DE2353973A1 - Steroid-bindendes globulin und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents
Steroid-bindendes globulin und verfahren zu dessen herstellungInfo
- Publication number
- DE2353973A1 DE2353973A1 DE19732353973 DE2353973A DE2353973A1 DE 2353973 A1 DE2353973 A1 DE 2353973A1 DE 19732353973 DE19732353973 DE 19732353973 DE 2353973 A DE2353973 A DE 2353973A DE 2353973 A1 DE2353973 A1 DE 2353973A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- steroid
- globulin
- binding
- range
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 title claims description 22
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 title claims description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 5
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 33
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 claims description 20
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 5-amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulopyranosonic acid Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 0.000 claims description 11
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 8
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 7
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 7
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-2-Deoxy-Hexose Chemical compound NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 claims description 4
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 claims description 4
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 claims description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 claims description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 claims description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 3
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-BKJPEWSUSA-N N-acetyl-D-hexosamine Chemical compound CC(=O)NC1C(O)O[C@H](CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-BKJPEWSUSA-N 0.000 claims 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 11
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 8
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 7
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 7
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 7
- -1 diamino ethyl Chemical group 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 4
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 229920006385 Geon Polymers 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 2
- 238000007693 zone electrophoresis Methods 0.000 description 2
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012511 carbohydrate analysis Methods 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- YUPQOCKHBKYZMN-UHFFFAOYSA-N ethylaminomethanetriol Chemical compound CCNC(O)(O)O YUPQOCKHBKYZMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000012817 gel-diffusion technique Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000001983 lactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4717—Plasma globulins, lactoglobulin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/909—Vibrio
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
- Y10S436/814—Pregnancy
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
- Y10S436/817—Steroids or hormones
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/85—Reproductive organs or embryos
- Y10S530/851—Placenta; amniotic fluid
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
BEHHrNGWEHKEAKTIENGESELLSCIIAFT, Marburg (Lahn)
Aktenzeichen: Hoe 73/017 Ma 183
Datum: ?5. Oktober 1973 Dr. Li/Fo
Steroid-bindendes Globulin und Verfahren zu dessen - " .
Herstellung - - -- . - . · - .
Gegenstand der Erfindung ist ein Steroid-bindendes Globulin,
welches ein Derivat des Steroid-bindenden ß-Globulins ist
sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung aus dem Steroidbindenden
!!-Globulin durch Behandlung mit dem Enzym Neuraminidase. :
Es ist bekannt, dass unter den als ß-Globuline bezeichneten
Plasmaproteinen ein EiweisskÖrper, vorkömmt, der eine be—-sondere
Affinität zu Steroidhormonen besitzt und deshalb als
Steroid-bindendes ß-Globulin bzw. Testosteron-bindendes Globulin bezeichnet'wird. Es wurde bereits vorgeschlagen,
(P 2221261.9 Hoe 72/b 007 = Ma 151) dieses auch als ß^AP-Glykoprotein
bezeichnete Protein aus Plazenten oder aus dem Blut von Schwangeren zu isolieren. Es ist Jedoch bisher nicht
gelungen, dieses ß-Globulin in reiner Form darzustellen. Das
hat insbesondere den Nachteil, dass bei der Gewinnung von
Antiserum, das gegen dieses Protein gerichtet ist, die
Verunreinigungen, auch wenn sie in noch so geringer Konzentration vorkommen, in den immunisierten Tieren ebenfalls zur
Antikorperbildung führen und dadurch unspezifische Reaktionen
der Antiseren bedingen. .- "
509619/1066
Ma 183
Es wurde nun ein Derivat des Steroid-bindenden ß-Globulins
gefunden, das durch die Behandlung dieser Substanz mit dem Enzym N_euraminidase entsteht und das in sehr reiner Form
hergestellt werden kann. Dieses Derivat im folgenden "Steroid-bindendes Globulin" genannt, entspricht in seinen
biologischen Eigenschaften weitgehend dem ursprünglichen Steroid-bindenden ß-Globulin, insbesondere ist von damit
immunisierten Tieren ein Antiserum hoher Spezifität zu gewinnen.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäss ein Derivat 'des Steroidbindenden
ß-Globulins, ein Glykoprotein mit einer besonderen Affinität zu Steroidhormonen. Die Summe aller Kohlenhydrate
dieses Steroid-bindenden Globulins beträgt 10,4 + 2,6% (nach der Bestimmungsmethode von H.E. Schultze et al. (1958),
Biochem. Z. 329, S. 490), davon 5,8 + 1,2% Hexosen, 4,0 + 0,8%
/ N-acetyl ~ ~
Hexosamin (berechnet als/Hexosamin), 0.5 + 0,5% Neuramin-
, N-acetyl ■ -
säure (berechnet als/Neuraminsäure) und 0,1 + 0,1% Fucose,
womit die Kohlenhydrat-Analyse mit Ausnahme des Neuraminsäure-Gehalts.
derjenigen entspricht, wie sie für das Steroid-bindende ß-Globulin erstellt werden kann. Das neue
Globulin wird durch ein gegen das Steroid-bindende ß-Globulin gerichtetes Antiserum präzipitiert. Die elektrophoretische Beweglichkeit
entspricht der eines Gainmaglobulins. Das in Phosphatpuffer bei pH 6,8 gelöste erfindungsgemässe Protein
zeigt in der Utrazentrifuge eine Sediroentationskonstante von
4,1+1,OS. In 1%iger Natriumdodezylsulfatlösung sedimentiert
das Protein mit 1,1 + 0,3 S. In einem Dodezylsulfat-haltigen Polyacrylamidgel wandert das erfindungsgemässe Protein im
elektrischen- Spannungsfeld mit oder etwa schneller als Albumin,
woraus sich ein Molekulargewicht von 65.000 + 5.000 ableiten lässt. Nach Inkubation des Proteins vor der Auftrennung in
einer 1%igen Natriumdodezylsulfatlösung wird eine Wanderungsstrecke der Proteinzone gemessen, die mit humanem Plazenten-
5 0 9819/1066
Ma
laktogen vergleichbar ist, wodurch ein Molekulargewicht von
<20.000 kalkulierbar ist. Demnach ist ein Molekülaraufbau
aus A Untereinheiten, die Molekulargewicht von jeweils etwa 16.000 besitzen, anzunehmen. *ein
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren, zur Herstellung,
des Steroid-bindenden Globulins, dadurch gekennzeichnet, dass Steroid-bindendes ß-Globulin-zuerst aus
Körperflüssigkeiten oder Gewebeextrakten, die dieses Protein in messbaren Konzentrationen enthalten, beispielsweise aus
menschlichen Seren, vorzugsweise aus dem Blut von Schwangeren, Retroplazentarserum oder Plazentenextrakten isoliert, danach
mit Neuraminidase behandelt und in einem abschliessenden
Reinigungsschritt, vorzugsweise durch Chromatographie, an
einem Anionenaustauscher oder durch eine entsprechende Maßnahme,
z.B. durch eine Elektrophorese in reiner Form dargestellt wird.
Die Isolierung des Steroid-bindenden ß-Globulins erfolgt durch
eine ausgewählte Kombination von Methoden, die einerseits zur Anreicherung des Steroid-bindenden ß-Globulins, andererseits
zur Abtrennung dieses Proteins von den übrigen Plasmaproteinen führt. Ohne dass daraus eine Einschränkung herzuleiten wäre,
sollen im folgenden Möglichkeiten beispielhaft aufgezeigt werden, die ein zur Herstellung des Derivats des Steroidbindenden
ß-Globulins geeignetes Ausgangsmaterial liefern.
Dazu werden zerkleinerte Plazenten mit Wasser oder einer verdünnten
Salzlösung, vorteilhaft mit einer etwa 0,5%igen.Kochsalzlösung,
extrahiert. Aus dem Extrakt wird durch Zusatz einer wässrigen Lösung eines wasserlöslichen Derivats einer
Akridinbase, vorteilhaft mit Diaminoäthcxyakridinlaktat, das
bis zu einer Konzentration von 0,25 bis 0,55, vorteilhaft
5098 19/1066
Ma 183
4 -
von 0,4% der Lösung zugegeben wird, bei schwach saurem bis
neutralem pH-Wert im Bereich von pH 5 bis pH 7, vorteilhaft bei pH 6, eine Vorfällung abgetrennt, die das gewünschte
Protein nicht oder nur in Spuren enthält.
Anschliessend wird im alkalischen pH-Bereich von pH 7 bis pH 9, vorteilhaft bei pH 8,5, aus dem Überstand der ersten
Fällung das Steroid-bindende ß-Globulin durch Zusatz einer
wässrigen Lösung eines wasserlöslichen Derivats einer Akridinbase,
vorteilhaft wiederum mit Diaminoathoxyakrxdinlaktat, das bis zu einer Konzentration von 0,55 bis 1,1%, vorteilhaft
von 0,8% der Lösung zugesetzt wird, präzipitiert. Der Niederschlag wird nach dessen Suspension in Wasser und anschliessender
Erniedrigung des pH-Wertes mit Hilfe von schwachen Säuren in Lösung gebracht und durch Zugabe von
geeigneten Adsorptionsmitteln, z.B. Aktivkohle, vom Fällungsmittel befreit und durch Zentrifugation abgetrennt.
Besonders einfach erfolgt die Abtrennung des Fällungsmittels vom Protein durch Aufschwemmung der Fällung in einer chloridhaltigen
wässrigen Lösung, vorteilhaft in einer etwa 5%igen Kochsalzlösung, wobei das Fällungsmittel präzipiert und danach
durch Filtration oder Zentrifugation entfernt wird, während die Proteine in Lösung gehen. Zur weiteren Anreicherung des
Steroid-bindenden ß-Globulins wird eine Fällung mit geeigneten
Salzen, vorteilhaft mit Ammoniumsulfat, in der Weise durchgeführt, dass die Konzentration des Salzes das Steroid-bindende
Globulin aus der Lösung verdrängt. Hierzu ist bekannt, dass Globuline von Ammoniümsulfat bei dessen Sättigungskonzentration
von etwa 50% präzipitiert werden.' Nach Wiederauflösen des
durch Zentrifugation oder Filtration gewonnenen Präzipitats wird zu der Lösung ein niedriger Alkohol, vorteilhaft Äthanol,
bis zu einer Konzentration zugesetzt, bei der das Steroid-
509819/1066
Ma
bindende ß-Globulin noch nicht niedergeschlagen, eine Reihe
von Verunreinigungen jedoch als Fällung abgeschieden werden
kann. Ks hat sich als zweckmässig erwiesen, etwa 25% Äthanol
zuzufügen, wobei die Zugabe des Äthanols zur Vermeidung von
Denaturierungserscheinungen unterhalb Raumtemperatur,^ vorzugswt.'i
se Ii β i. einer Temperatur um 0 + 4°C erfolgt. Durch FraktionierungsmeLhoden,
die Proteine mit Molekulargewichten zwischen 50.000 und 150.000 in definierten Bereichen anzureichern im
Stande sind, kann das Steroid-bindende ß-Globulin weitergereinigt
werden. Besonders geeignet sind hierfür Maßnahmen der Gelfiltration, beispielsweise Saulenchromatographie-Schritte
unter Verwendung von mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran, beispielsweise Sephadex® G-1150 der Firma Pharmacia,
Uppsala. Die Gelfiltration kann gewünschtenfalls auch im
Anschluss an eine Dialyse gegen eine verdünnte Pufferlösung, z.B. gegen 0,01 molare Trishydroxymethylaminoraethan-Salzsäure-Pufferlösung
von pH 7,5 bis 8,5, vorzugsweise pH 8,0, durchgeführt werden. Zur Elutionkann beispielsweise 0,1
molarer Trishydroxymethylaminomethan-Salzsäurepuffer vom pH-Wert
8 dienen, der pro Liter 1 M Natriumchlorid enthält. Bei diesem Elutionsverfahren wird das Steroid-bindende ß-Globulin
in dem Bereich der Molekulargewichte von etwa 10.0.000., häufig unmittelbar nach dem 7-S-Gammaglobulin des Plasmas, eluiert.
Unter Ausnutzung der elektrischen Eigenschaften des Steroidbindenden
ß-Globulins lassen sich zu dessen Reinigung jedoch
auch Elektrophorese-Maßnahmen und Schritte: der Ionenaustausch-Chromatographie
einsetzen. Das Steroid-bindende ß-Globulin wird von basischen Anionenaustauschern, beispielsweise von
Diamindäthyl-Austauschern auf der Basis von vernetztem
Dextran, im Handel als Diaminoäthyl-Sephadex'8' der Firma
Pharmacia, Uppsala, erhältlich, im pH-Bereich von etwa4,5 bis
5098 19/ 106 6
Ma 183
9 adsorbiert und ist davon durch Elution mit Pufferlösungen steigender Tononstärke zu gewinnen. Vorteilhaft werden 2
D'raktionierungen an basischen Ionenaustauschern ausgeführt,
einmal durch Adsorption und fraktionierte Elution des Steroidbindenden ß-Globulins bei schwach saurem pH-Wert, beispielsweise
pH 5,0, und ein zweites Mal in neutralem bis schwach alkalischem pH-Bereich, beispielsweise pH 7,0.
Besonders geeignet als Reinigungsoperation ist die präparative Zorienelektrophorese, die in Kombination mit Molekularsiebver—
fahren gute Erfolge zeigen.
Auch das zonenlektrophoretxsche Verfahren mit Hilfe von Trägersubstanzen
wird vorteilhaft in zwei verschiedenen pH-Bereichen durchgeführt, einmal im alkalischen pH-Bereich, beispielsweise
pH 8,6, wobei die Zone des ß-Bereichs der Plasmaproteine gewonnen wird und das andere Mal im schwach sauren pH-Bereich,
beispielsweise pH 5, wobei die entsprechende, das Steroidbindende ß-Globulin enthaltende Zone herausgeschnitten wird.
Die Reihenfolge dieser Maßnahme ist dabei nicht zwingend.
Wird die Elution des Proteins aus dem Trägermaterial der
Elektrophorese mit einem flüchtigen Puffer, beispielsweise Ammoniumhydrogencarbonat, vorgenommen, lässt sich eine
Gefriertrocknung des Verfahrensprodukts direkt anschliessen.
Bei Verwendung von Plasma als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Steroid-bindendem ß-Globulin kann genau so
verfahren werden wie beim Plazentenextrakt. Es erscheint lediglich die Vorfällung mit Akridinsalzen im schwach sauren
pH-Bereich nicht erforderlich.
, 5098 19/1066
Ma - 7 -
Zur Gewinnung des erfindungsgemässen Derivats de#Steroidbindenden
f3-Globulins. wird die nach den oben beschriebenen oder vergleichbaren Reinigungsoperationen erhaltene Substanz
in einem Puffer gelöst, dessen pH-Wert den angenähert optimalen Bedingungen der Neuraminidase für die Abspaltung der
Neuraminsäure aus dem Substrat durch Neuraminidase entspricht.
Die Inkubation des Steroid-bindenden ß-Globulins mit Neuraminidase v/ird so lange durchgeführt, bis der Neuraminsäure-Gehalt
dieses Proteins auf 0,5 + 0,5%, also weniger als Λ%,~ abgesunken
ist.
Für die Behandlung von Steroid-bindendem ß-Globulin sind Glykoprotein
N-acetylneuraminylhydrolasen, klassifiziert unter
EC. 3-2-1·18, sogenannte Neuraminidasen vorzugsweise mikrobiellen
Ursprungs geeignet, insbesondere bakterielle Neuraminidasen wie die entsprechenden Enzyme aus Vibrio cholerae,
Pneümokokken oder Clostridium perfringens. Bei Verwendung einer Neuraminidase aus Vibrio eholerae wird die Inkubation im
pH-Bereich 5 bis-7» vorzusweise bei pH 5,5, in einem in der
Enzymologie gebräuchlichen Puffer, vorteilhaft in einer Pufferlösung aus Trishydroxymethylaminomethan oder Natriumacetat,
durchgeführt. Dabei werden auf 100 mg Protein 50-500 Einheiten
Neuraminidase zugesetzt, und die Inkubation wird im Temperaturbereich O-37°C, vorzugsweise 40C oder bei Zimmertemperatur von 200C, durchgeführt, wobei 20 Stunden "bei
4°C etwa die gleiche Verringerung des Neuraminsäuregehalt©
des Proteins, nämlich auf etwa 0,5%, zeigen wie 5 Stunden
bei 20°C. /
Wie jedem Enzymologen bekannt, sind Reaktionen dieser Art
unter den verschiedensten Bedingungen durchzuführen, so dass auch mit einer anderen, niedrigeren als angegebenen Kon —
5098 19/1066
Ma
zentration an Neurajninidase bei entsprechend längerer
Inkubationsdauer, insbesondere bei etwas erhöhten Temperaturen und Zusatz von Aktivatoren des Enzyms, der gleiche Effekt,
nämlich die Entfernung der Neuraminsäure aus dem Steroidbindenden
ß-Globulin, erreicht werden kann, mit anderen Worten, das erfindungsgemässe Derivat dieses Proteins hergestellt
v/erden kann. Einige Neuraminidasen werden durch Erdalkaliionen aktiviert. Besonders geeignet für die
Aktivierung der Neuraminidase aus Vibrio cholerae sind bekanntlich Calciumionen, die in Form von wasserlöslichen
Salzen wie Calciumchlorid in einer Konzentration von '0,1 bis 1 mg/ml der Inkubationslösung zugesetzt werden können. Die
Menge der einzusetzenden Neuraminidase ist durch folgende Definition der Einheiten gegeben:
Eine Neuraininidase-Einheit ist die Menge des Enzyms, die benötigt
wird, um 1 Mikrogramm N-acetylneuraminsäure aus humanem
c^j-Glykoprotein in 0,05 molaren Natriumacetatpuffer vom pH-Wert
5,5 mit dem Zusatz von 9 mg/ml Kochsalz und 1 mg/ml Calciumchlorid
in 15 Min. bei 37°C freizusetzen (E. Mohr und G. Schramm, Z.Naturf. 15b, S. 568, 1960).
Das durch die Neuraminsäure-Abspaltung gegenüber dem Ausgangsmaterial
stärker basisch gewordene Proteinderivat wird weniger an basische Anionenaustauscher gebunden und ist deshalb
durch eine Chromatographie an beispielsweise Diaminoäthyl-Ionenaustauscher
von restlichen Verunreinigungen und auch von eventuell noch vorhandenem unverändertem Ausgangsmaterial
zu befreien.
Die Ladungseigenschaft des neu gewonnenen Derivats erlaubt die Abtrennung der Verunreinigungen auch auf elektrophoretischem
Wege. Die das Derivat des Steroid-bindenden ß-Globulins ent-
5 0 9 8 19/1066
Ma 183
haltenden Eluate können konzentriert, dialysiertundohne
Denaturierungserscheinigungen lyophllisiert werden.
Das Steroid-bIndene Globulin liefert in der elektrophoretischen
Analyse eine einheitliche Linie, in der Ultrazentrifugen-Analyse eine einheitliche Bände. Es reagiert mit Antiserum
gegen das flteroid-bindende ß. -Globulin wie das ursprüngliche
Protein. Es bindet wie das ursprüngliche Protein Steroide, insbesondere Testosteron und Östradiol.
Das erfindungsgemäss hergestellte Pröteinderivat hat eine diagnostische
Bedeutung dadurch, dass einerseits das reine Antigen,
andererseits das durch Immunisierung mit'dem reinen Antigen
gewonnene spezifische Antiserum in Bestimmungsmethoden für
Steroid-bindendes ß-Globulin eingesetzt werden kann. Diese
Methoden erlauben, Störungen des Steroid-Haushalts bzw.
Änderungen im Gehalt des Steroid-bindenden ß-Globulin in Plasma
oder Geweben z.B. im Verlauf von Krankheiten festzustellen und zu verfolgen.
Die Erfindung wird im nachfolgenden Beispiel näher erläutert.
5098 19/1066
Ma 183
Isolierung des Steroid-bindenden ß-Globulins aus Plazenten:
10 kg menschliche Plazenten werden in tiefgefrorenem Zustand zerkleinert und mit 10 Liter einer 0,5%igen Natriumchloridlösung
extrahiert (1 Stunde bei 5°C). Alle im nachfolgenden beschriebenen Operationen werden, soweit nichts anderes vermerkt
ist, bei A-0C durchgeführt. Den verwendeten Pufferlösungen
ist zur Sterilhaltung 0,05% w/v Natriumazid zugesetzt,
10 Liter der Extraktionslösung werden mit 20%iger Essigsäure auf pH 6,0 eingestellt und zunächst mit 1500 ml einer 3%igen
6,9-Diamino-2-Äthoxyakridinlaktat-Lösung ("Akridinsalz-Lösung")
versetzt. Die inaktive Vorfällung wird durch Zentrifugation abgetrennt und verworfen. Der' Überstand wird
mit 2 normaler Natriumhydroxidlösung auf pH 8,5 eingestellt und mit 3 Liter Akridinsalzlösung gefällt. Die Fällung, die
das Steroid-bindende Globulin enthält, wird zentrifugiert. Der flüssige Überstand wird verworfen, der Niederschlag wird in
6 1 einer 5%igen Natriumchloridlösung suspendiert. Nach Abzentrifugation der aufgetretenen Fällung wird dem Überstand
festes Ammoniumsulfat bis zu einer 50%igen Sättigung zugefügt. Dabei bildet sich ein Niederschlag, der abzentrifugiert wird.
Die als Zentrifugat erhaltene feuchte, ammonsulfathaltige Paste (250 g) wird in 1000 ml Wasser gelöst, gegen
deionisiertes Wasser dialysiert und zur Abscheidung eines Teils der Begleitproteine bei pH 7,0, einer Leitfähigkeit
von 10 mS (Einstellung mit einer 5%igen Kochsalzlösung)
und einer Temperatur von O0C mit Äthanol bis zu einer
Konzentration von 25% versetzt. Den dabei entstehende Niederschlag zentrifugiert man ab und verwirft ihn; der Überstand,
der die Hauptmenge des Steroid-bindenden ß-Globulins enthält,
509819/1066
Ma 183
- 11 -
wird gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Die Weiterreinigung erfolgt durch Gelfiltration an Sephadex® G-150 (Säule 20 χ 100 cm) unter Verwendung eines 0,01 m
Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffers pH 7,0. .
Der Nachweis des Steroid-bindenden ß-Globulins in den Eluaten
wird immunologisch, mit einem spezifischen Antiserum im Geldiffusionstest
durchgeführt. Die positiven Fraktionen 1400 ml werden gepoolt und zur weiteren chromatographisehen Reinigung
an einer Diaminoäthyl-Sephadex®-Säule (5x20cm) adsorbiert. .
Die Elution der Proteine von der Diaminoäthyl-Sephadex^-Säule
erfolgt mit 0,01 m Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer unter
Verwendung eines Kochsalzgradienten von 0-2%. Der Nachweis
des Steroid-bindenden ß-Globulins im Eluat wird wieder
immunologisch geführt; die das Steroid-bindende ß-Globulin
enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, 900 ml, und mit 35% w/v Ammoniumsulfat gefällt. Die sich dabei ausbildende
Fällung wird durch Zentrifugation gewonnen und der Niederschlag
in Wasser aufgelöst, zuerst gegen Wasser und anschliessend
gegen 0,1 m Natriumdiäthylbarbituratpuffer von pH 8*6 dialysiert.
Die weitere Auftrennung der Proteine des Dialysats; : im elektrischen Feld erfolgt mit der von Heide et al. (1964)
beschriebenen Apparatur und Methode; als inertes Trägermaterial dient Polyvinylchlorid (Geon® X 427), Hersteller Goodrich
Chem. Comp., Cleveland/Ohio, USA, als Puffer wird eine 0,1 m Natriumdiäthylbarbituratlösung (pH 8,6) verwendet.Das
Steroid-bindende ß-Globulin wandert in der ß^-Zone; es wird
daraus mit dem mehrfachen Volumen des Trägers mit 0,9%iger
Kochsalzlösung eluiert und nach Entfernung der SaIzC durch
Dialyse gegen Wasser mit Ammonsulfat (35% w/v) gefällt.
5098 19/ 1066
Ma 183
- 12 -
Die Fällung wird in 500 ml Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffe.r
pH f3,0 aufgelöst und gegen einen 0,01 m Trishydroxymethylaminomuthan-IICl-Puffer
pH 5,0 dialysiert. Anschliessend
lässt man die Lösung über eine Diaminoäthyl-Sephadex®-Säule (5 x 25 cm) laufen, die mit dem gleichen Puffer (pH 5,0)
equilibriert worden war. Ein Teil der Proteine bleibt zusammen mit dem Steroid-bindenden ß-Globulin an der Säule adsorbiert
und kann dann unter Anwendung eines linearen Kochsalzgradienten von 0-2% eluiert werden. Die Eluate, die das Steroidbindende
ß-Globulin enthalten, werden vereinigt, neutralisiert und durch Zusatz von 40% w/v Ammoniumsulfat präzipitiert.
Für die anschliessende präparative Zonenelektrophorese bei pH 5,0 ist das Trägermaterial wieder Geon X 427; als Puffer
wird eine 0,15 m Natriumazetatlösung von pH 5,0 verwendet. Das Steroid-bindende ß-Globulin wandert bei diesem pH anodisch;
es wird mit physiologischer Kochsalzlösung aus der entsprechenden Zone eluiert und nach Neutralisiation der Lösung durch Zusatz
von 40% (w/v) Ammoniumsulfat ausgefällt.
Steroid-bindendes ß-Globulin kann auf die gleiche Weise aus Serum, insbesondere Retroplazentarserum gewonnen werden. Dazu
wird als Ausgangsmaterial für die Fraktionierung entsprechend dem vorstehenden Beispiel statt 10 Liter Gewebeextrakt 5 Liter
Serum eingesetzt, das mit. 5 Liter destilliertem Wasser verdünnt
wird.
Neuraminidasebehandlung des Steroid-bindenden ß-Globulins:
Zur Abspaltung der Neuraminsäure werden 150 mg Steroid-bindendes ß-Globulin in 30 ml 0,01 m Trishydroxymethylaminomethan-Puffer
von pH 5,5, der 0,2 mg CaCIp pro ml enthält, gelöst und mit 500 Einheiten Neuraminidase aus Vibrio cholerae
20 Stunden bei 4°C inkubiert. Anschliessend reinigt man
5098 19/1066
Ma 183
- 13 >
das modifizierte Protein durch Chromatogaphie an Diaminoäthyl-Sephadex^
(2,5 χ 20 cm) unter Verwendung eines 0,01 in
Trishydroxymethylamlnomethan-HCl-Puffers vom pH 5,5. Das
Derivat des Steroid-bindenden ß-Globulins wandert dabei ungehindert durch die Säule hindurch, während die im Ausgangs-,
material noch vorhanden gewesenen Verunreinigungen adsorbiert bleiben. Das proteinhaltige Eluat wird Inreiner^ Kollodiumhülse
(Sartorius-Membranf111er-Geseilschaft) eingeengt,
gründlich gegen Wasser dialysiert und dann lyophllisiert.
0 981971066
Claims (8)
- - 14 - . Ma 183PatentansprücheSteroid-bindendes Globulin gekennzeichnet durch(a) eine besondere Affinität zu Steroidhormonen,(b) einen Gehalt an Kohlenhydraten von 10,4 + 2,6%,davon 5,8 + 1,2% Hexosen, 4,0 + 0,8% Hexosamin, berechnet als N-acetyl-Hexosamin ,. 0,5 + 0,5% Neuraminsäure,berechnet als N-acetyl-Neuraminsäure, und 0,1 + 0,1% Fucose,(c) die Präzipitierbarkeit mit gegen Steroid-bindendes ß-Globulin gerichteten Antiseren,(d) eine elektrophoretische Beweglichkeit entsprechend dem Gammaglobulin,(e) eine Sedimentationskonstante von 4,1 + 1,0 S gemessen in Phosphatpuffer bei pH 6,8,(f) eine Sedimentationskonstante von 1,1 + 0,3 S gemessen in 1%iger Natriumdodezylsulfatlösung und(g) ein Molekulargewicht von 65.000 + 5.000.
- 2. Verfahren zur Herstellung des Steroid-bindenden Globulins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Steroidbindendes ß-Globulin mit folgenden Eigenschaften:(a) eine besondere Affinität zu Steroidhormonenj(b) einen Gehalt an Kohlenhydraten von 12,5 + 3%, davon 5,7 + 1,2% Hexosen, 3,9 + 0,8% Hexosamin, berechnet als N-acetyl-Hexosamin, 2,9 + 0,9% Neuraminsäure, berechnet als N-acetyl-Neuraminsäure, und 0,1 + 0,1% Fucose, rf(c) die Präzipitierbarkeit mit spezifischen Antiseren,(d) eine elektrophoretische Beweglichkeit entsprechend den ß^-Globulinen,(e) eine Sedimentationskonstante von 4,1 + 1,0 S gemessen in Phosphatpuffer bei pH 6,8,(f) eine Sedimentationskonstante von 1,1 + 0,3 S gemessen in 1%iger Natriumdodezylsulfatlösung und(g) ein Molekulargewicht von 65-000 + 5.000.50981 9/1066Ma 183 -15- · =mit Neuraminidase behandelt und in einem Reinigungsschritt • vorzugsweise durch Ionenaustausch-Chromatographie oder. Elektrophorese in reiner Form darstellt.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Steroid-bindendes ß-Globulin mit Neuraminidase bis zum Absinken des Neuraminsauregehalts des Proteins auf 0,5 + 0,5% "behandelt wird. _ ". -
- 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Steroid-bindendes ß-Globulln mit einer mikrobiellen Neuraminidase'im pH-Bereich des ReaktionsOptimums des Enzyms vorteilhaft von pH 5 bis 7 behandelt wird.
- 5- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Steroid-bindendes ß-Globulin mit Neuraminidase aus Vibrio cholerae bei pH 5,5 im Verhältnis von 50-5,00 Einheiten Neuraminidase pro 100 mg Protein bei 0.20 G, . " ν vorzugsweise A0C, während 5-20 Stunden behandelt wird, wobei der langen Inkubationsdauer niedrige Temperaturen und der kurzen Inkubationsdauer entsprechend höhere Temperaturen zuzuordnen sind.
- 6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das als Ausgangsmaterial dienende Steroid-bindende ß-Globulin aus Körperflüssigkeiten oder Gewebeextrakten, die dieses Protein in meßbaren Konzentrationen enthalten, wie menschliche Seren, vorzugsweise aus dem Blut von Schwangeren, Retroplazentenserum oder Plazentenextrakten isoliert wird.Ma 183 - 16 -
- 7. Verfahren nach Ansprüchen 2-6, dadurch gekennzeichnet, dass das als Ausgangsstoff dienende Steroid-bindende Globulin.erhalLon wird, indem man(a) aus Körperflüssigkeiten oder Gewebeextrakten nicht gewünschte Proteine im pH-Bereich von pH 5 bis pH. 7 mit einem wasserlöslichen Akridinderivat, das bis zu einer Konzentration von 0,25 bis 0,55% der Lösung zugegeben wird, ausfällt,(b) aus dem Überstand dieser Fällung das Steroid-bindende ß-Globul.in durch ein wasserlösliches Akridinderivat, das bis zu einer Konzentration von 0,55 bis 1,1% der Lösung zugegeben wird, im alkalischen pH-Bereich von pH 7 bis pH 9 ausfällt,(c) den Niederschlag aus (b) in Wasser auflöst und aus dieser Lösung das Globulin mit geeigneten Salzen erneut präzipitiert,(d) das Präzipitat aus (c) in Wasser löst und aus' der Lösung mit einem niedrigen Alkohol weitere Verunreinigungen abscheidet und verwirft,(e) durch Fraktionierungsmethoden, die Proteine mit Molekulargewichten zwischen 50.000 und 150.000 in definierten Bereichen anzureichern im Stande sind, den Bereich der Molekulargewichte, unterhalb 100.000 anreichert,(f) das in diesem Bereich anfallende Steroid-bindende ß-Globulin durch Chromatographie an basischen Ionenaustauschern im schwach sauren und im neutralen bis schwach alkalischen Bereich adsorbiert und eluiert und in zonenelektrophoretischen Verfahren im alkalischen pH-Bereich als Zone des ß-Bereichs der Plasmaproteine und im schwach sauren pH-Bereich die entsprechende, das Steroid-bindende Globulin enthaltende Zone gewinnt.509819/1066Ma 183
- 8. Verwendung des Steroid-bindenden Globulins nach Anspruch 1 als diagnostisches Reagenz.9· Verwendung dos Steroid-bindenden Globulins nach Anspruch 1 zur· Gewinnung von AnLi seren. ;50 9 8 19/ 1066
Priority Applications (17)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2353973A DE2353973C3 (de) | 1973-10-27 | 1973-10-27 | Steroid-bindendes Globulin und Verfahren zu dessen Herstellung |
NL7413812A NL7413812A (nl) | 1973-10-27 | 1974-10-22 | Steroide-bindend globuline en werkwijze voor het bereiden daarvan. |
US05/517,764 US4018885A (en) | 1973-10-27 | 1974-10-24 | Steroid-binding globulin and process for preparing it and antibodies thereto |
IL45931A IL45931A (en) | 1973-10-27 | 1974-10-24 | Steroid-binding globulin and process for preparing it |
GB4607074A GB1459617A (en) | 1973-10-27 | 1974-10-24 | Steroid binding globulin and process for the preparation thereof |
AT861274A AT336783B (de) | 1973-10-27 | 1974-10-25 | Verfahren zur herstellung eines neuen derivates des steroid-bindenden globulins |
LU71184A LU71184A1 (de) | 1973-10-27 | 1974-10-25 | |
DK560474A DK139627C (da) | 1973-10-27 | 1974-10-25 | Steroidbindende globulin til anvendelse ved in vitro-diagnostik og ved fremstilling af antisera samt fremgangsmaade til dets fremstilling |
IE2202/74A IE40191B1 (en) | 1973-10-27 | 1974-10-25 | Steroid-binding globulin and process for the preparation thereof |
IT28819/74A IT1034074B (it) | 1973-10-27 | 1974-10-25 | Globulina in grado di legabe steroidi e processo per la sua prefarazione |
NO743852A NO142961C (no) | 1973-10-27 | 1974-10-25 | Steroidbindende globulin til anvendelse ved in vitro-diagnostikk og ved fremstilling av antisera |
SE7413467A SE420412B (sv) | 1973-10-27 | 1974-10-25 | Derivat av steroidbindande beta-globulin (testosteronbindande globulin) for anvendning vid in vitrodiagnostik och for framstellning av antisera |
JP49123046A JPS58404B2 (ja) | 1973-10-27 | 1974-10-26 | ステロイド結合性グロブリンの製造方法 |
BE149923A BE821534A (fr) | 1973-10-27 | 1974-10-28 | Globuline fixant les steroides et son procede de preparation |
FR7435940A FR2249093B1 (de) | 1973-10-27 | 1974-10-28 | |
DK446876A DK446876A (da) | 1973-10-27 | 1976-10-04 | Anvendelse af et steroidbindende globulin til udvinding af antisera |
AT761376A AT349649B (de) | 1973-10-27 | 1976-10-13 | Gewinnung von antiseren |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2353973A DE2353973C3 (de) | 1973-10-27 | 1973-10-27 | Steroid-bindendes Globulin und Verfahren zu dessen Herstellung |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2353973A1 true DE2353973A1 (de) | 1975-05-07 |
DE2353973B2 DE2353973B2 (de) | 1979-02-15 |
DE2353973C3 DE2353973C3 (de) | 1979-10-04 |
Family
ID=5896636
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2353973A Expired DE2353973C3 (de) | 1973-10-27 | 1973-10-27 | Steroid-bindendes Globulin und Verfahren zu dessen Herstellung |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4018885A (de) |
JP (1) | JPS58404B2 (de) |
AT (1) | AT336783B (de) |
BE (1) | BE821534A (de) |
DE (1) | DE2353973C3 (de) |
DK (1) | DK139627C (de) |
FR (1) | FR2249093B1 (de) |
GB (1) | GB1459617A (de) |
IE (1) | IE40191B1 (de) |
IL (1) | IL45931A (de) |
IT (1) | IT1034074B (de) |
LU (1) | LU71184A1 (de) |
NL (1) | NL7413812A (de) |
NO (1) | NO142961C (de) |
SE (1) | SE420412B (de) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1064396A (en) * | 1975-02-18 | 1979-10-16 | Myer L. Coval | Fractional precipitation of gamma globulin with polyethylene glycol |
US4165370A (en) * | 1976-05-21 | 1979-08-21 | Coval M L | Injectable gamma globulin |
DE2640387C3 (de) * | 1976-09-08 | 1981-01-22 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung |
DE2718326A1 (de) * | 1977-04-25 | 1978-10-26 | Behringwerke Ag | Neues protein und verfahren zu dessen herstellung |
US4230684A (en) * | 1978-03-16 | 1980-10-28 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for determining steroids in human body liquids |
DE3013724A1 (de) * | 1980-04-10 | 1981-10-15 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Neues protein pp (pfeil abwaerts)9(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowieseine verwendung |
KR0123107B1 (ko) * | 1992-02-27 | 1997-11-12 | 아끼야마 요시히사 | 연소배기가스중의 2산화탄소의 제거방법 |
-
1973
- 1973-10-27 DE DE2353973A patent/DE2353973C3/de not_active Expired
-
1974
- 1974-10-22 NL NL7413812A patent/NL7413812A/xx not_active Application Discontinuation
- 1974-10-24 US US05/517,764 patent/US4018885A/en not_active Expired - Lifetime
- 1974-10-24 GB GB4607074A patent/GB1459617A/en not_active Expired
- 1974-10-24 IL IL45931A patent/IL45931A/en unknown
- 1974-10-25 DK DK560474A patent/DK139627C/da active
- 1974-10-25 AT AT861274A patent/AT336783B/de active
- 1974-10-25 IE IE2202/74A patent/IE40191B1/xx unknown
- 1974-10-25 NO NO743852A patent/NO142961C/no unknown
- 1974-10-25 LU LU71184A patent/LU71184A1/xx unknown
- 1974-10-25 IT IT28819/74A patent/IT1034074B/it active
- 1974-10-25 SE SE7413467A patent/SE420412B/xx unknown
- 1974-10-26 JP JP49123046A patent/JPS58404B2/ja not_active Expired
- 1974-10-28 BE BE149923A patent/BE821534A/xx unknown
- 1974-10-28 FR FR7435940A patent/FR2249093B1/fr not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATA861274A (de) | 1976-09-15 |
DE2353973B2 (de) | 1979-02-15 |
GB1459617A (en) | 1976-12-22 |
FR2249093A1 (de) | 1975-05-23 |
SE7413467L (de) | 1975-04-28 |
SE420412B (sv) | 1981-10-05 |
IE40191B1 (en) | 1979-03-28 |
US4018885A (en) | 1977-04-19 |
BE821534A (fr) | 1975-04-28 |
JPS5071819A (de) | 1975-06-14 |
LU71184A1 (de) | 1976-08-19 |
IT1034074B (it) | 1979-09-10 |
JPS58404B2 (ja) | 1983-01-06 |
DK560474A (de) | 1975-06-23 |
IE40191L (en) | 1975-04-27 |
FR2249093B1 (de) | 1978-06-16 |
DK139627C (da) | 1979-10-29 |
NO142961B (no) | 1980-08-11 |
IL45931A0 (en) | 1974-12-31 |
IL45931A (en) | 1977-08-31 |
DE2353973C3 (de) | 1979-10-04 |
DK139627B (da) | 1979-03-19 |
NO743852L (de) | 1975-05-26 |
AT336783B (de) | 1977-05-25 |
NL7413812A (nl) | 1975-04-29 |
NO142961C (no) | 1980-11-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0021152B1 (de) | Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Basalmembranmaterial, hierfür geeignete Basalmembranfragmente und Verfahren zu deren Herstellung, bzw. Gewinnung | |
DE2734821C3 (de) | Blutgerinnungsfördernde Präparation und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE2720704C2 (de) | Neues Glycoprotein, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung | |
DE3486423T2 (de) | Neue Faktor VIII Polypeptidkoagulantien | |
EP0000134B1 (de) | Glykoprotein, Verfahren zu seiner Herstellung, seine Verwendung zur Gewinnung von Antiserum sowie das Antiserum | |
EP0060491B1 (de) | Protein (PP16), Verfahren zu seiner Anreicherung und Gewinnung sowie seine Verwendung | |
DE2641840C2 (de) | Verfahren zum Reinigen eines Antiserums | |
EP0100522B1 (de) | Neues Protein (PP17), Verfahren zu seiner Anreicherung und Gewinnung sowie seine Verwendung | |
DE3229132A1 (de) | Reinigung von rinder-thrombin | |
DE2353973C3 (de) | Steroid-bindendes Globulin und Verfahren zu dessen Herstellung | |
DE2616984C3 (de) | Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines plazentenspezifischen Glycoproteins | |
EP0165476A2 (de) | Gewebeprotein PP18, Verfahren zu seiner Gewinnung sowie seine Verwendung | |
EP0141326B1 (de) | Neues Protein PP20, Verfahren zu seiner Gewinnung sowie seine Verwendung | |
EP0029191B1 (de) | Neues Protein PP11, ein Verfahren zu seiner Gewinnung und seine Verwendung | |
DE3410694C2 (de) | ||
EP0282018B1 (de) | Verfahren zur Isolierung von Basalmembranproteinen aus menschlichen und tierischen Geweben | |
EP0151463B1 (de) | Gewebeprotein PP19, Verfahren zu seiner Gewinnung sowie seine Verwendung | |
AT349649B (de) | Gewinnung von antiseren | |
DE2157610C3 (de) | Schwangerschaftsspezifisches ß , -Glykoprotein, Verfahren zu seiner Isolierung und seine Verwendung für die Herstellung von Antiseren | |
DE2445677C2 (de) | Hochmolekulares alpha-Globulin und Verfahren zu dessen Herstellung | |
EP0025508B1 (de) | Verfahren zur Herstellung der dritten Komponente des Komplements aus menschlichem Blutplasma | |
EP0198259A1 (de) | Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Heparansulfat-Proteoglykan, Verfahren zur Herstellung bzw. Reinigung von dafür geeignetem Heparansulfat-Proteoglykan aus basalmembranhaltigen Geweben | |
AT330358B (de) | Diagnostisches mittel zum nachweis und zur uberwachung einer schwangerschaft | |
AT330357B (de) | Verfahren zur herstellung eines anti-schwangerschaftsspezifischen -beta 1- glykoprotein-serums | |
AT330351B (de) | Verfahren zum nachweis und/oder zur uberwachung einer schwangerschaft |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |