DE2357794A1 - Verfahren zur herstellung von traegerfixierten aminoverbindungen - Google Patents

Description

Br, Max Bfeeniter» Basel

Verfahren zur Herstellung von Träger-fixierten Aminoverbindungen

■' . * Bier Mxierutig von iiiteteäiisefc -|je|ifci4±scfoer flatur (z.B. PeptMhormane,, Enzyme, ÄnfcikSrpe-ry an vorzugsweise unl8$liQnen Trägem wird wegen ihrer interessanfeen und vielseitigen ÄnwendungsniBgliehkeiten schon seit längerer Zeit in Betracht gezogen E Grubhof ei* und "Scheith, Z. Fhysiol. Chem. (Hoppe Seyler) 297, 108 (1954); Mieheel und Ewers/ Makromol.ehem., ^, 200 (15^9)5 Levin, Peeht, Goldstein und Katchalski, lioehemistry J, 1905 (1964); Weetall

0.11.73/Dr.PR/, 4098237115

ORIGINAL INSf⁵ECTED

und Vleliky, Katarr» 2ö4, 6Q$ (19©*) J* Nach den ersten ■ "■ Veröffentlichungen erfolgt© Bemühungen in dieser fticft-* feung haben sieh in einer umfangreichen PatentIiteratur niedergeschlägön* / ■

Als besonders erfolgreich erwies sich in der Praxis die Fixierung a».Polvsächariden und Polysacharidderivsfcen; dieser ¥mständ liängt vermutlich mit der Art der Wechselwlrfcting zwischeii fixierter Substanz und träger zusammen, derart, dass sich z«B* ein fixiertes Enzyttr auf einer hydrafeisierten, aus einem Polysacharid bestehenden Unterlage in einer quasi natürlichen Umgebung befindet» Wegen ihrer relativ wohldefinierten Natur werden als Träger vorzugsweise vernetzte Dextrane verwendet, wie man sie z.B. aus der umsetzung von Dextran mit Epiehiorhydrin erhält (z.B. Schweizer Patent Mr. 501 695)· Wegen ihrer grossen Quellfähigkeit werden im gleichen Patent aush entsprechend vernetzte Stärkegele undAgarosesowie merceriaierte Cellulose empfohlen.

Zur Fixierung der peptidisehen Substanzen müssen die genannten Trägermaterialien durch ETinführung funfctio-Heller Gruppen "aktiviert" werden, derart, dass durch chemische Reaktion zwischen trägergebundener funktioneller Gruppe und peptldiseher Substanz pro Peptldmolekel mindestens eine chemische Bindung zum Träger entsteht- Wiederum sind die Vorschläge zahlreich [Zitate- u.a. bei Axen et al.,

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Nature (Ι967) 214., 1V02.;. Als besonders milde Methode wird an der gleichen Stelle sowie im bereits genannten Schweizer Patent (Nr. 501 695) eine Aktivierung durch Behandlung hydroxyl- oder äminogruppenhaltiger Polymerer mit einem Halogencyan vorgeschlagen. Dieses Verfahren . hat seither ungeachtet seiner relativ kostspieligen Ausgangsprodukte (vor-vernetztes Polymeres einerseits, Bromcyan andererseits) und ungeachtet"der unangenehmen Eigenschaften der Halogencyane weite Verbreitung gefun- ' den.

Ueber den chemischen Vorgang beim Aktivierungsprozess, die Natur der aktiven funktioneilen Gruppe und ihre Reaktionsweise mit der peptidischen Substanz ist, mit Sicherheit nur bekannt, dass die Aktivierung an den Hydroxylgruppen des Trägers und die Fixierung über basischen Stickstoff der peptidischen Substanz erfolgt. "

Bei dieser Sachlage erschien es aussichtslos, j ' . _ -' '■■■·-.

ein inbezug auf die Produktqualität gleichwertiges., inbezug auf die Ausgangsprodukte anspruchsloseres und inbezug auf den technischen Aufwand einfacheres, im Ganzen gesehen also ein in seiner Nützlichkeit ebenbürtiges, aber wirtschaftlich überlegenes Verfahren zu finden. Der Bedarf nach solchen Verfahren dürfte andererseits unbestritten sein, denn die Herstellung und Anwendung fixierter, Enzyme,"namentlich in der Biotechnologie, ist beim heutigen Stand der Technik vor allem eine Frage der preislichen Möglichkeiten. · -% f. j- ; ·

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Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass es dennoch möglich ist, auf einem kurzen^ billigen und sehr einfachen Weg zu Trägern mit Aminfixierungsvermögen und zu qualitativ wie quantitativ hochwertigen, gegebenenfalls biologisch aktiven,Träger-fixierten Aminoverbindungen zu gelangen, indem man Blausäure und/oder ein wasserlösliches Cyanid und ein Reagens, welches positives Chlor oder Brom enthält, nämlich hypochlorige oder hypobromige Säure und/oder ein wasserlösliches Salz der hypochlorigen oder hypobromigen Säure oder eine Chlor- oder Bromverbindung, welche bei der Hydrolyse eine der besagten Säuren liefert, oder eine Mischung solcher Halogenderivate auf eine wasserlösliche oder quellbare, wasserunlösliche Polyhydroxylverbindung in alkalischem Milieu, vorzugsweise in der Kälte, einwirken lässt, die Reaktbnsnischung gegebenenfalls neutralisiert und a) im Falle einer Lösung durch Klärung und Dialyse oder Gelfiltration, b) im Falle einer Suspension durch Filtrieren oder Zentrifugieren und Auswaschen, von niedermolekularen Anteilen befreit, das in der Lösung oder Suspension vorliegende oder als Filter- bzw. Zentrxfugenrückstand verbleibende Vernetzungs- und Aktivierungsprodukt in Gegenwart von Wasser und gegebenenfalls eines Puffersysteins bei einer Temperatur unterhalb 50 C, vorzugsweise in der Kälte, auf eine gegebenenfalls biologisch aktive, wasserlösliche,

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an mindestens einem basischen Stickstoffatom substituierbare Aminoverbindung einwirken lässt und dialysierbares oder in gelöster Form verbliebenes Material mit Wasser oder einer wässrigen"Salzlösung aus dem Umsetzungsprodukt ausdialysiert oder ausfiltriert oder auswäscht.

Als wasserlösliches Cyanid eignet sich insbesondere ein Alkalicyanid, beispielsweise Natrium- oder Kaliumcyanid. Das Gesamt-Cyanid, d.h. die Summe von Blausäure und wasserlöslichem Cyanid, wird mit Vorteil in einer Menge benützt, die sich ohne scharfe Grenze im Bereich zwischen 0,25 und 6 Grammäquivalent pro Grammäquivalent polymergebundenes Hydroxyl bewegt.

Man kann das Gesamt-Cyanid zusammen mit der Polyhydroxylverbindung vorlegen und das Reagens, welches positives Chlor oder Brom enthält, und nachfolgend kurz als "Reagens" bezeichnet wird, zusetzen. Vernetzungsgrad und Aminfixierungsvermögen richten sich dann nach der Menge des "Reagens", solange dieses gegenüber dem Gesamt-Cyanid im- Unterschuss bleibt. Weitere Faktoren sind die "Hydroxylgruppendichte" auf der eingesetzten Polyhydroxylverbindung und deren Molekulargewicht sowie Reaktivität.

Wenn die pro Grammäquivalent .organisch^ gebundenes Hydroxyl verbrauchte "Reagens"-Menge grosser ist als

bis 1/2 Grammol, so hat verbleibendes überschüssiges 40 982 3/ 11 5 7

Gesamt-Cyanid keinen nennenswerten Einfluss auf Vernetzungsund Aktivierungsreaktion. Es ist aber zweckmässigerer, das vorgelegte Gesamt-Cyanid weitgehend oder ganz auszunützen, indem man nur einen kleinen Unterschuss oder aber die theoretische Menge an "Reagens" zusetzt. Im letzteren Fall erkennt man das Ueberschreiten des Aequivalenzpunktes oft, z.B. beim Arbeiten mit Hypochlorit, an einer Blaufärbung von Kaliumjodidstärkepapier durch die alkalisch.; Reaktionslösung. Zweckmässig nähert man sich dem Aequivalenzpunkt erst dann, wenn die Vernetzungsreaktion im wesentlichen vollzogen ist. Zu einem früheren Zeitpunkt " kann überschüssiges "Reagens" die Vernetzungsreaktion und die Aktivierung vorzeitig abbrechen. Nach vollzogener Vernetzung und Aktivierung ist ein "Reagens"-Ueberschus3 zwar unzweckmässig, aber unschädlich, solange er 100 % nicht wesentlich überschreitet. Anderenfalls reicht das in einer Nebenreaktion gebildete Cyanat eventuell 'nicht mehr aus, das vernetzte und aktivierte Polymere vor einer Schädigung, beispielsweise durch Hypochlorit, zu schützen; Cyanat reduziert nämlich Hypochlorit nach der Gleichung:

2 NCO" + 3 OCl" + H₂O » 2HCO₃" + 3 Cl" + N₂

[Lister, Can. J. Chem. 33, 426 - 440 (1955)1. Obige Mengenangaben umschreiben den praktischen Arbeitsbereich, stellen .indessen weder eine obere noch eine untere Grenze dar.

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Eine mit,der obigen Ausführung^form verwandte besteht darin,· nur einen Teil des Gesamt-Cyanids zusammen mit der Polyhydroxy!Verbindung· vorzulegen-und den Rest gemeinsam mit dem ,"Reagens" in das Reaktionsgemisch einzutragen. Hierbei ist zw.eckmässig darauf zu achten, dass mindestens bis zu beendeter Zugabe das Cyanid im Reaktionsgemisch.im Ueberschuss vorhanden ist.

Man kann aber auch das "Reagens." vorlegen und das Gemisch von, Gesamt--Cyanid und Polyhydroxylverbindung zusetzen. .In diesem Fall ist es unzweckmässig, mit einem "Reagens"-Ueberschuss zu arbeiten, weil sonst das. Cyanid abgefangen wird. , ... '

Die, Zugabe von.'^Reagens", insbesondere Hypochlorit^ zur Polyhydroxylverbindung kann auch vor der Zugabe des Cyanids erfolgen. Zweckmässig lässt .man hierbei die wässerige Mischung von z.B. Hypochlorit und.Polyhydroxylverbindung unter Rührend und-guter Kühlung bei etwa O⁰C-in die wässerige Cyanidlösung eintropfen. Wie unten beschrieben, kann man unter bestimmten Voraussetzungen auch die Cyanidlösung auf einmal zur Mischung von z.B. Hypochlorit und Polyhydroxylverbindung geben. Die beträchtliche -Wärmeentwicklung erfordert im letzteren Fall eine besonders wirksame Kühlung. ^! . ■"'" "-■' ' ■

"Reagens", insbesondere Hypochlorit,undPoly- ^: hydroxylverbindung scheinen, wie unten genauer beschrieben

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wird, aufeinander einzuwirken, indem ein Teil der Hydroxylgruppen durch hypochlorige Säure verestert wird. Diese Reaktion kann gegebenenfalls durch Einleiten von CO oder Eintragen von Trockeneis begünstigt werden. Bei Verarbeitung derart vorbehandelter Mischungen, insbesondere von Hypochlorit und Polyhydroxy!verbindung, ist aber gegebenenfalls darauf zu achten, dass" die Alkalinität der Cyanidlösung genügt, um den CO -bedingten Verlust an Alkalinität in der "Reagens"-Lösung wettzumachen.

Hypochlorit in Form von Natronbleichlauge oder Kalibleichlauge ist eine bevorzugte Form des "Reagens".

Anstelle von Hypochlorit kann man nun auch eine Mischung von Alkalilauge oder Alkalicarbonat lösung und gasförmigem Chlor verwenden, wobei das Alkali mit der Polyhydroxylverbindung und dem Cyanid vorgelegt oder erst .während der Zuleitung des Chlors allmählich zum Reaktionsgemisch gegeben werden kann. Auch hier ist die Reihenfolge umkehrbar, indem der Hydroxylverbindung und dem Alkali zuerst Chlor und erst dann das Cyanid zugegeben werden. Bezüglich der Stöchiometrie gilt dasselbe wie bei Verwendung von Hypochlorit. Wie bei der Bereitung von Hypochloritlösung wird inbezug auf Chlor ein kleiner Ueberschuss an Alkali empfohlen.

Allgemein kann man das Alkalihypochlorit im erfindungsgemässen Verfahren durch Verbindungen ersetzen, die bei der Kydroly- se hypochlorige Säure bilden. Hierzu gehören [Houben-

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Weyl 5/3 (1962), Seite 76o] die-Ester der hypochlorigen Säure und Stickstoffverbindungen,, deren Chlor an Stickstoff gebunden ist, wie z.B. Chlorimide, Chlor amide,ChI orräShe sowie Chloramine. Genannt selen Aethyl-, Propyl- und tert.-Butylhypochlorit (Houben-V/eyl 5/3, 765 und 6/3, 491, 492), N-Chlor-succinimid (Houben-V/eyl ^, 8OO), N-Chloracetamid (Houben-Weyl 5/3, 799)V Chloramin T und Dichloramin T (Höuben-Weyl 5/3/ 808) sowie Chloramin· (Houben-V/eyl 5/3,796). '

Eine Angabe, wonach Chloramin mit Kaliumcyanid in Chlorcyan (Beilstein 3_ Ξ H^ 32) übergehen soll, hat sich als unzutreffend erwiesen: Es entsteht kein Chlorcyan, wohl aber in erheblichen Mengen Kaliumcyanat [Markwald und Wille, Beri dt sch. ehem. Ges. ^6, 1325

Ebenso wie N-Chlorverbindungen haben sich

analoge Brcmverbindungen, wie z.B. N-Bronvsuccinimid oder N-Bromacetamid als mit bestem Erfolg verwendbar erwiesen.

Deshalb werden im neuen Verfahren auch die Verwendung der entsprechenden N-Bromverbindungen und nicht zuletzt die Verwendung der Alkalihypobromite und der hypobromigen Säure selbst einbezogen.

Zweckmässig beschränkt man sich in der Wahl der N-halogenierten Verbindung mit basischer Stickstofffunktion auf Produkte, welche bei der Halogenabgabe direkt oder nach milder Hydrolyse entweder Ammoniak oder ein-tertiäres Amin freisetzen. Beispiele sind das Chlor-

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amin (NHpCl) und das Pyridiniumbromid-perbromid [Bull. Soc. Chim.. France 1952 > 331] . Ammoniak lässt erfahrungsgemäss die Amin-fixierenden Gruppen intakt, weil sich seine Einwirkung vermutlich auf eine Austauschreaktion beschränkt; tertiäre Basen werden wegen Fehlens von substituierbarem Wasserstoff nicht fixiert. Die niederen aliphatischen Alkohole aus den Hypochloriten konkurrieren bei der O-Cyanierung mit den Polyhydroxy!verbindungen in der Regel nur unwesentlich.

Vernetzung und Aktivierung erfordern ein alkalisches Reaktionsmilieu, vorzugsweise im Bereich von etwa pH 10 bis etwa pH 13. Es stellt sich von selber ein, wenn man beispielsweise zur wässrigen Mischung von Polyhydroxylverbindung und Natriumcyanid eine der unten beschriebenen Lösungen von Natriumhypochlorit (Natronbleichlauge) oder Chloramin oder Chloramin T oder t-Butylhypochlorit in Substanz zusetzt. Dies gilt auch, wenn man zunächst eine wässrige Mischung von Polyhydroxy!verbindung und einem der eben genannten Halogen-Träger bereitet und die Mischung zur wässrigen Lösung von Natriumcyanid gibt. In anderen Fällen, wo-die vorgelegte oder die einzutragende Komponente des Reaktionsgemisches zu alkalisch, zu wenig alkalisch oder gar sauer ist, und die andere Komponente ungenügende Pufferkapazität besitzt, um das gewünschte pH in der Mischung der Komponenten zu gewährleisten, setzt man einer oder bei-

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den Komponenten in erforderlichem Masse starke oder schwa- * ehe Säure, stärke oder "schwäche Base oder ein -Puffersalz zu, wie etwa Salzsäure öder Kohlendioxyd, Alkälihy'droxyd oder Ammoniak, Alkalicarbonat öder 'Alkalihydrogehcarbonat oder Ammoniumchlorid. Ein Beispiel ist gegeben bei Ver— ■ Wendung von Chlorwässer als Quelle für positives Chlor, ein anderes bei^Verwendung von Blausäure als Quelle für Cyanid. Entsprechende puffernde Massnahmen wird man ■ ' ■ selbstverständlich auch dann treffen, wenn beide Komponenten zu alkalisch, zu wenig alkalisch oder sauer. sind. .. · -'■'

Unter einer Komponente' des Reaktionsgemisches •wird allgemein die Mischung der- Polyhydroxylverbihdung mit Cyani'd und/oder Blausäure oder die Mischung der Polyhydroxy.! verbindung mit dem "Reagens" verstanden. Die' ·. andere, ergänzende Komponente ist dann das zur erfindungsgemässen Umsetzung noch erforderliche Mittel, nämlich das "Reagens", oder Cyanid und/oder Blausäure. Jede der so definierten Komponenten kann zvieeks- Vornahme der Umsetzung entweder vorgelegt werden, um alsdann mit der fehlenden GegenkompOnente versetzt zu werden, oder umgekehrte ^; ■-'-'.'

Man beachte, dass an der unteren Grenze des . angegebenen pH-Bereiches sowohl Blausäure als auch' hypo- : chlorige und hypöbrOmige Säure unvollständig neuträli-

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-η ·

siert sind.

Es ist also nach obigem gegebenenfalls vorteilhaft, hypochlorige oder hypobromige Säure, welche durch hydrolytischen Zerfall von organischen Hypochloriten oder Stickstoffverbindungen, welche positives Chlor oder Brom enthalten, entsteht, ganz oder teilweise zu neutralisieren. Wenn die betreffende Stickstoffverbindung selber basischen Charakter hat, verliert die Neutralisation ihre Bedeutung. Die alkalisierende Funktion von Alkalihydroxyden und -carbonaten kann auch von überschüssigem Alkalicyanid übernommen werden. Wenn die N-Halogenverbindung bereits salzartig ist, wie zum Beispiel das Chloramin T der Formel CH CgH^SCLNNaCl, so ist für die Neutralisation der unterhalogenigen Säure gesorgt und zusätzliches Alkali eher schädlich.

Als Polyhydroxylverbindung eignen sich vor allem Kohlehydrat.e wie Stärke, Stärkekleister, lösliche Stärke, Dextrine, Dextrane, vernetzte Dextrane, Zellulose, speziell mercerisierte Zellulose, Zellulosefasern, Agarose, Pektine usw.

Der Polymerisationsgrad der als Ausgangsmaterial brauchbaren Polyhydroxylverbindungen aus der Klasse der Kohlehydrate ist im Rahmen der Löslichkeit oder Quellbarkeit dieser Verbindungen beliebig. Sogar Saccharose gibt erfindungsgemäss- ein unlösliches Produkt mit sehr

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gutem Enzymfixierungsvermögen. Man ist aber nicht auf Kohlehydrate angewiesen. Auch wasserlösliche Polyvinylalkohole werden, beispielsweise im System Cyanid/Hypochlorit, zu unlöslichen' hydrophilen Produkten mit befriedigendem Aminfixierungsvermögen vernetzt.

_ Vernetzung und Aktivierung der Polyhydroxylverbindung vollziehen sich im Temperaturbereich zwischen dem Erstarrungspunkt der. Lösung und etwa 50 ⁰C; zweckmässig arbeitet man zwischen Ö⁰C und Raumtemperatur.

Bei der Behandlung der genannten Polyhydroxylverbindungen mit "Reagens" und Cyanid ergibt sich also erfindungsgemäss folgendes:

War die eingesetzte PoIyhydroxylverbindung wasserlöslich und dialysierbar, wie zum Beispiel Sacharose (Rohrzucker), oder war sie nur wasserlöslich, wie lösliche Stärke, Dextrine und Dextrane, so entsteht, daraus in kürzester Zeit ein in dichten Flocken ausfallendes Polykondensat in praktisch quantitativer Ausbeute.. Höhermolekulare Stoffe, wie Stärkekleister, Verliereri ihre gelartige Natur, werden flockig und f.iltrierbar. Vernetzte Dextrane, welche unlöslich sind, verdichten ihre Struktur. Weniger deutliche aber trotzdem feststellbare Veränderungen sieht man-bei mercerisierter Zellulose und Agarose. Alle diese Substanzen zeichnen sich durch ein ausgeprägtes Vermögen zur Amirifixierung aus; sie sind fixierungsaktiv.

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-Ii₁-

In der Kombination von Vernetzung und Aktivierung, welche die Verwendung auch billigster Poiyhydroxylverbindungen ermöglicht, in einem.einzigen Schritt ein qualitativ hochwertiges aktivierte's Vernetzungsprodukt liefert und hierzu lediglich die Verwendung üblichster Chemikalien und Einrichtungen erfordert, ist ein erheblicher, unerwarteter und wirtsqhaftlich bedeutsamer technischer Portschritt zu erblicken. Das aktivierte Produkt eignet sich vorzüglich zur Fixierung von Proteinen, Polypeptiden, Oligopeptiden, Aminosäuren oder auch Aminen der allgemeinen Formel:

wobei R(X) Wasserstoff oder einen Rest mit Wasserstoff oder einer funktioneller Gruppe an der Stelle X, R'(Y) einen Rest mit Wasserstoff oder einer funktioneller Gruppe an der Stelle Y bedeutet. Es eröffnet sich also ein sehr einfacher Weg zur Gewinnung von Polysacchariden mit - im Rahmen der Wasserbeständigkeit beliebigen - funktioneilen Zusatzgruppen.

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Falls wasserunlöslich,können die aktivierten Produkte in Suspension verbleiben und nach erfolgter Abstumpfung des Alkalis direkt mit der Aminoverbindung weiter umgesetzt werden. Es ist aber in manchen Fällen

vorteilhafter, das unlösliche Material auf einem Filter zu sammeln, es auszuwaschen, wozu Wasser, Salzlösungen und Puffer, mit oder ohne Zusatz von Proteinstabilisatoren (z.B. Glycerin oder Komplexbildnern), verwendet werden können, und dann den feuchten Filter.rückstand, wiederum ohne Verzug wegen begrenzter Lebensdauer der aktiven funktioneilen Gruppen, mit einer wasserlöslichen Aminoverbindung umzusetzen. .

Falls wasserlöslich, kann man die aktivierten Produkte, gegebenenfalls nach Abstumpfung des Alkalis,direkt mit der Aminoverbindung weiter, umsetzen. Es. ist aber in manchen Fällen vorteilhafter, niedermolekulares Mate- riali gegebenenfalls nach Abstumpfung- des. Alkalis^ durch Dialyse zu entfernen und erst dann die: Umsetzung mit der Aminoverbihdung vorzunehmen. ■ -...-"

Die unlöslichen Fixierungsprodukte sind ausgezeichnet filtrierbar und wege,n ihrer hydrodynamischen Eigenschaften auch zur-Verwendung in fliessenden Reaktionssystemen (kontinuierlicher Säulenbetrieb) bestens geeignet.

Lösliche aber nicht dialysierbare Fixierung's-

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produkte erhält man gegebenenfalls beim Umsatz von niedermolekularen Aminoverbindungen mit aktivierten Vernetzungsprodukten aus z.B. löslicher Stärke, die nur schwach vernetzt sind und deshalb nicht ausflocken, oder mit aktivierten Pektinen und Schleimstoffen, die trotz Vernetzung in Lösung bleiben.

Die Umsetzung zwischen der Cyanid/"Reagens"-

vernetzten und -aktivierten Polyhydroxy!verbindung und der Aminoverbindung wird vorzugsweise in neutralem bis schwach bis mittel-alkalischem Bereich, z.B. in Gegenwart von Wasser oder Natriumhydrogencarbonat oder Natriumcarbonat, durchgeführt. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die Aminoverbindung im Ueberschuss einzusetzen und gegebenenfalls in der Kälte zu arbeiten, wobei es zweckmässig ist, die Konzentration so hoch als möglich zu gestalten. Im Falle eines Filterrückstands genügt oft das eingeschlossene Wasser, um eine trocken, in lyophilisierter Form vorliegende Aminoverbindung aufzulösen. Die Aminoverbindung wird hierzu einfach mit dem Filterrückstand verrührt. Beim Stehenlassen erfolgt dann die Fixierung; sie kann durch gelegentliche Umwälzung des Filterrückstands beschleunigt werden.

An den oben beschriebenen wasserlöslichen Polymeren wurden in wässeriger Alkalihydrogencarbonatlösung fixiert: Oxytocin, Vasopressin, Angiotensin, 0 Corticotropin. Nach erfolgter Reaktion wird zur Ent-

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fernung von nicht umgesetztem Material und Salzen filtriert (Sephadex G-25) oder dialyslert. Die Produkte enthalten nach Aminosäureanalyse pro Gramm Trockensubstanz zwischen 2 und 20 %■ an peptidischem Material."

An den oben beschriebenen wasserunlöslichen Polymeren wurden in Gegenwart von Natriumhydrogencarbonat, das aus der Waschflüssigkeit des Filterrückstands stammte (1-proz.NaHCO.,-Lösung), und in einer zweiten Versuchsreihe in zusätzlicher Gegenwart von Glycerin, das ebenfalls aus dem Waschprozess stammte (letzte

■ Waschflüssigkeit: 10-proz* Glycerin,

1-proz. NaHCO.,), folgende Enzyme durch Einrühren in den Filterückstand gebracht und fixiert?

Hexokinase
- Ribonuclease

Trypsin

Chymotrypsin

Carboxypeptidase .

Acyl'-L-aminosäure-Acylase ·

Auf 1 Teil(Trockengewicht) aktivierten Träger wird vorteilhaft 1/4 bis 1/2, eventuell auch ein ganzer -Gewichtsteil Protein eingesetzt. Der Proteinanteil in den Träger-Proteinverbindungen liegt bei etwa 3 bis 30

■ des Trockengewichtes (Aminosäureanalyse).

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Sämtliche Aktivierungsstufen auf der Basis von 50 bis *IOO mg Natriumcyanid pro 100 mg (Trockengewicht) "Amylopektinfraktion", Stärke _s wasserlösliche Stärke, Dextrin, Dextran, Cellulose, Cellulosefasern, Sephadex G 20O₁ Saccharose und Polyvinylalkohol liefern enzymatisch aktives Material, das die für Kohlehydratfixierte Präparate charakteristische Beständigkeit besitzt.

Während man also Enzyme in der Regel am besten trocken zum Filterkuchen gibt, erweist es sich oft als vorteilhaft, niedermolekulare Aminoverbindungen wie Oligopeptide, aliphatische und aromatische Aminocarbon- bzw. -sulfonsäuren, Aminophenole, aliphatische und aromatische Aminoalkohole, Diamine und Polyamine, sowie aliphatische, alicyclische und heterocyklische Amine und wasserlösliche Derivate all dieser Substanzen mit noch vorhandenem substituierbarem und basischem Stickstoff in Form mehr oder weniger konzentrierter wässeriger Lösungen zur Fixierung zu bringen.

So sind beispielsweise aus wässeriger Lösung an einer Cyanid/Hypochlorit-behandelten "Amylopeptinfraktion" folgende Aminoverbindungen mit Erfolg fixiert worden: · * - . .

das Sequenzpeptid Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala zur Durchführung von Abbaureaktionen in heterogenem Milieu; das S-Peptid aus Ribonuclease zur Verwendung in der Affinitätschromatographie;

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das p-Aminophenyl-oc-N-acetyl-alanin als Substratanaloges einer Acylaminosäure-Acylase; .

das Glycyl-phenylalanin als Substratanaloges derselben· Acylaminosäure-Acylasej

Glutaminsäure und SuIfanilsäure zur Gewinnung chromatographischer Adsorbentien; Dehydroabietylamin zur Gewinnung 'eines optisch aktiven Salzbildners;

Imidazol zur Gewinnung eines Hydrolysekatalysators; Hydroxylamin, Hydrazin* Pheny!hydrazin, p-Aminophenol und

p-Phenylendiamin zur Gewinnung von Reduktionsmitteln. . ..-■-·

. Die Eigenschaften der fixierten Aminoverbindungen, im speziellen die Eigenschaften fixierter biologisch ak-'tiver Peptide une Proteine₉ bewegen sich im Rahmen ein- · schlägiger Angaben der Literatur und Patent literatur.·

Es ist ungeklärt, welche chemischen Reaktionen der Vernetzung der- Polyhydroxyverbindungen zugrunde liegen, und worauf die Aktivität, d.h. die Fähigkeit des vernetzten Produktes zur Fixierung von Aminoverbindungen, beruht. Die Hypothese einer intermediären Bildung von Chlorcyan konnte experimentell ausgeschlossen werden, indem unter vergleichbaren bedingungen" Cyanid/Hypochlorit deutlich anders reagierte als Chlorcyan.

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Es ist zwar bekannt, dass

- Chlor unterhalb pH 9 aus Alkalicyanid Chlorcyan erzeugt,

- Chlorcyan durch Alkalilauge in Alkalicyanat umgewandelt wird, und

- bei der Hypochloritoxydation von Alkalicyanid zu Alkalicyanat ein Geruch auftritt, der an Chlorcyan erinnert.

In der Literatur wird deshalb - wenn auch nicht unwidersprochen - die Auffassung vertreten, dass die praktisch momentane Cyanatbildung bei der HypochloritOxydation von Cyanid über Chlorcyan verlaufe.

Trotzdem stellt die erfindungsgemässe Hypohalogenit/Cyanid-Behandlung von Polyhydroxy!verbindungen (im folgenden mit H bezeichnet) keine Variante der bekannten Alkali/Halogencyan-Behandlung von Polyhydroxyverbindungen (im folgenden mit I^- bezeichnet) dar. Dies lässt sich besonders einfach und eindrücklich demonstrieren, wenn bei I und II wasserlösliche Polyhydroxyverbindungen, z.B. wasserlösliche Stärke, eingesetzt werden. Die lösliche Stärke wird unter geeigneten Bedingungen sowohl nach I als auch nach II infolge, von Vernetzung unlöslich. Die Vernetzungsprodukte fallen in flockiger Form aus, sind leicht isolierbar und besitzen das bekannte Aminfixierungsvermögen von Produkten, wie man sie beispielsweise nach Schweizer Patent Nr. 501.695 durch

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.- 21 -

Halogencyanaktivierung von vernetztem,Dextran (Sephadex) oder Cellulose erhält. '

Die Vernetzung der Stärke und die offensichtlich gleichzeitige Einführung des Aminfixierungsvermögens lassen sich nach heute diskutierten Vorstellungen schematisch etwa folgendermassen formulieren:

■"·.-" Schema

	-	ι	-	II	.HO-	-O-C-N ---V	- _ ι 0-	1 -I	-OH	NH Il	•
	-OH		a)			'' NH0-	Il -o-e-o-
HO-		I oder		"^ ' ... (Stufe ι	b) * ■ -. - - -		-OH
(Stufe		unbeständiges Zwischen produkt
lösliche Stärke		unlösliches Vernetzungs produkt mit Aminfixierungs vermögen

Die Vernetzungsreaktion (Stufe b) wäre danach bei I und II identisch, hätte also die gleiche pH-Abhängigkeit. Die O-Cyanierung (Stufe a) ist bei I an die Gegenwart von deprotonisierten Hydroxylgruppen der Stärke gebunden und der Konkurrenz durch Hydroxylionen aus dem alkalischen Medium unterworfen (Bildung von Alkalicyariat als Nebenprodukt). Bei II müssten die Verhältnisse ebenso liegen, wenn der erste Schritt im Zuge von II tatsächlich in einer •augenblicklichen [vgl. Gmelins Handbuch der Anorganischen

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Chemie, 8. Aufl., C [D 1] 14, Seiten 35 und 37 (1971)] Bildung von Halogencyan bestünde; vor allem müsste unter vergleichbaren Bedingungen immer I mindestens gleich schnell sein wie II. Lässt man dagegen die Hypothese fallen, dass II über Halogencyan verlaufe, so wird bei II dort, wo Stufe a für die Gesamtreaktion (Abscheidung eines unlöslichen Vernetzungsproduktes) geschwindigkeitsbestimmend wird, eine pH-Abhängigkeit möglich, welche anders ist als jene von I. Genau dieses wird experimentell gefunden, wie im Anhang näher beschrieben wird.

Nachstehende Beispiele zur Vernetzungs- und Aktivierungsreaktion und zur Aminfixierung sollen den Rahmen der Erfindung in keiner Weise einschränken. Die Temperatur wird überall in ⁰C angegeben.

-22a-

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Experimenteller Teil ^

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I. D±e Vernetzungs- und Ak tivierungsreaktion

Reagenzien: Natronbleichlauge. Es wurden die Präparate verwendet welche man erhält, wenn 80 g NaOH, 375 g Wasser und 375 g Eis unterhalb 0 C unter kräftigem Rühren mit ,

gasförmigem Chlor bis zu einer Gewichtszunahme von

66 g (5 Studen) behandelt werden. Solche frisch

- - · enthalten ■ ·

bereitete Lösungen/etwa 7,5 Gewichtsprozent Natriumhypochlorit (jodometrische Analyse)j der pH-Wert liegt um 11,5. , .

Uatriumcyänid. Händelsware der Qualität "pract." ergab bei der Titration mit Natronbleichlauge einen Gehalt von nahezu 100%.

. ' Polyhydroxy!verbindungen; wasserlösliche Stärke, Kartoffelstärke, wasserlöslicher Polyvinylalkohol, Zucker (Saccharose), Zellulosepulver.Avicel (mercerisiert),, gepulverte Fasercellulose MN 300 (Firma Maeherey und Nagel), Baumwollgarn (mercerisiert), Viskoseseide (mercerisiert). waren Händeispräparate.

Versuchsanordnung: siehe die einzelnen Beispiele im folgenden.

Aufarbeitung: lösliche Vernetzüngsprodukte wurden durch

_ Filtrieren oder Zentrifugieren (Klärung) ihrer Lösung vorgereinigt und durch Dialyse oder Gelfiltration von niedermolekularen Substanzen befreit. Unlösliche Vernetzungsprodukte fielen in der Regel flockig an, waren im allgemeinen leicht .filtrierbar und wurden dann durch Filtration und Auswaschen mit τ Wasser möglichst sofort vom Alkali und anderen löslichen. Stoffen befreit. Sofern nicht sofort zur Aminfixierung weiterverwendet, wurden sie vorzugsweise in der Kälte gelagert. Das Aminfixierungsvermögen ist allerdings erstaunlich stabil. Mehrtägiges Stehenlassen in feuchtem Zustand bei Raumtemperatur erwies sich in sehr vielen Fällen als zulässig. 4 0-98 23/1 157

-■ #5 -

^Belsplele

1) Wasserlösliche Stärke / Hypochlorit oder hypochlorige Säure

Man suspendiert 2 g wasserlösliche Stärke in 100 ml Wasser, erhitzt auf dem Wasserbad bis zur Lösung und lässt erkalten. Man versetzt je 5 ml dieser Stärkelösung (je 100 mg Stärke, entsprechend etwa 2 mVal -OH) mit je 100 mg (2mMol) Natriumcyanid, verdünnt mit Wasser auf 10,25 oder 50 ml, kühlt auf -5 oder 0 oder 10 C ab und versetzt bei. guter Kühlung tropfenweise mit Bleichlauge entsprechend einer Menge von 1/2 oder 1 oder 2 oder 4 mMol Natriumhypochlorit. Flockung setzt ein nach Zugabe von 0,5 bis 1 mMol Natriumhypochlorit, weitgehend unabhängig von Temperatur und Volumen der Reaktionsmischung Das Trockengewicht der Ausfällungen liegt um 100 mg. Dieselbe Versuchsreihe mit nur 50 mg (1 mMol) Natriumcyanid ergibt etwa das gleiche Resultat.

Führt man diese Versuche derart durch, dass die ganze Hypochloritmenge auf einmal zum Stärek/Cyanid-Gemisch gegeben wird, so erfolgt die Ausflockung nur dann mit Sicherheit, wenn das Cyanid im Ueberschuss vorlag. Im Fall von Unterschussigem Cyanid scheint sich die Reaktion im wesentlichen auf die Oxydation des Cyanids zu beschränken.

Dieser letztere Eindruck bestätigt sich, wenn man das Hypochlorit vorlegt und das Stärke/Cyanid-Gemisch dazugibt. Erfolgt diese Zugabe tropenweise, so erfolgt auch bei Cyanid-Üeberschuss keine Produktflockung. Erfolgt sie dagegen auf einmal, so ist im Fall von Cyanidüberschuss Produktflockung zu beobachten. Man vergleiche hierzu die Diskussion über den Reaktionsmechanismus im Anhang.

Der pH-Wert obiger Reaktionslösungen liegt bei etwa 12. Verdünnt man das Stärke/Cyanid-Gemisch mit 0,1-n Natronlauge anstelle von Wasser, so erfolgt keine Produktflockung. Ein pH von 13 stellt

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also ungefähr die obere Grenze dar. Legt man 100 mg Stärke und 100 mg Natriumcyanid in 15 ml Wasser vor (pH 11,2) und versetzt dann innert 5 Minuten bei O- 5°C mit 2 mMol Natriumhypochlorit und 2mMol Natriumhydrogencarbonat in 10 ml Wasser (pH 10,8) oder mit dem Reaktionsprodukt von 2mMol Natriumhypochlorit und 1 g festem CO in 10 ml Wasser (pH 7,8), so erfolgt beidemale Flockung schon vor beendeter Zugabe; die pH-Werte nach beendeter Zugabe sind bei 11,0 und 10,6.

Setzt man dagegen zum selben/Stärke/Cyanid-Gemisch 2 mMol HCl und 2,5 InMoIK₂CO₃ (Totalvolumen 15 ml, pH 10>0) , so bewirkt obige Lösung von hypochloriger Säure mit dem pH 7,8 nicht mehr in jedem Fall eine Produktflockung. Der pH-Endwert solcher Reaktionsmischungen liegt um 10,0. Keine Flockung erfolgt, wenn die Stärke/Cyanid-Mischung wegen Zusatz von 2mMol HCl und 0,1 mMol K C0_ ein pH von 9,8 oder wegen Zusatz von 2 mMol HCl ein pH von ca, 7 besitzt und das pH nach Reaktion mit der Lösung der hypochlorigeh Säure vom pH 7,8 bei-9,6 oder 7,5 liegt. Daraus folgt für die untere pH-Grenze ein Wert von etwa 10. Die Alkalinität von Stärke/Cyanid-Gemisch kann wahlweise auch durch Zusatz von Ammoniumchlorid abgepuffert werden.

2) Wasserlösliche Stärke/Chlor und Natronlauge oder Kaliumcarbonat

Man versetzt 5 ml Stärkelösung (100 mg Stärke) mit 100 mg (2 mMol) Natriumcyanid, 2 ml oder mehr einer 1-m Lösung von Kaliumcarbonat (mindestens 2 mMol) und 8 ml Wasser, kühlt auf 0°C, setzt 10 g Eis zu und leitet unter guter Kühlung Chlorgas (2 mMol^ ein bis das Reaktionsgemisch auf Kaliumjodid/Stärke-Päpier positiv anspricht. Das Produkt fällt flockig aus. Dies ist auch der Fall, wenn 5 ml Stärkelösung, 2 ml 2-n Natronlauge, 3 ml Wasser und 10 g Eis unter Kühlung r, mit Chlor (ca. 2 mMol) behandelt werden, bis der pH-Wert zwischen 9,5 und 10 liegt, und dann auf einmal mit einer Lösung von mindestens 100 mg Natriumcyanid in 5 ml Wasser

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Übergossen werden. Man beachte, dass bei dieser Ausführungsform ein Cyanid-üeberschuss erforderlich ist.

3) Stärkekleister/Brom und Natronlauge oder Kaliumhydrogen-• ■ Karbonat · . ; ;

Man erwärmt 300 mg Stärke in 35 ml Wasser auf 70°C, lässt erkalten, zentrifugiert während 5 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute, dekantiert den üeberstand ab, setzt zum Rückstand., der ein Trockengewicht von etwa 100 mg besitzt, 2 ml 2-n Natronlauge und 0,5 ml einer Lösung von 110 mg (2,2 mMol) Natriumcyanid in 5 ml Wasser, kühlt auf 0 - 5°C und lässt nun gleichzeitig aber getrennt die restliche Cyanidlösung und 320 mg Brom (2 mMol) derart unter kräftigem Rühren eintropfen, dass mit Kaliumjodid/Stärke-Papier in keinem Moment überschüssiges Brom bzw. Hyprobromit nachgewiesen werden kann. Es flockt ein gut filtrierbares Vernetzungsprodukt. Das Ergebnis ist ungefähr gleich bei Verwendung der doppelten Menge von Natronlauge, Cyanid und Brom, aber schlechter bei Verwendung der jeweils halben Menge.

Man kann auch den Stärkekleister mit 110 mg Natriumcyanid (2,2 mMol), mindestens 4 ml einer 1-m Lösung von Kaliumhydrogen-carbonat und dann tropfenweise unter Kühlung mit 320 mg Brom (2 mMol) versetzen, worauf der Kleister infolge Veränderung durch Vernetzung filtrierbar wird.

In einer dritten Variante versetzt man den Stärkekleister mit 320 mg Brom, tropft unter gutem Rühren und Kühlen mindestens 4 ml 1-m Kaliumhydrogen-carbonat-Lösung zu, lässt 15 Minuten stehen und versetzt auf einmal mit der Lösung von 140 mg Natriumcyanid (2,8 mMol) in 5 ml Wasser, wobei für intensivstes Rühren zu sorgen ist.

4) Wasserlösliche Stärke/Chloramin T

Man versetzt 5 ml Stärkelösung (100 mg Stärke) mit 100 mg (2 mMol) Natriumcyanid in 20 ml Wasser und tropft innert

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O'

1-1 Minuten bei 5 C eine Lösung von 562 mg (2 mMol) Trihydrä't von Chloramin T in 2 ml Dioxan unter gutem Umrühren zu. Die Produktflockung erfolgt schon vor Beendigung der Chloraminzugabe. Man kann mit demselben Erfolg bei 20°C arbeiten und/oder eine wässerige Lösung von Chloramin T benützen. .

5) Wasserlösliche Stärke / N-Bromsuccinimid

Man versetzt 5 ml Stärkelösurig (100 mg Stärke) mit 100 mg (2-mMol) Natriumcyanid in 15 ml Wasser und 1 ml 2-n Natronlauge und hierauf bei 20°C tropfenweise unter Rühren mit einer Lösung von 360 .mq Bromsuccinimid in 2ml Dioxan. Dauer ca. 15 Minuten. Die .Umsetzung wird schon nach etwa 7 Minuten durch Ausbildung einer Trübung sichtbar.

Anstelle von N-Bromsuccinimid kann man auch N-Bromacetamid oder N-Chlorsuccinimid verwenden.

6) Wasserlösliche Stärke / Chloramin

Man versetzt eine Mischung von 1-n Ammoniak und Eis mit Natronbleichlauge (1 MpI Natriurnhypochlorit pro Mol Ammoniak) _r destilliert am Vakuum (Kp₂_ = 35 C) und kondensiert die wässerige Chloramin-Lösung in gut gekühlter Vorlage. Die Gehaltsbestimmung erfolgt jodometrisch. Man versetzt 5 ml Stärkelösung (100 mg) Stärke mit 100 mg (2 mMol) Natriumcyanid .in 10 ml Wässer, kühlt auf 2 -* 4°C und tropft unter gutem Rühren und Kühlen 10 ml Chloraminlösung (2 mI4ol) zu. Es fällt ein sehr gut filtrierbares Vernetzμngsprodukt aus, Trockengewicht ca. 100 mg. Etwas Ammoniak in der Chloramin-Lösung ist unschädlich.

7) Wasserlösliche Stärke / t-Buty!hypochlorite

Man tropft zur 5 ml Stärkelösung (100 mg Stärke) und 100 mg

Natriumcyanid (2 mMol) in 20 ml Wasser (pH 11,1) bei 5°C

unter gutem Rühren 217 mg (2 mMol) frisch bereitetes aber

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nicht destilliertes t-Butylhypochlorit. Noch bevor die gelben Estertropfen völlig verschwunden sind, setzt die Reaktion ein (Opaleszenz), und einige Sekundenspäter erfolgt die Ausflockung des vernetzten Reaktionsproduktes (pH 10,8). Das Ergebnis ist ähnlich, wenn das Stärke/Cyanid-Gemisch vorher mit 1 oder mit 2 ml einer 1-m Lösung von Pottasche versetzt wird.

Mit gleichem Erfolg verwendet man die Ester der hypochlorigen Säure mit Aethanol, Propanol oder tert. Amylalkohol.

8) Wasserlösliche Produkte mit Aminfixierungsvermögen

Durch Anwendung höherer Verdünnungen (50 ml_f 100 ml oder mehr pro 100 mg wasserlösliche Stärke) gelangt man nach den unter 1-2) und 4 - 7)beschriebenen Verfahren im vorgeschriebenen pH-Bereich, insbesondere bei kräftigem Umrühren zu Verhältnissen, wo keine Flockung mehr eintritt, aber an der gelösten Substanz gleichwohl ein Aminfixierungsvermögen nachweisbar ist, insbesondere gegenüber niedermolekularen dialysierbaren Aminoverbindungen. - Einen qualitativ gleichen "Effekt erzielt man durch Verringerung der die Vernetzung limitierenden Menge an Cyanid bzw. Hypochlorit auf etwa 0,25 -VaI pro VaI organisches Hydroxyl.

9)"Saccharose / Hypochlorit

Man löst 100 mg Saccharose (Zucker) in 10 ml Wasser (2,34 Milligrammäquivalente organisches Hydroxyl), fügt 100 mg Natriumcyanid (2 mMol) dazu, kühlt auf 5 - 10 C und versetzt unter starkem Rühren mit 2 mMol Natriumhypochlorit in Form von Natronbleichlauge. Schon nach Zugabe der halben Menge des Hypochlorits fällt ein flockiges Vernetzoingsprodukt aus. Es wird nach Beendigung der Hypochloritzugabe abfiltriert

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und gründlich ausgewaschen. Sein .Aminfixierungsvermögen ist tadellos; das Trockengewicht belauft sich auf rund 100 mg. Es ist bemerkenswert, dass diese Verbindung sich beim Stehen im alkalischen Reaktionsmedium nach einigen Stunden verflüssigt. Die gleiche Eigenschaft besitzt ein Produkte, welches man aus 100 mg Saccharose, 10 ml Wasser und 106 Cl mMol) bzw. 212 (2 mMol) Bromcyan und 1 bzw. 2 ml 1-n NaOH erhält. Diese Saccharosederivate sind neu.

Entsprechend verhalten sich andere nicht reduzierende ■". Oligosaccharide, z.B. das Trisaccarid Raffinose und das· Tetrasaccarid Stachyose. Auch deren Vernetzungspro.dukte sind neue Verbindungen.

10) Polyvinylalkohol / Hypochlorit

Man löst 100 mg Polyvinylalkohol (2.3 Milligramm aequivalente organisches Hydroxyl) in 10 ml siedendem Wasser, setzt zur erkalteten Lösung lÖO mg (2 mMol) Natriumcyanid und dann bei 0 - 5 C unter Rühren 2 mMol Natriumhypochlorit in Form von Natronbleichlauge. Das Vernetzungsprodukt fällt in groben ■ etwas schmierigen Flocken aus, lässt sich aber gleichwohl abfiltrieren und auswaschen. Das Produkt ist in Kontakt mit Wasser stabil wie die Produkte aus den Beispielen 1) bis 9), verflüssigt sich aber wie das Saccharosederivat beim Stehen im alkalischen Reaktionsmedium.

11) Baumwollgarn / Hypochlorit oder hypochlorige Säure

500 mg rohes Baumwollgarn werden mit Wasser ausgekocht und zur Entfettung zweimal mit Alkohol, zweimal mit Tetrachlor-. kohlenstoff und zweimal mit Aether gewaschen und an der Luft getrocknet. Das Garn wird anschliessend über Nacht in 17%iger Natronlauge unter Luftausschluss stehengelassen, gut ausgewaschen, mit 500 mg Natriumcyanid in 10 ml Wasser und

ii 0 - 5 C tropfe
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anschliessend bei 0 - 5 C tropfenweise mit 10 mMol Natrium-

hypochlorit in Form von Natronbleichlauge versetzt. Man wäscht gründlich aus und bestimmt das Aminbindungsvermögen, indem nach erfolgter Enzymfixierung mehrere aufeinanderfolgende Aktivitätsprüfungen durchgeführt werden, wobei zwischen jeder Prüfung aufs Neue gründlich ausgewaschen wird. Diese Vorsichtsmassnahme ist notwendig, weil, auch unspezifische Enzymfixierung auf mercerisierten Fasern beobachtet worden ist, und weil die Säureempfindlichkeit des Enzympräparates den sonst üblichen Waschprozess mit einem schwach sauren Puffer ausschloss.

Eine Variante besthet darin, das gewaschene und mercerisierte Garn mit der oben angegebenen Menge von Natronbleichlauge und überschüssigem festem C0_? zu behandeln, die Flüssigkeit abzudekantieren und das Garn in die wässrige Lösung von" 500 mg Natriumcyanid einzutragen. Nach 5-10 minütigem Stehen wird die Lösung abgegossen und das Garn mit Wasser ausgewaschen.

In einer dritten Variante wird das gewaschene und mercerisierte Garn (500 mg) mit 3 g Natriumcyanid in möglichst wenig Wasser über Nacht inkubiert und nach Verdünnen mit 25 ml Wasser unter stärker Kühlung mit 60 mMol Natriumhypochlorit versetzt, wobei starkes Rühren erforderlich ist.

12) Viscosegarn / Hypochlorit

Man suspendiert 250 mg Viscosegarn in 2-n Natronlauge, giesst nach 1 Stunde ab, wäscht mit Wasser aus, übergiesst mit einer Lösung von 500 mg Natrimcyanid in 5 ml Wasser, inkubiert 30 Minuten, kühlt auf 5°C und versetzt innert 30 Minuten mit 10 mMol Natriumhypochlorit in Form von 7-proz. Natronbleichlauge, wobei kräftig gerührt wird, .und wäscht mit Wasser gründlich aus.

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13) Anstelle der wasserlöslichen Stärke kann man nach 1-2)-und 4-8) Dextrine oder Mischungen von Destrinen und wasserlöslicher Stärke oder Mischungen von wasserlöslicher Stärke und Polyvinylalkohol verwenden. Ebenso ist Natronbleichlauge durch eine aequivalente Menge von Kalibleichlauge und Natriumcyanid durch Kaliumcyanid ersetzbar; die verwendeten Bleichlaugen wurden in jedem Fall titriert.

14) Arbeitstemperaturen von 25 bis zu 50 C verwendet man, um bei Einsatz konzentrierterer Lösungen Gelierung des Eduktes wie auch des Produktes zu vermeiden. Ein Beispiel bietet die Anwendung des Verfahrens auf die Vernetzung, und Aktivierung von Pektinen und von Schleimstoffen, deren Wasserlöslichkeit bei.massiger Vernetzung erhalten bleibt.

"Amylopektinfraktion"/Hypochlorit

1 Gramm Kartoffelstärke wird in 1 Liter Wasser suspendiert. Man erwärmt unter Rühren auf 70 ⁰C₃ hält eine Stunde auf dieser Temperatur, lässt erkalten und trennt die·hochgequollene, aber unlöslich gebliebene Fraktion durch Zentrifugieren ab. Nach Wiederholung der Warmwasserbehandlung und abermaliger Abtrennung auf der Zentrifuge verbleibt eine "Amylopektin"-Fraktion mit einem Trockengewicht von etwa einem Drittel der eingesetzten Stärke; siehe Advances, in Carbohydrate Chemistry, Vol. I₃ Seite 262, Academie Press Ine. Publishers, New York

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Je ungefähr 100 mg (Trockengewicht) eingeweichte

Stärke und "Ämylopektinfraktion" werden in 35 ml Wasser .suspen alert, mit 25 oder 50 oder 100 oder 200 oder 4oo mg Natriumcyanid und anschliessend, in einer Versuchsreihe unter Eiskühlung, in einer zweiten Versuchsreihe bei Raumtemperatur, tropfenweise unter starkem Rühren mit 3-proz. (Gew„/Gev7,) Javellewasser versetzt, bis die Prüfung mit Kl^Stärke eben einen bleibenden lieber schuss an Hypochlorit anzeigt» Hypochloritverbrauch: 1 Mol pro "öl Natriumcyanid..Der pH-Wert steigt von etwa 10,5 (Cyaiiid-Lösung) auf etwa' 12 an.Versuchsdauer 5 - 20 Min« Resultat hinsichtlich Vernetzung:

Stärke zeigt schon ab 25 mg Cyanid gute Filtrierharkeit; "Ämylopektinfraiction" wird bereits bei 50 mg Cyanid flockig und sehr gut filtrierbar.

Das Resul'tat bleibt, praktisch gleich bei Verwendung¹ von 6-pro.z., (Gew,/Gevr.) Javellewasser.

Das Resultat eines "Ämylop©ktinfrak;tion"-Änsatzes mit 50 mg Cyanid ändert sich auch nicht, wenn das 6-proz. Javellewasser vor seiner Verwendung auf pH 6 eingestellt wird: der pH-V.^rert steigt auch hler von anfänglich 10,5 immerhin gegen 11 und das Pro'dukt ist hinsichtlich Floekung,. Filtrierbarkeit und Aktivierungsgrad einwandfrei. Wird der pH indessen nach der Cyanidzugabe auf pH 6 oder 8 eingestellt und erfolgt

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dann die Hypochloritzuigabe beim selben pH (pH-Stat), so bleibt jede Ausflockung aus; der Hypochloritverbrauch pro Mol Cyanid nimmt in, allen diesen Fällen zu, vermutlich wegen teilweiser Disproportionierung des Hypochlorits unter Bildung von Chlor at und Kochsalz, .oder -wegen Oxydation zu Cyanat. ;

IiJb) Cellulose/Hypochlorit

O mg mikrokristallines Cellulosepulver (AVICEL) und gepulverte Fasereellulose MN 3OO (Firma Macherey und Nagel) werden während 2 Stunden in V/asser suspendiert. Eine dritte Probe, ebenfalls aus Fasereellulose MN 3⁰⁰> wird über Nacht in 17,5-proz_o Natron-. lauge unter Luftausschluss mercerisiert. Anschliessend werdeij die drei Proben wie unter Γ beschrieben mit je 50 mg Natriumcyanid und Javellewässer aktiviert. In -allen Fällen wird die Cellulose körniger und dichter; sie lässt sich gut filtrieren. '.-,-■..

. Der Hypochloritverbrauch beträgt auch hier 1 Mol pro ^lolrC^-anidi Die Gegenwart der Mercerisierlauge stört wegen-erhöhter Alkalinität den Reaktionsverlauf; . deshalb empfiehlt sich, -

ein vorhergehendes Abtrennen ' •oder Neutralisieren der Natronlauge.

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ORIGINAL INSPECTED Sephadex G 200/Hypochlorit

Je 100 mg Sephadex G 200 (Pharmacia Pine Chemicals AB, Uppsala) werden wie unter l^a beschrieben mit Mengen von 25 bis 400 mg Natriumcyanid und Javellewasser aktiviert, wobei Hypochlorit-Verbrauch und pH-Veränderung sich im angegebenen Rahmen bewegen. Das Sephadsx wird hierbei ebenfalls dichter, so dass es nun beispielsweise in der schnellen Flüssigkeitschromatographie als Säulenfüllung benutzbar ist.

15) Kartoffelstärke/Hypochlorit

Man suspendiert 10 g Kartoffelstärke für Speisezwecke in 1 1. Wasser, erwärmt während einer Stunde auf 60 ⁰C .unter leichtem Rühren, zentrifugiert, giesst den Ueberstand ab, versetzt den Rückstand, der ein Volumen von ungefähr 45O ml besitzt, mit 14,7 g (0,3 Mol) Natriumcyanid, rührt, kühlt auf 10 ⁰C und lässt'innert 30 Minuten 130 ml (0,25 Mol Hypochlorit) Natronbleichlauge einlaufen. Der pH-Wert steigt von 11 auf 12,5. Man filtriert auf einer Glasfritte und wäscht mit 1,5 1 Eiswasser. Das Produkt wird sofort verwendet oder im gefrorenen oder lyophilisierten Zustand aufbewahrt.

In einer Variante A suspendiert man 10 g Stärke derselben Qualität in 500 ml Wasser, erhitzt 30 Minuten auf 60 ²C, lässt erkalten, fügt 24,5 g (0,5 Mol) Natriumcyanid zu, kühlt auf 5 ⁰C und versetzt unter Rühren gleichseitig mit - 200 ml (0,38 Mol Hypochlorit) Natronbleichlauge

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!--Ei; Salzsäure^ eterart_? dass, der pl-^Wq-rt in der Reak— tionsmiserhttng; ii& Bw&ieh von 11 bis. 11,5 bleibt« Ope.ra;tiOfii dauert?. jQ; bis MQ Minuten·.

Jm. einer Variante 1 versetzt man das Gel nach ® £ mit;' 1^,J g: Natramnoyanid (0,^ MpI). Hierauf wdrd unter Ritjjpe-rt bei % ^PC ChlQr eingeleitet und der RH^Viert durcla g;leiQhse.itiges Z:ugeben von' 2-n. Natronlauge; bei. 11 bis -ti j § gehalten. Die Operation wird nach Zugabe von 2.00 ml Lauge (0,8 Mol) abgebrochen.

Ίχχ einer Variante C löst man im Star kegel nach Variante A t_hk-% g Natriumcyanid (0,05; Mol) , Man kühlt . stuf § ⁹C und leitet unter Rühren langsam (blasenweise) Chlor ein,: wQbe-i der pH^Wert durch kontinuierliche Zugäbe einer !,ös,ung? von 22 g (Q,U5 Mol) Natriupcyanid in 30Oj ml 2-n NattFO.nlauge auf ungefähr 11 gehalten -vfird, Me eingele^it et© Chlormenge ent spricht ungefähr Q,,3 Mol

einher' Variante D suspendiert man 20; g Ear^ derserlben Qualität in ^QQ m:l Wasser= von 30 erwärmt während 3Q Minuten auf 6q ^cc_?: kühlt die gielatinSse Masse auf" % ⁰C,, setzt 25 w& .'. ■ von 23^ g (O₃SS Mol) Natriumeyanid in Vf^sser (Tota^volumen 2^5 ml.) zu» rührt langsam und; gibt .■viährend ungefähr einer Stunde, gleichzeitig ein:,

ϊ4ί Mßl Natriumhypochlorig Nätronbleichlauge _3: und

- die restlichen 220 ml obiger Lösung von Natriumcyanid, Nach Beendigung der Reaktion liegt den pH^-Wert zwischen 13 und 1*1» Man filtriert bei 15 °G_S wäscht mit Wasser chlorfrei (2 1) und erhält einen Filterkuchen von 157 ig· Sein Trockengewicht beträgt 22,6 g, der· Stickstoffgehalt 6,4 %> bezögen auf das" Trockengewicht» In einer Variante E verfährt man genau wie in Variante D, arbeitet aber mit einer Lösung von 49 g [1 Mol) Nätriumcyanid (Totalvolumen 245 ml). Das Resultat ist praktisch identisch mit dem Resultat von Variante D (Gewicht des Filterkuchens, Trockengewicht, Stickstoffgehalt) mit Ausnahme des Urnstandes, dass Piltrat und Waschwasser in diesem Fall 0,5*1 Mol unverändertes Gyanid enthalten. Der Cyanidverbr-aueh entspricht also der Menge des-eingesetzten Hypochlorits.

In einem völlig identischen Parallelversuch ist laufend geprüft worden, wie sich eine kleine Probe des Reaktionsgemiscb.es in essigsaurem Milieu gegen Kaliumjodidstärkepapier verhielt. Es trat regelmässig eine blaue Färbung auf, wenn das Molverhältnis von zugesetztem

Hypochlorit zu

jfcyanid den Wert 0,46 überschritt. In alkalischem Milieu tritt die blaue Färbung bekanntlich erst ein, wenn das besagte Verhältnis den Wert 1 überschreitet.. Die Bedeutung dieses Unterschiedes bleibt vorläufig unklar. Möglicherweise ist die blaue Fäbung in essigsaurem Milieu ein

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Hinweis auf ein Zwischenprodukt, welches bei Unterschreitung vom Molverhältnis 0, *16 jeweils wieder verschwindet. Um Chlorcyan kann es sich nicht handeln, denn Chlorcyan färbt das Kaliurnjodid-Stärkereagens nicht. Ebensowenig handelt es sich um unverbrauchtes Hypochlorit,denn dieses färbt das Reagens schon in alkalischem Milieu.

Eine Probe des lyophilisierten Produktes absorbierte in Kaliumbromid zwischen 3200 und 3600 cm (OH-Bande) etwas schwächer als die als Ausgangsmaterial benutzte Stärke,'ferner" schwach aber deutlich bei 2150 cm (Zuordnung unsicher: Cyanat? ^C=NH ?) und stark bei 1720 cm ( >C = N-Bande).

16) Bemerkung zur Stärkequalität

"V Nicht jede industrielle Stärke ist als solche zur erfindungsgemässen Vernetzung und Aktivierung zwecks Aminfixierung geeignet. Es ist in der Tat nicht überraschend, dass das Ausgangsmaterial einerseits, die Extraktions- und die Aufschlussmethode andererseits die Zugänglichkeit und die Reaktionsfähigkeit der erfindungsgemäss involvierten Hydroxylgruppen beeinflussen. Die Verhältnisse sind hier also ähnlich wie bei Zellulosepulver und Zellulosefasern.

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II. Die Aminfixierungsreaktion

Repräsentative Beispiele bieten

- die Fixierung einer Acylase, welche von der Firma Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Nagoya (Japan) zur industriellen Racematspaltung von N-acetylierten cC-Aminosäuren

angeboten wird,

- die Fixierung von kristallisiertem Chymotrypsin, und

- die Fixierung von Valin und von Glutaminsäure.

In ausgedehnten Vorversuchen mit der genannten Acylase ist festgestellt worden', dass es vorteilhaft ist, die aktivierten Produkte bei 4 oder -15 ⁰C aufzubewahren; Aktivitätsverluste bei Raumtemperatur innert *l8 Stunden. in feuchtem Zustand sind indessen unerheblich. Im lyophilisierten Zustand spielt die Aufbewahrungstemperatur keine ßrosse Rolle. Ihre Fixierung erfolgt in Wasser oder

-4 0,1-n Hydrogencarbonatlösung unter' Zusatz von 10 -m KobaltChloridlösung etwas effektiver als in 0,1-n Hydrogencarbonat lösung. Erhöht man die Ionenstärke durch Zusatz von Kochsalz (0,1-n oder 0,5-n), so nimmt die Fixierung etwas zu. Von gröss.erer Bedeutung ist die Verdünnung: in Mischungen von je 1 g lyophilisiertem aktivem Träger und je 0,1 g Acylase in 5, 20 oder 50 ml Wasser betrug die Fixierung 8¹J, 79 und 68 % der eingesetzten Aktivität. Eine wichtige Rolle spielt auch das Verhältnis von Träger zu Enzym: 409823/1157

je 10 g feuchter Träger wurden mit 0,02, 0,05, 0,1 und 0,2 g Enzym in 10 mlöji-h Hydrögencarbönatlösung und 10 -m Kobaltchloridlösüng Während 72 Stünden bei ^ ⁰C inkübiert. Nach Auswaschen mit je einem Liter desselben Puffers ergab die Aktivität^bestimmung im Filträt Fixierung von lÖÖ, lOOj 77,3 und 83 ί 5 %.

Die Fixierung erfolgt ,verhältniSmässig längsami

je 5 f feuchter Träger j 0,1 g Acyläse und 5 ml Wasser wurden bei 4 ⁰C während 1, 2, 12 und 24 Stunden inkübiert. Nach Filtration und Auswaschen fanden'sieh -im Fütrat 46v 47, 39> 27 und 13 % .der eingesetizten Aktivität.

Am wirkungsvollst en erscheint die- seho-ri in der . Einreitühg vorgeschlagene. Methode, das lyöphilisierte öder ahderweitig nach Möglic'hkeit entwässei'te Enzym in den bei der Filtration des aktivierten Tragers erhaltenen feuchten Filterkuchen einzurühren, _wobei es Von Vorteil sein kanrij den. Filterkuchen vorgähgig in Puffer zu suspenfdierehj den überschüssigen Puffer durch Filtration- zu eiitffernen und den nunmehr gepufferten. Fiiterkuöhen zu verwenden* , ·. , --..-,.

B7

17) Acylase, Fixierungstest

Man vermischt die feuchten Filterkuchen aus je 100 mg wasserlöslicher Stärke der Beispiele 1, 2, 4, 5, 6 und 7)s aus 100 mg Saccharose nach Beispiel 9) und aus 100 mg Polyvinylalkohol nach Beispiel 10) mit 25 mg eines Enzympräparates, das durch Dialysieren der "Amand^-AcjOase und Lyophilisieren des nicht-dialysierbaren Anteils erhalten wurde, lässt über Nacht in der Kälte stehen, wäscht mit 200 ml des oben genannten Hydrogencarbonat/Cobaltchloridpuffers aus und versetzt zur Aktivitätsprüfung mit einer Standardlösung des Natriumsalzes von Acetyl-DL-pheny!alanin. Eine Vorbehandlung des Filterkuchens mit dem Puffergemisch erwies sich in den meisten Fällen als überflüssig.

In entsprechender Weise behandelt man die Filterkuchen nach Beispiel 3) und die Fasern nach Beispiel 11) und 12).

18) Acyläse, Anwendungstest

In den feuchten Filterrückstand (aktivierte "Amylopektinfraktion" aus 10 g Kartoffelstärke und 9 g Natriumcyanid), der aus dem Waschprozess (0,1 m NaHCO, + 10 -m CoCIp) etwas Base und etwas Co -Ion enthält, wird 1 g durch Dialyse vorgereinigte lyophilisiefte Acylase eingerührt» Man lässt über Nacht bei 4 °C stehen,

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-4
nimmt in 0,1-m NaHCO +10 -m CoCl₂ auf, filtriert und ■wäscht mit 1 Liter derselben Salzlösung langsam und gründlich nach. Man gibt den. nunmehr Acylase^-beladenen Filterrückstand zu einer Lösung von 24 g Acetyl-DL-phenyl-

-4
alanin-Natrium in 300 ml 10 —m CoCl₂ und inkubiert unter langsamem Rühren bei 4o ⁰G in Gegenwart'von etwas Thymol, Nach 2 Tagen, während derer man den Fortschritt der Reaktion polariinetrisch verfolgen kann, wird vorn fixierten Enzym abfiltriert und der Filterrückstand - ohne ihn auch nur auszuwaschen -· in eine weitere Portion von 24 g

DLrPhenylalanin-Natrium in 300 ml ^v10 -m CoCl₂ eingetragen usw. (2. Abbauzyklus). ·

Aus dem eingeengten Filtrat kristallisiert L-Phenylalanin in einer Ausbeute von 60v- 70 %₃ und aus der angesäuerten Mutterlauge Acetyl-phenylala- " 'nln, Ausbeute JO - 80 %, das vorwiegend aus der D-Form besteht. Die Substanzverluste beruhen auf der Flüssigkeitsretention durch den voluminösen Filterruckstand. Sie verringern sich bereits bei der Aufarbeitung des Filtrates aus dem zweiten Abbauzyklus, Es können leicht minöi stens 100 bis 150 Abbauzyklen durchgeführt werden, bevor die Enzyminaktivierung ein Ersetzen des Enzympräparates erfordert. In der Kälte ist die fixierte Acylase, besonders in Gegenwart von Natriumacetat und Acetyl-D-phenylalanin-Natriunij monatelang unverändert haltbar.

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19) Chymotrypsin

Man löst eine Mischung von 25 nig Chymotrypsin und 25 mg Natriumsulfat in 2 ml V/asser, lyophilisiert und verreibt den Rückstand unter Zusatz von 2 ml 0,1-n Natriumhydrogencarbonatlösung mit einem nach Beispiel 1) bei O bis 5 ⁰C erhaltenen Filterkuchen aus 200 mg löslicher Stärke, 200 mg Natriumcyanid, 20 ml Wasser und 4 mMol Natriumhypochlorit (Bleichlauge), lässt 30 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, wäscht gründlichst mit 1,5 1 Wasser und lyophilisiert den Rückstand: Trockengewicht ca. 220 mg mit einem Wassergehalt von"11,5 % (Karl Fischer-Titration) . Eine Probe wurde 36 Stunden bei 110 ⁰C in 20Jfiger Salzsäure hydrolysiert, und das Hydrolysat nach

Stein und Moor auf Aminosäuren analysiert.. Es wurden die erwarteten Aminosäuren im erwarteten Mengenverhältnis gefunden /ihre Gesamtmenge entsprach einer Fixierung von 16,5 mg Chymotrypsin.

20) Valin auf löslichem Träger

Man fügt zu den dialysierten Lösungen nach Beispiel 8) und Beispiel 14) 1 % vom Gewicht der Lösung Valin, puffert mit etwas Hydrogencarbonat auf pH 9, lässt über Nacht bei 0 ⁰C stehen, dialysiert bei 0 ⁰C bis zur völligen Entfernung der Natriumionen und lyophilisiert. Im Hydrolysat der lyophilisierten Produkte findet sich Valin. 40982 3/1157

21) Glutaminsäure auf unlöslichem Träger

Je 1 nach der Hauptvorschrift in Beispiel 15) bereiteter Filterkuchen wurde in verschiedener Verdünnung bei verschiedener Temperatur während verschiedenen Zeiten ■■ mit 8 g Glutaminsäure (54 mMpl) und 5,6 g Natriumcarbonat (5*1 mMol) behandelt. Die erzielte, Beladung nimmt im Konzentrationsbereich von 0,01 bis 0,1 g Glutaminsäure pro ml um einen Faktor 6,5 zu., von 0 auf 20 ⁰C um einen Faktor 1>3* von 20 auf 40 ^CC um einen Faktor 1,16 zu, und von ,. 2,5 auf 5 Stunden um einen Faktor 1,17, von 5 auf 50 Stünden nochmals um denselben Faktor zu. Bei konstantem Volumen nimmt sie bei Verf.ünffachung der Glutaminsäure- menge um das dreieinhalbfache zu» Bei Verdünnung mit 20 ml liasser, Raumtemperatur und 15-stündiger Reaktionsdauer resultierte eine Fixierung von durchschnittlieh 10 mMol Glutaminsäure (Bestimmung acidimetrisch und.durch Aminosäureanalyse nach Stein und Moore). Die fixierte Glutaminsäure verbraucht pro Mol Ί Mol Lauge;.ihre Titrationskurve erinnert' an jene von Mönonätriumglutamat in-Gegenwart von Formaldehyd, -

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III. Analytischer Nachweis von fixierter 'Enzymaktivität

22) -Fixierte Acylase

Ein Filterkuchen oder eine'Fasermenge, welche 100 mg ursprünglich eingesetzter Polyhydroxy!verbindung entspricht, wird in 4 ml 10 -m CobaltchloridlÖsung aufgenommen, auf MO ⁰C erwärmt und mit H ml einer auf HO °C erwärmten Lösung versetzt, welche DL-Acetylphenylalanin -m), Natriumhydrogencarbonat (6.6·10 -m) und

Kobaltchlorid (10 -m) enthält. Man inkubiert 30 Minuten bei i|0 ⁰C unter Rühren, filtriert und trägt 5 /il des Filtrates auf eine Dünnschicht aus Kieselgel, und daneben 5 )il von Vergleichslösungen, welche gerade so viel Phenylalanin enthalten, dass auf dem Chromatogramm Flecken entstehen, welche einem enzymatischen Abbau von 5» 10, 20 und ¹JO % entsprechen. Fliessmittel ist Chloroform/Methanol/ Eisessig/Pyridin (70/25/5/5). Das dermassen geschätzte Ausmass des enzymatischen Abbaus lag bei allen in den Beispielen beschriebenen Ausführungsformen zwischen 5 und HO %. '

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- HA -

23) Fixiertes Chymotrypsin . .

Man gibt die Lösung von 20 mg Acetyl-L-tyrosinät hy lest er in 3 ml Aethanol zu 9 ml 0,1-ni Phosphat puffer (pH 7»8), setzt das Enzympräparat zu, schliesst den pH-Stat an und verfolgt die Reaktion durch den Verbrauch von 0,2-n Natronlauge bei 27 - 28 ⁰C. Die Aktivität des Präparates aus 19)' war etwa halb so gross wie es die fixierte Chymotrypsinmenge erwarten Hess..

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Anhang

1. Experimenteller Vergleich der Reaktionswege I und II

Zur Diskussion stehen die Reaktionswege I und II nach dem vorstehenden Schema.

Im Zuge von I wird wegen der Reaktion:

XCN + £rOK + (l-£) HOH ;>£rOCN + (1-S) HOCN + HX

eine gewisse Menge Säure frei. Im Zuge von II dagegen wird unabhängig vom Mechanismus wegen der Reaktion:

NaOCl+NaCIi+öROH+ (l- &)H0H -> <$ROCN+(l-<S)NaOClH-SNaGK+

eine gewisse Menge Alkalihydroxyd frei. Ausserdem enthält Hypochlorit etwas freie Alkalilauge. Säure wie Lauge lassen sich im vorliegenden Fall durch die Gegenwart von starkem Carbonatpuffer soweit auffangen/ dass sich die pH-Verschiebungen im Rahmen von nur 0,3-0*^ pH-Einheiten bewegen. Eine pH-Regulierung mittels pH-Stat musste wegen der hohen Reaktionsgeschwindigkeiten ausser Betracht faller

Die pufferbedingte hohe Salzkonzentration verlangsamt I sowohl wie II. Ebenso wirkt die Erniedrigung der Reaktionstemperatur von 20 auf 0 ⁰C. Durch Kumulierung dieser Effekte werden I und II bequem vergleichbar. Nachstehende Vergleichsversuche sind typisch mit Hinsicht auf Reaktionsbedingungen und Resultate:

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Eine Stammlösung- aus

versetzt man mit entweder

oder

5 ml 2-^ige Stärkelßsung (Gew./Gew.) 10 ml 2-m K₂CO₃

10 ml Wasser
1,17 β NaCl (20 mMol) 5 ml 1-m KHCO, ■ 138 mg NaCl (2,34 mMol) und erhält so Losung A, pH 10,55 10 ml 2-m K₂CO, -

:;: =5 mi-i-m KKco,-

138 mg NaCl (2,34 mMol) und erhält so Lösung 3, pH 11,Γ 10 ml V/asser
1,17 g NaCl (20 mMol) oder 2,84 e. 5 ml 1-m KHCO₃ 2

128 mg NaCN (2,6 mMol) und erhält so Lösung C, pH 10,6 oder 5 ml Wasser

293 mg NaCl (5 mMol)

10 ml 2-m K₂CO₃ I38 mg NaCl (2,34 mMbl) und erhält so Losung D, pH 12,0

Man kühlt die Lesungen A, 3, C und'D auf -1 ⁰C und lässt unter starkem Rühren innert einer Minute zu A bzw. B bzw.

oder

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- tar- ■ '

D je 3 ml (2,6 mMol) einer frisch bereiteten wässrigen Lösung von frisch bereitetem Chlorcyan (Verfahren nach I), und zu C 2,53 g (2,3^ mMol NaOCl) Bleichlauge (Verfahren nach II) eintropfen. A und B (Verfahren I) reagieren schwach exotherm; die Temperatur wird durch Kühlung um 0 ⁶C gehalten. Nach 13 Minuten ist der Geruch des Chlorcyans noch schwach feststellbar; der pH-Wert liegt bei 10,25 (A) bzw. 10,8 (B). Die Abscheidung eines unlöslichen Vernetzungsproduktes erfolgt nicht. - C (Verfahren II) reagiert stark exotherm; die Temperatur steigt trotz Kühlung vorübergehend auf +3 ⁰C. Noch vor Beendigung der Hypochlorit-Zugabe wird das Reaktionsgemisch milehig, und dann erfolgt innert Sekunden die Abscheidung des Vernetzungsproduktes in flockiger, gut filtrierbarer Form. Ein scharfer Geruch verschwindet ziemlich schnell. 13 Minuten nach Versuchsbeginn liegt der pH-Wert bei 11,0. - Der Versuch mit Losung D dient zur Kontrolle der Chlorcyan-Qualität: noch vor Beendigung der Chlorcyan-Zugabe tritt die für. Vernetzung typische milchige Trübung auf und innert Sekunden erfolgt dann die Ausflockung des Vernetzungsproduktes. Man hält noch 12 Minuten um 0 ⁰C; der pH-Wert liegt bei 11,2. Der Chloreyan-Gerueh verschwindet erv/artungsgemäss rascher als bei den Versuchen mit den Lösungen A und B. Kommentar; Man beachte, dass I sich im Fall B innerhalb des pH-Bereiches von II Im Fall C abspielt. Das unterschied·

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- **■-■■■

liehe Ergebnis führt zur unausweichlichen Schlussfolgerung, dass die nach II beobachtete Vernetzung nicht auf die Wirkung von intermediär gebildetem Chlorcyan zurückzuführen ist. Ausbeute und Aminfixierungsvermogen des nach II unter Verv/endung von Lesung C erhaltenen Produktes bewegen sich in dem für das Verfahren II allgemein Üblichen Rahmen. « ·

2. Hinweis auf die Art der chemischen Reaktion, welche erfindungsgemäss zu vernetzten Polyhydroxyverbindungen mit Aminfixierungsvermögen führt

Ein weiterer, von obigem Ergebnis unabhängiger Hinweis auf die Verschiedenartigkeit von I und II ergibt sich aus der Beobachtung, dass II sich.so verhält, wie es dann zu erwarten wäre, wenn der erste Schritt in einer ' Veresterung von Hydroxylgruppen der Stärke mit hypochloriger Säure bestünde. Lässt man nämlich eine Mischung von " 2-^iger (Gew./Gew.) Stärkelösung und 7-^iger (Gew./Gew.) Natriumhypochloritlösung mit dem Mischungsverhältnis 100 mg Stärke : 2 mMol NaÖCl bei 0 bis 5 ⁰C unter kräftigem Rühren in eine gut gekühlte l-$ige Losung von. Natriumcyanid eintropfen, so erfolgt unabhängig vom stöchiometrischen Verhältnis zwischen OCl" und CN" eine prompte Ausflockung von vernetzter Stärke mit hervorragendem Aniinflxierungsvermogen. Lässt man umgekehrt das Cyanid zur Mischung von Stärke und Hypochlorit zutropfen, so fällt kein

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Vernetzungsprodukt aus. Offensichtlich wird das Cyanid vom Hypochlorit abgefangen, bevor die Stärke in Reaktion treten kann. Uebergiesst man aber die Stärke/Hypochlorit-Mischung auf einmal mit der stöchiometrischen Menge an Cyanid-Lb'sung, so erfolgt Ploekung von aminfixierungsaktivem Vernetzungsprodukt unter der auffälligen Voraussetzung, dass das Stärke-Hypochloritgemisch vor dem Cyanidzusatζ zuerst während kurzer Zeit inkubiert wurde, Zi3. während 5-15 Minuten bei 20 ⁰C. Ein Teil des Cyanids findet hierbei offenbar Gelegenheit, direkt mit einem vermutlich stärkegebundenen Anteil des Hypochlorits- zu rea.-gieren, z.B. nach dem Schema:

ROCl + CN" · > ROCN +Cl"

Dementsprechend kann man eine in Wasser gequollene, unlösliche Polyhydroxylverbindung (Trockengewicht 100 mg) wie beispielsweise Sephadex G 200 oder mercerisierte Cellulose (Avicel) mit Hypochlorit-Losung (2 mMol NaOCl) während 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur, gegebenenfalls unter Zusatz von Trockeneis, inkubieren, nach Zusatz von 100 ml Wasser von der Flüssigkeit abtrennen (Zentrifuge), den Rückstand in 100 ml Wasser aufnehmen, die Flüssigkeit abdekantieren (Zentrifuge), den Rückstand mit 10 ml 1-^iger Natriumcyanidl'csung übergiessen und ihn anschliessend auf der Zentrifuge cyanidfrei waschen. Das Produkt ·

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besitzt ein Arninfixierungs-vermÜgen, welches von der Dauer der Inkubation mit dem Hypochlorit abhängig ist.

Die unter den Beispielen beschriebene., ganz besonders milde und gleichm'ässig verlaufende Vernetzungsreaktion durch Einwirkung von t-Butylhypochlorit auf ein Gemisch von, löslicher Stärke und Nätriumcyanid wäre, da nach gegebenenfalls als Ergebnis einer primären .Umeste-r rungsreakt.ion zwischen dem organischen Hypochlorit und der Stärke aufzufassen. ,

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Claims (1)

1. ■ * si

   Patentansprüche

   1. Verfahren zur Herstellung von Umsetzungsprodukten einer gegebenenfalls biologisch aktiven, wasserlöslichen, an mindestens "einem basischen Stickstoffatom Substitüierbaren Aminoverbindung und eines aktivierten Trägers, dadurch gekennzeichnet, dass man Blausäure und/oder ein wasserlösliches Cyanid und ein Reagens, welches positives Chlor oder Brom enthält, nämlich hypochlorige oder hypobromige Saure und/oder ein wasserlösliches Salz der hypochlorigen oder hypobromigen Säure Oder eine Chlor- oder Bromverbindung, welche bei der Hydrolyse eine der besagten Säuren liefert, oder eine Mischung solcher Halogenderivate auf eine wasserlösliche oder quellbare, wasserunlösliche Polyhydroxy!Verbindung in alkalischem Milieu* vorzugsweise in der Kälte, einwirken lässt, die Reaktionsmischung gegebenenfalls neutralisiert und a) im Falle einer Lösung durch Klärung und Dialyse oder Gelfiltration, b) im Falle einer Suspension durch Filtieren oder Zentrifugieren und Auswaschen, von niedermolekularen Anteilen befreit, das in der Lösung oder Suspension vorliegende oder als Filter- bzw. Zentrifugenrückstand verbleibende Vernetzungs- und Aktivierungsprodukt in Gegenwart von Wasser und gegebenenfalls eines Puffersystems bei einer Temperatur unterhalb 50°C, vorzugsweise in der Kälte, auf eine gegebenenfalls biologisch aktive, wasserlösliche, an mindestens einem basischen Stickstoffatom sübstituierbare

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   Aminoverbindung einwirken lässt und dialysierbares oder in gelöster Form verbliebenes Material mit Wasser * oder einer wässrigen Salzlösung aus dem Umsetzungsprodukt ausdialysiert oder ausfiltriert oder auswäscht.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Blausäure und/oder Cyanid in einer Gesamtmenge zusetzt, welche pro Grammäquivalent organisch gebundenes Hydroxyl 0,25 bis 6 Grammäquivalenten Gesamt-Cyanid entspricht. _■'-.'-.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die· hypochlorige oder hypobromige Säure und/oder Salze und/oder die entsprechenden hydrolysierbaren Chlor- oder Bromverbindungen in einer Gesamtmenge zusetzt, welche pro Grammäquivalent organisch gebundenes Hydroxyl 0,25 bis 6 Grammäquivalenten positivem Chlor

   oder Brom entspricht. <

   4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Cyanid ein Alkalicyanid verwendet.

   5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch ^s gekennzeichnet, dass man als Salz der hypochlorigen oder hypobromigeh Säure ein Alkali-hypochlorit oder -hypobromit, vorzugsweise Natronbleichlauge oder Kalibleichlauge _c oder Chlor oder Brom und ein Alkaii^hydroxyd oder -car-

   ./ bonat oder -hydrogencarbonat verwendet.

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   6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man pro Grammol Chlor oder Brom mindestens" '2 Grammole Alkalihydroxyd oder mindestens 1 Grammol Alkalicarbonat oder mindestens 2 Grammole Alkalihydrogencarbonat zusetzt.

   7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als zu hypochloriger oder hypobromiger Säure hydrolysierbare Verbindung einen Ester der besagten Säure, vorzugsweise ein Alkylhypochlorifc mit 2 bis 5' Kohlenstoffatomen im Alkylrest, verwendet.

   8. Verfahren nach Artspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als zu hypochloriger oder hypabromiger Säure hydrolysierbare Verbindung eine an das Stickstoffatom gebundenes, positives Chlor oder Brom enthaltende Stickstoffverbindung, beispielsweise das Natriumsalz des p-Toluolsulfonsäure-chloramids (Chloramin T), N-Chloracetamid, N-Chlorsuccinimid, Chloramin, N-Bromacetamid oder N-Bromsuccinimid, verwendet.

   9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man Gesamt-Cyarcä und PoIyhydroxylverbindung vorlegt und die entstandene Mischung mit dem Reagens versetzt, welches positives Halogen enthält.

   10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man das Reagens, welches positives Halogen enthält, vorlegt und mit der Mischung von Gesamt-Cyanid und Polyhydroxylverbindung versetzt.

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   * Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Polyhydroxylverbindung zusammen mit dem Reagens, welches positives Halogen enthält, vorlegt und die entstandene Mischung mit dem Ge-samt-Cyanid versetzt. ·

   12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man das Gesamt^Cyanid Vorlegt und mit der Mischung von Polyhydroxylverbindung und Reagens, welches positives Halogen enthält, versetzt.

   13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man die Mischung von Polyhydroxy!verbindung und Salz der hypochlörigen oder hypObromigen Säure zuvor mit Kohlendioxyd behandelt. .

   14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass.man eine wasserunlösliche Polyhydroxy!- . verbindung einsetzt, ihre Mischung mit dem Salz der hypochlorigen oder hypobromigen Säure gegebenenfalls mit.Kohlendioxyd behandelt, die Mischung filtriert oder zentrifugiert, den unlöslichen Rückstand gegebenenfalls auswäscht, mit einer wässrigen Lösung eines Alkalicyariids versetzt und unverbrauchtes Gyanid durch Auswaschen entfernt.

   15. Verfahren nach einem der Ansprüche' 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion zwischen Polyhydroxy !verbindung, Gesamt-Cyanid'und Reagens, welches positives Halogen enthält, in einem pH-Bereich von etwa 1Ö bis'etwa 13 vorgenommen Wird. ' '' ^{; l} "' '^: · ·"

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   St,

   ο q c τ "7 Q / 16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurcn gekenn-

   zeichnet, dass als Aminoverbindung ein Protein, ein Poly peptid, ein Oligopeptid, eine Aminosäure oder ein Amin der allgemeinen Formel:

   HN
   ^R¹

   (Y)

   eingesetzt wird, in welcher R(X) Wasserstoff oder einen Rest mit Wasserstoff oder einer funktionellen Gruppe an der Stelle X "und R¹ (Y) einen Rest mit Wasserstoff einer funktionellen Gruppe an der Stelle Y bedeutet,

   17. Verfahren nach Anspruch 1 oder IS# gekennzeichnet _t das ma,n die Ami.noverbind\,vng in oder schwach ©der fnittelalkaliseheRi Bereich^ ζ .B, in Wasser oder in Gegenwart von N§tri-u;iiili^4f'i§.f-e:aGa Natriumcarbonat, bei Eaupteiaperatur oder bei ti.ef:ere;r Teia peratur und vorzuigswejLse im. iJefeers-ehuss eißwijeken lässt.

   82 3/1 "US'/

   ORIGINAL INSPECTED