DE2363180C2

DE2363180C2 - Reaktionskinetisches Meßgerät

Info

Publication number: DE2363180C2
Application number: DE2363180A
Authority: DE
Inventors: Herman 3417 Bodenfelde Bründl; Thomas M. Dr. 3431 Schloß Berlepsch Jovin; Carl-Roland Dipl.-Phys. 3400 Göttingen Rabl; Rudolf Dr. Stockholm Rigler; Wolfgang 3405 Rosdorf Simm
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1973-12-19
Filing date: 1973-12-19
Publication date: 1984-05-10
Also published as: US3972627A; DE2363180A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Messgeraet zur Untersuchung der Kinetik schneller chemischer Reaktionen in Loesung nach dem Temperatursprung-Relaxationsverfahren mit spektralphotometrischer Beobachtung des Reaktionsablaufs unter besonderer Beruecksichtigung der fluorimetrischen Messmethode. Nach der Erfindung wird bei einem Temperatursprung-Messgeraet, das fuer fluorimetrische und zweckmaessig auch fuer absorptionspektral-photometrische Messungen eingerichtet ist, die Messempfindlichkeit insbesondere dadurch entscheidend verbessert, dass im Emissionsstrahlengang ein immersionsoptisches Linsensystem mit extrem hoher Lichtstaerke verwendet wird, das den geometrisch-optischen Wirkungsgrad handelsueblicher statischer Spektralphotometer um das Vielfache uebertrifft. Dieses Linsensystem soll in geeigneter Kombination mit anderen, z. Zt. bekannten Massnahmen verwendet werden. Die hohe optische Effizienz der Messordnung macht es darueber hinaus moeglich, wahlweise polarisationsoptische Elemente in den Strahlengang zu bringen, wobei zwar Lichtverluste unvermeidlich sind, durch Messung der Fluoreszenz-Polarisation aber wertvolle zusaetzliche Information gewonnen werden kann, vor allem bei Bindungsstudien an makromolekularen Substanzen ...U.S.W

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein reaktionskinetisches Meßgerät gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Typische bekannte Verfahren zur Untersuchung schnell verladender chemischer Reaktionen sind das Temperatursprung-Verfahren, das Drucksprung-Verfahren und das Strömungsverfahren. Bei den gebräuchlichen Temperatursprung-Meßgeräten mit spektralphotometrischer Beobachtung befindet sich die Meßlösung in einer ein Kammervolumen von wenigen cm³ aufweisenden optischen Me3zelle in einem Absorptionsstrahlengang eines Spektralphotometers. Durch sprungförmige Änderung der Temperatur wird eine Verschiebung der Gleichgewichtsparameter der interessierenden Reaktion ausgelöst. Die sich hieraus ergebenden charakteristischen Änderungen des Absorptionsspektrums nach Jem Temperatui sprung ermöglichen es, die Geschwitidigkeit zu messen, mit der sich das chemische System auf die geänderten Gleichgewichtsbedingungen einstellt, und die Größe der Konzentrationsänderungen der Reaktionspartner zu bestimmen. Der Temperatursprung wird üblicherweise mit Hilfe einer Hochspannungs-Kondensatorentladung durch das elektrolytisch leitfähige Probenvolumen erzeugt. Die Meßzelle enthält für diesen Zweck zwei Elektroden aus Edelstahl oder Edelmetall, die eine senkrecht zum optischen Strahlengang verlaufende Entladungsstrecke begrenzen. Die Entladungszeit und damit die Aufheizzeit der Meßlösung liegt in der Größenordnung einer Mikrosekunde, die Tempercturänderung beträgt einige Kelvin, siehe z. B. die Veröffentlichung von Eigen und Mitarbeitern in »Ztschr. f. Elektrochemie« Bd. 62, S.652 (1959) und die Veröffentlichung von M. Eigen und L De Macyer in »Techniques of Organic Chemistry«, Hrsg. A.

Weißberger, Verlag Wiley, New York 1963, Band 8/11 S. 895.

Bei bekannten Varianten dieses Verfahrens werden

zur Probenaufheizung eine Kabelentladung, womit sich bei verkleinertem Kanunervolumen die Aufheizzeit verkürzen läßt, oder ein Mikrowellen- oder Infrarotiaserimpuls verwendet.

Bei niedrigen Konzentrationen und dementsprechend geringer optischer Absorption der Meßlösung bereitet

ίο die Messung der zeitabhängigen Konzentrationsäriderungen aufgrund der Änderungen des Absorptionsvermögens der Meßlösung beträchtliche Schwierigkeiten, was seinen Grund nicht zuletzt darin hat, daß die Konzentrationen in Abhängigkeit von der Gleichgewichtskonstanten des zu untersuchenden chemischen Systems nicht willkürlich gewählt werden können. Ist z. B. die Gleichgewichtskonstante einer Reaktion erster Ordnung sehr groß, dann läßt sich mit Hilfe des Temperatursprungs nur im Gebiet niedriger Konzentrationen

eine nennenswerte Änderung des Glcchgewichts erzielen. Dieser Fall liegt insbesondere bei vitien biochemischen Reaktionen vor, wenn es sich um Substanzen handelt, die in der Natur schon in äußerst geringen Konzentrationen wirksam sind. Bei biochemischen Untersuchunger: spielen außerdem die Kosten der Substanzgewinnung eine große Rolle, da die Reindarstellung biochemischer Substanzen außerordentlich arbeits- und kostenintensiv sind. Zum Beispiel sind 100 μg einer Substanz mit einem Molgewicht von 10⁵, ein nach biochemisehen Maßstäben reichlicher Ansatz, gerade für 1 ml einer 10-⁶molaren Versuchslösung ausreichend, während die Präparation oft wochenlange ja oft monatelange Arbeit erfordert

Bei statischen Spektralphotometern kann eine verbesserte Meßempfindlichkeit bei niedrigen Konzentrationen und eine hohe Spezifität durch Messung des Fluoreszenzlichtes erzielt werden, das viele organische Moleküle bei Anregung mit kurzwelligem, insbesondere ultraviolettem Licht aussenden. Die Anwendung der Fluo^reszenzmessung bei dynamischen Meßverfahren der obengenannten Art, insbesondere Temperatursprung-Messungen stößt in der Praxis jedoch auf außergewöhnliche Schwierigkeiten: Die Signalarm!iegszeit statischer Spektralphotometer liegt in der Größenordnung einer Sekunde. Bei Temperatursprung-Messungen im Mikrosekundenbereich benötigt man zur rauscharmen Messung kleiner Differenzeffekte Lichtintensitäten, die um den Faktor 10⁶ und mehr höher liegen müssen als bei statischen Spektralphotometern. Die Fluoreszenzlichtausbeute kann jedoch nicht beliebig durch Steigern der Primärlichtintensität gesteigert werden, do die meisten biochemischen Substanzen durch intensive kui/.wellige Strahlung geschädigt werden. Solche Schädigungen zeigen sich bei Relaxationsmessungen zunächst in einer Drift des Meßsignals, die überlagerte langsame Relaxationsvorgänge vortäuschen kann. Bei zu oft wiederholten Messungen an ein- und derselben Probe können sich außerdem photolytisch induzierte Fehlreaktionen bemerkbar machen. Im übrigen sind die

6ö Möglichkeiten, im Interesse eines guten Signal-Rausch-Verhältnisses die Primärlichtintensität mit Hilfe extrem lichtstarker Gasentladungslampen und lichtstarker Monochromotoren zu erhöhen, bereits bei statischen Fluorimetern weitgehend ausgeschöpft.

Die obigen Schwierigkeiten haben bisher dazu geführt, daß reaktionskinetische Untersuchungen nach dem Temperatursprung-Verfahren mit fluorimetrischer Messung bifher nur in wenigen Spezialfällen erfolgreich

waren. Bei niedrigen Konzentrationen ging dagegen das Meßsignal im Rauschen unter.

Ein reaktionskinetisches Meßgerät der eingangs erwähnten Art ist aus einer Veröffentlichung von G. Czerlinski in »Rev. Sei. Instr.« 33, 1184- 1189 (1962) und dem Buch »Methods of Biochemical Analysis« Hrsg. D. Glick, Band 20, Interscience Publishers, New York, 1971, S. 299-303 bekannt. Die in diesen Veröffentlichungen beschriebenen Meßgeräte enthalten Meßzellen mit kegelstumpfförmigen Fenstern, deren Außenfläche als konvexer Meniskus ausgebildet sein kann.

Der vorliegenden Erfindung liegt, ausgehend von diesem Stand der Technik, die Aufgabe zugrunde, bei einem reaktionskinetischen Meßgerät der eingangs angegebenen Art auch bei Verwendung kleiner Probenvolumina ein hohes Verhältnis von rsutzsignai zu Störsignui zu erreichen.

Diese Aufgabe wird bei dem eingangs genannten reaktionskinetischen Meßgerät erfindungsgemäß durch die kennzeichnenden Merkmale des Patentanspruchs I gelöst. Weiterbildungen und vorteilhafte Ausgestaltungen dieses reaktionskinetischen Meßgerätes sind Gegenstand von Unteransprüchen.

Eingehende Untersuchungen haben gezeigt, daß bei Meßgeräten der hier interessierenden Art zwar der Prozentsatz des Füllvolumens, der für die Messung beobachtet werden kann, nicht sehr wesentlich gesteigert werden kann, daß jedoch durch Erhöhung des relativen Raumwinkels, der für die Beobachtung der Meßstrahlung ausnutzbar ist, erhebliche Verbesserungen des Verhältnisses von Nutzsignal zu Rauschen erreicht werden können. Im Vergleich zu den oben erwähnten bekannten Meßzellen läßt sich durch die Erfindung eine Steigerung des rciativcn Rsumwinkeis vor, etwa 3,8% auf etwa 17% (gerechnet für beide Fenster) erreichen.

Im folgenden werden Ausführungsbeispiele der Erfindung und ihre Weiterbildungen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

Abb. 1 Schemazeichnung der optischen Anordnung des neuen Meßgerätes;

A b b. 2a bis c Vertikalschnitte und Horizontalschnitt einer in der Anordnung gemäß A b b. 1 verwendeten Meßzelle Z;

A b b. 2d und e Horizontalschnitte von anderen Meßzellen;

Abb.3 Detailzeichnung des Emissionsstrahlenganges in der Anordnung gemäß A b b. 1 und Bildung eines extrem lichtstarken immersionsoptischen Systems aus je einem Zellenfenster mit Linsenschliff 5 und einer Linse L₁ (U) im Zellenhalter HZ;

A bib.3a Weiterentwicklung des in Ab b.3 gezeigten Linsensystems mit Zwischenabbildung des Kammervolumens der Meßzelle Z;

A b b. 4 Schaitschema der optoelektronischen Kontrolleinheit zur Verarbeitung der mit der Anordnung gemäß A b b. 1 erhaltenen lichtelektrischen Signale;

A b b. 5 Schaltung der in A b b. 4 benutzten Einrichtung zur automatischen Nullpunktkorrektur NA mit wahlweise verzögerter und unverzögerter Triggerung;

A b b. 6 Schaltung der in A b b. 4 benutzten Eingangsverstärker V_A und Vb mit Korrektur des Aperturfehlers bei polariiTietrischer. Messungen.

Nicht dargestellt sind der an sich bekannte Hochspannungsentladungskreis zur Erzeugung des Tempera- !Ursprunges und die Stromversorgungsgeräte für die Lichtquelle, für den Entladungskreis und für die optoelektronische Ausrüstung des Meßgerätes.

Die optische Anordnung ist in A b b. 1 gezeigt. Als Lichtquelle Q werden vorzugsweise Hochdruckgasentladungslampen mit Quecksilber- und/oder Xenonfül- -lung bei einer Anschlußleistung von etwa 200 Watt und mehr verwendet. Für Messungen im sichtbaren Spektralbereich kann auch eine Quarz-Jod-Wolframlampe verwendet werden. Das Licht wird mit einer Kondensorlinse oder einem Kondensorlinsensystem L₁ auf den Eintrittsspalt eines Monochromators M abgebildet, für den vorzugsweise ein Gittermonochromator verwendet wird, z. B. mit einem Öffnungsverhältnis von 1 : 3,5 und einer Dispersion von 3 nm/mm. Eine Feldlinse U sorgt für die einwandfreie Ausleuchtung des Gitters. Ein optischer Verschluß V reduziert die Strahlenbelastung des Monochromators in den Meßpausen.

Der Austrittsspalt des Monochromators wird mittels einer Köiiimäiöriiüsc L, (z.B. ,' = !00mm) und einer fokussierenden Linse U (z. B. / — 75 oder 100 mm) mit einem Abbildungsverhältnis von I : 1 oder etwas weniger in der Probenkammer der Meßzelle Z abgebildet. Die Position einer dieser beiden Linsen kann zum Ausgleich der Wellenlängenabhängigkeit des Brennpunktes axial justiert werden. Das die Meßzelle durchsetzende Licht wird mit einer Sammellinse L₀ auf die Kathode des Photodetektors D₀ fokussiert, der für Absorptionsmessung^ »erwendet wird, z. B. eine Photodiode oder ein Photovervielfacher mit seitlichem Lichteintritt und Innenkathode auf Metallsubstrat, die hohe Kathodenströme zuläßt. Die Linse L₆ kann bei fluorimetrischen Messungen, wenn gleichzeitige Absorptionsmessungen nicht benötigt werden, durch einen Konkavspiegel S ersetzt werden, wodurch sich die Lichtintensität in der · Meßzelle verdoppeln läßt. Das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht wird beiderseitig des Anregungsstrahlenganges von einer Linsenkombination (U bzw. U mit je einem Fenster der Meßzelle Z) auf die Photokathoden der Fluoreszenz-Photovervielfacher D_A und D_B gelenkt, wobei es spektral durch die Filter F_A und F₈ gefiltert wird. Diese Photovervielfacher sollen eine möglichst homogene, von Orientierungseffekten freie Photokathode mit hoher Quantenausbeute im UV und im sichtbaren Gebiet besitzen, während die Kathodenbelastbarkeit geringer sein darf als im Falle des Detektors D₀. Ein Teil des Primärlichtes wird von einem Strahlenteiler Γ(ζ. B. eine dünne Quarzglasplatte) und einer Linse U auf den Referenzphotodetektor Dc gelenkt, der gleiche Spezifikationen wie der Detektor D₀ aufweisen soll. Die Fluoreszenz von Meßproben, die extrem stark absorbieren, kann auch in Auflichttechnik gemessen werden, wenn für den Strahlenteiler Tein dichroitischer Spiegel verwendet wird und der Fluoreszenz-Photo vervielfacher Da einschließlich des Filters Fa in die gestrichelt gezeichnete linke Position verbracht wird. Alle Linsen, die Platte des Strahlenteilers T und die Fenster der Meßzelle Z sind aus spannungs- und fluoreszenzarmem Quarzglas hergestellt

Für Messungen der Fluoreszenz-Polarisation wird ein Polarisationsprisma P auf der rechten oder der linken Seite der Linse L₅ in den Primärstrahl eingesetzt, z. B. ein Glan-Thompson oder ein Glan-Luft-Prisma aus Kalkspat. Als Analysatoren F_A' und Fb im Emissions- -'.; strahlengang dienen vorzugsweise UV-durchlässige Po- % larisationsfolten- Die Fassungen des Polarisators P und y der Analysatoren Fa und Fb sind drehbar angeordnet, ij wobei die Stellungen 0°, und 90° und 353° bzw. 54,7° als ^ Raststellungen vorgesehen sind. i|

Alle optischen Elemente, die rechts vom Monochro- K mator angeordnet sind, können in einem Probenhaus jyj

untergebracht werden, an das die Photodetektoren D₀, Da,Dflund Dcangeflanschtwerden.

Die Temperacursprungzelle Z ist in A b b. 2 dargestellt.

A b b. 2a zeigt den Vertikalschnitt in der Achse des Anregungsstrahlenganges und Abb. 2b den Vertikalsr^iitt in der Achse des Emissionsstrahlenganges. In A b b. 2c ist der Horizontalschnitt dargestellt. A b b. 2d und e zeigen Weiterbildungen.

Die dargestellte Konstruktion erfüllt, au^er der schon erwähnten maximalen Ausbeute des Fluoreszenzlichtes, insbesondere folgende Forderungen: niedrige Eigenfluoreszenz und größtmögliche Spannungsfreiheit der optischen Elemente, geringes Zellenvolumen sowie einfachste, substanzsparende Handhabung bei Konzentrationsreihenuntersuchungen (Titrationen).

Der Zellenkörper besteht aus einem Mantel aus Edelstahl 1 und einem Kern 2 aus PTFE, schwarzem Polyacetalharz oder ähnlichem Kunststoff, der auf der Unterseite das Profil eines Hochspannungsisolators 7aufweist. Alternativ kann der gesamte Zellenkörper aus einem Stück Polyacetalharz oder dgl. hergestellt werden. Die konischen Zellenfenster 3 bzw. 5 im Anregungsstrahlengang bzw. im Emissionsstrahlengang haben auf der Innenseite einen Durchmesser von z. B. 6 mm und werden auf der Außenseite von Schraubringen 4 bzw. 6 gehalten. Der Konuswinkel, gegen die Achse gemessen, beträgt vorzugsweise 15° im Falle der Fenster 3 und 40° im Falle der Fenster S. Um auch bei unterschiedlichen Wärmeausdehnungskoeffizienten größtmögliche Freiheit von mechanischen Spannungen und gleichzeitig eine einwandfreie Dichtung zu erzielen, werden die Fenster abweichend von der bisher üblichen Technik, den Konusmantel einzufetten und anzupressen, mit einer lösungsmittelbeständigen gummielastischen Kleb- oder ' Dichtmasse eingesetzt, vorzugsweise mit einer polymerisierenden Silikonkautschukmasse. Diese wird schwarz eingefärbt, wodurch Lichtreflexionen an den Konuswänden und Fluoreszenz der Dichtmasse weitestgehend unterdrückt werden. Eine gleiche oder ähnliche Dichtmasse wird beim Einsetzen der unteren Zellenelektrode 8 verwendet, an der der Hochspannungsimpuls angelegt wird. Auf der Oberseite dieser Elektrode ist als eigentliches Elektrodenmaterial eine Platte aus Edelmetall aufgelötet (fett gezeichnet). Die obere Elektrode 9, die geerdet wird, trägt auf ihrer Unterseite eine Kappe aus gleichem Edelmetall. Der Elektrodenschaft besitzt eine Sacklochbohrung zur Aufnahme eines Temperaturfühlers.

Die Meßzelle wird mit Hilfe eines Schraubklemmringes oder dgl. in dem Zellenhalter HZ (A b b. 1) aufgenommen, über den auch die Thermostatierung erfolgt. Elektrode 9 kann mit Hilfe eines Bajonettverschlusses 10 und 11 mit Feder 12 aus der Zelle herausgenommen werden. Dadurch ist es im Gegensatz zu älteren Zellenkonstruktionen möglich, die Zelle zu öffnen und bei Konzentrationsreihenuntersuchungen Substanz anzugeben, ohne daß die Zelle selbst aus dem Halter herausgenommen werden muß. Dies ist dank des halbkugeligen Ausgleichsvolumens 14 über Zellenkammer 13 vor allem bei fluorimetrischen Arbeiten vorteilhaft, wo man mit sehr geringen Substanzzugaben aus einer Mikroliterspritze auskommt Bekannte Zellenkonstruktionen, die besondere FQUbohningen besitzen, gewährleisten den Vorteil der genauen Substanzzugabe und die Möglichkeit der einwandfreien Durchmischung der Probenlösung nicht entfernt im gleichen Maße.

Die Zellenkammer 13 besitzt vorzugsweise quadrati

schen Querschnitt, z. B. 7 · 7 mm². Das Füllvolumen der dargestellten Ausführung beträgt dann etwa 0,7 cm^J.

Die Verwendung von konischen Zellenfenstern mit sphärischem Linsenschliff bei Fluoreszenz-Temperatur-Sprungmeßgeräten ist bekannt: dabei können bei den Zellenfenstern zusätzliche Linsen vorgesehen sein, über deren Zweck, Dimensionierung und Anordnung jedoch keine Angaben gemacht werden (G. Czerlinski, Rev. Sei. I nstr. 33, S. 1184 (1962)).

ίο Im Gegensatz zu dieser bekannten Zellenkonstruktion, die vier identische Zellenfenster im Anregungsund im Emissionsstrahlengang verwendet, ist die Meßzelle des neuen Meßgerätes in beiden Strahlengängen sehr unterschiedlich dimensioniert. Die freie öffnung der Fenster 3 im Anregungsstrahlengang, die in ähnlicher Form von Temperatursprung-Meßzellen für ausschließliche Absorptionsmessungen bekannt sind, ist gerade so groß gewählt, daß das von einem Monorhrnm». tor großer Apertur (z. B. I : 3,5) und der zugehörigen Beleuchtungsoptik Lj und Lj gelieferte Lichtbündel die Meßzelle ungehindert durchsetzen kann. Für die Fenster 5 im Emissionsstrahlengang wird deshalb bei gegebenen Anforderungen an die mechanische Stabilität der Meßzelle ein wesentlich größerer Konuswinkel verfüg bar.

Die Besonderheit des neuen Meßgerätes ergibt sich aus der Kombination der Zellenfenster mit Kugelschliff 5 und weiteren Linsen L₁ und L₈ im Zellenhalter in unmittelbarer Nähe der Zellenfenster, die als zusammen- gehöriges optisches System berechnet und in A b b. 3 als Detailzeichnung dargestellt ist. Sie gewährleistet einen optimalen Strahlengang sowie die Vermeidung elektrischer Störungen, wie im folgenden noch näher erläutert wird.

Die Krümmungsradien des in A b b. 3 gezeigten Linsensystems betragen z. B.p\ = 16,2 mm beim Zellenfenster 5 und (n — 23,4 mm bei der Linse £.7; die Abstände der Krümmungsmittelpunkte vom Zellenmittelpunkt sind im gleichen Falle a - 8,8 mm und b = 18,0 mm. Bei einem Brechungsindex des verwendeten Quarzglases von η = 1,5 und einem Brechungsindex des Lösungsmittels von π = 133 (Wasser) liegt der Brennpunkt dieses immersionsoptischen Systems, das eine numerische Apertur von etwa 0,75 aufweist, kurz vor dem Zellen mittelpunkt. Strahlen, die vom Zellenmittelpunkt ausge hen, durchsetzen deshalb die Filter F_A und Fa,' in leicht konvergenten, fast parallelem Strahlengang, was z. B. für die Verwendung von Interferenz-Filtern wichtig ist. Da die Dimensionen des Linsensystems groß sind ge genüber den Dimensionen der Zellenkammer, ist der fasi parallele Strahlengang aber auch für Lichtstrahlen gewährleistet, die von anderen Volumenelementen innerhalb der Zellenkammer ausgehen. Die freie öffnung der Linse Lj hat einen ungefähren Durchmesser von 40 mm und ist an den wirksamen Kathodendurchmesser des verwendeten 2"-PhotovervieIfachers Da optimal angepaßt Diese Anpassung und der fast parallele Strahlengang ermöglichen es, einen größeren Abstand zwischen Meßzelle und Photovervielfacher einzuhalten,

eo was die elektrische Abschirmung vereinfacht Durch geeignete Wahl dieses Abstandes (z. B. > 15 cm) wird zugleich erreicht, daß Elektrolumineszenzeffekte, die während des Entladungsvorganges an den Zellenelektroden auftreten können und die Fluoreszenzmessungen bei älteren Konstruktionen empfindlich stören, am Ort der Photokathode kaum mehr nachzuweisen sind.

Bei besonders hohen Anforderungen an die Streulichtfreiheit des Meßsystems kann es zweckmäßig sein.

das in A b b. 3 gezeigte Linsensystem gemäß A b b. 3a durch Hinzufügen einer weiteren Linse Lj derart zu ergänzen, daß eine Abbildung des Zellenvolumens in dem Raum zwischen dem Linsensystem und der Photokathode zustandekommt. Die Brennweite der Linse Lj soll hierbei bleich oder größer sein als die Brennweite der Linse //, so daß eine vergrößerte Abbildung entsteht. Aus dieser Abbildung werden mittels ein oder vorzugsweise zweier Blende" E\ und Ei die für die Messung interessierenden Volumenelemente herausgeblendet. Zum Beispiel kann Streulicht unterdrückt werden, das von den Kanten der Zellenfenster 3 ausgeht. Bei der in F i g. 3a gezeigten Anordnung wird z. B. die Eintrittspupille des linken Zellenfensters 5' am Ort der Blende Ei abgebildet und die Eintrittspupille des rechten Zellenfensters 5 am Ort der Blende Ei. Da der Abbildungsmaßstab in beiden Fällen verschieden ist, werden Blenden unterschiedlicher Öffnung verwendet. Die Blende Ei kann dabei entfallen, wenn der Durchmesser der benötigten Blende dem Durchmesser der Photokathode selbst entspricht. Es kann weiterhin zweckmäßig sein, bei einem solchen 3fachen Linsensystem die Flächen der Linsen Li und Lj optisch zu vergüten, z. B. für den bei biochemischen Untersuchungen bevorzugten Fluoreszenzspektralbereich von 320 bis 500 nm. — Dem in A b b. 3a nicht dargestellten Photovervielfacher Db ist sinngemäß eine Linse W mit den entsprechenden Blenden zuzuordnen.

Zur Optimalisierung des spektralen Wirkungsgrades sollen bevorzugt Kantenabsorptionsfilter als Emissionsfilter Fa und Fb verwendet werden, die das kurzwellige Anregungslicht sperren und das langwelligere Emissionslicht durchlassen. Diese Maßnahme ist bekannt, um die integrale Lichtintensität der Emissionsbanden zu erfassen. Bei dem vorliegenden Meßgerät werden für Intcnsitätsrncssungen normalerweise beide Phoiövervielfacher D_A und D₈ parallelgeschaltet und mit gleichen Filtern Fa und F_B betrieben, wobei das Signal-Rausch-Verhältnis um den Faktor ]/2 verbessert wird (Benutzung des Summenmeßkanales Y in A b b. 4). Es ergibt sich für den Benutzer aber auch die Möglichkeit, in beiden Meßkanälen verschiedene Kantenfilter F_A und F_B zu verwenden und durch Differenzbildung beider Meßsignale die Durchlaßcharakteristik nicht erhältlicher breitbandiger Interferenz-Bandfilter zu simulieren, um die Emissionsbanden verschiedener Reaktionspartner voneinander zu trennen (Benutzung des normalerweise nur bei Polarisationsmessungen benötigten DifferenzkanalesA"in Abb. 4).

Weiterentwicklung der Meßzelle: Es hat sich gezeigt, daß die Streulichteigenschaften der Meßzelle selbst in hohem Maße abhängig sind von der Abbildungsqualität des primären Strahlenganges in der Meßzelle und insbesondere von der Form der Fenster im primären Strahlengang. An der Rückseite des Fensters auf der Lichtaustrittsseite (rechts) tritt eine Reflexion von etwa 4% auf, die bei Fenstern mit Linsenschliff bei ungünstigem Krümmungsradius erhebliches Streulicht in die Fenster im Emissionsstrahlengang eintreten läßt Beiderseits plangeschliffene Fenster 3 wie in A b b. 2a bis c sind in dieser Hinsicht weniger kritisch, noch bessere Streulichtverhältnisse ergeben sich jedoch bei Fenstern mit Linsenschliff, dessen Krümmungsradius ungefähr dem Abstand des Scheitels vom ZcUcnrniitelpunkt entspricht oder geringfügig größer ist. Durch eine solche, bezüglich des Zellenmittelpunktes im wesentlichen zentrierte, sphärische Linsenfläche wird das Licht mit abbildender Qualität in die Zellenkammer zurückreflektiert, wo es zum primären Nutzlicht beiträgt. Diese Ausführung ist als Querschnittszeichnung in Abb.2d dargestellt. Der optimale Krümmungsradius ist der, bei dem die Außenfläche eines jeden Fensters 3 die innere öffnung des gegenüberliegenden Fensters in sich abbildet. Die Dicke der Fenster 3 sollte möglichst groß sein, also in der Praxis größer als in der Zeichnung A b b. 2d dargestellt ist.

Die in A b b. 2e gezeigte Ausführungsform der Meß-

zelle hat nur drei Fenster; das eine der in A b b. 2d dargestellten Fenster 5 im Emissionsstrahlengang ist durch einen sphärisch geschliffenen Quarzglaskonus 15 mit Außenverspiegelung 15a ersetzt. Anstelle des Schraubringes 6 in A b b. 2d wird eine Abdeckkappe 16 verwen- det. Diese Ausführung gewährleistet hohe Lichtausbeute bei Meßgeräten mit nur einem Photodetektor im Emissionsstrahlengang, bei denen auf die Möglichkeit reaktionskinetischer Untersuchungen mit Messung der Fluoreszenzpolarisation verzichtet wird. Der Krüm mungsradius der Spiegelfläche des Quarzglaskonus 15 soll unter Berücksichtigung der Brechungsindexdifferenzen von Glas und Lösung vorzugsweise so bemessen sein, daß das Zentrum der Meßzelle in sich selbst abgebildet wird.

Die anhand von A b b. 2a bis 3a erläuterten Fenster- und Meßzellenkonstruktionen und Linsensysteme lassen sich mit Vorteil auch bei anderen reaktionskinetischen Meßgeräten, als sie hier beschrieben sind, verwenden, z. B. bei Geräten, die mit Strömungsverfahren arbeiten.

A b b. 4 zeigt das Schaltschema einer zu der Einrichtung gemäß A b b. I passenden opto-elektronischen' Kontrolleinheit, die weitgehend in bekannter Operationsverstärker-Schaltungstechnik aufgebaut sein kann (Summen- und Differenzbildung, kontinuierlich und stu-

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Division). Die dargestellte Anordnung verfügt über zwei Eingänge A_1n und B_1n zum Anschluß zweier Photodetektoren im primären und/oder sekundären Strahlen- gang (z. B. Da und De), und einen Eingang C_1n zum Anschluß des Referenzdetektors D_c. Wegen der im Vergleich zu herkömmlichen Spektralphotometern ungewöhnlich hohen Lichtintensitäten im primären und im sekundären Strahlengang können Photovervielfacher

mit einer Schaltungsanordnung zum Ändern des Verstärkungsgrades durch Umschalten der Anzahl der aktiven Dynoden verwendet werden, z. B. nach der DE-PS 23 53 573. Für die Photodetektoren D₀ und Dc können auch Vakuum- oder Halbleiterphotodioden mit einem

so Strom-Spannungswandler und Empfindlichkeitsumschaltung durch Umschalten des Arbeitswiderstandes verwendet werden. Potentiometer P_A und Pb ermöglichen bei Messung sehr niedriger Lichtintensitäten die Einspeisung von Kompensationsspannungen, z. B. zur Dunkelstromkompensation der Photodetektoren (wobei Uo als Konstantspannung gewählt wird) oder zur Kompensation von Falschlichtanteilen (Monochromatorstreulicht, Eigenfluoreszenz der Meßzelle Z, der Filter Fa und Fe usw., wobei U₀ den Referenzsignal Cpro- portional ist). Die Einspeisung der Kompensationsspannungen direkt an den Eingängen erlaubt es, die Verstärkung der bereinigten Signale A und B zu variieren, ohne daß die Potentiometer P_A und P_B neu abgeglichen werden müssen. Der Verstärker V_c besitzt zusätzlich einen stufenweise umschaltbaren (in A b b. 4 getrennt dargestellten) ÄC-Tiefpaß 77" mit Zeitkonstanten im Mikrosekundenbereich und mit einer nachfolgenden, nicht eingezeichneten Trennstufe. Dieser Tiefpaß ist dazu be-

stimmt, bei vergleichenden Messungen von Fluoreszenz und Absorption, bei denen stets mit geringer Probenabsorption gerechnet werden muß, das Rauschen im Referenzkanal klein gegen das Rauschen im Absorptionsmeßkanal zu halten und einen optimalen Kompromiß zwischen bester Kompensation von Lichtschwankungen und geringstem optischen Rauschen zu finden.

Um die Stufensprünge beim Umschalten der Empfindlichkeit der in A b b. 4 angeschlossenen Photodetektoren D_A, Db und Dc zu überbrücken und normierte Signale A, B und C zur Verfügung zu stellen, sind Eingangsverstärker V_A, Vb und Vc mit kontinuierlich variablem Verstärkungsfaktor vorgesehen, z. B. mit 1 bis 5facher Verstärkung.

Zur Summen- und Differenzbildung der normierten Signale A und B untereinander und zur wahlweisen Differenzbildung dieser Signale mit dem normierten Referenzsignal Csind zwei Hauptverstärker Kv und Vy vorgesehen. Mittels Wahlschalter Sx \, Sn können die Funktionen A B₁A + B und A — B bzw. A. B(A + B)/2 und (A + 2B)/2 gebildet und mittels kalibrierter Potentiometer Px bzw. Py einer Kompensation mit dem Referenzsignal Cunterworfen werden, im Falle des Verstärkers V_x auch einer Kompensation mit dem Signal Yam Ausgang des Verstärkers Vy. Die Wahl der für die Kompensation verwendeten Spannung C, Voder null, bzw. C oder null erfolgt durch Schalter 5;.-2 bzw. Sy₂. Ein schneller Dividierer DIV kann die Division X/Y und zusätzlich (nicht eingezeichnet) die Divisionen X/C und V/Causführen. Ein Schwellwertdetektor 7Vschaltet den Dividierer über Relaiskontakte ab, wenn eine Division mit zu kleinem Nenner erfolgen würde, z. B. beim Schließen des Photoverschlusses Vin A b b. 1.

Die in A b b. 4 gezeigten Schalterstellungen werden z. B. benutzt bei der Messung des Polarisationsgrades ρ des Fluoreszenzlichtes, der definiert ist durch

(D

wobei in A b b. 1 das Polarisationsprisma P im Anregungsstrahlengang vertikal orientiert ist (elektrischer Schwingungsvektor orthogonal zu der durch die beiden Meßstrahlengänge definierten Ebene), und /,, und l_± die zum Anregungslicht parallel bzw. orthogonal polarisierten Fluoreszenzlichtintensitäten bezeichnen. Steht also die Polarisationsrichtung des Analysatorfilters Fa ebenfalls vertikal und die des Analysatorfilters Fe' horizontal, dann wird nach vorausgegangenem Abgleich der Gesamtverstärkung der Meßkanäle A und B auf gleiche Empfindlichkeiten (F_A' und F_B' in zueinander parallelen Stellungen) der Polarisationsgrad ρ erhalten in der Form

p = XIlY=(A- B)Z(A + B)

wenn das Kompensationspotentiometer Ρχ nicht benutzt wird (Schalter 5x2 auf Masse). Zur Messung kleiner Differenzeffekte bei reaktionskinetischen Untersuchungen dient dagegen die kompensierte Form:

ρ -

(A-B) -p₀ (A +B) A+B

(3)

wobei der kompensierte statische Polarisationsgrad p_o an der Skala des Polen tiometers Px abgelesen werden kann (Schalter S_x ι auf Stellung »Y«). — Bei gleichen Polarisator- und Analysatorstellungen dient die Funktion Y = (A + 2 B)I2 mit Kompensation durch C zur Messung von Änderungen der Fluoreszenzquantenausbeute, wobei Einflüsse von Änderungen des Polarisationsgrades vollständig unterdrückt sind. Andere Polarisator- i'nd Analysatorstellungen unter den vorzugjweise rastbaren Winkeln 353° und 54,7° entsprechen einem Verhältnis von Vertikal- zu Horizon.talintensitäten von 2 :1 bzw. 1 : 2 und eignen sich in bekannter Weise dazu, die aufgrund theoretischer Ableitungen notwendigen Gewichtsfaktoren beider Intensitäten auf optischem statt elektronischen Wege zu erzeugen. — Bei Berichtung des weiter unten angegebenen Polarisationsfehlers bei großer Apertur wird im Emissionsstrahlengang mit Winkelstellungen von 53° statt 54,7° gearbeitet.

Die beiden Verstärker Vx und Vy haben zusätzlich eine stufenweise umschaltbare Verstärkung. Die Anwendung von Verstärkungsfaktoren, die wesentlich größer als eins sind, steht in ursächlichem Zusammenhang mit der in Gl. (3) ?um Ausdruck gebrachten Differenzbildung von Dividend und Divisor vor Ausführung der eigentlichen Division: sie erlaubt es, den Pegel des zu dividierenden Signales soweit anzuheben, daß das Rauschen, die Nullpunktsdrift und die Nichtlinearität des Dividierers selbst bei sehr empfindlichen Differenzmessungen vernachlässigbar klein gehalten werden.

Die durch die beschriebene Schaltung ermittelte Ausgangsgröße wird über einen Wahlschalter Sz einem Ausgangsteil zugeführt, der eine anhand von A b b. 5 beschriebene Schaltung NA zur automatischen Nullpunktskorrektur, die über einen Trigger Tn wahlweise unverzögert oder verzögert betrieben werden kann, und einen umschaltbaren ÄC-Tiefpaß TPenthält, der in bekannter Weise zur optimalen Filterung und Rauschbefreiung der Meßsignale verwendet wird.
Das in A b b. 4 gezeigte Schema kann erweitert werden durch einen vierten Eingangsverstärker, so daß alle in A b b. 1 gezeigten Photodetektoren gleichzeitig angeschlossen werden können, durch zwei weitere Hauptverstärker ähnlich den Verstä-kern V_x und Vy, evtl. weitere Dividierer und insbesondere weitere Ausgangsschaltungen NA und TP, so daß eine simultane Erfassung aller spektralphotometrisch interessierenden Größen im Mehrkanalbetrieb möglich ist (z. B. Abscytion, Fluoreszenzintensität und Fluoreszenzpolarisation, oder Absorption und Fluoreszenzintensitäten bei verschiedenen Emissionswellenlängen). Bei gleichzeitiger Messung von Fluoreszenzintensitäten und Absorption ist es zweckmäßig, das Fluoreszenzsignal durch den arithmetischen Mittelwert aus dem normierten Referenzsignal und dem normierten Signal des Absorptionsdetektors D₀ zu dividieren. Der sogenannte innere Filtereffekt aufgrund endlicher Absorption der Meßlösung wird hierdurch bei Relaxationsexperimenten weitgehend unterdrückt und die quantitative Auswertung des Fluoreszenzsignales erleichterL

Die Schaltung gemäß A b b. 4 enthält vorzugsweise weiterhin einen nicht eingezeichneten Meßstellenschalter, mit dem sämtliche durch einen Kreis bezeichneten Signalpositionen: A_iny B_1n, Q_n; A, B, C; X, Y, X/Y mit einem Digitalvoltmeter kontrolliert werden können. Die Erfassung der statischen Meßwerte, besonders A_im B,„ und Q_n, ist bei Konzentrationsreihenuntersuchungen, bei denen unmittelbar in der Meßzeile 7 titriert wird, unerläßlich für die Analyse der kinetischen Meßwerte.

Die z. T. sehr komplexen Meßvorgänge und die Vielfait der erhaltenen Signale machen eine Steuerung des neuen Meßwertes durch einen Prozeßrechner mit nachfolgender digitaler Datenverarbeitung wünschenswert Die in A b b. 4 dargestellte Knntrnllpinhoit ;cf fr..- <>;«=

Prozeßrechnersteuerung geeignet Für die Steuerung der Anordnung gemäß A b b. 4 durch einen Prozeßrechner sind folgende Ergänzungen bzw. Abänderungen vorzunehmen: Vor jeder reaktionskinetischen Messung werden sämtliche Signale an den mit einem Kreis bezeichneten Stellen mittels Multiplex-Schalter (z. B. Mosfet-Kanalschalter) und eines mittelschneilen Analog-Digital-Wandlers überprüft Zum Verstärkungsabgleich der Eingangsverstärker V_A, V_B und V_c werden Digital-Analog-Wandler im Gegenkopplungszweig dieser Ver- stärker verwendet, weitere Digital-Analog-Wandler anstelle der Potentiometer P_A, Pb, Px und Px zum Abgleich der Kompensationsspannungen. Mittels digitaler Halteschaltungen werden die eingestellten Verstärkungs- und Teilungafaktoren festgehalten. Der Abgleich auf nor- is mierte Signale Λ Bund Cist für den Einsatz der Digital-Analog-Wandler besonders günstig und wichtiger als bei rein analoger Datenverarbeitung; sogenannte multiplizierende Digital-Analog-V/andicr sind vorteilhaft, aber nicht zwingend erforderlich. Halbleiter-Schalter mit Halteschaltungen werden ferner anstelle sämtlicher Wahlschalter sowie im Gegenkopplungsnetzwerk der Verstärker V_x und Vy zur Einstellung geeigneter Verstärkungsfaktoren verwendet. Die Zeitkonstante des Tiefpasses TP' im Referenzkanal wird über Halbleiter-Schalter gesteuert. Für alle diese Einstellungen genügen relativ langsame Sieuefvorgänge, die in wenigen Millisekunden ablaufen können. An den Ausgängen der Hauptverstärker Vx und Vy sollte jeweils eine eigene Nullpunkts-Korreklurschaltung NA liegen. Diese wird entbehrlich, wenn der für die kinetische Messung im Multiplexbetrieb anzuschließende sehr schnelle Analog-Digital-Wandler eine hinreichende Amplitudenauflösung besitzt Der Dividierer DIV und der Tiefpaß TP können entfallen; Division und Mittelwertbildung der Ausgangssignale werden zweckmäßig digital durchgeführt. Die in A b b. 5 gezeigte Schaltung zur automatischen Nullpunktskorrektur, in Abb.4 mit NA bezeichnet, kann als das duale Gegenstück einer sogenannten »Sample and bold«-Schaltung aufgefaßt werden. Bekannte Schaltungen zur Nullpunktskorrektur sind erheblich aufwendiger und/oder für die Zwecke von Fluoreszenz-Relaxationsexperimenten weniger vielseitig einzusetzen. Die gezeigte Schaltung besteht aus einem leckstromarmen Haltekondensator C_x, einem Folgeverstärker Vn mit sehr hochohmigem Eingang (Eingangsstrom z. B. 1 pA), einem Widerstand R_x in Reihe mit dem Kondensator Ci und einem Widerstand R2 in Reihe mit einem Feldeffekttransistor FET, der als steuerbarer Schalter zwischen dem Verstärkereingang und Masse liegt (z. B. ein p-Kanal-Mosfet-Transistor mit Bahnwiderstand Rf < 200 Ohm in leitendem Zustand). Der F ti-Transistor wird beim Anlegen einer Torspannung Ut(die in üblicher Weise zum Zeitpunkt der die Reaktion auslösenden Störung erzeugt wird) über den Trigger Tu wahlweise ünvcrzögeri oder um die Zeit Ai verzögert geöffnet wobei ein Transistor T_x über einen Kondensator C* von wenigen Picofarad an der oberen Bahnelektrode des FET einen Ladungsimpuls erzeugt der den über die Steuerelektrode des FET einwirkenden kapazitiven Schaltimpuls kompensiert (z.B. mit Rk =c R₃B).

Bei leitendem Transistor FET stellt A b b. 5 eine Differenzierschaltung mit der Zeitkonstanten

C_x- (R_x + R₂ + R_F)

(4)

dar, wobei R_Fder Bahnwiderstand des FET ist Die Elemente C_x, gegebenenfalls auch R_x und A₂, und die Trig-' gerverzögerungszeit At, die z.B. im Intervall 10 usec - 10 msec in Stufen von z. B. 1 :ψί gewählt werden kann, sind durch einen nicht dargestellten Schalter auf verschiedene Werte (siehe Tabelle I) umschaltbar. Es ergeben sich drei wesentlich verschiedene Betriebsarten, für die typische Werte in Tabelle I zusammengestellt sind:

Tabelle 1

Funktion	*dt™*	5	2.2	^Rlkfl	22
Drift-Filter	0	0,01 0,03 0,2	0,03 0.05 0.2	0	0,15 0,47 0,82
automatische Null punktsverschiebung		15	22	0 0 0	0
Kurzschließer				6,8
mit Drift-Filter	0,01 _ 0.1 0,1 _l I _10		ablaufen, mit einwandfreiem		registriert wer-
	0,01 _ 0,1		Basiswert

1) Drift-Filter

Die sehr hohe Meßempfindlichkeit des neuen Gerätes bringt es mit sich, daß selbst geringe thermische Ausgleichsvorgänge und photochemische Instabilitäten der Meßlösung einen exakten, zeitlich konstanten NuIlpunktsabgleigh der Schaltung mit Hilfe der Potentiometer Ρχ bzw. Ργ in der Praxis unmöglich machen. Bei leitendem FET-Schalter werden solche Drifteffekte mit einer Ausgleichszeitkonstanten r, der Größenordnung 1 ms unterdrückt. Beim Auslösen des Relaxationsesperimentes wird der FET-Schalter unvcrzögert gesperrt, womit wegen des dann sehr hohen Kanal- oder Bahnwiderstandes eine Zeitkonstante r, > 10⁴SeC wirksam wird. Änderungen des Meßsignales gelangen also praktisch unverfälscht an den Ausgang, insbesondere können auch kleinste Effekte, die nicht übermäßig langsam

den. Der Widerstand Ri verhindert Störungen bei geringfügig verzögertem Sperren des FET-Schalters.

2) Automatische Nullpunktsverschiebung

Driften des Meßsignales vor dem Relaxationsexpcriment wird ähnlich wie im Falle I) unterdrückt. Die Aus- gleichszeitkonstante r, ist hier jedoch kleiner oder höchstens gleich einer endlichen Triggerverzögerungszeit At gewählt. Hierdurch werden schnelle Signaländerungen, die während der Zeit At erfolgen, weitgehend unterdrückt. Insbesondere können langsame kleine Re laxationseffekte nach größeren schnellen Effekten, die aufgrund der Temperaturabhängigkeit der Quantenausbeute fluoreszierender Moleküle für Fluoreszenz-Tcmperatursprungmessungen typisch sind, mit voller Vcr-

15 16

stürkung des angeschlossenen Oszillographen regi- darauf, daß die Fehlerkomponente, die im Falle des

siriert werden. Die obere Grenze von r, ist darch At oben genannten Aperturwinkels den Wert 0.08 Z₁ hat,

gegeben, die unlere Grenze wird durch das dem Nutzsi- durch Differenzbildung mit einem Teil des normierten

gnal überlagerte Rauschen bestimmt, das bei za kleinem Signales B eliminiert und die Verstärkung für das ver-

T₁ZU willkürlichen Schwankungen des Ausgangssignales 5 bleibende Signal 032 /_lt um den Faktor 1/032 angeho-

führt. Es hat sich daher als iweckmäßig erwiesen, die ben wird. Dargestellt and die beiden Eingangsverstär-

Zcitkonstante r, gekoppelt mit der Verzögerungszeit At ker V_Aund Vi(A bb. 4) mit Gegenkopplung über regel-

unizuschaltcn. Während der Verzögerungszeit wird der bare Widerstände Λ_Λ und Rb zur Einstellung des Ver-

Schrcibstrahl des Oszillographen über einen Anschluß Stärkungsgrades und feste Widerstände Ri, Rs, Rs und

Uh des Triggers dunkelgesteuert; eine zwischengeschal· io Rs". wobei l/Äs - URi' + i/Rs". Befindet sich der

tete Verstärkerstufe V_H sorgt für eine ausreichende Schalter S_p in seiner normalen oberen Stellung, dann

Steueramplitude. Der endliche Wert des Widerstandes wird die Verstärkung des Verstärkers V_A R₂ dient dazu, eine gut definierte Zeitkonstante r_s zu

gewährleisten, und trägt gleichzeitig in Verbindung mit ν = (Ra + Rs + Ra)ZR* (7)

dem Kondensator Q dazu bei, Schaltimpulse beim 15

Sperren des FET-Schalters, die über den Kondensator Entsprechendes gilt für den Verstärker Ve. Typische

G nicht vollständig kompensiert werden, vom Eingang Werte für Verstärkungen ν = 13 ... 7,5 si*4 z.B.:

des Verstärkers V/« fernzuhalten. R« = l,6kOhm, R,-8200hm, R_A und R_B - 0 ...

10 kOhm. Befindet sich der Schalter S_p dagegen in seiner

3) Kurzschließer kombiniert mit Drift-Filter 20 unteren Stellung, dann wird das Ausgangssignal

Das Meßsignal wird für die Dauer der eingestellten A - A_m ■ ν ■ A₅VRs - B ■ Rs"/Rs (8)

Verzögerungszeit At mit Ri >· Rf und Rj - 0 kurzgeschlossen. Auf diese Weise lassen sich bei Messungen Dieses Signal stellt das korrigierte Signal At_0n- dann höchster Empfindlichkeit restliche Siörungen durch 25 dar, wenn sich die Leitwerte 1/R_S'und 1/R₅" zueinander Elektrolumineszenzeffekte in der Meßzelle, die in ge- verhalten wie die Intensitäten der parallel und der orwissen Lösungen während der Hochspannungsentla- thogonal polarisierten Komponente im unkorrigierten dung auftreten können, von der Registriereinrichtung Α-Signal (z. B. R₅' - 891 Ohm und R₅" - 103 kOhm), fernhalten; insbesondere werden Ausgleichsvorgänge und wenn zuvor die Verstärkung beider Meßkanäle bei im Tiefpaß TP vermieden. Im Gegensatz zu der unter 30 gleich orientierten Analysatorfiltern F_A' und Fb' auf Punkt 2) beschriebenen Betriebsart findet wegen der gleiche normierte Werte A und B eingestellt wurde, sehr großen Ausgleichszeit r, > At praktisch keine Wird das Signal B abgeglichen, bevor A abgeglichen Nuü-^unktsverschiebung statt, und schnelle sprungför- wird, dann ist es nicht erforderlich, den Schalter S₉ zum mige Signaländerungen können nach Ablauf der Verzö- Abgleich von A in seine obere, normale Stellung zu gerungszeit mit unverfälschter Amplitude nachgewie- 35 bringen. Die in A b b. 6 gezeigte Schaltung hat deshalb sen werden. Der Oszillograph wird während der Verzö- den Vorzug besonders einfacher Bedienung. Zur Korgcrungszeit dunkelgesteuert rektur des Polarisationsfehlers bei Messung mit Zellen Die sehr große Apertur der beschriebenen Meßzelle beliebiger Apertur £34° kann der Widerstand R₅ an / im Emissionsstrahlengang erfordert bei genaueren den Abgriff eines geeichten Potentiometers gelegt wer-Messungen der Fluoreszenz-Polarisation eine Korrek- 40 den, das zwischen die Ausgänge der Verstärker V_A und tür, die in erster Linie die Messung der parallel zum V₈ gelegt wird, wobei zweckmäßig ein Trennverstärker Anregungslicht polarisierten Fluoreszenzkomponente für eine niedrige Quellimpedanz des Potentiometerab-/„ ir. Gl. (1) betrifft Bei paralleler Stellung von Polarisa- griffes sorgt In A b b. 6 beim Verstärker V_B gestrichelt tor P und Analysatorfilter F_A' (A b b. 1) wird bei einem eingezeichnete Elemente R», R7 und Pb zeigen, wie eine effektiven Aperturwinkel von 34° das normierte Signal 45 Eingangskompensationsspannung ohne Beeinflussung 4 nämlich nicht gleich ^sondern durch die Einstellung des Verstärkungsgrades durchgeführt ν erden kann. Es ist erforderlich, daß

A " 0,92 /„ +0,08 /χ, (5) mfo „ R₁/fl_v Am Abgriff des Potentiometers Pb kann

ein Trennverstärker eingefügt werden. Die Verstär-

während B weiterhin nahezu gleich /^gesetzt werden ^ro kungsformel Gl. (7) wird mit dieser Schaltung etwas mokann. Ohne Berücksichtigung dieses »Aperturfehlers« difiziert, doch bleibt bei Anwendung dieser Kompensamißt man also anstelle des wahren Polarisationsgrades ρ tionsschaltung aui den Verstärker V_A die oben genannte den scheinbaren Polarisationsgrad p' Bedingung für das Verhältnis der Leitwerte 1/R₅' und

^d

„_m±JL_m Q.92/,,-0,92/. . J^_ ₅₅

A+B 0,92/;, +1,08/j. /-0,08p Hierzu 6 Blatt Zeichnungen

(6)

Es ist also eine besondere Umrechnung erforderlich. 60 Diese Umrechnung wird entbehrlich, wenn man mittels besonders ausgelegter Differenz- und Summationsnetzwerke der beiden Hauptverstärker K* und Vy eine elektronische Korrektur des Signales A ausführt. Noch zweckmäßiger ist es, bereits im Eingangsverstärker V_A es ein korrigiertes Signal /Wr herzustellen. Eine Schaltung, die dies in besonders einfacher und spezifischer Weise ermöglicht, ist in Abb.6 dargestellt. Sie beruht

Claims

Patentansprüche:

1. Reaktionskinetisches Meßgerät zur optischen Untersuchung schnell verlaufender, durch eine außere Störung ausgelöster chemischer Reaktionen, mit einem Anregungsstrahlengang, einem sich mit diesem kreuzenden Emissionsstrahlengang, einer Meßzelle, die eine von den Strahlengängen durchsetzte Kammer für eine zu untersuchende, durch die äußere Störung beeinflußbaren Probenflüssigkeit, zwei im Anregungsstrahlengang angeordnete Fenster und mindestens ein im Emissionsstrahlengang angeordnetes, eine als Linsenfläche ausgebildete Außenseite aufweisendes Fenster hat, deren Querschnitt sich zur Kammer hin verjüngt, mit mindestens einer weiteren Linse im Emissionsstrahlengang, mit einem dem mindestens einem Fenster im EmissiorissArahlengang nachgeordneten photoelektrischen wandler und mii einer diesem Wandler zugeordneten Schaltung, dadurch gekennzeichnet, daß das Zeüenfenster (5) im Emissionsstrahlengang einen wesentlich größeren öffnungswinkel und für durch den Kammermittelpunkt gehende Strahlen eine größere Brechkraft aufweist als die Fenster (3) im Anregungsstrahlengang.

2. Meßgerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellenfenster (5) im Emissionsstrahlengang und die in einem 2:ellenhalter (HZ) angeordnete ..eitere Linse (L?) ein immersionsoptisches System bilden, desser Brennpunkt vor dem Kammermittelpunkt liegt.

3. Meßgerät nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Eintrittsfläche des immersionsoptischen Systems und die Kammer (13) in der durch die beiden Strahlengänge definierten Ebene annähernd gleiche Abmessungen haben.

4. Meßgerät nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Apertur des immersionsoptischen Systems mindestens 0,7 beträgt.

5. Meßgerät nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßzelle (Z) vier Fenster (3,5) hat und daß der Emissionsstrahlengang zu beiden Seiten der Meßzelle symmetrisch ist.

6. Meßgerät nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Anregungsstrahiengang und die beiden symmetrischen Teile des Emissionsstrahlenganges jeweils ein polarisationsoptisches Element (P, Fa, Fb) enthalten, von denen mindestens eines um 90° drehbar um die Strahlengangachse gelagert ist.

7. Meßgerät nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß gegenüber dem Fenster (5) im Emissionsstrahlengang ein Glaskörper (15) angeordnet ist, der eine sphärische und verspiegelte Außenfläche hat.

8. Meßgerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die im Anregungsstrahlengang angeordneten Fenster (3) eine sphärische Außenfläche haben.

9. Meßgerät nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Krümmungsmittclpunkt der sphärischen Außenfläche mit dem Kammermittelpunkt zusammenfällt.

10. Meßgerät nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die im Anregungsstrahlengang angeordneten Fenster (3) eine sphärische Außenfläche haben, deren Krümmung derart bemessen ist, daß die innere Öffnung des gegenüberliegenden Fensters auf sich selbst abgebildet wird.

11. Meßgerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fenster (3, 5) konische Mantelflächen haben und unter Zwischenlage einer gummielastischen Dichtmasse in einem Zellenkörper (2) gehaltert sind.

12. Meßgerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche für Temperatursprungmessungen, dadurch gekennzeichnet, daß an den zur Ebene der Strahlengänge parallelen Seiten der Kammer jeweils eine Elektrode (8,9) angeordnet ist, von denen die eine durch eine leicht lösbare Verriegelungsvorrichtung (10, 11,12) gehaltert ist.

13. Meßgerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im Anregungsstrahiengang auf der einer Lichtquelle (Q) entgegengesetzten Seite der Meßzelle (Z) ein.sphärischer Spiegel (S) angeordnet ist, der den Kammermiiieipunkt oder den 'nnenrand des auf der Seite der Lichtquelle angeordneten Fensters (3) auf sich selbst abbildet

14. Meßgerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß jedes Zellenfenster (S) im Emissionsstrahlengang, die in einem Zellenhalter (ZH) angeordnete weitere Linse (L₇) und eine zusätzliche Linse (L₇') ein immersionsoptisches System bilden, das zwischen den Linsen telezentrisch ist und das Kammervolumen im Raum vor einem Photodetektor (D_A) abbildet und daß im Abbildungsbereich mindestens eine Gesichtsfeidblende (E\, £2) angeordnet ist.

15. Meßgerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch mindestens zwei Meßstrahlungsphotodetektoren (D_A, Db, D₀) und einem Referenzlichtphotodetektor (Dc), eine Schaltungsanordnung (V_x, Vy) zur Bildung der Summe und/oder Differenz der AuSgangssignale zweier Meßlichtdetektoren und eine Schaltungsanordnung (Px, Pr) zum Subtrahieren einer Größe, die dem Ausgangssignal des Referenzlichtphotodetektors proportional ist, von dem Ausgangssignal der ersterwähnten Schaltungsanordnung (V_x, V_Y).

16. Meßgerät nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das durci die letztgenannte Differenzbildung erzeugte Ausgangssignal einem Differenzierglied zugeführt ist, dessen Zeitkonstante durch ein Steuersignal (Ut) steuerbar ist.

17. Meßgerät nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Steuersignal (Ut) dem Differenzierglied über ein Verzögerungsglied (Tn) zugeführt ist.

18. Meßgerät nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Zeitkonstante des Differenziergliedes zwischen einem Wert der groß gegenüber der Verzögerungsdauer ist und einem Wert, der in der Größenordnung der Verzögerungsdauer liegt, umschaltbar ist.

19. Meßgerät nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden symmetrischen Teile des Emissionsstrahlenganges jeweils ein polarisationsoptisches Element (Fa. Fb) und einen Photodetektor (Da, Db) enthalten, die Ausgangssignale liefern, die senkrecht zueinander polarisierten Strahlungskomponenten entsprechen: daß die Ausgänge der Photodetektoren jeweils mit dem Eingang eines gegengekoppelten Verstärkers (V,\, Vg) verbunden sind, daß die Ausgänge der Verstärker durch zwei in

Reihe geschaltete Widerstände (R₅', Rs") verbunden sind, und daß der Verbindungspunkt dieser beiden Widerstände mit dem Gegenkopplungszweig desjenigen Verstärkers (V_A) verbunden ist, der das Signal von dem Photodetektor (D₄) erhält, der die zur Polarisation der Anregungsstrahlung parallel polarisierte Komponente der Emission?strahlung erfassen solL

20. Meßgerät nach Anspruch 15 oder nach Anspruch 15 und einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden symmetrischen Teile des Emissionsstrahlenganges jeweils ein polarisationsoptisches Element (Fa, Fb') und einen Photodetektor (D_A, Dg) enthalten, die Ausgangssignale liefern, die zueinander senkrecht polarisierten Strahlungskomponenten entsprechen; daß die Ausgänge dieser Photodetektoren mit zwei Eingängen einer Subtrahierschaltung (Vx) über je einen Verstärker (Va, V_b) mit veränderbarem Verstärkungsgrad gekoppelt sind; daß die Ausgänge dieser Verstärker außerdem mit den Eingängen einer Summierschaltung (Vy) verbunden sind; daß ;!as Ausgangssignal der Summierschaltung über einen verstellbaren Abschwächer (Px) einem dritten Eingang der Subtrahierschaltung zugeführt ist, um das abgeschwächte Summensignal von der Differenz der beiden Verstärkerausgangssignale (A, B) abzuziehen und daß die Ausgänge der Subtrahier- und der Summierschaltung mit einem den Quotienten aus Summe und Differenz bildenden Dividierschaltung (DIV) gekoppelt sind.