DE2419232C3 - Process for purifying microbiological rennin - Google Patents

Description

einsetztbegins

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die mikrobiologische Renninlösung einen pH-Wert von 3 bis 3,5 besitzt4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that the microbiological rennine solution has a pH of 3 to 3.5

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet daß man als Metallsalz ein Calciumsalz, Magnesiumsalz, Bariumsalz und/oder Aluminiumsalz einsetzt5. The method according to claim 1 to 4, characterized in that the metal salt is a calcium salt, Magnesium salt, barium salt and / or aluminum salt is used

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Filterhilfe zu der Lösung des mikrobiologischen Rennins vor dem Vermischen mit der Polycarbonsäure zusetzt6. The method according to claim 1 to 5, characterized in that there is a filter aid to the Solution of the microbiological rennin added before mixing with the polycarboxylic acid

Bei der üblichen Käseherstellung wird Milch zur Gerinnung gebracht oder koaguliert, wobei ein Quark entsteht, der in viele Stücke geschnitten wird, die gemeinsam gekocht werden. Die flüssige Molke wird von dem gekochten Quark abgetrennt, der dann in Blöcke geschnitten, gepreßt und einige Monate gereift wird, wobei der gewünschte Käse entsteht. Das Mittel, das üblicherweise zur Bildung des Quarks durch Gerinnung oder Koagulation der Milch angewandt wird, ist das Rennin, das sich im Kälbermagen findetIn the usual cheese-making, milk is curdled or coagulated, with a quark that is cut into many pieces that are cooked together. The liquid whey will separated from the cooked curd, which is then cut into blocks, pressed and matured for a few months resulting in the desired cheese. The means that usually lead to the formation of the quark Coagulation or coagulation of milk is used, is the rennin that is found in the calf's stomach

Kälberrennin ist eine Substanz, die hergestellt wird •us der den vierten Magen nicht entwöhnter Kälber auskleidenden Membran. Es ist offensichtlich, daß die Qualität und Quantität des zur Käseherstellung verfügbaren Rennins direkt abhäng /on der Anzahl und Art der Kälber, die für Nahrungszwecke geschlachtet werden. Es wurden daher viele Versuche unternommen, «m einen geeigneten Ersatz für Kälberrennin zu entwickeln. Es wurden verschiedene mikrobiologische Enzyme zur Milchgerinnung angewandt. Verschiedene Stämme von Mucor miehei und Mucor pusilius wurden tür Bildung eines mikrobiologischen Renniis angewandt Calf racein is a substance that is manufactured • of the membrane lining the fourth stomach of calves not weaned. It is obvious that the The quality and quantity of the rennin available for cheese production is directly dependent on the number and Type of calves slaughtered for food. Many attempts have therefore been made «M to develop a suitable substitute for race woman. There were various microbiological Enzymes used to coagulate milk. Different tribes of Mucor miehei and Mucor pusilius were made used for the formation of a microbiological race

Die das mikrobiologische Rennin enthaltenden Lösungen, die beim Wachstum derartiger Mikroorga-•ismen entstehen, enthalten eine verhältnismäßig hohe Konzentration an Gesamtfeststoffen, aber nur eine kleinere Menge der gewünschten mikrobiologischen Renninenzymaktivität bezogen auf die Gesamtfeststoffe. Dadurch tritt ein Problem auf, wenn die Renninaktivität verstärkt bzw. konzentriert werden soll. Das Produkt enthält dann auch unerwünschte Enzyme wie Lipase, die bei der vorgesehenen Verwendung des mikrobiologischen Rennins stören können.The solutions containing the microbiological rennin that are involved in the growth of such microorganisms contain a relatively high concentration of total solids, but only one smaller amount of the desired microbiological rennine enzyme activity based on total solids. This creates a problem when the inactivity of racing is to be intensified or concentrated. The The product then also contains undesirable enzymes such as lipase, which are produced when the intended use of the can interfere with microbiological rennins.

In der DT-OS 19 62 575 ist ein Verfahren zur Herstellung von Labferment beschrieben, wobei ein spezieller Stamm von Mucor miehei angewandt wird. Das Ferment wird dann auf übliche Weise gewonnen. Über die Reinheit des Ferments findet sich kein näherer Hinweis. Es muß daher davon ausgegangen werden, daß es wie alle derartigen mikrobiologisch gewonnenen Labfermente eine verhältnismäßig hohe Konzentration an Feststoffen enthält, verglichen mit einer relativ geringen Renninaktivität, sowie neben dem gewünschten Rennin noch Anteile anderer unerwünschter Enzyme.In the DT-OS 19 62 575 is a method for Production of rennet described using a special strain of Mucor miehei. The ferment is then obtained in the usual way. There is no more detailed information on the purity of the ferment Notice. It must therefore be assumed that it, like all such microbiologically obtained Rennet contains a relatively high concentration of solids compared to a relatively low racing inactivity, as well as next to the desired Rennin and other unwanted enzymes.

Es wäre daher günstig, wenn es möglich wäre, mikrobiologisches Rennin leicht zu isolieren und zu reinigen.It would therefore be beneficial if it were possible to easily isolate and use microbiological rennin to clean.

Die Erfindung betrifft eir Verfahren zur Isolierung und Reinigung von mikrobiologischem Rennin (Labferment), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine wäßrige Lösung von mikrobiologischem Rennin, enthaltend Verunreinigungen, welche einen pH-Wert von ungefähr 3 bis ungefähr 4 besitzt mit einer Polycarbonsäure vermischt den entstandenen Niederschlag von der die Verunreinigungen enthaltenden Lösung abtrennt und dann durch Vermischen mit einer wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von über 5 löst, worauf man zu dieser Lösung ein geeignetes Metallsalz, das wasserlöslich ist und mit der Polycarbonsäure einen festen Komplex bildet zusetzt und den entstandenen Niederschlag von der gereinigten mikrobiologischen Renninlösung abtrennt.The invention relates to a process for the isolation and purification of microbiological rennin (rennet), which is characterized in that one contains an aqueous solution of microbiological rennin Impurities which have a pH of about 3 to about 4 with a polycarboxylic acid mixed separates the precipitate formed from the solution containing the impurities and then dissolved by mixing with an aqueous solution having a pH greater than 5, whereupon to this solution a suitable metal salt, which is water-soluble and one with the polycarboxylic acid solid complex forms clogs and the resulting precipitate from the purified microbiological Separates rennine solution.

Die das mikrobiologische Rennin enthaltenden Lösungen, die als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren angewandt werden, sind bekannt und werden auf bekannte Weise durch Fermentation ausgewählter Stämme von Mucor miehei oder Mucor pusülus und Abfiltrieren des Mycels erhalten. Die entstehende wäßrige Fermentationsbrühe enthält das gewünschte mikrobiologische Rennin zusammen mit löslichen Verunreinigungen wie Salzen, Kohlenhydraten, organischen Säuren und anderen löslichen Enzymen wie Lipasen. Pulverisiertes mikrobiologisches Rennin, das aus der erwähnten Fermentationsbrühe erhalten wird, enthält auch die angegebenen Verunreinigungen.The solutions containing the microbiological rennin used as starting material for the inventive Methods used are known and are made in a known manner by fermentation obtained selected strains of Mucor miehei or Mucor pusülus and filtering off the mycelium. the The resulting aqueous fermentation broth contains the desired microbiological rennin together with soluble impurities such as salts, carbohydrates, organic acids and other soluble enzymes like lipases. Powdered microbiological rennin obtained from the fermentation broth mentioned also contains the specified impurities.

Die erfindungsgemäß geeigneten Polycarbonsäuren sind die Polyacrylsäuren, die hydrolysierten Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymeren und die hydrolysierten Methylvinyläther-Maleinsäureanhydrid-Copolymeren. Diese Polyacrylsäuren sind bekannt und werden hergestellt durch Polymerisation von Acrylsäure oder Acrylsäurederivaten, wie Acrylamid oder Acrylsäureestern, und anschließende Hydrolyse unter Bildung von freien Caroxylgruppen. Der Ausdruck »Polyacrylsäu-The polycarboxylic acids suitable according to the invention are the polyacrylic acids, the hydrolyzed ethylene-maleic anhydride copolymers and the hydrolyzed methyl vinyl ether-maleic anhydride copolymers. These polyacrylic acids are known and are produced by polymerizing acrylic acid or Acrylic acid derivatives, such as acrylamide or acrylic acid esters, and subsequent hydrolysis with the formation of free caroxyl groups. The expression »polyacrylic acid

ren« ist so zu verstehen, daß der Polymethacrylsäuren ynd Salze von Polyacrylsäure^ wie die Natrium- und Ammoniumsalze, umfaßt Geeignete Polyacrylsäuren lind im Handel erhältlich. Diese feinteiligen festen Substanzen oder die Flüssigkeiten sind alle im Wasser löslich oder leicht dispergierbar.ren «is to be understood as meaning that of the polymethacrylic acids ynd salts of polyacrylic acid ^ such as the sodium and Ammonium salts, includes Suitable polyacrylic acids are commercially available. These finely divided solid Substances or the liquids are all soluble or easily dispersible in water.

Die Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymeren, die erfindungsgemäß angewandt werden können, sind bekannt und im Handel erhältlich als lineare Harze in Form der freien Säuren und des Anhydrids. Die freie ,₀ Säure ist in Wasser löslich. Das Anhydrid ist im allgemeinen in Wasser unlöslich, aber es kann bequem durch Erhitzen gelöst werden, wobei durch Hydrolyse die freie Säure entstehtThe ethylene-maleic anhydride copolymers which can be used according to the invention are known and are commercially available as linear resins in the form of the free acids and of the anhydride. The free, ₀ acid is soluble in water. The anhydride is generally insoluble in water, but it can be conveniently dissolved by heating, hydrolysis producing the free acid

Die Methylvinyläther-Maleinsäureanhydrid-Copoly- ,₅ meren, die erfindungsgemäß angewandt werden können, sind bekannt und im Handel erhältlich. Sie sind in Wasser löslich und hydrolysieren langsam unter.Bildung der freien Säure.The methyl vinyl ether maleic anhydride copolymer chain, ₅ mers that can be used in this invention are known and commercially available. They are soluble in water and hydrolyze slowly, forming free acids.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Lösung von mikrobiologischem Rennin, enthaltend Verunreinigungen, mit einer Lösung der Polycarbonsäure vermischt Die Polycarbonsäure wird in einer solchen Menge angewandt, daß das entstehende Gemisch ungefähr 0,1 bis ungefähr 1% (Gew/Vol.) Polycarbonsäure, bezogen auf das Gesamtvolumen des Gemisches, enthält. Der pH-Wert der mikrobiologischen Renninlösung sollte im Bereich von ungefähr 3 bis ungefähr 4 liegen, wenn sie mit der Polycarbonsäure vermischt wird. Wenn der pH-Wert _J0 über ungefähr 4 liegt ist die Bildung an gewünschtem Niederschlag gering. Wenn der pH-Wert unter ungefähr 3 liegt kann das mikrobiologische Rennin inaktiviert werden und die Niederschlagsbildung stark abnehmen. Vorzugsweise beträgt der pH-Wert 3 bis 3,5 Die Mischtemperatur und die Muchzeit zwischen der Polycarbonsäure und der mikrobiologischen Renninlösung sind nicht in engen Grenzen kritisch. Eine Mischtemperatur von ungefähr 15 bis ungefähr 65° C und eine Mischzeit von ungefähr 30 bis ungefähr 90 Minuten sind günstig. Eine Temperatur von mehr als 65° C sollte nicht angewandt werden, da die Gefahr der thermischen Inaktivierung des mikrobiologischen Rennins besteht. Bei Temperaturen oberhalb von ungefähr 4O⁰C nimmt die Niederschlagsbildung deutlich ab. Es hat sich als günstig erwiesen, eine Filterhilfe wie Diatomeenerde zu der mikrobiologischen Renninlösung vor der Zugabe der Polycarbonsäure zuzusetzen. Dadurch wird die Ausflockung des mikrobiologischen Rennin-Polycarbonsäure-Komplexes erleichtert und die _s0 Abtrennung des Komplexes von der die Verunreinigungen enthaltenden Lösung verbessert.When carrying out the process according to the invention, a solution of microbiological rennine containing impurities is mixed with a solution of the polycarboxylic acid. The polycarboxylic acid is used in such an amount that the resulting mixture is about 0.1 to about 1% (w / v) polycarboxylic acid , based on the total volume of the mixture. The pH of the rennin microbiological solution should be in the range of about 3 to about 4 when mixed with the polycarboxylic acid. When the pH _{J0 is} above about 4, the formation of desired precipitate is low. If the pH value is below about 3, the microbiological rennin can be inactivated and the formation of precipitates can be greatly reduced. The pH is preferably 3 to 3.5. The mixing temperature and the Much time between the polycarboxylic acid and the microbiological rennin solution are not critical within narrow limits. A mixing temperature of about 15 to about 65 ° C and a mixing time of about 30 to about 90 minutes are beneficial. A temperature of more than 65 ° C should not be used, as there is a risk of thermal inactivation of the microbiological rennin. At temperatures above about 4O ⁰ C, the precipitation significantly decreases. It has proven beneficial to add a filter aid such as diatomaceous earth to the microbiological rennine solution before adding the polycarboxylic acid. This facilitates the flocculation of the microbiological rennin-polycarboxylic _{acid complex and improves the} separation of the complex from the solution containing the impurities.

Der wie oben hergestellte mikrobiologische Rennin· Polycarbonsäure-Niederschlag kann abfiltriert, abzentrifugiert oder auf andere übliche Weise von der verbleibenden, die Verunreinigungen enthaltenden Lösung abgetrennt werden. Da das mikrobiologische Rennin zur eventuellen Verwendung zur Herstellung von Käse für den menschlichen Verzehr in Betracht gezogen wird, ist es erforderlich, im wesentlichen alle ^₀ Spuren von Polycarbonsäure zu entfernen. Der mikrobiologische Rennin-Polycarbonsäure-Niederschlag-Komplex wird gelöst indem man ihn mit einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert oberhalb ungefähr 5 vermischt Vorzugsweise liegt der pH-Wert bei 6 bis 7. Zu der entstehenden Lösung wird dann ein geeignetes Metallsalz zugesetzt, das ausreichend wasserlöslich ist, um mit der Polycarbonsäure zu reagieren.The microbiological rennine · polycarboxylic acid precipitate prepared as above can be filtered off, centrifuged off or separated from the remaining solution containing the impurities in another conventional manner. Since the microbiological rennet is drawn for possible use in the production of cheese for human consumption into consideration, it is necessary to substantially all ^ ₀ tracks away from polycarboxylic too. The microbiological rennin polycarboxylic acid precipitate complex is dissolved by mixing it with an aqueous medium with a pH value above approximately 5. Preferably, the pH value is 6 to 7. A suitable metal salt is then added to the resulting solution is sufficiently water soluble to react with the polycarboxylic acid.

Solche Metallsalze sind Calciumsalze, wie Calciumcarbonat Calciumacetat Calciumchlorid, Calciumoxid u. ä„ Magnesiumsalze wie Magnesiumacetat Magnesiumchlorid u ä\, Bariumsalze wie Bariumacetat, Bariumchlorid, Bariumoxid u. ä. oder Aluminiumsalze wie Aluminiumkaliumsulfat Aluminiumsulfat u.a. Das zugesetzte Salz kann auch angewandt werden, um den pH-Wert auf einen Wert von über 5 einzustellen. Diese zugesetzten Substanzen können mit der Polycarbonsäure bei einem pH-Wert über ungefähr 5 einen festen Komplex bilden, und dieser Komplex kann von der gereinigten mikrobiologischen Renninlösung abgetrennt werden. Die entstehende hoch gereinigte mikrobiologische Renninlösung kann im allgemeinen, so wie sie ist, verwendet werden, oder sie kann auf irgendeine gewünschte Konzentration eingeengt oder nach üblichen Verfahren zur weiteren Verwendung getrocknet werden. Diese Lösung »so wie sie ist« ist im allgemeinen gegenüber der Ausgangslösung um ein Mehrfaches konzentriert und besitzt neben der hohen Reinheit den Voneil, daß diese Konzentrierung ohne Anwendung von Vakuumverdampfungsverfahren erreicht werden kann, wie sie üblicherweise angewandt werden.Such metal salts are calcium salts, such as calcium carbonate, calcium acetate, calcium chloride, calcium oxide and the like Magnesium salts such as magnesium acetate, magnesium chloride and the like, barium salts such as barium acetate, barium chloride, Barium oxide and the like or aluminum salts such as aluminum potassium sulfate Aluminum sulphate etc. The added salt can also be used to adjust the pH set a value greater than 5. These added substances can with the polycarboxylic acid at a pH above about 5 form a solid complex, and this complex can be removed from the purified microbiological rennin solution are separated. The resulting highly purified microbiological Rennin solution can generally be used as it is, or it can be any Concentrated to the desired concentration or dried for further use by conventional methods will. This solution "as it is" is generally several times that of the initial solution concentrated and, in addition to its high purity, has the advantage that this concentration is without application can be achieved by vacuum evaporation processes commonly used.

Die Lösung von mikrobiologischem Rennin, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wird, ist helle'· und besitzt eine niedrigere Viskosität als die bekannten Renninlösungen, die die gleiche Menge an mikrobiologischer Renninaktivität enthalten.The microbiological rennin solution produced by the process of the invention is bright '· and has a lower viscosity than that known rennin solutions that contain the same amount of microbiological rennin activity.

Die Polycarbonsäure kann zur erneuten Verwendung in dem Verfahren zurückgewonnen werden. Der wie oben gebildete Metallsalz-Polycarbonsäure-Komplex wird in Wasser aufgeschlämmt und mit einer stöchiometribchen Säuremenge, wie Schwefelsäure, die stärker ist als die Polycarbonsäure, behandelt. Dabei wird die Polycarbonsäure aus dem Komplex freigesetzt, und es bildet sich ein Salz aus dem Metallkation des Komplexes und der zugegebenen Säure. Wenn das entstehende Salz unlöslich ist, wie das Calciumsulfat, das bei der Umsetzung eines Calciumions und zugesetzter Schwefelsäure entsteht wird der entstehende Niederschlag von der Polycarbonsäurelösung vor deren erneuter Verwendung abgetrennt Wenn das entstehende Salz löslich ist, wie das Magnesiumsalz, das Dei der Umsetzung zwischen einem Magnesiumkation und zugesetzter Schwefelsäure entsteht kann die entstehende Lösung aus dem löslichen Salz und der Polycarbonsäure erneut angewandt werden, um mikrobiologisches Rennin zu gewinnen. Wenn der mikrobiologische Rennin-Polycarbonsäure-Komplex-Niederschlag entstanden und von den löslichen Verunreinigungen abgetrennt ist, werden die erwähnten löslichen Salze mit der Lösung verworfen.The polycarboxylic acid can be recovered for reuse in the process. The how Metal salt-polycarboxylic acid complex formed above is slurried in water and with a stoichiometribchen Amount of acid, such as sulfuric acid, which is stronger than the polycarboxylic acid, is treated. The Polycarboxylic acid is released from the complex, and it forms a salt from the metal cation of the complex and the added acid. If the resulting salt is insoluble, like the calcium sulfate used in the Implementation of a calcium ion and added sulfuric acid creates the resulting precipitate separated from the polycarboxylic acid solution before it is used again If the resulting salt is soluble, like the magnesium salt, the Dei the conversion between a magnesium cation and added sulfuric acid can form the resulting solution from the soluble salt and the polycarboxylic acid reapplied to obtain microbiological rennin. If the microbiological Rennin-polycarboxylic acid complex precipitate emerged and from the soluble impurities is separated, the mentioned soluble salts are discarded with the solution.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelte mik-obiologische Rennin wurde auf seine Milchgerinnungsaktivität auf die folgende Weise untersucht. Eine 10%ige (Gew7Vol.) wäßrige Lösung wurde hergestellt durch Lösen der entsprechenden Menge nicht fetter, trockener Milchfeststoffe in Wasser. Zu dieser Lösung wurde dann CaCb · 2 H2O zugegeben bis zu einer Konzentration von 0,01 m Calcium. 5 ml dieser Milchlösung wurden in ein Reagenzglas gegeben und auf 37,5°C erhitzt. 0,5 ml einer wäßrigen verdünnten Enzymlösung mit einer Temperatur von 37,5°C wurden dann zu der Milchlösung in dem Reagenzglas gegeben. Das Enzym-Milch-Gemisch wurde dann gerührt und die Zeit bis zur Bildung des ersten Klumpens gemessen. Die Enzymkonzentration wurde so gewählt, daß die Gerinnungszeit ungefähr 4 Minuten betrug. DieThe micobiological rennin treated according to the method according to the invention was tested for its milk coagulation activity examined in the following way. A 10% (wt. 7Vol.) Aqueous solution was made by dissolving the appropriate amount of non-fat, dry milk solids in water. to CaCb · 2 H2O was then added to this solution up to a concentration of 0.01 M calcium. 5 ml of this Milk solutions were placed in a test tube and heated to 37.5 ° C. 0.5 ml of an aqueous dilute Enzyme solution at a temperature of 37.5 ° C was then added to the milk solution in the test tube. The enzyme-milk mixture was then stirred and the time taken for the first lump to form was measured. the Enzyme concentration was chosen so that the clotting time was approximately 4 minutes. the

Milchgerinnungsaktivität des Enzyms wurde wie folgt Soxhlet-Emheiten =Milk coagulation activity of the enzyme was as follows Soxhlet units =

£(mg)£ (mg)

Γ (see)Γ (see)

M = Milchvolumen
E = Enzymgewicht
T = Zeit bis zur ersten KJumpenbUdung M = milk volume
E = enzyme weight
T = time to first training

Die Enzymaktivität wird in Soxhlet-Einheiten (SE) pro Gramm angegeben. Wenn das ursprünglich angewandte Enzym in flüssiger Form und nicht in Form eines in Wasser löslichen Pulvers angewandt wird, wird bei der obigen Formel das entsprechende Volumen in μΐ fangegeben und die Enzymaktivität als Soxhlet-Einheit pro ml angegebea Eine Soxhlet-Einheit ist die Menge an Enzymaktivität, die 1 ml der obigen Milchlösung in 40 Minuten zum Gerinnen bringen kann.The enzyme activity is given in Soxhlet units (SE) per gram. If that was originally applied enzyme is applied in liquid form and not in the form of a water-soluble powder in the above formula, the corresponding volume is given in μΐ and the enzyme activity as a Soxhlet unit A Soxhlet unit is the amount of enzyme activity that 1 ml of the above milk solution in 40 Minutes to curdle.

Die Lipaseaktivität der erfindungsgemäß behandelten mikrobiologischen Renninlösung wurde auf die folgende Weise bestimmt Es wurde ein Reaktionsgemisch hergestellt durch Emulgieren von 15 ml Tributyrin in 135 ml einer 10%igen (Gew/Vol.) wäßrigen Lösung von Gummiarabikum. Die entstehende Tributyrinemulsion wurde dann mit 60 ml einer 0,001 m wäßrigen Lösung von Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Puffer, pH 8,0, 60 ml einer 3,0 m wäßrigen Natriumchloridlösung und 180 ml destilliertem Wasser vermischt. 5 ml dieses Gemisches wurden auf einen pH-Wert von 8,0 gebracht und in die Reaktionsmulde eines Instruments gegeben, mit dessen Hilfe es möglich ist, ausreichende Mengen an 0,02 η wäßriger Natriumhydroxidlösung zuzugeben, um den pH-Wert des Reaktionsgemisches auf 8,0 zu halten. Das zu bestimmende Enzym wurde, wenn es ein Pulver war, in einer 0,0Cl m wäßrigen Lösung von Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCL-Puffer bei einem pH-Wert von 8,0 gelöst. Wenn ein flüssiges Enzym bestimmt werden sollte, wurde es auf einen pH-Wert von 8,0 gebracht. 1 ml des flüssigen Enzyms wurde zu den obigen 5 ml Reaktionsgemisch gegeben und das Reaktionsgemisch-Enzym-Gemisch 3 bis 4 Minuten auf 35⁰C gehalten. Während dieser Zeit wurde der pH-Wert des gesamten Gemisches durch Zugabe der oben angegebenen Natriumhydroxidlösung auf 8 0 gehalten. Die Gesamtzeit in Sekunden und die Gesamtmenge an 0,02 η Natriumhydroxidlösung, die zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von 8,0 erforderlich war, wurde gemessen. Die Lipaseaktivität wurde dann folgendermaßen berechnet:The lipase activity of the microbiological rennin solution treated according to the invention was determined in the following manner: A reaction mixture was prepared by emulsifying 15 ml of tributyrin in 135 ml of a 10% (w / v) aqueous solution of gum arabic. The resulting tributyrin emulsion was then mixed with 60 ml of a 0.001 M aqueous solution of tris (hydroxymethyl) aminomethane HCl buffer, pH 8.0, 60 ml of a 3.0 M aqueous sodium chloride solution and 180 ml of distilled water. 5 ml of this mixture were brought to a pH of 8.0 and placed in the reaction well of an instrument with the aid of which it is possible to add sufficient amounts of 0.02 η aqueous sodium hydroxide solution to bring the pH of the reaction mixture to 8 To hold 0. The enzyme to be determined, if it was a powder, was dissolved in a 0.0Cl m aqueous solution of tris (hydroxymethyl) aminomethane-HCl buffer at a pH of 8.0. When a liquid enzyme was to be determined it was brought to pH 8.0. 1 ml of the liquid enzyme was added to the above 5 ml reaction mixture and the reaction mixture-enzyme mixture was ^{kept at 35 °} C. for 3 to 4 minutes. During this time the pH of the entire mixture was kept at 8 0 by adding the sodium hydroxide solution given above. The total time in seconds and the total amount of 0.02 η sodium hydroxide solution required to maintain a pH of 8.0 were measured. The lipase activity was then calculated as follows:

t~ u · ^V ' ¹²⁰°t ~ u · ^V ' ¹²⁰ °

Lipase-Einneiten = —- Lipase Einneiten = ---

V = Volumen Natriumhydroxid (ml)
T = Zeit (see) V = volume of sodium hydroxide (ml)
T = time (see)

Die Enzymaktivität wird dann in Lipase-Einheiten ίο (LE) pro ml angegeben. Eine Lipase-Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die erforderlich ist, um ein μΜοΙ Fettsäure pro Minute unter den angegebenen Bedingungen zu bilden. Das zugesetzte Natriumhydroxid, um den pH-Wert der entstehenden Fettsäure zu neutralisieren, ist ein Maß für die Fettsäurebildung.The enzyme activity is then expressed in lipase units ίο (LE) stated per ml. One lipase unit is defined than the amount of enzyme required to produce a μΜοΙ Forming fatty acids per minute under the specified conditions. The added sodium hydroxide to the Neutralizing the pH value of the resulting fatty acids is a measure of the fatty acid formation.

Die Erfindung wird durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele näher erläutertThe invention is illustrated in more detail by the following non-limiting examples

Beispiel 1example 1

Eine wäßrige Lösung von mikrobiologischem Rennin wurde erhalten durch übliche Fermentation eines wäßrigen Nährmediums mit einer Kultur von Mucor miehei NRRL 3420 und Abfiltrieren des Mycels. 181 des entstehenden Filtrats wurden bei 19°C durch Zugabe von Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,2 gebracht und mit 9 g Diatomeenerde als Filterhilfe vermischt. 360 ml einer wäßrigen Lösung von einer Polyacrylsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 180 000 bis ungefähr 220 000 wurden langsam unter gutem Rühren zugegeben. Die Konzentration der Polycarbonsäure in dem entstehenden Gemisch betrug 0,1% (Gew/Vol.). Das Gemisch wurde dann 1 Stunde stehengelassen, wobei sich der größte Teil der Feststoffe absetzte. Die Feststoffe wurden von der Flüssigkeit abgetrennt und in 4,51 destilliertes Wasser, enthaltend 20 g Calciumcarbonat, gerührt. Der pH-Wert des Gemisches stieg nach 50 Minuten langem Mischen auf 6,1. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und auf 650 ml eingeengt Es wurden insgesamt 94% Enzymaktivität, bezogen auf die Ausgangslösung, gewonnen. Die wie oben erhaltene isolierte, gereinigte mikrobiologische Renninlösung wurde mit der nicht behandelten mikrobiologischen Renninlösung mit der gleichen Gesarntmilchgerinnungsaktivität pro Volumeneinheit verglichen. Die Eigenschaften dieser Renninlösungen sind im folgenden angegeben:An aqueous solution of microbiological rennin was obtained by conventional fermentation of a aqueous nutrient medium with a culture of Mucor miehei NRRL 3420 and filtering off the mycelium. 181 des The resulting filtrate was brought to a pH of 3.2 at 19 ° C. by adding hydrochloric acid and mixed with 9 g of diatomaceous earth as a filter aid. 360 ml of an aqueous solution of a polyacrylic acid with average molecular weights from about 180,000 to about 220,000 were slowly falling below added good stirring. The concentration of the polycarboxylic acid in the resulting mixture was 0.1% (w / v). The mixture was then left to stand for 1 hour, during which time most of the Solids settled. The solids were separated from the liquid and poured into 4.5 liters of distilled water, containing 20 g calcium carbonate, stirred. The pH of the mixture rose after 50 minutes Mix to 6.1. The reaction mixture was filtered and concentrated to 650 ml. A total of 94% Enzyme activity, based on the starting solution, obtained. The isolated purified as obtained above microbiological rennin solution was mixed with the untreated microbiological rennin solution with the same total milk clotting activity per unit volume compared. The properties of these Rennin solutions are given below:

FeststoffeSolids Gesamttotal Farbe.Color. Viskositätviscosity VerVer Lipase-Lipase Proteinprotein zuckersugar optischeoptical bei 26° C cPat 26 ° C cP brennungsburning Einheitenunits Dichte beiDensity at rückstandResidue (O/O)(O / O) (0/0)(0/0) 420 mm420 mm (0/0)(0/0) (0/0)(0/0)

Nicht behandeltNot treated 30,030.0 4,674.67 2,242.24 4,74.7 7,17.1 2626th 4,674.67 GereinigtCleaned 2,32.3 0,200.20 0,790.79 0,50.5 0,250.25 11 2,02.0

Diese Werte zeigen deutlich die durch das erfindungsgemäße Verfahren erreichte Reinigung. Die Asche, die Viskosität, der Gehalt an nichtenzymatischen Pi steinen und Lipase sind deutlich verringert, und die Farbe ist verbessert, ohne daß eine nennenswerte Menge an mikrobiologischer Renninaktivität verlorengegangen ist. Das Enzymmaterial konnte dann auf bekannte Weise zur Herstellung von Käse angewandt werden.These values clearly show the results achieved by the invention Procedure achieved purification. The ash, the viscosity, the content of non-enzymatic stones and lipase are significantly reduced, and the color is improved without a significant amount of microbiological inactivity has been lost. The enzyme material could then be processed in a known manner used to make cheese.

Beispiel 2Example 2

Eine wäßrige mikrobiologische Renninlösung wurde durch übliche Fermentation eines wäßrigen Nährmediums mit einer Kultur von Mucor pusillus und Abfiltrieren des Mycels gewonnen. Pulverförmiges mikrobiologisches Rennin wurde aus dem Filtrat auf bekannte Weise gewonnen. 10,6 g dieses pulverförmigen Enzyms wurden in 1 1 Wasser gelöst Die entstehende Lösung wurde bei ungefähr 20⁰C durch Zugabe von Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,2 gebracht. Zu dieser Lösung wurden dann unter Rühren 40 ml einer 5%igen Lösung der im Beispiel 1 angegebenen Polyacrylsäure gegeben. Die Konzentration an Polycarbonsäure in dem entstehenden Gemisch betrug 0,2% (Gew./Vol.). Das Gemisch wurde dannAn aqueous microbiological rennin solution was obtained by conventional fermentation of an aqueous nutrient medium with a culture of Mucor pusillus and filtering off the mycelium. Powdered microbiological rennin was obtained from the filtrate in a known manner. 10.6 g of this powdery enzyme were dissolved in 1 l of water. The resulting solution was brought to a pH of 3.2 ^{at approximately 20 ° C. by adding hydrochloric acid.} 40 ml of a 5% strength solution of the polyacrylic acid given in Example 1 were then added to this solution with stirring. The concentration of polycarboxylic acid in the resulting mixture was 0.2% (w / v). The mixture then became

ungefähr 1 Stunde stehengelassen, wobei sich ein Niederschlag bildete. Dieser Niederschlag wurde durch Zentrifugieren und Abdekantieren der Flüssigkeit gewonnen und in 400 ml Wasser dispergiert. Es wurde langsam Calciumcarbonat zugegeben, bis der pH-Wert auf 6,1 stieg. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert. Das Filtrat enthielt 85% der Gerinnungsaktivität, die in der Ausgangslösung des pulverförmigen mikrobiologischen Rennins enthalten war.allowed to stand for about 1 hour during which time a precipitate formed. This precipitate was through Centrifuge and decant the liquid obtained and dispersed in 400 ml of water. It was slowly added calcium carbonate until the pH rose to 6.1. The reaction mixture was filtered. The The filtrate contained 85% of the coagulation activity in the starting solution of the powdered microbiological Rennins was included.

Beispiel 3Example 3

11 einer mikrobiologischen Renninlösung, die vermutlich durch Fermentation einer Kultur von Mucor miehei Stamm CBS 370.65 erhalten worden war, wurde mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,2 gebracht und dann mit 50 ml einer wäßrigen Lösung von 2 Gewichtsprozent einer Polycarbonsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 3 bis 5 Millionen vermischt. Die Konzentration an Polycarbonsäure in dem entstehenden Gemisch betrug 0,1% (Gew/Vol.). Das Gemisch wurde dann 30 Minuten stehengelassen, wobei sich ein Niederschlag bildete. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen und in 300 ml Wasser, enthaltend 0,9 g Calciumcarbonat, suspendiert Der pH-Wert stieg in 30 Minuten auf 5,8. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert. Das Filtrat enthielt 90% der ursprünglichen Gerinnungsaktivität.11 of a microbiological solution of rennin, presumably obtained by fermentation of a culture of Mucor miehei strain CBS 370.65 brought to a pH of 3.2 with hydrochloric acid and then with 50 ml of an aqueous solution of 2 Weight percent of a polycarboxylic acid with an average molecular weight of about 3 to 5 Millions mixed up. The concentration of polycarboxylic acid in the resulting mixture was 0.1% (Weight / volume). The mixture was then 30 minutes allowed to stand, whereby a precipitate formed. The precipitate was collected by centrifugation and suspended in 300 ml of water containing 0.9 g of calcium carbonate. The pH rose to 5.8 in 30 minutes. The reaction mixture was filtered. The filtrate contained 90% of the original clotting activity.

Beispiel 4Example 4

990 ml einer mikrobiologischen Renninlösung, die vermutlich durch Fermentation einer Kultur von Mucor miehei NRRL 3169 erhalten worden war, wurde mit Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 3,1 gebracht und dann mit 5 g Diatomeenerde als Filterhilfe und 130 ml einer wäßrigen Lösung von 5 Gewichtsprozent der in Beispiel 1 angegebenen Polyacrylsäure vermischt Die Konzentration an Polyacrylsäure in dem entstehenden Gemisch betrug 0,66% (Gew7Vol.). Das Gemisch wurde dann 1 Stunde stehengelassen, die Feststoffe entfernt und in 300 ml Wasser, enthaltend 6,5 g Calciumcarbonat, suspendiert. Der pH-Wert stieg nach 40 Minuten auf 5,7. Das Reaktionsgemisch wurde abfiltriert. Das Filtrat enthielt 96% der ursprünglichen Gerinnungsaktivität.990 ml of a microbiological solution of rennin, presumably produced by fermentation of a culture of Mucor miehei NRRL 3169 was brought to pH 3.1 with phosphoric acid and then with 5 g of diatomaceous earth as filter aid and 130 ml of an aqueous solution of 5 percent by weight of the in Example 1 given polyacrylic acid mixed The concentration of polyacrylic acid in the resulting Mixture was 0.66% (7% by weight). The mixture was then allowed to stand for 1 hour and the solids removed and suspended in 300 ml of water containing 6.5 g of calcium carbonate. The pH rose to 5.7 after 40 minutes. The reaction mixture was filtered off. The filtrate contained 96% of the original clotting activity.

Beispiel 5Example 5

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde getrennt wiederholt, wobei getrennte Lösungen von drei verschiedenen hydrolysierten Äthylen-Maleinsäure-anhydrid-Copolymeren Polycarbonsäuren in Konzentrationen von 0,1% (Gew7Vol.) angewandt wurden. Die Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymere sind im Handel erhältlich. Sie wurden zunächst mit Wasser vermischt und auf eine Konzentration von ungefähr 5 Gewichtsprozent gebracht und dann zum Sieden erhitzt, bis eine klare Lösung entstand. Das erforderte ungefähr 10 Minuten. Die entstehende Lösung wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und zu der mikrobiologischen Renninlösung gegeben. Die entstehenden Niederschläge wurden gewonnen und mit einer wäßrigen Lösung von Calciumcarbonat bei einem pH-Wert von ungefähr 6 behandelt. Die entstehenden Niederschläge wurden abfiltriert, wobei Filtrate entstanden, die das isolierte, gereinigte Rennin enthielten und im wesentlichen die gesamte ursprüngliche Gerinnungsaktivität.The procedure of Example 1 was repeated separately, using separate solutions of three various hydrolyzed ethylene maleic anhydride copolymers Polycarboxylic acids in concentrations of 0.1% (weight 7 vol.) Were used. the Ethylene-maleic anhydride copolymers are commercially available. They were first treated with water mixed and brought to a concentration of about 5 percent by weight and then heated to the boil, until a clear solution resulted. That took about 10 minutes. The resulting solution was then on Cooled to room temperature and added to the microbiological rennin solution. The resulting precipitation were recovered and treated with an aqueous solution of calcium carbonate at a pH of about 6 treated. The resulting precipitates were filtered off, resulting in filtrates containing the isolated, purified rennin contained and substantially all of the original clotting activity.

Während bei den obigen Beispielen Polyacrylsäuren oder hydrolysierte Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymere zur Ausfällung des mikrobiologischen Rennins verwendet wurden, können selbstverständlich auch hydrolysierte MethylvinylätheraMaleinsäureanhydrid Copolymere für diesen Zweck angewandt werden.While in the above examples polyacrylic acids or hydrolyzed ethylene-maleic anhydride copolymers were used to precipitate the microbiological rennin, can of course also hydrolyzed methyl vinyl ether-maleic anhydride copolymers can be used for this purpose.

Claims (3)

Patentansprüche: 24 I 232Claims: 24 I 232 1. Verfahren zur Rejiigung von mikrobiologischem Rennin, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung von mikrobiologischem Rennin, enthaltend Verunreinigungen, welche einen pH-Wert von ungefähr 3 bis ungefähr 4 besitzt, mit einer Polycarbonsäure vermischt, den entstandenen Niederschlag von der die Verunreinigungen enthaltenden Lösung abtrennt und dann durch Vermischen mit einer wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von über 5 löst, worauf man zu dieser Lösung ein geeignetes Metallsalz, das wasserlöslich ist und mit der Polycarbonsäure einen festen Komplex bildet, zusetzt und den entstandenen Niederschlag von der gereinigten mikrobiologischen Renninlösung abtrennt1. Process for rejiying microbiological Rennin, characterized in that an aqueous solution of microbiological Rennine containing impurities which has a pH of about 3 to about 4, mixed with a polycarboxylic acid, the resulting precipitate from which the impurities containing solution separated and then by mixing with an aqueous solution with a pH value above 5 dissolves, whereupon a suitable metal salt, which is water-soluble, is added to this solution is and forms a solid complex with the polycarboxylic acid, adds and the resulting Separates precipitate from the purified microbiological rennin solution 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polycarbonsäure in einer Menge von ungefähr 0,1 bis 1% (GewVVoL), bezogen auf das Gesamtvolumen des Gemisches, verwendet2. The method according to claim 1, characterized in that the polycarboxylic acid in one Amount of about 0.1 to 1% (GewVVoL), based on the total volume of the mixture 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß man als Polycarbonsäure Polyacrylsäure, hydrolysiertes Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymer und/oder hydrolysiertes Me-3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that one is used as the polycarboxylic acid Polyacrylic acid, hydrolyzed ethylene maleic anhydride copolymer and / or hydrolyzed meth- thylvinyläther-Maleinsäureanhydrid-Copolymerethyl vinyl ether-maleic anhydride copolymer