DE2425999C3 - Verfahren zum Nachweis von Antibiotika und Vorrichtung zu seiner Durchführung - Google Patents

Description

Das Verfahren nach M 0 1 erfüllt bis zu einem

Es sind verschiedene Verfahren zum Nachweis von gewissen Grad die Bedingungen von Ziffer 1, 2, 3 und sstmengen an Antibiotika, wie Penicillin, in Milch 65 5, jedoch nicht die Bedingung von Ziffer 4 und beid anderen Flüssigkeiten bekannt. Einige dieser Ver- nötigt deshalb zu seiner Durchführung besonders gehren sind als Standard-Verfahren allgemein aner- schultes Fachpersonal,
mnt. Beispiele für derartige Verfahren sind das so- Aufgabe der Erfindung ist es somit, ein Verfahren

ι ι

nun schnellen Nachweis von Antibiotika in Flüssig- weisen. Ein geeigneter Empfindlichkeitsbereich gegenkeiten zu schaffen, das die vorgenannten 5 Bedingun- über verschiedenen Antibiotika kann durch die Vergen erfüllt. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung Wendung von Sporen einer einzigen Art oder eines gelöst. einzigen Stammes oder einer Kombination von

Die Erfindung ist mit den Ansprüchen definiert 5 Sporen verschiedener Mikroorganismen erhalten wer-

Die Genauigkeit der Untersuchungsergebnisse hängt den. Geeignete Sporen erhält man von Sporenbildnern von der Menge der eingesetzten zu untersuchenden der Gattung Bacillus mit entsprechender Empfind-Probe ab. Wenn das Verfahren standardisiert wird, Iichkeit gegenüber den zu bestimmenden Antibiotika, liefert es auch bei Ausführung durch ungeschultes beispielsweise Bacillus calidolactis (H us so ng et Laborpersonal zuverlässige Ergebnisse. In einigen io al., J. Bact, Bd. 15 [1928], S. 179 bis 188), Bacillus Fällen kann sogar eine grobe quantitative Abschät- subtilis, Bacillus stearothennöphilus (Bergey's Manual zung der Menge des in der untersuchten Probe vor- of Determinative Bacteriology, 7. Auflage [1957], handenen Antibiotikums erfolgen. Die Verfestigung S. 613 bis 693), die von G a 1 e s I ο ο t et al. (Neth. des Agar-Nährmediums in senkrechter Lage des Ge- Milk & Dairy J., Bd. 13 [1959], S. 155 bis 179), befäßes in Verbindung mit standardisierten Mengen der 15 schriebenen thermophilen Bacillen, Bacillus stearozu uniersuchenden Probe und des Nährmediums hat thermophilus var. calidolactis (H. Mol, Neth. den Vorteil, daß die Oberfläche des Agar-Nähr- Milk & Dairy J., Bd. 23 [1969], S. 153 bis 162) und mediums definiert ist, so daß nach dem Eintragen von Bacillus calidolactis, Stamm C 953 vom Niederlän-Nährstoffen zuverlässige Ergebnisse der Inkubation dischen Institut für Molkereiforschung in Ede, Niedererhaiten werden, die sogar halbquantitativ sein können, ao lande (Galesloot et al., Neth. Milk & Dairy J.,

Dem die Sporen enthaltenden Agar-Nährmedium Bd. 16 [1962], S. 89 bis 95). Am besten werden Sporen oder den Nährstoffen kann ein Indikator zugegeben von Bacillus stearothermophilus var. calidolactis verwerden. Wird der Indikator dem Agar-Nährmedium wendet, der beim Laboratorium für Mikrobiologie zugefügt, kann er dann vor Beginn des Verfahrens in Delft, Niederlande, unter der Nummer L. M. D. 74.1 besser verteilt werden. Durch den Indikator wird die »5 hirterkgt ist Dieser Mikroorganismus besitzt neben Empfindlichkeit des Verfahrens erhöht und bei einer hohen Empfindlichkeit gegenüber Penicillin-G manchen zu untersuchenden Flüssigkeiten deren und PenicilUn-V und einer sehr hohen Wachstums-Farbe weniger durch die Eigenfarbe von Verunreini- geschwindigkeit den zusätzlichen Vorteil, daß seine gungen der Probe gestört Der Indikator kann ein optimale Wachstumsgeschwindigkeit bei relativ hoher Säure-Base-Indikator, wie Bromkresolpurpur oder 30 Temperatur liegt, bei der sich andere Mikroorganis-Phenolrot, oder ein Redoxiadikator, wie 2,3,5-Tri- men normalerweise nicht vermehren, so daß die Gephenyltetrazoliumchlorid, sein. Für den Nachweis fahr einer Infektion vermindert ist. Sporen dieses von Penicillin ist die Verwendung von Bromkresol- Mikroorganismus sind nicht nur gegenüber den vorpurpur günstig. genannten uiid anderen natürlichen Penicillinen emp-

Der pH-Wert des Agar-N&hrmediums ist für die 35 findlich, sondern auch gegenüber anderen Antibiotika, optimale Wachstumsgeschwindigkeit des Mikroorga- wie halbsynthetischen Penicillinen, beispielsweise Nafnismus als auch für die Wirkung des nachzuweisenden cillin, Cloxacillin, Cephalosporine^ sowie Amino-Antibiotikums und damit für die Empfindlichkeit des glucosiden, beispielsweise Streptomycin, Dihydro-Mikroorganismus gegenüber dem Antibiotikum von streptomycin, Neomycin und Kanamycin, ebenso Bedeutung. Bei Verwendung von Bacillus stearo- 40 Tetracyclinen, wie Chloi tetracyclin und Chloramthermophilus var. calidolactis soll zu Beginn des Ver- phenieol, Macroliden, wie Oleandomycin und Eryfahrens das Agar-Nährmedium einen pH-Wert von thromyein, und Polypeptid-Antibiotika. Das erfinam besten etwa 7 haben. Bei Verwendung eines Indi- dungsgemäße Verfahren ist zum Nachweise vorkators, wie Bromkresolpurpur, wird eine sehr kurze stehend genannter Antibiotika, gegebenenfalls nach Zeit zur Durchführung des Verfahrens erreicht. Ob- +5 Einstellung des entsprechenden pH-Wertes der Probe, wohl diese Zeit etwas länger ist, wenn zu Beginn des verwendbar.

Verfahrens das Agar-Nährmedium einen pH-Wert Sehr günstig ist ein Gehalt von 10⁸ bis 10⁸, ins-

von etwa 8 aufweist, kann damit die Empfindlichkeit besondere 10· bis 10', Sporen pro ml des Agardes Verfahrens gegenüber gewissen Antibiotika, ins- Nährmediums. Die Sporenkultur des Mikroorganisbesondere Aminoglucosiden, wie Streptomycin, Di- 50 mus wird in einer Oberflächenkultur auf einem Agarhydrostreptomyein, Kanamycin und Neomycin, er- Nährmedium oder in einer flüssigen Submerskultur, höht werden. Als Indikator eignet sich in diesem Fall beispielsweise in einem Schüttelkolben oder in einem beispielsweise Phenolrot Die Empfindlichkeit des Fermenter (Y a ο et al., Appl. Microbiol., Bd. 15 Verfahrens gegenübei anderen Antibiotika wird je- [1967], S. 455) hergestellt. Die Sporen werden derart doch nicht nachteilig beeinflußt, wenn der pH-Wert 53 in das Agar-Nährmedium überimpft, daß sie zwar während des Verfahrens in der Weise abnimmt, daß lebensfähig bleiben, aber nicht keimen. Dem Agarjedes vorliegende Antibiotikum bei einem ihm ent- Nährmedium können eine physiologische Salzlösung sprechenden pH-Wert das Wachstum des Mikro- und/oder ein Indikator zugegeben werden, jedoch Organismus hemmt Der nutzbare pH-Bereich zwischen soll es keine Nährstoffe für den Mikroorganismus entBeginn und Ende des Verfahrens kann durch Verwen- 60 halten.

dung von Mischindikatoren gegebenenfalls erweitert Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Ver-

werden. fahrens liegt darin, daß es den Einfluß von Hemm-

Die Empfindlichkeit des Verfahrens gegenüber be- stoffen, beispielsweise von Leucozyten gebildeten Verstimmten Antibiotika kann durch Verwendung anderer bindungen, die normalerweise in Milch und anderen Sporen oder deren Kombination eingestellt werden. 65 zu untersuchenden Flüssigkeiten vorliegen und keine

Erfindungsgemäß können Sporen aller Bakterien Antibiotika darstellen, beträchtlich vermindert, was verwendet werden, die eine ausreichende Empfindlich- bei den bekannten Verfahren normalerweise nicht der keit eeeenüber den zu bestimmenden Antibiotika auf- Fall ist. Die Verminderung der Wirksamkeit dieser

Hemmstoffe ist darauf zurückzuführen, daß sie nicht liehen Nährstoffe, gegebenenfalls mit einem Indikator, oder nicht in wesentlichem Ausmaß in das Agar- auf die Oberfläche des die Sporen enthaltenden Agar-Nährmedium in den Gefäßen, beispielsweise den Nährmediums gegeben. Obwohl auch eine vorgege-Teströhrchen, eindiffundieren. Dadurch wird die Zu- bene Menge an Nährstoffen in flüssiger Form zugcverlässigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens er- 5 fügt werden kann, ist die Zugabe von Nährstoffen in höht und macht es zu einem leicht durchführbaren trockener Form bevorzugt, insbesondere auf runden Verfahren, das zur Inaktivierung jener Hemmstoffe Filterpapieren als Trägermaterial oder in Form von eifie Vorbehandlung der Milchprobe normalerweise Tabletten, welche die getrockneten Nährstoffe entnicht erfordert, selbst dann, wenn sich die Milch- halten, die so eine bessere Lagerstabilität aufweisen. proben in ihrem Aussehen bereits etwas verändert io Die runden Filterpapiere oder Tabletten sollen kleiner haben. ^a'^s die Querschnittsfläche des Gefäßes sein, damit sie

Das die Sporen enthaltende Agar-Nährmedium beim Aufliegen auf dem Agar-Nährmedium den Luftläßt man in senkrecht aufgestellten Gefäßen fest zutritt nicht wesentlich behindern, was das Diffusionswerden. Um zuverlässige Untersuchungsergebnisse zu bild in der Agarschicht beeinflussen würde. Die vererhalten, haben diese Gefäße eine vorgegebene Größe. 15 wendeten Nährstoffe sollen wenigstens eine dem ver-Das erfindungsgemäße Verfahren ist sogar bis zu wendeten Stamm angepaßte assimilierbare Kohleneinem gewissen Grad quantitativ, wenn es unter be- stoff- und Stickstoffquelle enthalten, am besten in stimmten Bedingungen durchgeführt wird. Das Anti- Form von Glucose und Pepton. Der mittels den biotikum diffundiert in das Agar-Nährmedium, in Filterpapieren oder den Tabletten zugegebene Nährdem seine Konzentration mit zunehmender Eindring- 30 stoff enthält gegebenenfalls den Indikator und/oder tiefe abnimmt. In der Zone des Agar-Nährmediums, eine Puffersubstanz.

in der die Konzentration des Antibiotikums unter Nach dem Aufbringen der Nährstoffe auf die Ober-

einem bestimmten Wert liegt, kann sich der Mikro- fläche der Agarschicht wird eine vorgegebene Menge Organismus vermehren, so daß der gegebenenfalls im der zu untersuchenden Flüssigkeit, im allgemeinen Agar-Nährmedium anwesende Indikator seine Farbe as Milch, oder des zu untersuchenden Fleisches zum Inindert. In der Zone, in der die Konzentration des halt des Gefäßes gegeben. Dies kann unmittelbar Antibiotikums über diesem Wert liegt, wird das nach dem Einbringen der Nährstoffe auf die Ober-Wachstum des Mikroorganismus gehemmt, und der fläche des Agar-Nährmediums oder nach einer vorIndikator ändert seine Farbe nicht. Die Höhe des ausgehenden Inkubationszeit geschehen. Falls die Agar-Nährmediums im Gefäß, beispielsweise dem 30 Nährstoffe in trockener Form zugegeben wurden, Teströhrchen, in dem der Farbumschlag des Indi- kann für die vorausgehende Inkubationszeit etwas kators erfolgt, definiert die Empfindlichkeit des Ver- Wasser oder physiologische Kochsalzlösung zugegeben fahrens. So kann diese Empfindlichkeit durch Stan- werden. Dies hat den Vorteil, daß zwischen dem Zudardisieren der Höhe des im Gefäß verfestigten Agar- geben der Probe im Verfahren und dessen Beendigung Nährmediums festgelegt werden. Diese Maßnahme 35 weniger Zeit verstreicht als beim Arbeiten ohne vorbietet den Vorteil, daß das Verfahren bei einer be- ausgehende Inkubationszeit. Beispielsweise kann in stimmten Höhe des die Sporen enthaltenden Agar- einer Molkerei die Milch, die zur Verteilung an die Nährmediums durchgeführt werden kann, bei der der Verbraucher oder zur Herstellung von Butter, Käse Indikator seine Farbe ändert, wenn die Konzentration oder Joghurt vorgesehen ist, erst nach Feststellung des anwesenden Antibiotikums unter einem gewissen 40 der Abwesenheit von Penicillin oder anderen Anti-Wert liegt, jedoch seine Farbe nicht ändert, wenn die biotika weiter verarbeitet werden. Die nach AnKonzentration des Antibiotikums darüber liegt. Der lieferung der Milch vor ihrer Weiterverarbeitung erDurchmesser des Gefäßes ist am günstigsten 3 bis forderliche Wartezeit bis zum Vorliegen des Unter-20 mm, insbesondere 6 bis 14 mm. Seine Höhe ist so suchungsergebnisses kann durch Arbeiten mit einer bemessen, daß die Gesamthöhe des eingefüllten Agar- 45 vorausgehenden Inkubationszeit im Verfahren ver-Nährmediums und der zu untersuchenden Probe am kürzt werden. Die vorausgehende Inkubationszeit besten 3 bis 30 mm betragen kann. Falls das Ver- beträgt in Abhängigkeit der gegebenen Bedingungen fahren quantitativ durchgeführt wird, wobei aus der bis zu etwa 1 Stunde. Das Verfahren wird noch wirt-Höhe der Zone, in der das Wachstum des Mikro- schaftlicher, wenn während der Zeit, in der die zu Organismus gehemmt wird, quantitative Rückschlüsse 50 untersuchende Milch sich noch auf dem Transport gezogen werden, beträgt die Gesamthöhe des Agar- zur Molkerei befindet, bereits das Verfahren begonnen Nährmediums und der zu untersuchenden Probe am wird.

besten 20 bis 30 mm. Falls das Verfahren dazu dient, Die Inkubationszeit, einschließlich der vorausfestzustellen, ob eine bestimmte Konzentration eines gehenden Inkubationszeit, die vor dem Zusatz der zu Antibiotikums vorliegt oder nicht, beträgt diese Höhe 55 untersuchenden Probe abläuft, hängt von den Beam besten 5 bis 15 mm. dingungen, wie der Art der eingesetzten Sporen, den

Nach dem Beschicken der Gefäße mit einer «or- Nährstoffen und der Temperatur, ab. Bei Verwendung gegebenen Menge an flüssigem Agar-Nährmedium von Sporen des Bacillus stearothermophilus var. caliwerden sie in senkrechter Lage gehalten, damit sich dolactis liegen die Temperaturen für die Inkubation die Oberfläche des sich verfestigenden Agar-Nähr- 60 bei etwa 55 bis 70⁰C, insbesondere 60 bis 65⁰C. Die mediums senkrecht zur Gefäßinnenwand ausbildet. Inkubationszeiten, die zuverlässige Ergebnisse des Die Gefäße mit dem verfestigten und die Sporen ent- Verfahrens bringen, betragen etwa l¹/» bis 4 Stunden, haltendem Agar-Nährmedium können verschlossen insbesondere 2 bis 3 Stunden.

werden und so wenigstens mehrere Monate, gegebenen- Obwohl das Verfahren zur Anwendung bei Milch

falls gekühlt, gelagert werden, ohne daß die Sporen 65 entwickelt wurde, dient es auch zur Untersuchung ihre Lebensfähigkeit verlieren. anderer Produkte, wie Fleisch, beispielsweise in Form

Bei der Durchführung des Verfahrens zum Nach- von kleinen Fleischstückchen, der aus einer Fleischweis eines Antibiotikums werden zuerst die erforder- probe gepreßten Flüssigkeit oder der von tiefge-

frorenem und anschließend aufgetautem Fleisch ab- gewiesen werden. Dabei werden gegebenenfalls zur

tropfenden Flüssigkeit. In diesem Fall müssen die Einstellung eines bestimmten pH-Wertes Puffersub-

Nährstoffe auf störende Bestandteile der Probe abge- stanzen zugegeben.

stimmt werden, was beispielsweise durch Zugabe ent- Falls andere Mikroorganismen zum Nachweis sprechender Verbindungen, wie Puffersubstanzen, er- 5 anderer Antibiotika verwendet werden, können das reicht wird. Störende Bestandteile, wie Lactoferin Nährmedium, die Nährstoffe und die Inkubationsund Seroferin, können durch Zugabe von Eisen(II)- bedingungen entsprechend angepaßt werden, sulfat unwirksam gemacht werden. Als Vorprüfung Die Beispiele erläutern die Erfindung, auf die Anwesenheit von Antibiotika in Schlacht- Beispiel 1 tieren kann das Verfahren auf deren Urin angewandt io u_eret»ii„_n„ „„„ T«h.sim4», werden, da sich Antibiotika darin ansammeln. Zur Herstellung von Testrohrchen Untersuchung von unverdünntem Urin soll der Eine Kultur von Bacillus stearothermophilus var. pH-Wert unter Verwendung einer entsprechenden calidolactis L.M.D. 74.1 wird in ein Medium folgender Puffersubstanz in der Tablette der Nährstoffe einge- Zusammensetzung überimpft: stellt werden. Urinproben können auch ohne Zusatz 15 Agar-Nährmedium Difco 0001 15 g von Puffersubstanzen untersucht werden, jedoch ist Agar-Nährmedium Difco 0140 5 g dann ein Verdünnen der Probe mit Wasser auf etwa Glucose 0 5g das lOfache nötig. MnSO₄-H₁Q ".'.'."!'.'.".'.'."!'.!" 3o'mg

Zur Untersuchung, ob in einer Probe em Penicillin Destilliertes Wasser auf 1000 ml

oder ein anderes Antibiotikum vorliegt, kann das « _{2Q Minuten w 12Q}o_{c sterilisier}e_n Verfahren mit zwei Gefäßen durchgeführt werden. In

das erste Gefäß wird eine penicillinasehaltige Tablette Nach d;m Überimpfen wird das Medium 48 Stunden mit Nährstoffen oder ein mit Nährstoffen getränktes bei 6O⁰C inkubiert, bis eine gute Sporenbildung beFilterpapier, in das zweite Gefäß werden die gleichen obachtet wird. Die Sporen werden gesammelt, mit Nährstoffe, jedoch ohne Penicillinase, gegeben. Bei »5 destilliertem Wasser gewaschen und bei 4° C gelagert. Anwesenheit von Penicillinase werden während des Die Menge an lebensfähigen Sporen wird durch Verfahrens die gegen Penicillinase nicht resistenten Untersuchen auf einem Medium folgender Zusammen-Penicilline abgebaut. An Stelle von Penicillinase Setzung bestimmt:

können auch andere spezielle Inaktivatoren des Agar-Nährmedium Difco0140 ... 20g

Penicillins, wie Cystein, eingesetzt werden. 30 Trvpton Difco 0123 8 5 e

Das Gefäß der erfindungsgemäßen Vorrichtung hat _ph^_{on p ßBL} ££■;;;;;;; · J

einen Innendurchmesser von am besten 3 bis 20 mm, Glucose 5 e

insbesondere 6 bis 14 mm. Die erforderliche Menge Destilliertes Wasser auf"'.".".'.'.'.'.''.". 1000ml

des Agar-Nahnnediums ist von der vorgesehenen 20 Minuten bei 120° C sterilisieren

Zeitdauer des Verfahrens sowie der Diffusionsge- 35

schwindigkeit der Nährstoffe abhängig. Die Gesamt- Nach dem Überimpfen wird das Medium 48 Stunden

höhe von Agar-Nährmedium und zu untersuchender bei 6O⁰C inkubiert. Anschließend werden die Kolonien

Probe im Gefäß ist am besten 3 bis 30 mm, insbeson- gezählt,

dere 5 bis 10 mm. Mit destilliertem Wasser wird eine Suspension der

Dabei können dann mehrere Gefäße in einem 40 Sporen hergestellt und auf einen Gehalt von etwa

Block eines durchscheinenden Materials, der mit 10⁸ Keimen/ml eingestellt 1 % der erhaltenen Suspen-

einen entsprechenden Anzahl von Löchern versehen sion wird einer Lösung folgender Zusammensetzung

ist, angeordnet sein. Es können aber auch mehrere zugefügt:

Gefäße in einer Haltevorrichtung zusammengefaßt Agar-Nährmedium Difco 0140 ... 12 g

^sem/. , . _XT._{t J}. .,_,-«-„ *⁵ Natriumchlorid 9 g

Die das Agar-Nahrmedium enthaltenden Gefäße Destilliertes Wasser auf 1000 ml

können über einen längeren Zeitraum gelagert werden, _{2Q Minutea} bei 120°C sterilisieren

der von den Lagerbedingungen, insbesondere der

Temperatur, abhängt. Das Agar-Nährmedium wird durch Erhitzen ver

Bei Luftzutritt kann sich der pH-Wert des Agar- 50 flüssigt und anschließend auf 6O⁰C abgekühlt Steril« Nährmediums im Gefäß während der Lagerzeit Testrohrchen mit einem Innendurchmesser von etws ändern, was vermutlich auf die Einwirkung von 9 mm werden mit jeweils 0,5 ml des erhaltenen Nähr

Kohlendioxid aus der Luft zurückzuführen ist Des- mediums gefüllt In senkrechter Stellung der Test

halb werden die Gefäße während der Lagerung luft- röhrchen läßt man ihren Inhalt erstarren. Anschließen«

dicht verschlossen, wie es bei Ampullen der Fall ist 55 werden die Testrohrchen bei 4° C gelagert

Manchmal neigt das Agar-Nähnnedium dazu, ach vt-t_» a »_= ,_» τ-,

von der Gefäßwand zu lösen. Dem kann dnrch Zu- Herstellung der Nahrstoff-getrankten Filterpapiere

gäbe eines klebrigen Zusatzes, der nicht als Nähr- Eine Nährstoffkombination folgender Zusammen

oder Hemmstoff gegenüber den Sporen wirken solL Setzung wird hergestellt:

anhydnden. »β—

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können (b) Glucose SJg

auch Antibiotika in Flüssigkeiten, die durch Ans- 65 Destilliertes Wasser 50ml

pressen von Fleisch, Organen, wie Nieren, oder (c) Trypton Difco 0123 34 g

Nahrungs- und Futtermittel erhalten worden, und in Phyton Pepton BBL11905 6 g

anderen Flüssigkeiten, wie Blutserum und Urin, nach- DestüT rtes Wasser 100 ml

tnoAAz

Die Gemische (a) und (b) werden über ein Seitz-Filter, das Gemisch (c) durch 30minütiges Erhitzen auf 11O⁰C sterilisiert, (c) bleibt eine Suspension. Anschließend werden 5 Teile (a), 2 Teile (b) und 3 Teile (c) gemischt und jeweils 0,04 ml des erhaltenen Gemisches auf ein rundes Filterpapier von etwa 8 mm Durchmesser gebracht, das anschließend getrocknet wird.

Beispiel 2
Durchführung eines Nachweises

Es werden Proben mit den Konzentrationen 0,1, 0,03, 0,01, 0,003 und 0,00!l IE Penicillin-G pro ml in frischer Kuhmilch sowie eine Probe dieser Milch ohne Penicillin-G zu einem Vergleichsversuch hergestellt. Gemäß Beispiel 1 werden 6 Teströhrchen hergestellt, mit je einem nährstoffgetränkten Filterpapier oder einer Nährstoff-Tablette versehen und mit 0,2 ml einer der vorgenannten Proben versetzt. Unmittelbar darauf werden die Teströhrchen in ein Wasserbad von 65° C gebracht und nach 3 und 4 Stunden kontrolliert.

Ergebnis
Vergleichsversuch:

Gelbfärbung der Agarschicht.
Proben mit weniger als 0,01 IE/ml:

Gelbfärbung der Agarschicht.
Proben mit 0,01 und mehr ΙΕ/ml:

Violettfärbimg der Agarschicht.

Beispiel 3

Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens
mit bekannten Verfahren

In der nachstehenden Tabelle (Werte in y/ml) ist die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens mit den Empfindlichkeiten bekannter Ver-

\o fahren zum Nachweis von Antibiotika zusammengefaßt. Bei den bekannten Verfahren handelt es sich um einen Nierentest (Schothorst und Peelen-Kn öl, Tijdschr. v. Diergeneesk., Bd. 95 [1970], S. 438 bis 445) und ein deutsches Untersuchungsverfahren (Levetzow, Bundesgesundheitsblatt,
Bd. 14 [1971], S. 30 bis 42, sowie Bartels et al., Die. Fleischwirtschaft, Bd. 52 [1972], S. 479 bis 482). Das erfindungsgemäße Verfahren wird auf zwei Arten durchgeführt: Zum einen wird es mit den in der nach-

ao stehenden Tabelle angegebenen Antibiotika in einer physiologischen Kochsalzlösung, zum anderen in Milch durchgefühlt, die diese Antibiotika als Verunreinigung enthält.

A.US der Tabelle ist ersichtlich, daß das erfindungs gemäße Verfahren für die meisten der angegebener Antibiotika empfindlicher ist als der Nierentest. Aucr im Vergleich mit dem deutschen Verfahren ist das er findungsgemäße Verfahren vorteilhafter, da es zurr Nachweis von Penicillin empfindlicher ist.

Antibiotikum

Erfindungsgetnäßes Verfahren

obere
Grenze in
physiologischer
Kochsalzlösung

untere und obere
Grenze in Milch

Nierentest Modifizierter Nierentest

S. lutea S. lutea, 20 ml pro Platte
ml pro

Platte pH 6 pH 8

Deutsches Verfahren
B. subtilis

pH 6

pH 8

1	Natriumsalz des	0,004	0,003 — 0,005	0,04	0,02	0,02	0,01	0,01
	Penicillins	10	20 — 30	etwa 200	etwa 200	16	3	0,9
2	Kanamycin	2	2 — 8	etwa 600	etwa 400	1	10	0,1
3	Neomycin	10	18 — 22	80 — 100	40	1	1	0,2
4	Streptomycin	0,8	1,5-3	1 — 2	0,8 — 1	0,05	20	0,8
5	Erythromycin	5	5 — 10	8 — 10	7	0,05	20	0,2
6	Oleandomycin		>10	etwa 150	etwa 100	0,4	>200	2
7	Spiramycin	0,1	0,2-0,5	2 — 4	2	etwa 10	0,5	8(?)
8	Oxytetracyclra		0,15—0,4	etwa 0,8	0,6	1	0,08	0,4
9	Chlortetracyclin	0,05	0,15 — 0,4	2 — 4	2	>10	0,5	8
10	Tetracyclin-HCl		0,03 — 0,04	0,03	0,01	0.02	0,02	0,04
11	Rifamycin	0,1	0,2-0,4	1	0,6	4	etwa 300	etwa 5<
12	Zinkbacitracin	8	5-7,5	5 — 8	4	6	5	8
13	Chloramphenicol	0,04	0,01 — 0,02	0,2	0,1	0,1	4	>10
14	Nafcillin	5	? —8	etwa 100	etwa 60	>100	1	2
15	Furazolidon		>1000	etwa 2000	etwa 1000	etwa 700	etwa 700	etwa 2(
16	Snifamezatbin		0,6 — 0,8	50S; 12 T	20S; 4T	8 S; 1,2 T	5S;1T	4S;0,8
17	A)	4	1 — ?	etwa 1000	etwa 600	30	70	30
18	Spectinomycin	0,6	? —0,5	etwa 2	1	0,1	500	5
19	Lincomycin		0,003 — 0,004	0,4	0,2	0,4	0,2	0,4
20	Cloxacilhn	At\ ***** TV5W
A)	200 mg SuIfadoxrn +	4Umg Ii in

Claims (2)

genannte TTC-Verfahren (Verfahren mit 2,3,5-Tri- Patentansprüche· phenyltetrazoliumchlorid), wie das Verfahren nach N e a 1 et. al., J. Dairy Science, Bd. 38 (1955), S. 629

1. Verfahren zum Nachweis von Antibiotika bis 633, und ein Verfahren nach Galesloot et al., unter Verwendung von Sporen eines Mikro- 5 Neth. Milk & Dairy J., Bd. 16 (1962), S. 89 bis 95, Organismus, der gegenüber dem nachzuweisenden das auf einem von V i η c e η t et al., Proc. Soc. exp. Antibiotikum empfindlich ist, und eines Agar- Biol. Med., Bd. 162 (1944), S. 55, beschriebenen Ver-Nährmediums, wobei das die Sporen, die zu unter- fahren beruht und die Mikroorganismen Bacillus suchende Flüssigkeit und das Nährmedium ent- stearothermophilus oder Bacillus calidolactis verwenhaltende Gefäß während einer vorgegebenen In- io det, sowie das Verfahren nach J a c ο b s et al., Tijdschr. kubatioaszeit auf den für das Wachstum des v. Diergeneesk., Bd. 79 (1972), S. 548 bis 550. Das VerMikroorganismus optimalen Temperaturbereich fahren nach Galesloot et al. wird so durchgeerwärmt und durch das Wachstum oder die führt, daß man mit der zu untersuchenden Milch ge-Wachstumshemmung des Mikroorganismus die tränkte runde Papierstücke in Petrischalen auf KuI-Ab- oder Anwesenheit eines Antibiotikums in der 15 türen des Bacillus stearothermophilus oder Bacillus untersuchten Flüssigkeit entweder visuell oder calidolactis legt, die auf einem Agar-Nährmedium durch einen dem Agar-Nährmedium beigegebenen gezüchtet wurden, und 2% Stunden bei 55° C in-Indikator bestimmt wird, dadurch gekenn- kubiert. Das Entstehen von Hemmzonen ist ein zeichnet, daß man vor dem Erwärmen des Zeichen für die Anwesenheit von Penicillin oder die Sporen, die zu untersuchende Flüssigkeit und »o anderer das Wachstum dieser Bakterien hemmenden das Nährmedium enthaltenden Gefäßes während Verbindungen in der untersuchten Milch. Das Vereiner vorgegebenen Inkubationszeit auf den für fahren hat eine Empfindlichkeit von etwa 0,0025 IE das Wachstum des Mikroorganismus optimalen Penicillin pro ml, erfordert jedoch zur Durchführung Temperaturbereich die Sporen des Mikroorganis- besonders geschultes Fachpersonal, weil frisch gemus in ein Agar-Nährmedium in das Gefäß über- »5 züchtete Bacilluskulturen verwendet werden müssen, impft, wobei das die Sporen enthaltende Agar- Die Untersuchungsergebnisse sind jedoch verhältnis-Nährmedium sich bei senkrechter Lage des Ge- mäßig unzuverlässig, wenn das Verfahren von Laborfäßes verfestigt hat und die Sporen aus Mangel personal ohne spezielle Fachkenntnisse durchgeführt an Nährstoffen nicht keimen, aber noch lebens- wird.

fähig bleiben, daß man auf die Oberfläche des 30 Um die Zuverlässigkeit des Verfahrens nach

Agar-Nährmediums die für das Wachstum des Galesloot et al. zu erhöhen, gibt H. Mol in

Mikroorganismus nötigen Nährstoffe bringt und der Zeitschrift Neth. Milk & Dairy J., Bd. 23 (1969),

hierauf, gegebenenfalls nach einer vorhergehenden S. 153 bis ¹62, an, in Petrischalen erhaltene Sporen

Inkubationszeit, eine vorgegebene Menge der zu von Bacillus stearothermophilus var. calidolactis zu

untersuchenden Flüssigkeit zufügt. 35 verwenden. Dabei wird ein scheibenförmiger Nähr-

2. Vorrichtung zur Durchführung des Ver- boden, der durch Tränken eines Stück Filterpapiers fahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, mit einer wäßrigen Lösung von 20% Pepton sowie daß sie aus einem Gefäß besteht, das Sporen eines 20 % Glucose und anschließendem Trocknen erhalten Mikroorganismus, der gegenüber dem nachzu- wurde, mit der zu untersuchenden Milch getränkt und weisenden Antibiotikum empfindlich ist, in einem 40 auf ein Agar-Nährmedium gelegt, auf das vorher die Agar-Nährmedium enthält, wobei das die Sporen Sporen aufgebracht wurden. Nach 6stündigem Inkuenthaltende Agar-Nährmedium sich bei senk- bieren der Petrischalen bei 63° C kann man an der rechter Lage des Gefäßes verfestigt hat und die Bildung von Hemmzonen die Anwesenheit von Peni-Sporen in das Agar-Nährmedium so überimpft cillin erkennen.

sind, daß sie nach der Zugabe von Nährstoffen 45 Das Verfahren nach Mol ist zwar zuverlässiger

und einer Inkubationszeit bei etwa der für das als das nach Galesloot, hat jedoch noch ver-

Wachstura des Mikroorganismus optimalen Tem- schiedene Nachteile. Vor allem ist für unerfahrenes

peratur in kurzer Zeit so weit wachsen, daß ihr Laborpersonal die Hemmzone schwierig zu erkennen.

Wachstum entweder visuell oder durch einen dem Auch ist das Volumen der untersuchten Probe schlecht

Agar-NährmediurG beigegebenen Indikator nach- 5° reproduzierbar.

weisbar ist, und das Gefäß einen Innendurchmesser, Ein Nachweisverfahren muß folgende Bedingungen

der so klein ist, daß für das Verfahren möglichst erfüllen:

wenig Agar-Nährmedium benötigt wird, aber so 1. Es muß in kurzer Zeit durchführbar sein,

groß ist, daß eine Wachstumshemmung des 2. Es soll für einen großen Teil der in der Praxis

Mikroorganismus nachweisbar ist und eine eine 55 eingesetzten Antibiotika sehr empfindlich sein,

ausreichende Menge des Agar-Nahrmediums und 3 g_s g_Ojj jjjj|j_{g sem}

der zu untersuchenden Flüssigkeit aufzunehmen ₄[ _{Fs soll auch bei} *_Aus{ührung durch ungeschultes

gestattende Hohe aufweist. Laborpersonal zuverlässige Ergebnisse liefern.

5. Die Gefäße, welche die für das Verfahren nötigen

Substanzen enthalten, sollen mehrere Monate

oder länger lagerfähig sein.