Komplex an ein Sucrose-Epichlorhydrin-Mischpolymerisat nach Beispiel 6 durch die Kurve C dargestellt.

In Fig. 2 sind die Werte für freies Chymotrypsin durch die Kurve D und die Werte für den Chymotrypsin-Dextran-Komplex nach Beispiel 5 durch die Kurve E dargestellt.

4Ü9885/-1287

Claims

Patentansprüche

Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem wasserlöslichen Komplex eines kovalent an ein Polymeres gebundenes proteolytisches Enzym.
2. Arzneimittel nach Anspruch 1,- gekennzeichnet durch einen Gehalt an Trypsin, Chymotrypsin, Bromelain, Papain, Pronase oder Brinase als proteolytisches Enzym.
3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Komplex, der sich von einem wasserlöslichen Polysaccharid ableitet.
4. · Arzneimittel nach Anspruch 3> gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Dextran als Polysaccharid.
5. Arzneimittel nach Anspruch 3* gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem modifizierten Polysaecharid.
6. Arzneimittel nach Anspruch 5.» gekennzeichnet durch einen · Gehalt an einem Sucrose-Epichlorhydrin-Mischpolymerisat als modifiziertem Polysaccharid.
7. Arzneimittel nach mindestens einem der vorstehenden Sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer für Injektionszwecke geeigneten Form oder in einer solchen Form vorliegt, daß es in eine Injizierbare Lösung überführt werden kann.

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8. , Arzneimittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form einer verschlossenen Ampulle vorliegt, die eine vorbestimmte Menge des Enzym-Komplexes in einer sterilen, gefriergetrockneten Form enthält.
9. Arzneimittel nach Anspruch ¹Js dadurch gekennzeichnet, daß der Enzym-Komplex in sterilem oder pyrrogenfreiem Wasser oder einer isotonischen Kochsalzlösung in einer vorbestimmten Konzentration gelöst oder suspendiert vorliegt.
10. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels nach den Ansprüchen 1 bis 9* dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrige Lösung eines wasserlöslichen Polymeren mit einem proteolytischen Enzym in Berührung bringt und aus dem erhaltenen Komplex Einzeldosierungen bildet.

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