DE2234069A1 - METHOD OF MANUFACTURING A PURIFIED GAMMA GLOBULIN - Google Patents

Description

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South. African Inventions Development Corporation Administration Building, G.S.I.R., Soientia, Pretoria, Süd-Afrika "South. African Inventions Development Corporation Administration Building, G.S.I.R., Soientia, Pretoria, South Africa "

VEiiFAHKEN ZÜH HERSTELLUNG EINES GEUEINIGTM GAM-4A-GLOBULIKS.VEiiHKEN ZÜH CREATING A UNIFIEDTM GAM-4A GLOBULIC.

Die vorliegende Erfindung lpe trifft ein Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Gamma-Giobulin Präparats mit gar keiner oder höchstens sehr geringer Antikomplementär-Aktivität (ACA) aus einem natürlichen gamma-globulinhaltigen Ausgangsmaterial, ins besondere Plasma, durch Fraktionierung und selektive Fällung von ACA und, gegebenenfalls, gleichzeitige Fällung von Hepatitisvirus bzw. Antigen.The present invention relates to a method of manufacture of a purified gamma-giobulin preparation with none or at most very low anti-complementary activity (ACA) a natural starting material containing gamma globulin, ins special plasma, through fractionation and selective precipitation of ACA and, if necessary, simultaneous precipitation of hepatitis virus or antigen.

Gamma-Globulin, bzw» Immuno-Globulin nennt man gewisse Proteine und insbesondere die Fraktion derjenigen Plasmaproteine, die im wesentlichsten für die Antikörper-Aktivität verantwortlich sind.Certain proteins are called gamma globulin or »immuno globulin and in particular the fraction of those plasma proteins which are essentially responsible for antibody activity.

Man verwendet Gamraa-Globulin als Therapeutikum um dem Empfänger eine gewisse zeitliche Immunität zu verleihen. Im allgemeinen kommt Gamma-Giobulin intramuskulär zur Anwendung, doch leidetOne uses Gamraa globulin as a therapeutic to the recipient to confer a certain temporal immunity. Generally, gamma-giobulin is used intramuscularly, but it suffers

die intramuskuläre Anwendung unter den folgenden nachteiligen : 209886/1137 intramuscular use under the following disadvantages : 209886/1137

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Λ) dem maximum Flüssigkeitsvolumen das ohne schmerzhafte Irritation eingespritzt werden kann,Λ) the maximum volume of liquid that without painful irritation can be injected,

B) den Verlusten, z.B. durch lokale Proteolyse, wodurch nur etwa UO)'.! der immunologischen Aktivität schliesslich in den Blutstrom gelangt}B) the losses, e.g. through local proteolysis, whereby only about UO) '.! the immunological activity eventually enters the bloodstream got}

C) der langsamen und unvollständigen Resorption, wodurch eine schnelle und wirksame Behandlung erschwert wird.C) the slow and incomplete absorption, causing a fast and effective treatment is made more difficult.

in vielen Fällen wäre'die intravenöse Anwendung vorzuziehen, die aber leicht ungünstige Reaktionen im Patienten hervorrufen kann, die man der Anwesenheit sog. antikomplementärer Aktivität (ACA) zuschreibt. Diese Nebenerscheinungen können manchmal sehr ernst sein (plötzlicher Blutdruckabfall, Bewusstlosigkeit, herz.rhythmische Störungen, Schüttelfrost, Fieber, anaphylaktischer Schock usw.)in many cases intravenous use would be preferable to the but can easily cause unfavorable reactions in the patient, which can be attributed to the presence of so-called anti-complementary activity (ACA) ascribes. These side effects can sometimes be very serious (sudden drop in blood pressure, loss of consciousness, heart rhythm Disorders, chills, fever, anaphylactic shock, etc.)

ACA wiederum bildet sich anscheinend mindestens zum Teil durch die Denaturierung des Gamma-Globulin während des Fraktionier-Verfahrens zur Reinigung des Gamma-Globulins unter Bildung hochmolekularer Komplexe.In turn, ACA appears to be formed, at least in part, from denaturation of the gamma globulin during the fractionation process for the purification of the gamma globulin with the formation of high molecular weight Complexes.

Bei der intravenösen' Anwendung verbinden sich diese Aggregate mit Komplement (daher der Ausdruck antikomplementäre Aktivität), und dadurch wiederum werden die verschiedenen Reaktionen, einschLLesi,-llch solche anaphylaktischer Art, ausgelöst. Diese Reaktionen können ausserdem unter Umständen die eigentliche Wirksamkeit des Gamma-Globulins selbst beeinträchtigen.When administered intravenously, these aggregates combine with Complement (hence the term anti-complementary activity), and this in turn determines the various reactions, including of an anaphylactic nature. These reactions can also impair the actual effectiveness of the gamma globulin itself.

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l-lan hai festgestellt., dass das nach dem bel-armten Cohn Cryo-Jlthariol-VerfatJi'cai hergestellte Gamma-Globulin erhebliehe, durch homplementfixation feststellbare Mengen an ACA enthält. Das gleiche gilt im grösseren oder kleineren Masse für Gamma-Globulin,■ das nach anderen Verfahren aus menschlichen Seren isoliert wird, z.B. dem liivanol-Verfahren, dem Multimembran-Elektrodekantations-Verfahren oder dem iolyäthyleneriglykol-Verfahren. Die nach solchen Verfahren hergestellten Produkte enthalten alle denaturiertes Material. Das Vorhandensein dieses veränderten iiaterials lässt sich wohl auf einen oder mehrere der folgenden Faktoren zurückführen:l-lan hai stated that according to the ill-poor Cohn Cryo-Jlthariol-VerfatJi'cai produced gamma globulin by homplement fixation contains detectable amounts of ACA. The same applies to a greater or lesser extent to gamma globulin, ■ which is isolated from human sera by other methods, e.g. the liivanol method, the multi-membrane electrode cantation method or the iolyäthyleneneriglykol-method. The ones after such Process manufactured products all contain denatured material. The presence of this changed material can be can be attributed to one or more of the following factors:

A) Mängel der eigentlichen Heinigungsverfahren;A) Deficiencies in the actual cleaning procedures;

B) Oberflächeridenatu'rierung;B) surface identification;

C) Mängel beim Gefriertrocknen des Endproduktes;C) Defects in the freeze-drying of the final product;

D) noch unbekannte Faktoren, die eine Veränderung der Antigenstruktur des Gamma-Globulins, oder anderer Proteinkomponenten, die der Heinigungsprozedur entgangen waren, hervorrufen.D) as yet unknown factors that change the structure of the antigen of gamma globulin, or other protein components, that had escaped the cleaning procedure.

Was auch schon die Ursache der sog. antikomplementären Aktivität sein mag, so steht fest, dass sie unerwünscht ist, besonders wenn das Gamma-Globulin intravenös zur Anwendung kommen soll.Which is also the cause of the so-called anti-complementary activity may be, it is clear that it is undesirable, especially if the gamma globulin is to be used intravenously.

Es wurden schon mehrere Versuche zur Lösung dieses Problems gemacht, z.B. auf physikalischem oder chemischen Wege, wovon einige grosstechnisch schlecht durchführbar sind und andere von zu giftigen Chemikalien Gebrauch machten (Schiff et al, Aust. paediat. J. (I968) k: 1^1-126). Es wurden auch einige Verfahren (einschliesslieh des in der obengenannten Literaturstelle beschriebenen VerfcihrerifO vorgeschlagen,- die von"Enzymen (und manchmal auch IiCl)Several attempts have already been made to solve this problem, for example by physical or chemical means, some of which are difficult to carry out on an industrial scale and others have made use of chemicals that are too toxic (Schiff et al, Aust. Paediat. J. (1968) k: 1 ^ 1-126). Some methods (including the method described in the above cited reference) have also been proposed - those of "enzymes (and sometimes also IICl)

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-If--If-

zum Abbau von ACA Gebrauch machen. In der Praxis muss man dabei jedoch einen unbefriedigenden Kompromiss machen. Die vollständige enzymatische Entfernung von ACA ist praktisch, undurchführbar ohne einen übermässigen Abbau des Gamma-Globulins selbst unter Bildung kleinerer Moleküle,die, falls sie überhaupt noch immunologisch wirksam sind, diese Wirksamkeit wegen ihrer schnellen metabolischen Ausscheidung aus dem Körper in unverhältnismässig kurzer Zeit verlieren. Wenn man die Enzyme (entweder Pepsin oder.Plasmin) nicht quantitativ beseitigt, setzen sie ihre zerstörerische Wirkung auch noch während der Lagerung fort. Eine Einbusse an Wirksamkeit lässt sich nicht vermeiden.make use of ACA to break down. In practice, however, you have to make an unsatisfactory compromise. The full enzymatic removal of ACA is practical, impractical without an excessive breakdown of the gamma globulin itself with the formation of smaller molecules, which, if at all, are still immunological These are effective because of their rapid metabolic rate Elimination from the body in a disproportionately short time Lose time. If you use the enzymes (either pepsin or plasmin) If not eliminated quantitatively, they continue their destructive effect even during storage. A loss of effectiveness cannot be avoided.

Die Behandlung von Gamma-Globulin mit herkömmlichen Adsorbenzien, z.B. Aktivkohle, wurde ebenfalls versucht. (Steinbuch et al Vox Sang. 13, IO3-IO6 (1967)). Die Erzeugnisse waren jedoch nicht ganz frei von Verunreinigungen, woraus sich unerwünschte Reaktionen ergeben können. Im Allgemeinen neigen solche Verfahren zu erheblichen Materialverlusten und gehen mit technologisch unerwünschten Massnahmen gepaart, sowie dem Risiko fremde Verunreinigungen einzuführen. Solche Verfahren lassen sich nicht leicht genau steuern.The treatment of gamma globulin with conventional adsorbents, e.g. activated carbon has also been tried. (Steinbuch et al Vox Sang. 13, IO3-IO6 (1967)). However, the products were not completely free of impurities, which can result in undesirable reactions. In general, such procedures tend to be considerable material losses and are paired with technologically undesirable measures, as well as the risk of foreign contamination to introduce. Such processes cannot easily be precisely controlled.

Man hat auch schon Polyäthylen-Glykol zur Fraktionierung von Blutplasma und zur Fällung einer gereinigten Gamma-Globulin-Fraktion aus verhältnismässig stark verdünnten wässrigen Lösungen berichtet ohne dass dabei die Frage der ACA-Entfernung berücksichtigt wurde. Infolgedessen wurdendiese Massnahmen (Chun et al., Anal. Biochem. 12, k81-k97 (196?)) nicht von diesem Gesichtspunkt aus optimalisiert, und kann man auch nicht voraussetzen, dass das Endprodukt einen geringen ACA Titer hat. 20 9886/1137Polyethylene glycol for the fractionation of blood plasma and for the precipitation of a purified gamma globulin fraction from relatively highly dilute aqueous solutions has also been reported without taking into account the question of ACA removal. As a result, these measures (Chun et al., Anal. Biochem. 12, k81-k97 (196?)) Have not been optimized from this point of view, nor can it be assumed that the end product has a low ACA titer. 20 9886/1137

* sich
Tatsächlich hat sich ergeben, dass/eine ausreichende ACA-Entfernung mit PEG ohne untragbare Gamma-Globulin Verluste nur durch Qptimalislerung der Verfahrensbedingungen erreichen lässt. * yourself
In fact, it has been found that / a sufficient ACA removal with PEG without intolerable gamma globulin losses can only be achieved by optimizing the process conditions.

Es wurden auch bereits Verfahren veröffentlicht, in denen Aluminiumsalze zur Fraktionierung von Plasmaproteinen und zur Gewinnung von Gamma-Globulin verwendet wurden (Coll· Czech« Chem. Commun·, 22 (1957), 1^89-1^93; ibid. 23, (1958), 773-775). Dabei wurden besonders Vorkehrungen getroffen, die (wie sich nun herausstellte) einer wirksamen Entfernung von ACA entgegen wirken. Einige der dort beschriebenen Massnahmen tragen sogar unmittelbar zur Bildung von ACA und seiner Gegenwart im Endprodukt bei.Processes have also already been published in which aluminum salts were used to fractionate plasma proteins and to obtain gamma globulin (Coll · Czech «Chem. Commun ·, 22 (1957), 1 ^ 89-1 ^ 93; ibid. 23, (1958), 773-775). In doing so, special precautions were taken that (as it now turned out) counteract an effective removal of ACA. Some of the measures described there even contribute directly to the formation of ACA and its presence in the end product.

Einige der bekannten Präparate wurden für chemisch und.klinisch unzuverlässig gehalten, da die ACA-Entfernung häufig unvollständig • war und die Möglichkeit einer Rückbildung von ACA durch Aggrega- . tion im Endprodukt während der Lagerung sich nicht ausschliessen Hess»Some of the well-known preparations were made for chemical and clinical held unreliable as ACA removal is often incomplete • was and the possibility of ACA regression through aggregate. tion in the end product during storage are not mutually exclusive Hess »

Um ohne Gefahr an menschliche Patienten verabreicht werden zu können darf ein Gamma-Globulin-Präparat ferner keine Hepatitisviren enthalten. Das Vorhandensein des Virus lässt sich nur schwer mit genügender Sicherheit feststellen. Man hat lange angenommen, dass nach dem Cohn-Äthanolfraktionierungsverfahren hergestelltes Gamma-Globulin ausreichend virusfrei zur sicheren Anwendung ist. Da es an ausreichenden Kenntnissen über das eventuelle Vorhandensein des Hepatitisvirus in Gamma-Globulin Fraktionen aus anderen Verfahren fehlte, machte man sich deshalb die Verwendung von nach dem C ο hn-Frak tlonIe rung sve rfahren herges telltem Gamma-GlobulinIn order to be able to be administered to human patients without danger Furthermore, a gamma globulin preparation must not contain any hepatitis viruses contain. The presence of the virus is difficult to identify with determine sufficient security. It has long been believed that Gamma globulin produced by the Cohn ethanol fractionation process is sufficiently virus-free for safe use. Because it sufficient knowledge of the eventual existence of the hepatitis virus in gamma globulin fractions from other methods was missing, one therefore made use of after C o hn frac tloning gamma globulin produced by the process

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weitgehend zur Hegel, trotz gewisser Nachteile dieses Verfahrens, wie dessen ausgeprägter Tendenz das Gamma-Globulin zu denaturieren. Leider besteht nun kein Zweifel mehr, dass auch Cohn-Fraktionen nicht unbedingt hepatitisfrei sind.largely to Hegel, despite certain disadvantages of this procedure, like its pronounced tendency to denature gamma globulin. Unfortunately, there is no longer any doubt that the Cohn factions are not necessarily free of hepatitis either.

Somit besteht ein unbedingter Bedarf an einem neuen Verfahren zur Behandlung immuno-globulinhaltiger Materialien, um dadurch die Gefahr zu verringern, dass das Produkt noch gefährliche Mengen an Hepatitisvirus enthält. Es besteht sowohl ein Bedarf an einem solchen Verfahren zur Anwendung an Material mit unbekanntem Infektivitätsrisiko,als auch zur Verringerung bzw. Ausschaltung des Hisikos in solchen Fällen wo man weiss, oder begründet vermutet, dass der Virus vorhanden ist.Thus there is an absolute need for a new method for treating immunoglobulin-containing materials in order to thereby to reduce the risk that the product is still in dangerous quantities contains hepatitis virus. There is a need for such a method of application to material with unknown risk of infectivity, as well as also to reduce or eliminate the Hisikos in such cases where one knows or suspects justified, that the virus is present.

Es ist allgemein üblich, das sogenannte australische Antigen als qualitative Andeutung hepatitisverdächtiger Präparate zu verwenden. Da es im Allgemeinen schwieriger ist das Antigen als den eigentlichen Virus zu entfernen, ist die Annahme vertretbar, dass ein australisches antigenfreies Präparat auch frei von ansteckendem Hepatitisvirus ist. Umgekehrt ist das Vorhandensein des australischen Antigens noch kein zwingender Beweis, dass der ansteckende Hepatitisvirus ebenfalls vorhanden ist.It is common practice to consider the so-called Australian antigen qualitative indication of suspected hepatitis preparations to be used. Since it is generally more difficult to find the antigen than the real one To remove the virus, it is reasonable to assume that an Australian antigen-free preparation is also free of the contagious hepatitis virus. Conversely, the presence of the Australian Antigens is not yet compelling evidence that the contagious hepatitis virus is also present.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung neuer bzw. verbesserter Methoden zur Verringerung bzw. Beseitigung der Gefahren, die sich aus AGA und/oder ansteckendem Hepatitisvirus im Gamma-Globulin ergeben. Es ist ferner Aufgabe der Erfindung ein solches Verfahren zu schaffen, das sich im wesentlichen in einem verhältnismässig leicht einzuhaltenden Temperaturbereich durchführen lässt, insbesondere im wesentlichen bei 0°C und darüber.The object of the invention is to create new or improved methods for reducing or eliminating the dangers that arise from AGA and / or contagious hepatitis virus in gamma globulin. It is also an object of the invention to provide such a method to create that can be carried out essentially in a relatively easy-to-maintain temperature range, in particular essentially at 0 ° C and above.

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In der vorliegenden Beschreibung werden die Bezeichnungen Gamma-Globulin und Immuno-Globulin als gleichbedeutend betrachtet.In the present description, the terms gamma globulin and immuno-globulin are considered synonymous.

Die Verunreinigungen, die für ACA verantwortlich sind, sind veränderlich und hängen u.a. von der Quelle des Rohgamma-Globulins ab (wobei einer der Faktoren die genaue Art der Vorkonzentrierung bzw. der Vorverarbeitung des Plasmas oder Gamma-Globulins ist). Deshalb ist es auch eine wichtige Erfindungsaufgabe ein Verfahren zu schaffen, das genügend wandelbar ist, um in den verschiedensten , Fällen, die ausreichende Beseitigung von ACA, gegebenenfalls jeweils nach einfachen routinemässigen Vorversuchen, zu gewährleisten. The impurities responsible for ACA are variable and depend, among other things, on the source of the raw gamma globulin (one of the factors being the exact type of preconcentration or the preprocessing of the plasma or gamma globulin). Therefore, it is also an important inventive task to use a method to create that is sufficiently changeable to ensure the adequate elimination of ACA in the most varied of cases, if necessary after simple routine preliminary tests.

Erfindungsgemäss wird ein Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Gamma-Globulin-Präparats im wesentlichen frei von Antikomplementäraktivität (ACA) aus einem natürlichen Gamma-Globulin-haltigen Ausgangsmaterial, insbesondere Plasma, durch Fraktionierung und selektive Fällung von ACA und, gegebenenfalls Fällung von Hepatitisvirus bzw. Antigen, vorgesehen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass nach der eigentlichen Fraktionierung des Ausgangsmaterials zur Befreiung des Gamma-Globulins von andersartigen Proteinen eine weitere Trennung zur ACA-Entfernung aus einer wässrigen Lösung des Gamma-Globulins durchgeführt wird, wobei das Gamma-Globulin selbst in Lösung bleibt, durch Zugabe mindestens eines lösungsheramenden Mittels, nämlich eines wasserlöslichen Salzes und/oder einer linearen,kettenförmigen, ungeladenen , polymeren Verbindung, wobei letztere in einer Konzentration verwendet wird, deren lösungshemmende Wirkung im wesentlichen dieselbe ist, wie die von *+,5 - 7 g/ 100 ml Polyäthylenglykol (PEG) mit Molekulargewicht zwischen k 000 und 8 000, und die wässrige Lösung im letzteren Fall ferner mindestens 3 g/ 100 ml Gamma- Globulin enthält,According to the invention, a method for producing a purified gamma globulin preparation is essentially free of anti-complementary activity (ACA) from a natural starting material containing gamma globulin, in particular plasma, by fractionation and selective precipitation of ACA and, optionally, precipitation of hepatitis virus or antigen , provided, which is characterized in that after the actual fractionation of the starting material to free the gamma globulin from proteins of a different type, a further separation for ACA removal from an aqueous solution of the gamma globulin is carried out, the gamma globulin itself in solution remains, by adding at least one solubilizing agent, namely a water-soluble salt and / or a linear, chain-like, uncharged, polymeric compound, the latter being used in a concentration whose solubilizing effect is essentially the same as that of * +, 5 - 7 g / 100 ml polyethylene englycol (PEG) with a molecular weight between k, 000 and 8,000, and the aqueous solution in the latter case also contains at least 3 g / 100 ml of gamma globulin,

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Für das Verfahren gibt es die verschiedensten Variationsmöglichkeiten, wobei es dem Fachmann überlassen bleibt zur Reinigung des Gamma-Globulins aus einer bestimmten Gamma-Globulin Quelle diejenige Ausführung bzw. Kombination von Ausführungen des Verfahrens zu wählen, die den jeweiligen Erfordernissen am besten genügt. Diese Wahl wird besonders dadurch erleichtert, dass sich AGA verhältnismässig einfach bestimmen lä'sst und, dass das vorliegende Verfahren so einfach ist, dass es sich ohne weiteres auch im kleinsten Masstab routinemässig als Vorversuch im Versuchslabor durchführen lässt· In der Mehrzahl der Fälle erwiess sich eine Gamma-Globuiin-Konzentration in der wässrigen Lösung zwischen k- und 10 g/ 100 ml, insbesondere mindestens 5 g Gamma-Globulin /100 ml Lösung als vorteilhaft.There are many possible variations for the method, whereby it is left to the person skilled in the art to select that execution or combination of executions of the method that best meets the respective requirements for purifying the gamma globulin from a specific gamma globulin source. This choice is particularly facilitated by the fact that AGA can be determined relatively easily and that the present method is so simple that it can be routinely carried out as a preliminary test in the test laboratory even on the smallest scale. In the majority of cases it was proven a gamma globulin concentration in the aqueous solution between k- and 10 g / 100 ml, in particular at least 5 g gamma globulin / 100 ml solution, is advantageous.

In einer der bevorzugten Ausführungen ist der Lösungshemmer eine lineare, kettenförmige, ungeladene Polymerverbindung und wird die AGA-haltige unlösliche Fraktion wieder dem Verfahren zugeführt, indem sie nochmals in Losung gebracht und darin enthaltenes, mitgeschlepptes Gamma-Globulin durch weitere Fällung wieder gewonnen wird. Die Polymerverbindung hat vorzugsweise ein Molekulargewicht zwischen 3 000 und 20 000.In one of the preferred embodiments, the dissolution inhibitor is one linear, chain-like, uncharged polymer compound and will the AGA-containing insoluble fraction is fed back into the process, by bringing them into solution again and the entrained gamma globulin contained therein by further precipitation is won. The polymer compound preferably has a molecular weight between 3,000 and 20,000.

Als Beispiele solcher Polymerverbindungen seien genannt Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Nonylphenoläthoxilat.Examples of such polymer compounds include dextran, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone and nonylphenol ethoxylate.

Bevorzugte Polymerverbindungen für das Verfahren sind Polyalkylenglykole, insbesondere solche mit einem Molekulargewicht zwischen 3 000 und 20 000, vorzugsweise zwischen If 000 und 8 000, z.B. 6 000.Preferred polymer compounds for the process are polyalkylene glycols, especially those with a molecular weight between 3,000 and 20,000, preferably between If 000 and 8,000, e.g. 6,000.

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Vorzugsweise wird als Polyalkylenglykol ein Polymerisat verwendet, das von monomeren Alkylenglykolen mit von 2 bis h Kohlenstoffatomen abgeleitet ist, bzw. ein Mischpolymerisat solcher Monomerverbindungen miteinander, bzw. Gemisch solcher Polymerverbindungen. Als Beispiele seien genannt Polyäthylen- , glykol, Polypropylenglykol, Polyäthylen-Propylenglykol, PoIy- !,U-Dihydroxybutanglykol oder Gemische solcher Polyglykole,The polyalkylene glycol used is preferably a polymer which is derived from monomeric alkylene glycols having from 2 to h carbon atoms, or a copolymer of such monomer compounds with one another, or a mixture of such polymer compounds. Examples include polyethylene, glycol, polypropylene glycol, polyethylene-propylene glycol, poly!, U-dihydroxybutane glycol or mixtures of such polyglycols,

Polyäthylenglykol (PEG) wird z'.Z. bevorzugt, da es als Handelsprodukt leicht und preisgünstig erhältlich ist und.besonders vorteilhaft in der Anwendung ist* Es hat, besonders im bevorzugten Molekulargewichtsbereich von zwischen h 000 und 8 000, insbesondere 6 000, günstige physikalische Eigenschaften.. Die in der vorliegenden Beschreibung gegebenen Molekulargewichte für PEG beziehen sich auf die von den Lieferanten des Handelsproduktes ge-., lieferten. Daten. Wo zum Beispiel von PEG mit MolekulargewichtPolyethylene glycol (PEG) is currently preferred because it is easy and available inexpensively as a commercial product und.besonders advantageous in the application * It has, especially in the preferred molecular weight range of between h 000 and 8000, particularly 6000, favorable physical properties .. The guidance given in the present description Molecular weights for PEG refer to those supplied by the suppliers of the commercial product. Data. Where for example from PEG with molecular weight

6 000 die Hede ist, wurde "Polyäthylenglykol 6 000" der Shell Chemical Company verwendet. Die Bezeichnungsziffer deutet annähernd das Molekulargewicht an, obwohl gemäss Shell's Datenangaben das "durchschnittliche Molekulargewicht" im Bereich 6 000 bis6,000, Shell Chemical Company's "polyethylene glycol 6,000" was used. The designation number indicates approximately the molecular weight, although according to Shell's data the "average molecular weight" in the range 6,000 to

7 500, gemäss der von dieser Firma angewandten Bestimmungsmethode, liegt. Solche Molekülargewichtsvariationen sind von keiner wesentlichen praktischen Bedeutung für das erfindungsgemässe Verfahrene Eigene Molekulargewichtsbestimmungen ergaben.ohnehin, dass das in den meisten Versuchen verwendete PEG fast ausschliesslich im Molekulargewichtsbereich zwischen 5 800 und 6 300 lag.7 500, according to the determination method used by this company, lies. Such variations in molecular weight are of no essential practical importance for the invention In any case, our own molecular weight determinations showed that the PEG used in most of the experiments was almost exclusively was in the molecular weight range between 5,800 and 6,300.

Vorzugsweise wird die lösungshemmende Polymerverbindung zur Fraktionierung durch Fällung aus ei^Sft $§Ν§φ·$ψ^ lösung ^des Gamma-Globulins verwendet. QRlGJNAt IMSPIGfEÖThe solution-inhibiting polymer compound is preferably used for fractionation by precipitation from a solution ^of gamma globulin. QRlGJNAt IMSPIGfEÖ

Prinzipiell ist es jedoch auch möglich ähnliche Fraktionierergebnisse durch selektive Extraktion eines Gamma-Globulinhaltigen Konzentrats mittels einer wässrigen Lösung der Polymerverbindung als Extraktionsflüssigkeit zu erzielen.In principle, however, similar fractionation results are also possible by selective extraction of a gamma globulin containing To achieve concentrate by means of an aqueous solution of the polymer compound as the extraction liquid.

Wo in den AusfUhrungsbeispielen die Verwendung von PEG 6 000 beschrieben wird, lässt sich die equivalente Menge anderer Polymerverb indungen zur annähernden Erzielung des gleichen Ergebnisses aus der folgenden Gleichung errechnen?Where in the working examples the use of PEG 6 000 is described, the equivalent amount of other polymer compounds can be used to approximately achieve the same result calculate from the following equation?

2,3032.303

wobei β der benötigten Polymerkonzentration umgekehrt proportional ist,
r den Radius des Polymermoleküls darstellt undwhere β is inversely proportional to the required polymer concentration,
r represents the radius of the polymer molecule and

r den Radius bzw· Stokesradius des zu fällenden Partikels dars r is the radius or Stokes radius of the particle to be precipitated

stellt«represents «

Eine bevorzugte Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens beinhaltet ausser einer AGA-Fällungsstufe mit der linearen, kettenförmigen, ungeladenen Polymerverbindung ausserdem eine Fällungsstufe für weitere AGA durch Hinzugabe eines wasserlöslichen Salzes, In manchen Fällen kann die Fällung mit Salz auch alleine zur An₇ wendung kommen.A preferred embodiment of the inventive method includes, besides a AGA precipitation step with the linear chain-like, uncharged polymer compound further comprises a precipitation step for further AGA by adding a water-soluble salt, in some cases, the precipitation ₇ application can with salt also alone for at arrive.

Gemäss einigen Ausführungen der Erfindung wird Kochsalz zur selektiven Fällung von AGA aus der wässrigen Lösung bei einer Salzkonzentration von zwischen 25 g/ 100 ml und dem Sättigungspunkt verwendet.According to some embodiments of the invention, common salt becomes selective Precipitation of AGA from the aqueous solution at a salt concentration of between 25 g / 100 ml and the saturation point used.

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In einer solchen Ausführung wird Gamma-Globulin zunächst als Teil ■ des Fraktionierungsverfahrens aus einer wässrigen Lösung, z.B. mit einer Konzentration von zwischen 3 und 7 % und "bei einem pH zwischen 6 und 7_t5) z.B.. 6,3»mit Polyäthylenglykol eines Molekulargewichtes zwischen 6 000 und 8 000, z.B. 6 000, und in einer " Konzentration in der wässrigen Flüssigkeit von etwa lh % gefällt. Diese Fällung kann man z.B. zwischen 0 C und 30 G, vorzugsweise etwa bei Zimmertemperatur, durchführe^ da die als Fällungsmittel verwendete polymere Verbindung das Protein schützt. Im bevorzugten Verfahren wird der Niederschlag unter annähernd neutralen Bedingung en (z.B. in Phosphatpuffer von pH 7,0) wieder gelöst, z.B. mit einer Konzentration zwischen 2 und $ %, insbesondere 3 % und mit kaltem Äthanol gefällt, z.B. bei -8°C und mit einer Äthanolkonzentration von 25 %, wonach das gefällte Gamma-Globulin zur Entfernung des Äthanols gefriergetrocknet wird.In such an embodiment, gamma globulin, first as part of the fractionation ■ from an aqueous solution, for example having a concentration between 3 and 7%, and "at a pH between 6 and 7 _t 5), for example. 6.3" with a polyethylene glycol Molecular weight between 6,000 and 8,000, for example 6,000, and precipitated in a "concentration in the aqueous liquid of about 1h%. This precipitation can be carried out, for example, between 0 C and 30 G, preferably around room temperature, since the polymeric compound used as the precipitating agent protects the protein. In the preferred method, the precipitate is redissolved under approximately neutral conditions (for example in phosphate buffer of pH 7.0), for example with a concentration between 2 and $%, in particular 3 % and precipitated with cold ethanol, for example at -8 ° C and with an ethanol concentration of 25 %, after which the precipitated gamma globulin is freeze-dried to remove the ethanol.

Statt der Äthanolfällung und Gefriertrocknung zwecks Entfernung des PEGs kann man auch Gelfiltration verwenden.Instead of ethanol precipitation and freeze-drying to remove the PEG, gel filtration can also be used.

Man wird nun bereits meistens feststellen, dass das so bereitete Gamma-Globulin eine geringere antikoraplementäre Aktivität hat als, ein nach dem herkömmlichen Gryo-Alkoholfällungsverfahren fraktioniertes Gamma-Globulin. Die noch übrige antikomplementäre Aktivität lässt sich nun Überraschender Weise mit Salz fällen, trotz der Beobachtung, dass es häufig nicht möglich war, AGA aus in herkömmlicher Weise (Cohn-Verfahren) hergestelltem Gamma-Globulin durch Salzfällung alleine, insbesondere mit Kochsalz, zu entfernen.Most of the time you will find out that it was preparing that way Gamma globulin has a lower anti-coraplementary activity than a fractionated according to the conventional Gryo alcohol precipitation process Gamma globulin. The remaining anti-complementary activity can now surprisingly be precipitated with salt, despite the Observation that it was often not possible to take AGA out in conventional Way (Cohn process) to remove gamma globulin produced by salt precipitation alone, especially with table salt.

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Zur Hemmung eventueller Bakterienwirkung kann man die Salzfällung auch bei Temperaturen unter O⁰C durchführen. Vorzugsweise wird die Salzfällung bei etwa neutralem pH, insbesondere bei dem isoelektrischen Punkt der zu reinigenden Antikörper durchgeführt. Somit liegt das bevorzugte pH im allgemeinen zwischen 6 und 7 »5» je nach dem isoelektrischen Punkt der betreffenden Antikörper.Salt precipitation can also be carried out at temperatures below ⁰ ° C. to inhibit possible bacterial effects. The salt precipitation is preferably carried out at approximately neutral pH, in particular at the isoelectric point of the antibodies to be purified. Thus, the preferred pH is generally between 6 and 7 »5» depending on the isoelectric point of the antibodies in question.

Kochsalz hat den Vorteil der physiologischen Verträglichkeit, doch können auch andere Salze verwendet werden, z.B. Ammoniumsulphat (das allerdings schwerer zu entfernen ist), lösliche Kalzium- und Magnesiumsalze, z.B. Kalzium- oder Magnesiumchlorid und Magnesiumsulphat. In solchen Fällen verhält sich die zur Fällung benötigte Konzentration annähernd wie die Quadrate der Wertigkeiten der Salzionen·Table salt has the advantage of physiological tolerance, however Other salts can also be used, e.g. ammonium sulphate (which is, however, more difficult to remove), soluble calcium and Magnesium salts, e.g. calcium or magnesium chloride and magnesium sulphate. In such cases, the concentration required for precipitation behaves approximately like the squares of the valences of Salt ions

überraschenderweise wurde festgestellt, dass eine zu hohe Gamma-Globulin-Konzentration^die Fällung von ACA mittels Salz hemmen kann. Vorzugsweise hat das Gamma-Globulin bei dieser Art der Salzfällung eine Konzentration von weniger als 10 g/100 ml, vorzugsweise zwischen 2 und 7, z.B_# 5 g/100 ml. $ % hat den Vorteil annähernd richtig für die nachträgliche intravenöse Anwendung zu sein (nachdem man den Salzgehalt z.B. durch Dialyse entsprechend verringert hat, z.B. auf 0,85 Gew.^, der Konzentration physiologischer Kochsalzlösung).It was surprisingly found that too high a gamma globulin concentration ^ can inhibit the precipitation of ACA by means of salt. In this type of salt precipitation, the gamma globulin preferably has a concentration of less than 10 g / 100 ml, preferably between 2 and 7, e.g. _# 5 g / 100 ml. $% Has the advantage of being approximately correct for subsequent intravenous use (After the salt content has been reduced accordingly, for example by dialysis, for example to 0.85 wt. ^, the concentration of physiological saline solution).

Bs ist aber auch möglich, das Gamraa-Globulin weiter zu konzentrieren, z.B. durch Pervaporation oder durch Druckdialyse.But it is also possible to concentrate the Gamraa globulin further, e.g. by pervaporation or by pressure dialysis.

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43 223406343 2234063

Es wurde beobachtet, dass solche Salze wie Natriumchlorid in erster Linie oder sogar ausschliesslich die höher molekularen Formen von ACA fällen. Damit lässt sich unter Umständen erklären, weshalb diese Art der Fällung mit Salz nicht unbedingt die gesamte AGA Aktivität entfernt. .It has been observed that such salts as sodium chloride in primarily or even exclusively precipitate the higher molecular forms of ACA. This can possibly explain which is why this type of precipitation with salt is not necessarily the whole AGA activity removed. .

Es kann auch kein Zweifel bestehen, dass die einzelnen Klassen der hier beschriebenen Lösungshemmer durch unterschiedliche Mecha nismen wirksam sind (und daraus lässt sich ihre häufig gegenseitig ergänzende Wirksamkeit erklären). Die Entfernung von AGA mittels polymerer Lösungshemraer beruht auf einem Verdrängungseffekt, während die meisten Salze, z.B. Kochsalz, Anmoniumsulphat und Magnesiumsulphat in erster Linie durch Aussalzung bzw. Ent-* Wässerung wirksam werden, überraschenderweise wurde festgestellt, dass mit einigen anderen Salzen sogar ein dritter Mechanismus auftritt, der sich bei der Trennung als besonders wirksam erweist. Es handelt sich dabei meistens um Salze einiger Metalle mit höherer Wertigkeit, vorzugsweise 3-wertige Metalle wie Aluminium oder 3-wertiges Eisen, die unter ganz bestimmten Umständen bei sehr viel geringeren Konzentrationen wirksam werden.There can also be no doubt that the individual classes The solution inhibitors described here are effective through different mechanisms (and this often makes them mutually exclusive explain additional effectiveness). The removal of AGA by means of polymeric solution inhibitors is based on a displacement effect, while most salts, e.g. table salt, ammonium sulphate and magnesium sulphate primarily through salting out or de- * Watering become effective, surprisingly it was found that with some other salts even a third mechanism occurs, which proves to be particularly effective in the separation. These are mostly salts of some metals with a higher valency, preferably trivalent metals such as aluminum or trivalent iron, which in very specific circumstances be effective at much lower concentrations.

Es hat sich herausgestellt, dass diese Salze nach der Einführung in die wässrige Lösung, dort mit bereits vorhandenen Ionen adsorbierende Niederschläge bilden, mit denen ACA kopräzipitiert wird;It has been found that these salts, after they have been introduced into the aqueous solution, adsorb there with ions that are already present Form precipitates with which ACA co-precipitates will;

Erstaunlicherweise wurde ferner festgestellt, dass gerade bei der "in situ" Bildung des adsorptionsstarken NiederschlagesAmazingly, it was also found that just at the "in situ" formation of the highly adsorbed precipitate

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auch eventuell vorhandenes australisches Antigen kopräzipitiert wird. Da der Hepatitisvirus, falls vorhanden, leichter adsorbiert wird als das Antigen, wird der Virus zwangsläufig ebenfalls kopräzipitiert·any Australian antigen also co-precipitated will. Since the hepatitis virus, if any, is more easily adsorbed than the antigen, the virus inevitably becomes also coprecipitated

Deshalb eignen sich diese Ausführungen besonders auch zur Durchführung an Gamma-Globulin-haltigem Material aus hepatitisinfizierten bzw. verdächtigen Plasmafraktionen, wobei das Verfahren gleichzeitig die gegebenenfalls vorhandene Infektivitat beseitigt oder mindestens verringert. Erfindungsgemäss wird somit auch ein Verfahren zur Herstellung eines hepatitisfreien Gamma-Globulin-Präparats mit gleichzeitiger Beseitigung eventueller AGA-Verunreinigung vorgesehen, dadurch gekennzeichnet, dass in einer Lösung des Gamma-Globulins und im wesentlichen ohne Fällung des Gamma-Globulins ein stark adsorbierender Niederschlag gebildet und anschliessend von der Lösung getrennt wirdr.Therefore, these versions are particularly suitable for implementation of gamma globulin-containing material from hepatitis infected or suspect plasma fractions, with the method at the same time eliminates any infectivity that may be present or at least reduced. According to the invention is thus also a method for producing a hepatitis-free gamma globulin preparation with simultaneous removal of any AGA contamination, characterized in that in a solution of the gamma globulin and, essentially without precipitation of the gamma globulin, a strongly adsorbing precipitate is formed and then separated from the solution.

Bs ist vorteilhaft, dass sich eine solche Verfahrensweise leicht regulieren lässt. Es ist prinzipiell eine saubere Methode, die sich mit kleinen Heagenzmengen durchführen lässt, die man entweder so auswählen kann, dass sie überhaupt keine störende Verunreinigung im Endprodukt zurücklassen, oder die sich sonst leicht durch einen weiteren Verfahrensschritt beseitigen lassen. Dieses Fällungsverfahren lässt sich so durchführen, dass scharfe Trennungen erzielt werden, und nur geringe Mengen an wertvollen Bestandteilen verloren gehen· Besonders vorteilhaft ist die gleichzeitige Beseitigung von AGA und Hepatitisvirus.It is advantageous that such a procedure can be easily regulated. It's basically a clean method that can be carried out with small amounts of Heagenz, which can be either can choose so that they do not have any annoying contamination at all leave behind in the end product, or which can otherwise easily be eliminated through a further process step. This Precipitation process can be carried out so that sharp separations can be achieved, and only small amounts of valuable components are lost · Simultaneous is particularly advantageous Elimination of AGA and hepatitis virus.

Das Verfahren lässt sich z.B. so durchführen, dass in der wässrigen Lösung des Gamma-Globulins ein Niederschlag von Kalzium-,The process can be carried out, for example, in such a way that in the aqueous Solution of gamma globulin a precipitate of calcium,

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Aluminium- oder Ferriphosphat oder Mischphosphaten gebildet wird. Dies wird beispielsweise dadurch zustande gebracht, dass man in die bereits phosphationhaltige Lösung (z.B. Phosphatpuffer-Lösung) eine kleine Menge des entsprechenden Metallions, insbesondere in Form eines wasserlöslichen Salzes einführt. Aluminium lässt sich z.B. als Aluminiumchlorid oder Alaun verwenden. Dreiwertiges Eisen kann ebenfalls als Chlorid oder als Alaun verwendet werden und Kalziumion lässt sich z.B. als Kaliumchlorid einführen.Aluminum or ferrous phosphate or mixed phosphates is formed. This is achieved, for example, by adding to the solution that already contains phosphate ion (e.g. phosphate buffer solution) a small amount of the corresponding metal ion, especially in Introduces the form of a water-soluble salt. Aluminum can be Use e.g. as aluminum chloride or alum. Trivalent iron can also be used as chloride or as alum and calcium ion can be introduced as potassium chloride, for example.

Man kann auch unlösliche Zinn- bzw. Zinkphosphate in ahnlicher Weise für den gleichen Zweck bilden.One can also use insoluble tin or zinc phosphates in a similar way Make way for the same purpose.

Für den gleichen Zweck lässt sich auch ein in der Lösung gebildeter Bariumsulphat-Niederschlag verwenden.For the same purpose one can also use one formed in the solution Use barium sulphate precipitate.

Andere adsorptionsstarke Niederschläge für den erfindungsgemässen Zweck sind gewisse unlösliche Metallhydroxyde, wie Aluminiumhydroxyd, Ferrihydroxyd oder Zinnhydroxyd· Im allgemeinen werden jedoch die Phosphate bevorzugt, da diese Niederschläge im allgemeinen leichter hantierbar und weniger gelartig sind und zu geringeren Materialverlusten führen. Aluminiumhydroxyd bzw. Ferrihydroxyd Niederschläge lassen sich beispielsweise durch eine geringfügige pH-Erhöhung der Lösung in Gegenwart von Aluminium oder Ferrisalzen, z.B. durch Hinzufügen von Alkali, wie Natriumhydroxyd oder Ammoniak, erzielen.Other strong adsorptive precipitates for the inventive The purpose is certain insoluble metal hydroxides, such as aluminum hydroxide, Ferric hydroxide or tin hydroxide. In general, however, the phosphates are preferred, since these precipitates in general are easier to handle and less gel-like and lead to less material loss. Aluminum hydroxide or ferric hydroxide Precipitates can be created, for example, by slightly increasing the pH of the solution in the presence of aluminum or ferric salts, e.g. by adding an alkali such as sodium hydroxide or ammonia.

In gewissen Fällen lassen sich auch unlösliche Chelate als adsorptionskräftige Niederschläger verwenden, vorausgesetzt, dass diese eine genügend starke Adsorptivität besitzen um auch in kleinen Mengen ausreichend wirksam zu sein.In certain cases, insoluble chelates can also be used as adsorptive ones Use precipitators, provided that they have a sufficiently strong adsorptivity to also be used in small amounts to be sufficiently effective.

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■Vorzugsweise wird das Material mindestens zeitweilig während des Verfahrens massig angesäuert. So kann z.B. durch Hinzufügung von Aluminiumchlorid oder Alaun zur Gamma-Globulinlösung in Phosphatpuffer (pH 7,0) das pH der Lösung auf etwa pH k mit gleichzeitiger Bildung des Aluminium- "bzw. Ferriphosphat-Niederschlages gesenkt werden. Bei solchen pH-Werten werden die meisten Virustypen abgetötet, und ausserdem wird eine weitere vorteilhafte Wirkung erzielt, die weiter unten noch erläutert wird.The material is preferably moderately acidified at least temporarily during the process. For example, by adding aluminum chloride or alum to the gamma globulin solution in phosphate buffer (pH 7.0), the pH of the solution can be lowered to about pH k with simultaneous formation of the aluminum or ferric phosphate precipitate most virus types are killed, and in addition another beneficial effect is achieved, which will be explained further below.

Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich vorteilhaft auf nach dem Cohn-Fraktionierungsverfahren hergestellte Immuno-Globulin Fraktionen anwenden (z.B. Fraktion II oder die kombinierte Fraktion II und III dieses Verfahrens), um dadurch gleichzeitig sowohl eventuell vorhandenen Hepatitisvirus als auch ACA zu entfernen. The method according to the invention can advantageously be followed use immunoglobulin fractions prepared using the Cohn fractionation method (e.g. fraction II or the combined fraction II and III of this procedure) in order to simultaneously remove both any hepatitis virus and ACA that may be present.

Das Verfahren lässt sich aber auch vorteilhaft auf Iramuno-Globulin Fraktionen aus anderen Fraktionierverfahren anwenden, insbesondere auf die Behandlung von Immuno-Globulin-Konzentraten, die durch Plasmafraktionierung mit linearen, kettenförmig, ungeladenen Polymerverbindungen als Lösungshemmer,z.B. PEG mit einem Molekulargewicht zwischen 3 000 und 2D000, hergestellt wurden. Damit soll nicht gesagt sein, dass solche Immuno-Globulin-Fraktionen in Bezug auf Hepatitis tatsächlich unzuverlässig oder weniger zuverlässig sind als die nach dem Cohn-Verfahren hergestellten Fraktionen. Wegen der diesbezüglichen Unsicherheit bzw. Unkenntnis bestand jedoch bisher ein Vorurteil gegen die Verwendung von Plasmaprodukten, die nicht durch Cohn-Fraktionierung gewonnen waren·The method can also be used advantageously on Iramuno globulin Apply fractions from other fractionation processes, in particular to the treatment of immunoglobulin concentrates containing by plasma fractionation with linear, chain-like, uncharged Polymer compounds as dissolution inhibitors, e.g. PEG with a molecular weight between 3,000 and 2D,000. This is not to say that such immunoglobulin fractions are in fact unreliable or less reliable than those made by the Cohn process for hepatitis Factions. Due to the uncertainty or lack of knowledge in this regard, however, there has been a prejudice against its use so far of plasma products that were not obtained by Cohn fractionation

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Die Salze zur Herstellung des adsorptionskräftigen Niederschlages werden vorzugsweise in Salzkonzentrationen unter etwa · 5 g/100 ml, insbesondere unter 3 g/100 ml, angewandt. Ka"tonische Aluminiumsalze lassen sich z.B. in Konzentrationen von etwa zwischen 0,2 und 0,5 g Aluminiummetal pro 100 ml Lösung anwenden. The salts for the production of the strong adsorptive precipitate are preferably used in salt concentrations below approximately 5 g / 100 ml, in particular below 3 g / 100 ml. Ca "tonic Aluminum salts can be used, for example, in concentrations of between 0.2 and 0.5 g aluminum metal per 100 ml solution.

Falls das Salz Aluminium im Anion enthält, z.B. als Alaun, wird vorzugsweise eine Konzentration zwischen 0,O⁵+ und 0,1 g Aluminium pro 100 ml verwendet. Eine bevorzugte Konzentration für Kaliumalaun ist etwa 1 g/100 ml. Ferrialaun wurde in ähnlicher Weise erfolgreich verwendet, wonach man etwaige Ferrialaunspuren durch Dialyse entfernte.If the salt containing aluminum in the anion, such as alum, a concentration between 0, ⁵ + O and 0.1 g of aluminum per 100 ml is preferably used. A preferred concentration for potassium alum is about 1 g / 100 ml. Ferric alum has similarly been used successfully, after which any trace of ferric alum has been removed by dialysis.

Generell lassen sich Alaune in Konzentrationen zwischen etwa 0,01 und 0,0¹I- Gramm-Atomen des dreiwertigen Metalls im Alaunion pro Liter Lösung verwenden, wobei die Lösung beispielweise bis zu 10 g/100 ml, z.B. zwischen 2 und 7 g/100 ml, insbesondere h g/100 ml Gamma-Globulin enthält, in den bevorzugten Ausführungen des Verfahrens mit adsorptiven Niederschlägen führen zu einer mindestens teilweisen Umwandlung des Gamma-Globulins in lösliche, nicht-antikomplementäre, immunologisch aktive Assoziierungen, beispielsweise werden mindestens 10 Gew.% vorzugsweise mindestens 50 %,z.B. bis zu 70 oder 80 $, des Gamma-Globulins so umgewandelt..In general, alums can be used in concentrations between about 0.01 and 0.0 ¹ gram atoms of the trivalent metal in the alum per liter of solution, with the solution, for example, up to 10 g / 100 ml, e.g. between 2 and 7 g / 100 ml, in particular h g / 100 ml of gamma globulin, in the preferred embodiments of the process with adsorptive precipitates lead to an at least partial conversion of the gamma globulin into soluble, non-anti-complementary, immunologically active associations, for example at least 10 wt. % preferably at least 50 %, e.g. up to $ 70 or $ 80, of the gamma globulin so converted.

Die assoziierte Form des Gamma-Globulins kann, z.B. durch Gelfiltrierung oder PEIG-Fraktionierung weiter angereichert werden.The associated form of the gamma globulin can, for example, by gel filtration or PEIG fractionation can be further enriched.

Diese Präparate mit mindestens 10 Gew.$ des Gamma-Globulins inThese preparations contain at least 10% by weight of the gamma globulin in

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der nicht antikomplementären, immunologisch aktiven assosiierten Form sind neu und pharmazeutisch vorteilhaft. Sie bilden sich, wenn in der obenerwähnten Weise das pH der wässrigen Lösung durch Einführung des Aluminiumsalzes, z*B. Aluminiumchlorids oder Alauns oder anderer solcher Salze verringert wird. Insofern sich dabei auch geringe Mengen der antikomplementären Aggregate bilden (die gegebenenfalls durch die pH-Verringerung gleichzeitig entstehen könnten), werden diese auf dem adsorptionskräftigen Niederschlag selektiv adsorbiert und dadurch entfernt, sodass nur die gewünschten Gamma-Globulin-Verbindungen in Lösung bleiben.the non-anti-complementary, immunologically active associated form are new and pharmaceutically advantageous. They form if in the above-mentioned manner the pH of the aqueous solution by introducing the aluminum salt, z * B. Aluminum chloride or alum or other such salts is reduced. Insofar as small amounts of the anti-complementary aggregates are formed (the could possibly arise at the same time due to the reduction in pH), these are on the adsorptive precipitate selectively adsorbed and thereby removed, so that only the desired gamma globulin compounds remain in solution.

Die Erfindung umfasst auch Gamma-Globulin, das in der oben beschriebenen Weise verarbeitet wurde und zur Einspritzung in menschliche Patienten vorbereitet wurde, z.B. zur intravenösen Anwendung.The invention also includes gamma globulin described in the above Has been processed and prepared for injection into human patients, e.g. for intravenous use.

Da die erfindungsgemässe ACA-Beseitigung nicht von enzymatisehen oder anderen Abbaureaktionen Gebrauch macht, bleiben die Gamma-Globulin-Moleküle in den erfindungsgemäss hergestellten Präparaten im wesentlichen intakt.Since the ACA removal according to the invention cannot be seen from enzymatics or uses other degradation reactions, the gamma globulin molecules remain essentially intact in the preparations produced according to the invention.

Seispiel 1Example 1

Gamma-Globulin wird aus Blutplasma durch Fraktionierung mit PEG 6 000 folgendermassen hergestellt:Gamma globulin is produced from blood plasma by fractionation with PEG 6,000 as follows:

Plasma (6 Gramm pro 100 ml Protein) wird bei 10 Grad mit Ammoniumsulphat in einer Endkonzentration von 35 % der gesättigten Lösung und 3 Gew. % NaGl behandelt. Das Gemisch wird zentrifugiert und ergibt einen Niederschlag P 1 und eine überstehende Lösung S 1, die nicht weiter verwendet wird.Plasma (6 grams per 100 ml protein) is treated at 10 degrees with ammonium sulphate at a final concentration of 35% of the saturated solution, and 3 wt.% Nagl. The mixture is centrifuged and gives a precipitate P 1 and a supernatant solution S 1, which is no longer used.

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4% 2234063 4% 2234063

Der Niederschlag Pl wird in Phosphatpuff er ' (pH 7,0? 0,02M) gelöst in einer Konzentration von 3 Gew. %, hO g/100 ml PEG wird bei etwa 20⁰G hinzugefügt. Das Gemisch wird zentrifugiert und ergibt eine überstehende Flüssigkeit S2 als Abfallprodukt und einen Niederschlag P2. Der Niederschlag P2 wird in Azetatpuffer (pH *f,6; 0,02M) in einer Konzentration von 2,U- Gew.% gelöst. Diesmal werden 12,8 Gew.% PEG bei etwa 2O⁰C in dieThe precipitate is dissolved in Pl Phosphatpuff he '(pH 7.0? 0.02M) at a concentration of 3 wt.%, HO g / 100 ml PEG is added at about 20 ⁰ G. The mixture is centrifuged and gives a supernatant liquid S2 as a waste product and a precipitate P2. The precipitate P2 (f * pH, 6; 0.02M) in acetate buffer in a concentration of 2, U- wt.%. This time, 12.8 wt. % PEG at about 20 ⁰ C in the

Lösung gebracht. Das Gemisch wird wieder zentrifugiert und ergibt einen Niederschlag P3 und eine überstehende Lösung S3, deren pH auf 6,3, eingestellt wird, worauf die PEG Konzentration auf I¹* % erhöht wird. Dieses Gemisch wird zentrifugiert und ergibt eine überstehende Flüssigkeit S*f als Abfallprodukt und einen Niederschlag Vh, Der Niederschlag P^ wird in Phosphatpuffer (pH 7,0; 0,02M) in 3 Gew.^iger Konzentration gelöst und bis -8⁰C abgekühlt. Vorgekühltes Äthanol wird hinzugefügt, bis die Äthanolkonzentration 25 Volumen % beträgt, und das Gemisch wird bei -8⁰C zentrifugiert. Die tiberstehende Flüssigkeit SJ> ist Abfallprodukt, während der Niederschlag P5 ein gereinigtes Gamma-Globulin enthält, das gefriergetrocknet wird.Solution brought. The mixture is centrifuged again and gives a precipitate P3 and a supernatant solution S3, the pH of which is adjusted to 6.3, whereupon the PEG concentration is increased to I ¹ * % . This mixture is centrifuged to yield a supernatant S * f as a waste product and a precipitate Vh, the precipitate P ^ is in phosphate buffer (pH 7.0; 0.02M) dissolved in 3 wt ^ sodium concentration and to -8 ⁰ C. cooled down. Pre-chilled ethanol is added until the ethanol concentration of 25 volume%, and the mixture is centrifuged at -8 ^0C. The supernatant liquid SJ> is a waste product, while the precipitate P5 contains a purified gamma globulin which is freeze-dried.

Das gefriergetrocknete Gamma-Globulin wird wieder,bei Zimmer-· temperatur in Wasser gelöst, diesmal in Form einer 5 Gew. folgen Lösung. 31 g/100 ml Kochsalz werden hinzugefügt. Der leichte Niederschlag, der sich dabei bildet,wird abzentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wird dialysiert bis die Salzkönzentration auf. 0,85 % gesunken ist. Diese Gamma-Globulin-Lösung ist ACA-frei und kann sofort intravenös angewandt werden.The freeze-dried gamma globulin is again dissolved at room temperature · water, this time in the form of a 5 wt. Follow solution. 31 g / 100 ml of table salt are added. The slight precipitate that forms is centrifuged off and the supernatant liquid is dialyzed until the salt concentration rises. 0.85 % has decreased. This gamma globulin solution is ACA-free and can be used intravenously immediately.

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Beispiel 2Example 2

Fibrinogen und Gamma-Globulin werden aus Plasma wie folgt hergestellt: Fibrinogen and gamma globulin are made from plasma as follows:

Plasma mit 6 Gew.% Protein wird bei 1O⁰G Ammoniumsulphat (26$ der Sättigungskonzentration) behandelt. Das Gemisch wird zentrifugiert und ergibt einen Niederschlag Pl, der das Fibrinogen enthält und eine Überstehende Flüssigkeit Sl, die das Gamma-Globulin enthält.Plasma with 6 wt.% Protein is ^{treated with 10 0} g ammonium sulphate (26 % of the saturation concentration). The mixture is centrifuged and gives a precipitate P1 which contains the fibrinogen and a supernatant liquid S1 which contains the gamma globulin.

Der Niederschlag Pl wird in Zitrat-Kochsalzpuffer, pH 7,0, in einer Konzentration von 1 Gew. % gelöst. Eine Lösung von 55 % PEG in Phosphatpuffer (0,02 M, pH 7,0) wird hinzugegeben bis die Lösung ^,5 Gewe# PEG enthält. Die Tempertur beträgt 2O⁰C. Das Gemisch wird zentrifugiert und ergibt einen Niederschlag P 2 und eine überstehende Flüssigkeit S2, wovon letztere als Abfallprodukt anfällt. Aus dem Niederschlag P2 wird eine l$ige Lösung in Zitrat-NaCl Puffer, pH 7,0, hergestellt, die filtriert wird. Das Filtrat wird auf -3°C abgekühlt und mit auf -3⁰C gekühltem Äthanol bis zu einer Konzentration von 8 Volumen % versetzt. Durch Zentrifugieren enthält man einen Niederschlag P3 aus gereinigtem Fibrinogen der gefriergetrocknet wird·The precipitate is Pl pH 7.0, dissolved in citrate saline buffer at a concentration of 1 wt.%. A solution of 55 % PEG in phosphate buffer (0.02 M, pH 7.0) is added until the solution contains 1.5% by weight of PEG. The temperture is 2O ⁰ C. The mixture is centrifuged to yield a precipitate P 2 and a supernatant S2, the latter of which is obtained as a waste product. A liquid solution in citrate-NaCl buffer, pH 7.0, is prepared from the precipitate P2, which is filtered. The filtrate is cooled to -3 ° C and chilled to -3 ⁰ C ethanol to a concentration of 8 volumes of displaced%. Centrifugation gives a precipitate P3 of purified fibrinogen which is freeze-dried.

Die überstehende Flüssigkeit Sl, wird bei 20⁰C mit 35 g/100 ml Ammoniumsulphat versetzt. Durch zentrifugieren erhält man (als Abfallprodukt) die überstehende Flüssigkeit S3, sowie den Niederschlag Ρ¹*, der in einer Konzentration von 3 g/100 ml in Phosphatpuffer (pH 7,0; 0,02M) gelöst wird. Bei etwa 20⁰C wird PEG hinzugefügt, bis die endgültige PEG-Konzentration kO gAOO ml beträgt. Daraus ergibt sich durch Zentrifugieren eine überstehende35 g / 100 ml of ammonium sulphate are added to the supernatant liquid S1 at 20 ^{° C.} Centrifugation gives (as a waste product) the supernatant liquid S3 and the precipitate Ρ ¹ *, which is dissolved in a concentration of 3 g / 100 ml in phosphate buffer (pH 7.0; 0.02M). At about 20 ⁰ C PEG is added until the final PEG concentration kO Gaoo ml. Centrifugation results in a supernatant

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Flüssigkeit S h als Abfallprodukt, sowie der Niederschlag P5. Der Niederschlag P5 wird in einer Konzentration von 2,hg Protein pro 100 ml in Azetatpuffer (pH If,6; 0,2M) gelöst. Die Lösung .wird bei 20⁰C mit 12,8 g/100 ml PEG versetzt und zentrifugiert, wobei man den. Niederschlag P 6 (als Abfallprodukt) und die überstehende Flüssigkeit S|? erhält. Das pH der Flüssigkeit S5 wird auf 6,3 eingestellt. Die Lösung wird bei etwa 20⁰C mit PEG versetzt, bis die Konzentration l*f g/100 ml beträgt. Dieses Gemisch wird zentrifugiert und ergibt die überstehende Flüssigkeit S6 (Abfallprodukt) und einen Niederschlag P7» der in einer Konzentration von 3 g Protein pro 100 ml Phosphatpuffer (pH 7,0', 0,2M) gelöst wird. Man klärt die Lösung durch Zentrifugieren, kühlt auf -8⁰G ab und versetzt mit auf -8⁰C gekühltem Äthanol bis zu einer Äthanolkonzentration von 25 g/100 ml. Durch Zentrifugieren erhält man eine überstehende Flüssigkeit S 7 (Abfall produkt) und einen Niederschlag P8 von Gamma-Globulin, das gefriergetrocknet wird. Das gefriergetrocknete Gamma-Globulin wird dann mit Salz wie in Beispiel 1 weiter behandelt,Liquid S h as a waste product, as well as the precipitate P5. The precipitate P5 is dissolved in an acetate buffer (pH If, 6; 0.2M) at a concentration of 2. hg protein per 100 ml. The solution .wird at 20 ⁰ C with 12.8 g / 100 ml PEG and centrifuged, whereby the. Precipitation P 6 (as waste product) and the supernatant liquid S |? receives. The pH of the liquid S5 is adjusted to 6.3. PEG is added to the solution at about 20 ^° C. until the concentration is 1 * fg / 100 ml. This mixture is centrifuged and gives the supernatant liquid S6 (waste product) and a precipitate P7 »which is dissolved in a concentration of 3 g protein per 100 ml phosphate buffer (pH 7.0 ', 0.2M). The solution is clarified by centrifugation, cooled to -8 ⁰ G and mixed with ^{ethanol cooled to -8 0} C up to an ethanol concentration of 25 g / 100 ml. Centrifugation gives a supernatant liquid S 7 (waste product) and a Precipitate P8 of gamma globulin which is freeze-dried. The freeze-dried gamma globulin is then treated with salt as in Example 1,

Beispiel λExample λ

Nach dem Cryoäthanol-Verfahren hergestelltes Gamma-Globulin wird folgendermassen gereinigt;Gamma globulin produced by the cryoethanol process is cleaned as follows;

Man löst das Gamma-Globulin in einem Puffer (pH 6,3) in einer Konzentration von 3 g Gamma-Globulin pro 100 ml. Die Lösung wird mit festem PEG 6 000 versetzt, bis die Konzentration l*f g/100 ml beträgt. Der sich bildende Niederschlag wird abzentrifugiert und in Phosphatpuffer (pH 7,0) in einer Konzentration von 3 g Protein pro 100 ml gelöst und auf -8°C abgekühlt, wonach, das Gamma-Globulin mit Äthanol,wie in Beispiel 1, gefällt wird. Der Niederschlag wird gefriergetrocknet und weiter wie in Beispiel 1 mit Salz gereinigt. _ ₂₁ _ 209886/1137 The gamma globulin is dissolved in a buffer (pH 6.3) in a concentration of 3 g gamma globulin per 100 ml. Solid PEG 6,000 is added to the solution until the concentration is 1 * fg / 100 ml. The precipitate that forms is centrifuged off and dissolved in phosphate buffer (pH 7.0) at a concentration of 3 g protein per 100 ml and cooled to -8 ° C, after which the gamma globulin is precipitated with ethanol, as in Example 1 . The precipitate is freeze-dried and further purified as in Example 1 with salt. _ ₂₁ _ 209886/1137

Beispiel *fExample * f XtXt

Ein Handelsprodukt (aus USA) von nach dem Cohn-Verfahren hergestelltem Gamma-Globulin (Probe A) (Gamma-Globulin Konzentration 16 %) wurde auf h % verdünnt und mit 31 g NaCl pro 100 ml wie in Beispiel 1 behandelt. Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen Kochsalzlösung druckdialysiert bis das Volumen wieder auf ein Viertel verringert worden war und danach die ursprüngliche Proteinkonzentration (16 %) zurückerhalten worden war (Probe Al).A commercial product (from USA) of gamma globulin (sample A) (gamma globulin concentration 16 %) produced by the Cohn method was diluted to h% and treated as in Example 1 with 31 g of NaCl per 100 ml. The supernatant liquid was pressure-dialyzed against saline solution until the volume had been reduced to a quarter again and then the original protein concentration (16 %) had been restored (sample A1).

Eine weitere Probe eines in Natal nach dem Cohn-Verfahren hergestellten Gamma-Globulins (Probe B) wurde in gleicher V/eise behandelt ( Probe Bl),Another sample of one made in Natal using the Cohn method Gamma globulin (sample B) was treated in the same way (sample B1),

Ein weiteres Handelsprodukt eines nach dem Rivanol-Verfahren hergestellten Gamma-Globulins (Probe G) wurde in gleicher V/eise behandelt (Probe G 1). Another commercial product made by the Rivanol process Gamma globulins (sample G) were treated in the same way (sample G 1).

Ein Gamma-Globulin Handelsprodukt, das nach dem PolyäthylengIykol Fraktionierverfahren hergestellt worden war (Probe D) wurde ebenfalls in der gleichen Weise behandelt (Probe Dl),A gamma globulin commercial product, which according to the PolyäthylengIykol Fractionation process had been prepared (sample D) was also treated in the same way (sample Dl),

Sämtliche Proben, die alle die gleiche Gamma-Globulin-Konzentration von 16 % hatten, wurden dann auf antikomplementäre Aktivität durch identische Agglutinationstests mit folgendem Ergebnis geprüft: All samples, which all had the same gamma globulin concentration of 16 % , were then tested for anti-complementary activity by identical agglutination tests with the following result:

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Tabelle 1Table 1

Probesample 00 2 ■2 ■ ifif Verdünnungdilution 1616 3232 SifSif 128128 256256 sichtbarer Grad der Agvisible degree of Ag .If.If IfIf ifif 88th 33 22 22 00 OO UQ
$
et
Η·
O
0
* UQ
$
et
Η ·
O
0
* AA. IfIf MM. ifif 33 22 11 11 00 OO ^Al ^A l ifif ifif ifif 33 33 11 11 BB. IfIf ifif ifif ifif 22 11 11 00 OO ^Bl ^B l VV ifif ifif 33 hH 33 22 11 OO CC. IfIf 'if'if ifif IfIf 33 33 22 11 , O, O ⁰I- ⁰ I- IfIf 33 33 00 00 OO OO OO DD. 00 00 00 00 00 00 OO OO OO ^Dl ^D l 00

Hieraus ergibt sich folgendes:This results in the following:

In den Proben A und B fand durch Kochsalzbehandlung eine verhältnismässig geringe ACA-Verringerung statt. Im Falle der Probe G wurde durch Salzbehandlung alleine keine wesentliche Verbesserung erzielt· Probe D (durch PEG Fraktionierung hergestellt) hat von vorneherein eine wesentlich geringere antikomplementäre Aktivität als die übrigen Handels erzeugnisse, sowohl vor als auch nach der Salzbehandlung,hatten. Die Salzbehandlung der Probe D ergab eine völlige ACA-Beseitigung, innerhalb der Empfindlichkeitsgrenzen des Tests. 'In samples A and B, a proportion was found due to the treatment of common salt low ACA reduction instead. In the case of sample G no significant improvement was achieved by salt treatment alone · Sample D (prepared by PEG fractionation) has from from the outset a much lower anti-complementary activity than the rest of the trade, both before and after Salt treatment. The salt treatment of Sample D resulted in a complete ACA elimination, within the sensitivity limits of the test. '

209886/1137209886/1137

2H2H

Alle Ergebnisse liessen sich mit im wesentlichen gleichbleibenden Resultaten wiederholen· Die Ergebnisse wurden auch dadurch nachgeprüft, dass man die Niederschläge der Salzbehandlung jeweils wieder löste und auf AGA prüfte, und zwar mit positivem Ergebnis im Falle der Proben A, B und D, und mit negativem Ergebnis im Falle der Probe C.All results could be repeated with essentially the same results. The results were also thereby verified that one of the precipitates of the salt treatment respectively solved again and checked for AGA, with a positive result in the case of samples A, B and D, and with a negative result in the case of sample C.

Man sieht also, dass das PEG Fraktionierverfahren von vorneherein die Bildung von AGA in erheblichem linfange verhindert, wonach der restliche ACA-Gehalt völlig von Kochsalz ausfällbar ist.So you can see that the PEG fractionation process from the start prevents the formation of AGA to a considerable extent, after which the remaining ACA content can be completely precipitated from table salt.

Beispiel 5Example 5

Mit einem weiteren Handelsprodukt von nach dem Cohn-Verfahren hergestellten Gamma-Globulin, das mit Kochsalzlösung auf h % Gamma-Globulin verdünnt worden war, wurde folgendes festgestellt:With another commercial product of gamma globulin produced by the Cohn process, which had been diluted to h% gamma globulin with saline, the following was found:

1) Fällung mit 5 % PEG 6 000 und anschliessendes Zentrifugieren ergab eine so gründliche Fällung des ACA-Gehaltes, dass im anschliessend mit 12 % PEG gefällten Gamma-Globulin kein ACA durch Agglutination feststellbar war ( der ACA-Niederschlag liess sich zur Rückgewinnung des kopräzipitierten Gamma-Globulins verwenden).1) Precipitation with 5 % PEG 6,000 and subsequent centrifugation resulted in such a thorough precipitation of the ACA content that no ACA was detectable by agglutination in the gamma globulin precipitated with 12% PEG (the ACA precipitate could be used to recover the coprecipitated Use gamma globulins).

2) Weiterbehandlung mit 31 % NaGl ergab trotzdem noch einen Niederschlag in dem noch etwas AGA feststellbar war,2) Further treatment with 31 % NaGl still resulted in a precipitate in which some AGA was still detectable,

3) Als das gleiche Ausgangsmaterial auf h % verdünnt und mit 31 %■ NaCl versetzt wurde, ergab sich diesmal eine überstehende Flüssigkeiten der AGA so weitgehend veningert worden war, dass man sie3) When the same starting material was diluted to h% and mixed with 31 % NaCl, this time there was a supernatant liquid of the AGA that had been reduced to such an extent that it was reduced

nicht mehr feststellen konnte.could no longer determine.

209886/ 1 1 37209886/1 1 37

In diesem Fall entstand allerdings ein so schwerer Niederschlag, dass ein erheblicher Teil der wertvollen Proteine mitgefällt wurde,In this case, however, there was such a heavy rainfall, that a considerable part of the valuable proteins was also precipitated,

Beispiel 6Example 6

Eine umfangreiche Versuchsreihe wurde folgendermassen durchgeführt: Versuchsmaterial: An extensive series of tests was carried out as follows: Test material:

Nach dem Cryo-Äthanol-Verfahren vom Natal Blood Transfusion Service, Durban, Südafrikanische Eepublik, hergestelltes Immuno-Globulin wurde für die Versuche verwendet«Immuno-globulin made by the cryo-ethanol process by the Natal Blood Transfusion Service, Durban, South Africa was used for the experiments «

VerdünnungsmittelDiluents

Phosphatpuffer, 0,066 M, pH 7_t0 bzw. 6,5.Phosphate buffer 0.066 M, pH 7 _t 0 and 6.5.

Prote inkonzentration:Protein concentration:

•Das Gamma-Globulin wurde mit den jeweiligen Puffern auf h,2 g/ 100 ml verdünnt.• The gamma globulin was diluted to h, 2 g / 100 ml with the respective buffers.

Fällungsmitte1: - ■ . Precipitation agent1: - ■.

PEG 6 000 der Shell Chemical Company KapstadtShell Chemical Company Cape Town's PEG 6,000

Die folgenden Salze„ alle analytischer Beinheit« wurden ferner verwendet: ■ " The following salts "all analytical units" were also used: ■ "

Natriumchlorid, Ammoniumsulphat, Magnesiumsulphat (mit 6 Molekülen Kristallwasser), Aluminiumchlorid .6 ELO, Kaliumaluminiumsulphat , 12 H₉O (Alaun) und Kaliumferrisulphat . 2h H_o0 (Ferrit alaun)·Sodium chloride, ammonium sulphate, magnesium sulphate (with 6 molecules of crystal water), aluminum chloride .6 ELO, potassium aluminum sulphate, 12 H ₉ O (alum) and potassium ferric sulphate. 2h H _o 0 (ferrite alum)

2 Q a a a 6 /113 τ2 Q a a a 6/113 τ

Experimentelles: η/ Experimental: η /

Verwendung von PEGUse of PEG

PEG wurde fein vermählen und in die Lösung von Gamma-Globulin in Puffer bei pH 7,0,h g Protein pro 100 ml Lösung bei 2k°G hineingerührt. Unterhalb einer Konzentration von 5 g PEG pro 100 ml fand ■ praktisch keine Proteinfällung statt. Bei 5 g pro 100 ml bildete sich ein ziemlich kräftiger Niederschlag,der nach 30 Minuten abzentrifugiert wurde. Die klare überstehende Flüssigkeit wurde zurückgehalten während der Niederschlag wieder mit Puffer auf h % Proteingehalt verdünnt wurde. Diese Flüssigkeit wurde nochmals mit 5 % PEG versetzt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, in der ursprünglichen Puffermenge wieder gelöst und auf ACA titriert» Die erste und zweite überstehende Flüssigkeit wurden kombiniert und ' mit PEG versetzt bis die Proteinfällung vollständig war, was zwischen 15 und 20 % PEG der Fall war (je nach Temperatur), Nach 30 Minuten wurde das gefällte Gamma-Globulin als klebrige Paste abzentrifugiert und in der dem Ausgangsvolumen entsprechenden Puffermenge gelöst. Die Lösung wurde mit Ammoniumsulphatkristallen auf die halbe Sättigungskonzentration gebracht (38 g Ammoniumsulphat pro 100 ml Proteinlösung), Der Niederschlag wurde bei 15 000 χ g 20 Minuten lang abzentrifugiert. Der Proteinniederschlag hatte eine grössere Dichte als die konzentrierte Salzlösung und bildete auf dem Boden des Zentrifugenbehälters eine Paste, während die PEG-Reste auf der Oberfläche der konzentrierten Salzlösung trieben. Dadurch wurde das Gamma-Globulin von PEG befreit. Geringe Mengen Proteinniederschlag blieben an dem PEG haften und stiegen damit zur Oberfläche, Obwohl es sich dabei nur um kleine Mengen han-* delte, lohnte sich die Bttekgewinnung durch Sammlung der treibendenPEG was finely ground and stirred into the solution of gamma globulin in buffer at pH 7.0, h g protein per 100 ml solution at 2k ° G. Below a concentration of 5 g PEG per 100 ml there was practically no protein precipitation. At 5 g per 100 ml a fairly heavy precipitate formed which was centrifuged off after 30 minutes. The clear supernatant liquid was retained while the precipitate was again diluted to h% protein content with buffer. Another 5 % PEG was added to this liquid. The precipitate was centrifuged off, redissolved in the original amount of buffer and titrated for ACA. The first and second supernatant liquid were combined and PEG was added until the protein precipitation was complete, which was between 15 and 20 % PEG (depending on the temperature) After 30 minutes, the precipitated gamma globulin was centrifuged off as a sticky paste and dissolved in the amount of buffer corresponding to the initial volume. The solution was brought to half the saturation concentration with ammonium sulphate crystals (38 g ammonium sulphate per 100 ml protein solution). The precipitate was centrifuged off at 15,000 g for 20 minutes. The protein precipitate had a greater density than the concentrated salt solution and formed a paste on the bottom of the centrifuge container, while the PEG residues floated on the surface of the concentrated salt solution. This freed the gamma globulin from PEG. Small amounts of protein precipitate adhered to the PEG and thus rose to the surface. Although these were only small amounts, it was worthwhile to obtain the Bttek by collecting the floating

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Substanz und Mischung mit halbgesättigter Ammoniumsulphatlösung und nochmaliger Zentrifugierung. Der Proteinniederschlag wurde durch Dialyse gegen Puffer bzw. den im Endprodukt benötigten Elektrolyten von Ammoniumsulphat befreit.Substance and mixture with half-saturated ammonium sulphate solution and centrifugation again. The protein precipitate was obtained by dialysis against buffers or those required in the end product Electrolytes freed from ammonium sulphate.

Verwendung der Salze; . Use of the salts; .

NaCl ,(HH^)₂ SO₁₊ und Mg.SO₁₊.6H₂O. "NaCl, (HH ^) ₂ SO ₁₊ and Mg.SO ₁₊ .6H ₂ O. "

h %ige Gamma-Globulin Lösungen in 0,06M Phosphatpuffer (pH 7,0) wurden stufenweise mit den obengenannten Salzen versetzt* Die sich bildenden Niederschläge wurden abzentrifugiert. Hierzu sei bemerkt, dass für die Fällung gerade genug Salz verwendet wurde um eine Suspension zu bilden, die die Lösung gerade undurchsichtig machte, überschuss an Salz wurde vermieden. Die Niederschläge wurden wieder in Ο,ΟβΜ Phosphatpuffer (pH 7>0) gelöst und sowohl diese Lösungen als auch die Überstehende Flüssigkeit wurden durch Dialyse gegen grosse Volumen Phosphatpuffer entsalzt. H% gamma globulin solutions in 0.06M phosphate buffer (pH 7.0) were gradually mixed with the above-mentioned salts * The precipitates that formed were centrifuged off. It should be noted that just enough salt was used for the precipitation to form a suspension that just made the solution opaque; excess salt was avoided. The precipitates were again dissolved in Ο, ΟβΜ phosphate buffer (pH 7> 0) and both these solutions and the supernatant liquid were desalted by dialysis against large volumes of phosphate buffer.

Analytische Ultrazentrifugierung:Analytical ultracentrifugation:

Sämtliche Immuno-Globulin Fraktionen wurden in der Model E Ultrazentrifuge untersucht« In allen Fällen wurde versucht durch Einhaltung möglichst konstanter Volumen vergleichbare Ergebnisse zu erzielen. Die einzelnen Lösungen wurden 50 Minuten lang bei 56 100 Umdrehungen pro Minute (von der Erreichung der konstanten Rotorgeschwindigkeit an gerechnet) in Kochsalzlösung bei 20°C ultrazentrifugiert. Es wurden jeweils 2 Lösungen gleichzeitig zentrifugiert und zwar jeweils in der Keilfenster- und in der Flachfensterzelle. In den am Ende der Zeit fotografierten Sedimentationsdiagramtnen zeichneten sich die Ergebnisse der verschiedenen Behandlungen des Gamma-Globulins deutlich ab. Das uribehandelte Gamma-Globulin enthielt in erster Linie die S7 Komponente undAll immunoglobulin fractions were in the Model E ultracentrifuge investigated «In all cases an attempt was made to achieve comparable results by maintaining a volume that was as constant as possible achieve. The individual solutions were at for 50 minutes 56 100 revolutions per minute (from reaching the constant Rotor speed calculated) in saline solution at 20 ° C ultracentrifuged. Two solutions were centrifuged at the same time, in each case in the wedge window and in the Flat window cell. In the sedimentation diagrams photographed at the end of time the results of the various treatments of gamma globulin were clearly evident. That urbehandelte Gamma globulin primarily contained the S7 component and

209886/1137209886/1137

.etwa 15 % einer S 9 Fraktion. Das Diagramm für das Gamma- Globulin aus welchem ACA durch Magnesiumsulphatfällung im wesentlichen entfernt worden war, betrug die Oberfläche der Hauptspitze etwa die Hälfte der entsprechenden Spitze des unbehandelten Gamma-Globulins· Hler war die S9 Komponente praktisch verschwunden. Aus dem Diagramm für das NaCl behandelte Material ergab sich der gleiche Grad der Beseitigung der S9 Komponente wie für Magnesiumsulphat. Das Ergebnis mit Ammoniumsulphat deutete auch auf eine verhältnismässig umfangreiche Fällung der S7 Komponente hin. Mit Alaun und Aluminiumchlorid ergab sich eine quantitative Entfernung der S9 Komponente in beiden Fällen. Die S? Komponente wurde vom Alaun praktisch unverändert zurückgelassen, während Aluminiumchlorid (bei etwas geringerem pH-Wert) eine besondere Art der Assoziation und des Gamma-Globulins verursachte (siehe weiter unten)..approximately 15 % of an S 9 fraction. In the diagram for the gamma globulin from which ACA had been essentially removed by magnesium sulphate precipitation, the surface of the main peak was about half the corresponding peak of the untreated gamma globulin. The S9 component had practically disappeared. The diagram for the NaCl treated material showed the same degree of elimination of the S9 component as for magnesium sulphate. The result with ammonium sulphate also indicated a relatively extensive precipitation of the S7 component. With alum and aluminum chloride, the S9 component was removed quantitatively in both cases. The S? Component was left practically unchanged by the alum, while aluminum chloride (at a slightly lower pH value) caused a special kind of association and gamma globulin (see below).

Die Sedimentationsdiagramme des Gamma-Globulins nach Entfernung der mit 5 % PEG fällbaren Fraktion, sowie des Extraktionsproduktes aus dem Niederschlag mit 5 % PEG wurden ebenfalls hergestellt. Letzteres erwies sich als hauptsächlich aus Gamma-Globulin bestehend mit einem sehr geringen Gehalt an S9 Komponente. Bei der Rückgewinnung entstanden gewisse Verluste. Im Präzipitat waren sowohl 37 als S9 Komponenten in geringerer Konzentration vorhanden.The sedimentation of the gamma globulin after removal of precipitated with 5% PEG fraction, as well as the extraction product of the precipitate with 5% PEG were also prepared. The latter turned out to be mainly composed of gamma globulin with a very low content of the S9 component. Certain losses were incurred in the recovery process. Both 37 and S9 components were present in lower concentrations in the precipitate.

Die Sedimentationsdiagramme der mit Magnesiumsulphat und Natriumchlorid gefällten Fraktionen zeigten einen geringen Gehalt an S9 Komponente. Die Sedimentationsdiagramme der Extrakte der mit Aluminiumchlorid und Alaun erhaltenen Niederschläge enthielten keine S9 Komponente, während die S7 Komponente normal erschien.The sedimentation diagrams of those with magnesium sulphate and sodium chloride precipitated fractions showed a low content of S9 component. The sedimentation diagrams of the extracts with aluminum chloride and alum contained no S9 component, while the S7 component appeared normal.

209886/ 1 1 37 • - 28 - 209886/1 1 37 • - 28 -

Tabelle 2Table 2

Entfernung von ACA aus menschlichem Gamma-Globulin (Immuno-Globulin) ( h,2% Proteingehalt).Removal of ACA from human gamma globulin (immuno globulin) ( h, 2% protein content).

FällungsmittelPrecipitants

^-Rückgewinnung des
totalen Protein^ - recovery of the
total protein

AGAAGA

PEG 5 g/100 ml ( 2 ml mitPEG 5 g / 100 ml (2 ml with

5 % PEG gefällt AGA Material ACA freies Material5 % PEG like AGA material ACA free material

Gesättigtes Kochsalz ACA Material ACA freies MaterialSaturated table salt ACA material ACA free material

1+0 g/100 ml MgS auf k-,6 H. ACA Material ^c 1 + 0 g / 100 ml MgS on k-, 6 H. ACA material ^c

ACA freies MaterialACA free material

^SO^ 17.5 g/100 ml^ SO ^ 17.5 g / 100 ml

ACA Material ACA freies MaterialACA material ACA free material

AlCl₃.6H₂O lg/100 ml ' ACA Material ACA freies MaterialAlCl ₃ .6H ₂ O lg / 100 ml 'ACA material ACA free material

Alaun Ig/ 100 ml ACA Material ACA freies MaterialAlum Ig / 100 ml ACA material ACA free material

Ursprüngliches Gamma-Globulin ·
(l+,2 g/100 ml Protein)Original gamma globulin
(l +, 2 g / 100 ml protein)

30
7030th
70

50,8
M-9,250.8
M-9.2

1+6,0
-70,31 + 6.0
-70.3

86
1686
16

61+ 161+ 1

6k 1 6k 1

32 032 0

nicht ausgeführt 1not executed 1

nicht ausgeführt 0not executed 0

100100

5 Gew.# PEG 6 000 fällte das ACA quantitativ aus einer 1+,2 $igen Gamma-Globulin-Lösung. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Gamma-Globulin Konzentrationen von 5 % und 6 % erzielt·The ACA quantitatively precipitated 5% by weight of # PEG 6,000 from a 1+, 2% gamma globulin solution. Similar results were obtained with gamma globulin concentrations of 5 % and 6 %

Das mit dem ACA Material kopräzipitierte Gamma-Globulin lässt sich durch Umfällung rückgewinnen, wie bereits weiter oben erläutert wurde. 209886/1137 The gamma globulin coprecipitated with the ACA material can be recovered by reprecipitation, as has already been explained above . 209886/1137

NaGl bewirkt eine erhebliche ACA-Befreiung, bringt aber auch erhebliche Gamma-Globulin Verluste mit sich. Ähnliche Verluste entstanden mit Ammoniumsulphat bei einer etwas geringeren ACA-Befreiung. NaGl causes considerable ACA exemption, but also brings considerable benefits Gamma globulin losses with it. Similar losses occurred with ammonium sulphate with a slightly lower ACA exemption.

Mit Magnesiumsulphat ist die ACA-Befreiung sehr gut, doch finden auch hohe Gamma-Globulin-Verluste statt. Trotzdem sind die, mit den verschiedenen Salzen beobachteten Materialverluste nicht höher als die Verluste, die im menschlichen Körper zwischen der herkömmlichen intramuskulären Einspritzung und der Aufnahme des Gamma-Globulins in den Blutstrom stattfinden.With magnesium sulphate, the ACA exemption is very good, but find it high gamma globulin losses also take place. Still they are, with The material losses observed in the various salts are not higher than the losses in the human body between the conventional ones intramuscular injection and uptake of the gamma globulin into the bloodstream.

Die Fällung von ACA mit Alaun bzw. Aluminiumchlorid war am wirksamsten, da nur sehr geringe Salzkonzentrationen zur Erzielung der gewünschten Wirkung benötigt wurden. In Gegenwart des Phosphat-Puffers bildete sich ein Niederschlag worin das denaturierte Protein selektiv kopräzipitiert wurde· Gleichzeitig fand eine Verringerung des pH-Wertes statt. Bei einer Verringerung des pH-Wertes auf etwa pH h- ergab sich die zusätzliche Wirkung der Entstehung löslicher assoziierter Formen des Gamma-Globulins, die keine antikomplementäre Wirkung hatten und deshalb therapeutisch den Vorteil bieten, dass mit deren Kombination mit dem entsprechenden Antigen die Phagocytose leichter stattfindet als mit der Kombination des Antigens und dem entsprechenden monomeren Immuno-Globulin. Da die mit Aluminiumsalzen gebildeten Niederschläge das denaturierte Immuno-Globulin einschliesslich der S9 Komponente selektiv adsorbieren, sollten diese Salze zur Entfernung von ACA den Übrigen untersuchten Salzen Überlegen sein.The precipitation of ACA with alum or aluminum chloride was most effective, since only very low salt concentrations were required to achieve the desired effect. In the presence of the phosphate buffer, a precipitate formed in which the denatured protein was selectively coprecipitated. At the same time, the pH was reduced. When the pH value was reduced to about pH h- , the additional effect of the formation of soluble, associated forms of gamma globulin, which had no anti-complementary effect and therefore offer the therapeutic advantage that their combination with the corresponding antigen, facilitates phagocytosis takes place as with the combination of the antigen and the corresponding monomeric immunoglobulin. Since the precipitates formed with aluminum salts adsorb the denatured immunoglobulin including the S9 component selectively, these salts should be superior to the other salts examined for removing ACA.

209886/1137209886/1137

Beispiel 7Example 7

Im Verfahren gemäss Beispiel 6 wurde 2 g/100 ml Ferrialaun anstelle von Aluminiumalaun verwendet. Nach gründlicher Entfernung des Ferrialauns aus dem gereinigten Gamma-Globulin durch Dialyse, waren die Ergebnisse ähnlich wie für Aluminiumalaun,In the method according to Example 6, 2 g / 100 ml Ferrialaun was used instead used by aluminum alum. After thorough removal of the ferric alum from the purified gamma globulin by dialysis, were the results similar to those for aluminum alum,

Beispiel 8Example 8

Man löst nach den Cryoäthanol-Verfahren (Cbhn-Verfahren) hergestelltes Gamma-Globulin in 3,75 #iger Konzentration in 0,05M Phosphatpuffer (pH 6,5). Die Lösung wird mit 1 Gew·^ Alaun ver- ■ setzt. Der sich bildende Niederschlag wird abzentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wird gegen Phosphatpuffer 0,066M (pH 7,2) 16 Stunden lang dialysiert. Der geringe Niederschlag wird bei 500 χ g 20 Minuten abzentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dann 16 Minuten lang bei 53 000 χ g im Schleuderkübelzentrifugenrotor ultrazentrj-fugiert, und die sich darin absetzende kleine Pille wird gründlich elektronmikroskopiseh (nach negativem Anfärben mit Phosphorwolframsäure) untersucht. Mit dieser sehr empfindlichen Untersuchungsmethode liess sich kein australisches Antigen oder Hepatitisvirus im Produkt feststellen. Das Produkt ist ferner ACA frei.Dissolves what is produced by the cryoethanol process (Cbhn process) Gamma globulin in 3.75% concentration in 0.05M phosphate buffer (pH 6.5). The solution is mixed with 1% by weight of alum puts. The precipitate that forms is centrifuged off and the supernatant liquid is treated against phosphate buffer 0.066M (pH 7.2) Dialyzed for 16 hours. The low rainfall is at 500 χ g centrifuged for 20 minutes. The supernatant liquid is then centrifuged for 16 minutes at 53,000 g in a centrifugal bucket ultra-centric, and the little one that settles in it The pill is examined thoroughly by means of an electron microscope (after negative staining with phosphotungstic acid). With this very sensitive The test method did not reveal any Australian antigen or hepatitis virus in the product. The product is further ACA free.

Beispiel 9Example 9

Der Versuch gemäss Beispiel 8 wurde wiederholt nachdem das Gamma-Globulin mit einem Konzentrat von australischem Antigen versetzt worden war. Es konnte kein australisches Antigen im Endprodukt festgestellt werden. Das Antigen war also quantitativ entfernt worden.The experiment according to Example 8 was repeated after the gamma globulin a concentrate of Australian antigen had been added. There could be no Australian antigen in the final product to be established. The antigen had thus been removed quantitatively.

209886/1137209886/1137

Beispiel 10 ** * Example 10 ** *

Beispiel 8 wurde mit einer durch PEG-Fraktionierung gewonnenen Gamma-Globulin-Probe wiederholt. Es konnte kein australisches Antigen festgestellt werden und das Produkt war auch ACA-frei.Example 8 was obtained with a PEG fractionation Repeated gamma globulin sample. It couldn't have an Australian antigen and the product was also ACA-free.

Beispiel 11Example 11

Beispiel 8 wurde wiederholt, wobei statt Aluminiumalaun 2 g/100 ml Ferrialaun oder lg/100 ml Aluminiumchlorid verwendet wurden. In beiden Fällen konnte kein australisches Antigen oder Hepatitisvirus im Endprodukt festgestellt werden. Das Endprodukt war ACA-frei,Example 8 was repeated, with 2 g / 100 ml instead of aluminum alum Ferrialaun or 1g / 100 ml aluminum chloride were used. In either case, no Australian antigen or hepatitis virus could be found can be found in the end product. The end product was ACA-free,

Beispiel 12Example 12

Beispiel 8 wurde mit 2 % Kalziumchlorid wiederholt zur Bildung eines Niederschlages von Kalziumphosphat mit ähnlichem Ergebnis.Example 8 was repeated with 2% calcium chloride to form a precipitate of calcium phosphate with a similar result.

Beispiel 13 · . - Example 13 ·. -

Beispeil 8 wurde mit 1 % Aluminiumchlorid in der ungepufferten Gamma-Globulin-Lösung wiederholt, die dann mit etwas Natriumhydroxyd versetzt wurde, gerade genug, um einen Aluminiumhydroxydniederschlag zu bilden. Auch diesmal konnte kein australisches Antigen, kein Hepatitisvirus und kein ACA im Endprodukt festgestellt werden,Example 8 was repeated with 1% aluminum chloride in the unbuffered gamma globulin solution, to which a little sodium hydroxide was then added, just enough to form an aluminum hydroxide precipitate. Again, no Australian antigen, no hepatitis virus and no ACA could be found in the end product,

Beispiel l*fExample l * f

Man nehme 20 ml einer ^folgen handelsüblichen durch elektrodekandation hergestellten Gamma-Globulin-Lösunf, die zunächst ·Take 20 ml follow a ^ standard by elektrodekandation produced gamma globulin Lösunf that initially ·

2 09886/11372 09886/1137

gegen Kochsalz dialysiert wird. Man versetzt mit Natriumbikarbonat bei Zimmertemperatur bis die Endkonzentration 0,1 N beträgt. Fein vermahlene Kristalle von Aluminiumchlorid werden hineingerührt bis pH 5»2 erreicht wird. Der gebildete Niederschlag wird abzentrifugiert. Die Überstehende Flüssigkeit ist ACA-frei und enthält kein australisches Antigen.dialyzed against common salt. Sodium bicarbonate is added at room temperature until the final concentration is 0.1 N. Finely ground crystals of aluminum chloride are stirred into it until pH 5 »2 is reached. The precipitate formed will centrifuged off. The supernatant fluid is ACA-free and does not contain any Australian antigen.

Beispeil 15 · Example 15

Beispiel Ik wird wiederholt mit dem gleichen Ergebnis nachdemExample Ik is repeated with the same result after

man 0,1 mg australisches Antigen in der dlalysierten Gamma-Globulin-Lösung gelöst hatte.0.1 mg of Australian antigen in the dlalyzed gamma globulin solution had solved.

Beispiel 16Example 16

Beispiel I¹+ wird mit ähnlichem Ergebnis mit einem handelsüblichen durch Cryoäthanol hergestellten Gamma-Globulin durchgeführt.Example I ¹ + is carried out with a commercially available gamma globulin produced by cryoethanol with a similar result.

Beispiel 17Example 17

Beispiel lh wird mit Alaun statt mit Aluminiumchlorid mit ähnlichem Ergebnis wiederholt.Example 1h is repeated with alum instead of aluminum chloride with a similar result.

2Ό9886/1 1372,9886 / 1 137

Claims (1)

PatentansprücheClaims 1, Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Gamtaa-GlobulinPräparats, im wesentlichen frei von Antikomplementäraktivität (ACA) aus einem natürlichen gamraa-globulinhaltigen Ausgangsmaterial, insbesondere Plasma, durch Fraktionierung und selektive Fällung von AGA und, gegebenenfalls gleichzeitige Fällung von Hepatitisvirus bzw. Antigen, dadurch gekennzeichnet, dass nach der eigentlichen Fraktionierung des Ausgangsmaterials zur Befreiung des Gamma-Globullns von andersartigen Proteinen eine weitere Trennung zur ACA-Entfernung aus einer wässrigen Lösung des Gamma-Globulins durchgeführt wird, wobei das Gamma-Globulin selbst in Lösung bleibt, durch Zugabe mindestens eines lösungshetnmenden Mittels, nämlich eines wasserlöslichen Salzes und/oder einer linearen, kettenförmigen, ungeladenen Polymer-Verbindung, wobei letztere in einer Konzentration verwendet wird, deren lösungshemmenda Wirkung im wesentlichen dieselbe ist, wie die von k,5 bis 7g/100 ml Polyäthylenglykol (PKG) mit Molekulargewicht zwischen h 000 und 8 000, und die wässrige Lösung im letzteren Fall mindestens 3g/100 ml Gamma-Globulin enthält.1, a process for the production of a purified Gamtaa globulin preparation, essentially free of anti-complementary activity (ACA) from a natural gamraa globulin-containing starting material, in particular plasma, by fractionation and selective precipitation of AGA and, optionally, simultaneous precipitation of hepatitis virus or antigen, characterized that after the actual fractionation of the starting material to free the gamma globulin from proteins of a different type, a further separation for ACA removal from an aqueous solution of the gamma globulin is carried out, the gamma globulin itself remaining in solution by adding at least one solution inhibitor agent, namely a water-soluble salt and / or a linear chain-like, uncharged polymer compound, the latter being used in a concentration whose lösungshemmenda effect substantially the same as that of k, 5 to 7 g / 100 ml polyethylene glycol (PKG) with molecular weight between h 000 and 8 000, and in the latter case the aqueous solution contains at least 3 g / 100 ml of gamma globulin. 2« Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gamma-Globulin-Konzentration der wässrigen Lösung zwischen ^- und 10g/100 ml beträgt·2 «The method according to claim 1, characterized in that the gamma globulin concentration of the aqueous solution between ^ - and 10g / 100 ml is 3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine wässrige Lösung verwendet wird, die mindestens 5 g/10i) ml Gamma-Globulin enthält.3. The method according to claim 2, characterized in that an aqueous solution is used which contains at least 5 g / 10i) ml of gamma globulin. 209886/1137209886/1137 *+. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-3» dadurch gekennzeichnet, dass als lösungshemmendes Mittel eine lineare, kettenförmige, ungeladene Polymerverbindung verwendet und die ACA-haltige unlösliche Fraktion wieder in Lösung gebracht und darin enthaltenes mitgeschlepptes Gamma-Globulin durch weitere Fällung wieder gewonnen wird. .* +. Method according to one of claims 1-3 »characterized in that that a linear, chain-shaped, uncharged polymer compound is used and the ACA-containing insoluble fraction is brought back into solution and contained therein entrained gamma globulin again through further precipitation is won. . 5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 - *+, dadurch gekennzeichnet, dass als Lösungshemmer zur Fällung von ACA ein Polyalkylenglykol mit Molekulargewicht zwischen 3 000 und 20 000 verwendet wird· ■5. The method according to any one of claims 1 - * +, characterized in that a polyalkylene glycol is used as a solution inhibitor for the precipitation of ACA with molecular weight between 3,000 and 20,000 is used · ■ 6. Verfahren gemäss Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, dass als Polyalkylenglykol ein Polymerisat verwendet wird, das von monomeren Alkylenglykolen mit zwischen 2 und h Kohlenstoffatomen abgeleitet ist, bzw. ein Mischpolymerisat solcher Monomerverbindungen miteinander, bzw. ein Gemisch solcher polymerer Verbindungen.6. The method according to claim 5 »characterized in that a polymer is used as the polyalkylene glycol which is derived from monomeric alkylene glycols with between 2 and h carbon atoms, or a copolymer of such monomer compounds with one another, or a mixture of such polymeric compounds. 7. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass ausser der Fällung von ACA mit einer linearen, kettenförmigen, nicht geladenen Polymerverbindung eine weitere Fällung von ACA durch Hinzugabe eines wasserlöslichen Salzes durchgeführt wird.7. The method according to any one of claims 1-6, characterized in that that in addition to the precipitation of ACA with a linear, chain-like, uncharged polymer compound, another Precipitation of ACA carried out by adding a water-soluble salt will. 8. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-7» dadurch gekennzeichnet, dass Kochsalz zur selektiven Lösung von ACA aus der wässrigen Lösung in einer Salzkonzentration von zwischen 25 g/100 ml und der Sättigungskonzentration verwendet wird..8. The method according to any one of claims 1-7 »characterized in that common salt for the selective solution of ACA from the aqueous solution with a salt concentration of between 25 g / 100 ml and the saturation concentration is used. 209886/1137209886/1137 ^3(f . 2234063 ^{3 (f} . 2234063 9. Verfahren gemäss einem der Ansprüche* 1-7» dadurch gekennzeichnet, dass in die wässrige Lösung ein wasserlösliches Salz eingeführt wird, das in der Lösung durch Reaktion mit anderen Ionen einen adsorbierenden Niederschlag bildet, worin AGA kopräzipitiert wird.9. The method according to any one of claims * 1-7 »characterized in that that a water-soluble salt is introduced into the aqueous solution, which is in the solution by reaction with others Ions forms an adsorbent precipitate in which AGA is coprecipitated. 10. Verfahren gemäss Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, dass10. The method according to claim 9 »characterized in that zur Bildung des Niederschlages ein mit Gamma-Globulin verträgliches, wasserlösliches Salz eines dreiwertigen Metalles verwendet wird.for the formation of the precipitate a compatible with gamma globulin, water-soluble salt of a trivalent metal is used. 11. Verfahren gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Aluminiumsalz oder Ferrisalz verwendet wird.11. The method according to claim 10, characterized in that an aluminum salt or ferric salt is used. 12. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 9 - H, dadurch gekennzeichnet, dass der adsorbierende Niederschlag durch Reaktion mit Phosphationen unter Bildung unlöslicher, bzw. schwer löslicher Phosphate gebildet wird«12. The method according to any one of claims 9 - H, characterized in that that the adsorbing precipitate reacts with phosphate ions to form insoluble or sparingly soluble Phosphate is formed " 13. .Verfahren gemäss Anspruch 9 und 12, dadurch gekennzeichnet, dass als adsorbierender Niederschlag zur Entfernung von aCA aus der wässrigen Lösung Kalziumphosphat gebildet wird.13. .The method according to claims 9 and 12, characterized in that that calcium phosphate is formed as an adsorbent precipitate to remove aCA from the aqueous solution. Ik-. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 9-13, dadurch gekennzeichnet, dass das Salz in einer Salzkonzentration von weniger als 3 g/100 ml verwendet wird. Ik-. A method according to any one of claims 9-13, characterized in that the salt is used in a salt concentration of less than 3 g / 100 ml. 15· Verfahren gemäss Anspruch I¹+, dadurch gekennzeichnet, dass ein kationisches Alurainiumsalz verwendet wird in einer Konzentration zwischen 0,2 und 0,5 g Aluminium /100 ml Lösung.15. Method according to claim I ¹ +, characterized in that a cationic alurainium salt is used in a concentration between 0.2 and 0.5 g aluminum / 100 ml solution. 209886/1137209886/1137 22340892234089 16, Verfahren gemäss einem der Ansprüche 9-12, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bildung des adsorbierenden Niederschlages ein Alaun in einer Konzentration von zwischen 0,01 und O,Qlf Gramm-Atome des dreiwertigen Metalles des Alaunions pro Liter der Lösung verwendet wird,16, method according to any one of claims 9-12, characterized characterized in that the formation of the adsorbent precipitate an alum in a concentration of between 0.01 and 0.1 gram-atoms of the trivalent metal of the alum per Liter of the solution is used, 17, Verfahren gemäss einem der Ansprüche 9-12, dadurch ge-" kennzeichnet, dass Aluminiumalaun in einer Konzentration von zwischen 0,0*f und 0,1.g Aluminium pro 100 ml Lösung verwendet wird.17, method according to one of claims 9-12, characterized in that " indicates that aluminum alum is used in a concentration of between 0.0 * f and 0.1 g aluminum per 100 ml solution. 18, Verfahren gemäss einem der Ansprüche 9 -17, dadurch' gekennzeichnet, dass die Fällung in einer wässrigen Lösung stattfindet, die zwischen 2 und 7 g Gamma-Globulin pro 100 ml enthält. 18. The method according to any one of claims 9-17, characterized in that the precipitation takes place in an aqueous solution which contains between 2 and 7 g of gamma globulin per 100 ml. 19· Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 -.18, dadurch gekennzeichnet, dass darin ein aus Blutplasma durch Cryoäthanol Fraktionierung bereitetes Gamma-Globulin verwendet wird,19 · Method according to one of claims 1 to 18, characterized in that that it uses a gamma globulin prepared from blood plasma by cryoethanol fractionation, 20. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 - 18, dadurch gekennzeichnet, dass die AGA-Abtrennung an einem Gamma-Globulin durchgeführt wird, das aus Blutplasma durch Fraktionierung bzw, unter Fraktionierung des Plasmas mittels eines linearen, kettenförmigen, ungeladenen polymeren Lösungshetnmungsmittels bereitet wurde,20. The method according to any one of claims 1-18, characterized in that that the AGA separation is carried out on a gamma globulin is extracted from blood plasma by fractionation or, with fractionation of the plasma by means of a linear, chain-shaped, uncharged polymeric solvent has been prepared, 21, Anwendung des Verfahrens gemäss einem der Ansprüche 9-18 auf die Herstellung eines hepatitisfreien Gamma-Globulin -Präparats aus einem hepatitisinfizierten bzw. verdächtigen Plasmamaterial.21, application of the method according to any one of claims 9-18 on the production of a hepatitis-free gamma globulin preparation from a hepatitis-infected or suspicious plasma material. 886/1137886/1137 22, Verfahren gemäss einem der Ansprüche 9-18, dadurch gekennzeichnet, dass das Gamma-Globulin mindestens teilweise in eine lösliche, nicht antikomplementäre, immunologisch aktive, assoziierte Form umgewandelt wird.22, the method according to any one of claims 9-18, characterized in that that the gamma globulin is at least partially converted into a soluble, non-anticomplementary, immunologically active, associated shape is converted. 23, Verfahren gemäss Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 10 Gew.$ des Gamma-Globulins so umgewandelt werden.23, the method according to claim 22, characterized in that at least 10% by weight of the gamma globulin are converted in this way. 2k. Verfahren gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 50 % des Gamma-Globulins so umgewandelt werden. 2k. Process according to claim 23, characterized in that at least 50 % of the gamma globulin is converted in this way. 25t Verfahren gemäss einem der Ansprüche 22 bis 2¹+, dadurch gekennzeichnet, dass die assoziierte Form des Gamma-Globulins weiter angereichert wird.25t A process according to any one of claims 22 to 2 ¹ +, characterized in that the associated form of the gamma-globulin is further enriched. 26. Verfahren zur Herstellung eines hepatitisfreien Gamma-Globulin Präparats mit gleichzeitiger Beseitigung eventueller ACA-Verunreinigung, dadurch gekennzeichnet, dass in einer Lösung des Gamma-Globulins und,im wesentlichen ohne Fällung des Gamma-Globulins selbst, ein stark adsorbierender Niederschlag gebildet und anschliessend von der Lösung/getrennt wird.26. Process for the preparation of a hepatitis-free gamma globulin Preparation with simultaneous removal of any ACA contamination, characterized in that it is in a solution of gamma globulin and, essentially without precipitation, of gamma globulin itself, a strongly adsorbing precipitate is formed and then separated from the solution /. 27. Anwendung des Verfahrens, gemäss Anspruch 1-26 auf die Herstellung von Gamma-Globulin in intravenös einspritzbarer Form.27. Application of the method according to claims 1-26 to the Manufacture of gamma globulin in intravenous injectable form. 28. Gamma-Globulin Präparat, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 10 Gew./6 des Gamma-Globulins in einer nicht antikoiriple- mentären, immunologisch aktiven, assoziierten Form vorliegen,28. Gamma globulin preparation, characterized in that at least 10 wt./6 of the gamma globulin is present in a non- antikoiriple, immunologically active, associated form, 209886/1137209886/1137 29· Präparat gemäss Anspruch. 28, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ^O Gew. % des Gamma-Globulins in der assoziierten Form vorliegen.29 · Preparation according to claim. 28, characterized in that at least ^ O wt.% Of the gamma-globulin present in the associated form. 30* Gamma-Globulin Präparat gemäss Anspruch 28 und 29 in einspritzbarer Form. .30 * gamma globulin preparation according to claim 28 and 29 in injectable form. . 209886/1 137209886/1 137