DE2260280C3 - Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung des Verlaufs einer chemischen Reaktion - Google Patents
Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung des Verlaufs einer chemischen ReaktionInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Verlaufs einer chemischen Reaktion zwischen
Serumproben und einem Reagenz, bei welchem durch Zentrifugieren in Serumprobenkammern gegebene
Serumproben und ein in je in Zentrifugenrichtung den einzelnen Serumprobenkammern benachbarte Reagenzkammern
gegebenes Reagenz jeweils in einer vom Zentrifugenmittelpunkt weiter entfernten Mischkammer
gemischt werden, bei welchem ferner die einzelnen Reagenz-Serumproben-Gernische während des Zentrifugierens
je zum Teil j·) eine in Zentrifugenrichtung hinter der jeweiligen Mischkammer liegende lichtdurchlässige
Analysenkammer überführt werden und bei welchem der die jeweilige Analysekammer passierende
Anteil des Lichtes einer auf die Analysekammer gerichteten konstanten Lichtquelle gemessen wird.
Außerdem betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zu Bestimmung des Verlaufs einer chemischen Reaktion
zwischen Serumproben und einem Reagen,:, mit einer Zentrifugenanordnung, die mehrere in Umfangsrichtung
nebeneinander angeordnete Kammersysteme aufweist, die je in Zentrifugalrichtung hintereinander
angeordnet eine Serumprobenkammer, eine Reagenzkammer, eine Mischkammer und eine lichtdurchlässige
Analysekammer aufweisen, mit einer Lichtquelle und einem fotodetektor, die mit Abstand voneinander
derart angeordnet sind, daß die rotierenden Analysekammern nacheinander den Lichtweg zwischen Lichtquelle
und Fotodetektor schneiden.
Die Zeiss-Informationen, Band 12, 1964, Seiten 54 bis
59 zeigen die Möglichkeit auf, aus der zeitlichen Extinktionsdifferenz ciiKs Proben-Reagenz-Gemisches
beispielsweise eine bestimmte Semmkonzcniration zu bestimmen.
Wegen der zahlreichen mikroanalyiischen Untersuchungen
in der biochemischen Forschung, infolge von klinischen Routineuntersuchungen für Ärzte und Krankenhäuser,
sowie aufgrund enzymatischer Untersuchungen u. dgl., hat sich in letzter Zeit der Bedarl für schnelle,
automatisch arbeitende Analysevorrichtungen beträchtlich erhöht. Fs sind jedoch nur wenige Vorrichtungen
verfügbar, mit denen Analysen in ausreichender Schnelligkeit und genügend genau vorgenommen
weiden können, um mit der wachsenden Anzahl der verschiedenen Untersuchungen fertig zu werden, wie sie
von Ärzten und Forschern gelordert werden.
Aus Clinical Chemistry, Bd. 15, 1969, Seiten 124 bis
12b, ist ein Verfahren bekannt, mit welchem aus der
zeitlichen Extinktionsdifferenz eines Proben-Reagenz-Gcmischcs die Aktivität eines bestimmten Stoffes in
Serum bestimmt werden kann. Zu dem Zweck werden sechs Küveticn von einer Küvcttenpositioniereinrichtung
/vcimal je 15 Sekunden lang in den Weg eines
Lichtstrahlenbündels gebracht und es wird die Absorblionszunahmc
gemessen. Als andere Möglichkeil ist angegeben, für jeden Test die Absorbtionserhöhung 5
Minuten lang alle I bi» 2 Minuten abzulesen und daraus die mittlere Absorbtionserhöhung pro Minute zu
berechnen. Dieses Verfahren erlaubt nicht die Bestimmung des Verlaufs einer chemischen Reaktion zwischen
den Serumproben und einem Reagenz, außerdem ist die gleichzeitige Beobachtung von nur wenigen Serumproben
möglich.
Für die schnelle Analyse einer breiten Vielfall von Flüssigkeiten wie Blutserum und andere Körperflüssigkeiten,
Nahrungsmittel u.dgl., steht bereits ein eine Vielzahl von Stationen aufweisendes analytisches
Photometer zur Verfugung, welches ein Zentrifugalfeld
benutzt. Da zahlreiche Analysen schnell und gleichzeitig durchgeführt werden können, sind diese Vorrichtungen
dann von besonderem Interesse, wenn eine große Anzahl von Proben vorliegt oder eine Vielzahl von
Versuchen an einer Probe vorgenommen werden soll. Da diese Vorrichtung die Verwendung relativ kleiner
Volumina von Reagenzien gestatten, kann der Einsatz von teuren Reagenzien auf ein Minimum reduziert
werden.
Eine derartige Vorrichtung für mikroanalytische Untersuchungen, die ein Zentrifugalfeld benutzt, ist in
»Analytical Biochemistry« 18, 545 bis 5b2, 1969 beschrieben. Diese Vorrichtung benutzt das Prinzip der
Doppelstrahl-Spekttophotometrie, wooei die Absorption in einer flüssigen Probe und in einer Bezugslösung
miteinander verglichen werden. Die Anordnung besteht grundsätzlich aus einer Reihe von Küvetten bzw.
Aussparungsräumen, die um den Umfang des Rotors so angeordnet sind, daß bei dessen Rotation die Zentrifugalkraft
die Reagenzien und Proben mischt und den Aussparungsräumen zuführt, wo die Analyse spektiophotometrisch
vorgenommen wird. Dabei ist eine Scheibe für das Aufbringen von Proben vorgesehen, die
Reihen von Hohlräumen enthält, welche konzentrisch angeordnet sind. In dieser Scheibe werden zu
analysierende Serumproben in den inneren Hohlräumen und die Reagenzien in den Hohlräumen angeordnet, die
einen größeren radialien Abstand als die Hohlräume haben, welche die Serumproben enthalten. Die Scheibe
für das Aufbringen von Proben wird dann einrastend in dem Rotor angeordnet. Beim Beschleunigen des Rotors
bewegt die Zentrifugalkraft die jeweilige Probe zu dem das Reagenz enthaltenden Hohlraum, wo sie gemischt
werden. Das Gemisch von Reagenz, und Probe wird dann durch einen Verbindungskanal in den Aussparungsraum
bzw. die Küvette bewegt. Die gelullten Küvetten drehen sich schnell an einem lagelesten
Lichtstrahl vorbei, wobei der Durchgang von Licht durch die Küvetten, d. h. durch die Proben, gemessen
wird.
Wenn bisher eine Vielzahl von Versuchen dtirchge
führt werden sollte, wurde für jedes Gemisch aus Probe und Serum ein »blankes« Reagenz vorgesehen, um
einen Nullwert der Absorption für den Vergleich mit Farbänderungen einzustellen, die während der Reaktion
des Serums mit dem Reagenz aultreten, wodurch das Ausmaß der Reaktion zwischen dem Serum und dem
Reagenz bestimmt wurde. Dies machte es erforderlich. daß die Serumproben nur in abwechselnden Hohlräumen
angeordnet werden konnten, wodurch die Anzahl der Versuche, die gleichzeitig durchgeführt werden
konnten, und die Geschwindigkeit, mit der die Versuche ausgeführt werden konnten, begrenzt waren.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine
Vorrichtung der eingangs genannten An verfügbar zu machen, mit denen sich das Untersuchungsvermögen
rotierender Spektrophoiometer. die für analytische Untersuchungen verwendbar sind, erhöhen läßt.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß ge!<-M mn
einem Verfahren der eingangs genannten An, das (,<
dadurch gekennzeichnet, ist. daß mit einer derartigen Zentrifugaldrehgeschwindigkeit begonnen wird, daß die
einzelnen Gemische aus Serumproben und Reagenz in die Analysekammern gelangen, bevor zwischen diesen
eine wesentliche Reaktion eintritt, daß der die jeweilige Analysekammer passierende Anteil des Lichtes unmittelbar
nach dem Eintritt des Gemische1- in die Analysekammer gemessen, in ein elektrisches Signal
umgesetzt und als Bezugswert für die jeweilige Serumprobe in einen Bezugsspeicher gegeben wird, daß
der die jeweilige Analysekammer passierende Lichtanteil nach Einsetzen einer Reaktion zwischen Reagenz
und jeweiliger Serumprobe zu vorbestimmten Zeitpunkten wiederholt gemessen, in elektrische Signale
umgesetzt und in einen Reaktionswertspeicher gegeben wird, daß die jeweils neuesten Reaktionsspeicherwerte
mit dem entsprechenden Bezugsspcicherwert verglichen
werden und daß die jeweiligen Vergleichswerte zur Bestimmung des Reaktionsverlaufs dargestellt
werden; sowie durch eine Vorrichtung der eingangs genannten Art, die dadurch gekennzeichnet, ist, daß
dem Fotodetektor ein Spitzenwertdetektor nachgeschaltet
ist, dessen Ausgang über einen ersten Schalter mit einem Bezugswertspeicher und über einen zweiten
Schalter mit einem Reaktionswertspeichcr verbunden ist. daß die Ausgänge der beiden Speicher mit je einem
Eingang einer Vergleichsschaltung verbunden sind, an deren Ausgang eine Anzeige- und/oder Aufzeichnungsvorrichtung
angeschlossen ist, und daß die beiden Schalter unter der Steuerung eines Steuergenerators
stehen, wobei der erste Schalter während der zu Beginn der Zentrifugenrotation vorgenommenen Messung der
Bezugswerte für die einzelnen Proben und danach der zweite Schalter zu vorbestimmten Meß/eitpunkien
geöffnet ist.
Anhand der Zeichnungen wird die Erfindung beispielsweise näher erläutert:
Γ i g. 1 zeigt eine Draufsicht auf «.lie drehbare Scheibe
eines Spektrophotometers für die analytische I iniersuch
ungen.
l: i g. 2 zeigt die Scheibe von F i g. 1 in einer
Seitenansicht im Schnitt sowie eine Lichtquelle, eine
i'hotodetektoreinrichiung. die Küvettcnanordnung und
den Antriebsmotor.
I' i g. J zeigt ein Blockschaltbild der elektrischen
Meßanordnung für die Einrichtung von F i g. I und 2.
Die in den F i g. 1 und 2 gezeigte drehbare
Aulgabescheibe 100 eines Spektrophotometers hat dreißig Reihen von Hohlräumen, die mit I bis
bezeichnet sind, wobei jede Reihe einen Serumliohlrauni
13 und einen Reagenzhohlraum 31 hat. Bei 40 ist ein Schlitz für das Einrasten der Aufgabescheibe
gezeigt. Das bisher bekannte .Standardverfahren bestand dann, das Reagenz in den Hohlräumen 31 in
abwechselnder Lage anzuordnen, also in den Hohlräumen 1, 3, 5 bis 29. wohei die benachbarten radial
ausgerichteten Serumhohlräume 3Ϊ leer blieben. Sowohl
Serum als auch Reagenz wurden in den jeweils zugeordneten Hohlräumen 33 und 31 in den Lagen 2, 4,
b, 8 bis 30 angeordnet. Dadurch war für jede durchzuführende Analyse in den Lagen 1, 3, 5 bis 29 ein
■blankes« Reagenz vorhanden. Wenn die Proben und
Reagenzien enthaltende Scheibe eingerastet bzw. indiziert und in der Rohranordnung 35 angeordnet war.
war jede Reihe von Hohlräumen zu einer zugeordneten
Küvette Yl ausgerichtet. Während des Laufens der Rohranordnung 35 bewegte die Zentrilugalkralt die
Inhalte aus Serum und Reagenz zu den äußersten Hohlräumen 39. Das Serum und das Reagenz der Lagen
2, 4, 6, 8 usw. wurden gemischt und von dem Hohlraum 39 durch Kanäle 50 den jeweiligen Küvetien
zugeführt. Die Küvetten, die mit den Hohlräumen der
Lagen 1, 3, 5 usw. in Verbindung standen, wurden nur mit Reagenz gefüllt, während die Küvetten 37, die mit
den Hohlräumen der Lagen 2, 4, 6 usw. in Verbindung standen, mit einem Gemisch von Serum und Reagenz
gefüllt wurden. Die gefüllten Küvetlen 37 drehten sich
zwischen der Lichtquelle 55 und dem Photoverviclfacher 60. Die Küvetten 37 der Lagen 1, 3, 5 usw.
enthielten nur Reagenz, so daß der Photovervielfacher 60 dafür einen Wert hervorbrachte, der als Nullabsorption,
d. h. als »unverfälschter« Wert, bezeichnet wurde.
Die von dem Photovervielfacher bzw. Photoelektronenvervielfacher für die anderen Lagen 2, 4, 6 usw.
erzeugten Signale konnten mit den entsprechenden »unverfälschten« Signalen verglichen werden, wodurch
alle Farbänderungen infolge der Reaktion zwischen dem Reagenz und dem Serum angezeigt wurden.
Basierend auf der Beobachtung, daß Serum-Reagenz-Reaktionen
einen endlichen Zeitraum benötigen, um eine merkliche Farbänderung, d. h. eine Änderung der
Absorption, aufzuweisen, wird erfindungsgemäß ein Verfahren geschaffen, bei welchem alle Lagen 1 bis 30
sowohl mit Serum als auch mit Reagenz in den zugeordneten Hohlräumen 33 bzw. 31 versehen werden
können.
Die Scheibe 100 wird dann sehr schnell, beispielsweise
mit 1 000 Upm, gedreht, wodurch alle Küvetten zwischen der Lichtquelle 55 und dem Photoelektronenvervielfacher
60 in einem sehr kurzen Zeitraum vorbeilaufen, d.h. in weniger als 1/10 s. Dadurch
entsprechen die von dem Photoelektronenvervielfacher 60 abgegebenen Signale während des Beginns der
Rotation einem unbeeinflußten Wert, da in diesem Zeilraum keine bedeutende Farbänderung infolge der
Serum-Reagenz-Reaktion eintritt. Die elektrischen Signale von dem Photoelektronenvervielfacher 60
werden, wie in F i g. 3 gezeigt, einem herkömmlichen logarithmischen Verstärker 61 zugeführt. Diese Signale
liegen in Form elektrischer Impulse infolge des »Zerhackungseffekts« der Rotoranordnung 35 vor. Man
nimmt einen logarithmischen Verstärker, da die Absorplionserscheinung der Serum-Reagenz-Reaktioncn
einen logariihmischen Charakter haben. In dem Verstärker 61 werden die von dem Photoelektronenvervielfacher
60 erzeugten elektrischen Stromimpulse in Spannungsimpulse umgewandelt, die bezüglich der
Stromimpulse eine logarithmische Beziehung haben. Die Spannungsimpulse aus dem logarithmischen Verstärker
60 werden einem herkömmlichen Spitzendetek-Analog-Digilal-Umsetztcr 66 zugeführt, der unter
Verwendung des herkömmlichen Binärsystems eine Gruppe von Impulsen erzeugt,deren Wert der von dem
Spitzendetcklor 62 gemessenen Spitze entspricht (als
Analog-Digital-Umsetzer kann ein Teledyne Philbrick Nexus Modell 4 103 verwendet werden). Die von dem
Analog-Digital-Umsetzer 66 während der beginnenden Rotation der Rotoranordnung 35 erzeugten Impulsgruppen
werden gespeichert und in der Speichereinheit
ίο 68 über einen elektronischen Schalter 70 gehalten, der
durch den Generator 64 für die Steuerfunktion im geeigneten Zeitpunkt betätigt wird. Die Impulsgruppen
stellen »unbeeinflußte Werte« dar, da keine bedeutende Reaktion zwischen dem Serum und dem Reagenz
während der Anfangsumdrehung der Rotoranordnung 35 eintritt. Die von dem Analog-Digital-Umsetzer 66 für
die darauffolgenden Umdrehungen der Rotoranordnung 35 in vorher gewählten Zeitpunkten erzeugten
Impulsgruppen werden der Speichereinheit 72 über den elektronischen Schalter 74 zugeführt, der von dem
Generator 64 für die Steuerfunktion im geeigneten Zeitpunkt betätigt wird.
Wenn die Impulsgruppen in der Speichereinheit 72 gespeichert sind, werden die Inhalte der Speichereinheiten
68 und 72 in der Subtraktionseinheit 75 subtrahiert und die sich ergebenden Daten am Drucker 77
ausgedruckt (beispielsweise Drucker Moduprint, Modell A, Practical Automation Inc.). Dieser Wert ist ein Maß
für die Farbänderung oder Absorptionsänderung in den Küvetten 37 der Rotoranordnung 35 und somit für das
Ausmaß der Reaktion zwischen dem Serum und dem Reagenz in den Küvetten.
Im folgenden soll zur Veranschaulichung eine häufig durchgeführte Analyse zur Bestimmung der Glukose im
Blutserum herangezogen werden. Bei dieser Analyse werden 5 Mikroliter Serum in den Serumhohlräumen 33
und 350 Mikroliter Glukosereagenz in den Reagenzhohlräumen 31 der Probescheibe 100 angeordnet. Das
Glukosereagenz ist ein 0,3 molarer Triäthanolamin-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5, der 0,004 Mol/1
Nikotinamid Adenin-Dinuklcotid-Phosphat (NADP), 0,0005 Mol/l Adenosin-Triphosphat (ATP), 70 mg/1
Hexokinase. 140 mg/1 Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase und 0,004 mol/1 MgSo 4 enthält. Die kombinierte
Wirkung von ATP und NADP in Anwesenheit der Enzyme Hexokinase und Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase
führt zu der Reduktion von NADP, die spektrophotometrisch durch Feststellung von Änderungen
in der Absorption bei einer Wellenlänge von 340 nrr
tor 62 zugeführt (Peak Detector Module 4 084/25 der 50 bestimmbar ist. Eine ursprüngliche Ablesung de;
Firma Burr-Brown Research Corporation). Der Spitzendetektor 62 beobachtet den Spitzenwert eines jeden
zugeführten Impulses und hält diesen Wert, bis er von dem Generator 64 für die Steuerfunktion zurückgesetzt
wird, der mit der Rotoranordnung 35 synchronisiert und gekoppelt ist. Die während der beginnenden Rotation
der .Rotoranordnung 35 erhaltenen Spitzensignale werden dem Spitzendetektor 62 für jede der Küvettenlagen
1 bis 30 zugeführt, wobei der Generator 64 für die Steuerfunktion den Spitzendetektor 62 jeweils nach
Empfang eines jeden Impulses rücksetzt Jedes von dem
Spitzendetektor 62 empfangene Spitzensignal wird dem »unverfälschten Wertes« kann bis zu 2 s nach den
Beginn des Umlaufs der Rotoranordnung 35 vorgenom men und in der Speichereinheit 68 zur Erzeugung eine:
»unverfälschten Wertes« gespeichert werden. Nacl einem Zeitraum von 10 min erfolgt die Endablesung, dii
in der Speichereinheit 72 gespeichert wird. De »unverfälschte bzw. unbeeinflußte Wert« wird von der
Wert in der Speichereinheit 72 subtrahiert. Di gemessene Änderung ist proportional der Absorptions
änderung infolge des Umfangs der Glukoseoxydatioi die mit der Reduktion von NADP gleichläuft.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (2)
1. Verfahren zur Bestimmung des Verlaufs einer chemischen Reaktion zwischen Serumproben und
einem Reagenz, bei welchem durch Zentrifugieren in Serumprobenkammern gegebene Serumproben und
ein in je in Zentrifugenrichtung den einzelnen Serumprobenkammern benachbarte Reagenskammern
gegebenes Reagenz jeweils in einer vom Zentrifugenmittelpunkt weiter entfernten Mischkammer
gemischt werden, bei welchem ferner die einzelnen Reagenz-Serumproben-Gemische während
des Zentrifugierens je zum Teil in eine in Zentrifugenrichtung hinter der jeweiligen Mischkammer
liegende lichtdurchlässige Analysekamnier überführt werden, und bei welchem der die jeweilige
Analysekammer passierende Anteil des Lichtes einer auf die Analysekamnier gerichteten konstanten
Lichtquelle gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß mit einer derartigen Zentrifugaldrehgeschwindigkeit
begonnen wird, daß die einzelnen Gemische aus Serumproben und Reagenz in die Analysekammern gelangen, bevor zwischen
diesen eine wesentliche Reaktion eintritt, daß der die jeweilige Analysekammer passierende Anteil des
Lichtes unmittelbar nach dem Eintritt des Gemisches in die Analysekammer gemessen, in ein
elektrisches Signal umgesetzt und als Bezugswert für die jeweilige Serumprobe in einen Bezugsspeieher
gegeben wird, daß der die jeweilige Analysekamnier passierende Lichtanteil nach Einsetzen
einer Reaktion zwischen Reagenz und jeweiliger Serumprobe zu vorbestimmten Zeitpunkten wiederholt
gemessen, in elektrische Signale umgesetzt und in einen Reaktionswertspeicher gegeben wird, daß
die jeweils neuesten Reaktionsspcichcrwerte mit dem entsprechenden Bezugsspeicherwert verglichen
werden und daß die jeweiligen Vergleichswerte zur Bestimmung des Reaktionsvcrlaufs dargestellt
werden.
2. Vorrichtung zur Bestimmung des Verlaufs einer chemischen Reaktion zwischen Serumproben und
einem Reagenz, mit einer Zentrifugcnanordnung, die mehrere in Umfangsrichtung nebeneinander angeordnete
Kammersysteme aufweist, die je in Zentrifugalrichtung hintereinander angeordnet eine
Serumprobenkanimer, eine Reagenzkammer, eine Mischkammer und eine lichtdurchlässige Analysekamnier
aufweisen, mit einer Lichtquelle und einem Photodetektor, die mit Abstand voneinander derart
angeordnet sind, daß die rotierenden Analysekammern nacheinander den Lichtweg zwischen Lichtquelle
und Photodetektor schneiden, dadurch gekennzeichnet, daß dem Photodetektor (60) ein
Spitzenwertdetektor (62) nachgeschaltet ist, dessen Ausgang über einen ersten Schalter (70) mit einem
Be/ugswertspcichei (68) und über einen /weiten Schalter (74) mit einem Reaktionswerlspeichcr (72)
verbunden ist, daß die Ausgänge der beiden Speicher ^o
(68, 72) mit je einem Eingang einer Vergleichsschaltung (75) verbunden sind, an deren Ausgang eine
Anzeige- und/oder Aufzeichnungsvorrichtung (77) angeschlossen ist, und daß die beiden Schalter (70,
74) unter der Steuerung eines Steuergenerators (64) stehen, wobei der erste Schalter (70) während der zu
Beginn der Zentrifugenrotation vorgenommenen Messung der Bezugswerte für die einzelnen Proben
und danach der zweite Schalter (74) zu vorbestimmten Meßzeitpunkten geöffnet ist.
Applications Claiming Priority (2)
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DE2260280B2 DE2260280B2 (de) | 1976-09-23 |
DE2260280C3 true DE2260280C3 (de) | 1977-05-12 |
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