DE2158827C3

DE2158827C3 - Mittel zur Qualitätsbewertung mikrobio logischer Wachstumsmedien

Info

Publication number: DE2158827C3
Application number: DE2158827A
Authority: DE
Inventors: Ronald Freake; Billy Harper Haden
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1970-11-27
Filing date: 1971-11-26
Publication date: 1973-09-27
Also published as: GB1377618A; FR2116110A5; AU3550871A; AR192595A1; ZA717538B; DE2158827A1; DE2158827B2; HU164476B; ES397274A1

Description

Die Erfindung betrifft Mittel zur Qualitätsbewertung mikrobiologischer Wachstumsmcdicii. Die Mittel enthalten auf einer mikroporösen Membran eine Kombination einer vorher bestimmten Konzentration von einem oder mehreren spezifischen Kolonien bildenden Mikroorganismen und ein mikrobiologisch inertes kolloidales Suspensionsmittel. Bei der Anwendung werden clese Mittel mit dem zu untersuchenden System zusammen;'.ebrac^K·, unter Standardbedingungen inkubiert und d'<Q Anzahl der gebildeten Kolonien bzw. das Ergebnis mit de erwarteten Anzahl oder dem erwarteten Ergebnis verglichen.

Die Mikrobiologie leidet, obwohl sie der älteste Zweig der laboratoriumsmäßigen Medizin ist, noch an mangelnder Genauigkeit. Zum Beispiel variiert bei einem Kulturmedium die Substanz, die als Nährstolf für das laboratoriumsmäßige Wachstum und die Vermehrung von Mikroorganismen verwendet wird, in einem weiten Bereich, sowohl in Beziehung auf ihre Zusammensetzung als auf seine Wirksamkeit. Was die bekannten Verfahren zur Qualitätsbewertung betrifft, stützen sich die meisten Labors auf »bekannte« und »unbekannte« Bakterienkulturen, die nur eine Überprüfung der Identifikationsgenauigkcit ermöglichen und nicht eine Überprüfung der Fähigkeit eines Kulturmediums oder sonstigen Testsystems oder Reagenses, den Mikroorganismus zu isolieren. Die Verwendung derartiger Kulturen ergibt jedoch keinen Empfindlichkeitsnachweis für kleine Änderungen in der Medienzubereitung und/ oder Herstellung. Diese Variation liegt großen Teils an einer Variation der Größe des Impffleckens, die bei verschiedenen Mikrobiologen und verschiedenen Übertragungs- bzw. Impfvorrichtungen oder -arten stark unterschiedlich ist.

Darüber hinaus existiert bis heute keine einfache Möglichkeit, eine vorher bestimmte Konzentration eines spezifischen Mikroorganismus zu lagern und zu liefern oder ihn in ein Testsystem, ein Reaktionsgefäß oder irgendeinen Prozeß, bei dem das Vorhandensein eines derartigen Mikroorganismus notwendig ist, zu übertragen.

Dieser Nachteil wird erfindungsgemäß überwunden durch ein Mittel zur Qualitätsbewertung mikrobiologischer Wachstumsmedien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß auf einer bekannten mikroporösen NVmbran eine Anzahl von Mikroorganismen bestimmter Art, suspendiert in einem mikrobiologisch inerten kolloidalen Suspensionsmittel, fixiert ist. Die Membran besitzt vorzugsweise einen 1 mm breiten, durch Erhitzen hydrophob gemachten Rand.

Das erfindungsgemäße Mittel kann mit einem Medium oder einer anderen mikrobiologischen Vorrichtung oder einem Reagens zusammengebracht werden, wobei das unter Slandardbedingungen erwartete Wachstum und die Vermehrung derartiger Organismen mit dem erhaltenen Ergebnis verglichen werden

ίο kann.

Das grundlegende Verfahren zur Anwendung der crfindiingsgemäßen Mittel besteht darin, daß man das ZL untersuchende Mittel, Reagens, WachstumsmediLim, Agargel, die Testplatte, Lösung usw. mit dem

erfindungsgemäßen Mittel zusammenbringt. Dieses Mittel, das im folgenden als Standard bezeichnet wird und eine standardisierte Kultur eines bekannten Stammes eines Mikroorganismus, die mit dem kolloidalen Suspensionsmittel stabilisiert ist, enthält,

wird dann verwendet, um das mikrobiologische Reagens oder Medium zu beimpfen. Nach einer bestimmten Inkubationszeit wird die erhaltene Anzahl der Kolonien mit der erwarteten Anzahl verglichen.
Der erste Schrit* bei der Hersteilung des erfindungsgemäßen Standards besteht darin, eine Reihe von Kulturen des gewählten Mikroorganismus von einer Ausgangskultur zu züchten, um den Mikroorganismus an das stabilisierte Kulturmedium anzupassen und Wachstumsbedingungen in dem Medium

für den speziellen verwendeten Mikroorganismus zu schaffen. Bei jedem der Schritte zur Züchtung der Kulturen wird ein genau gemessenes Volumen oder Anteil der vorhergehenden Kultur verwendet, um das nächste Medium zu beimpfen. Dieser Anteil wird während der sogenannten »log-Phase« entnommen, also wenn der Mikroorganismus -eine stärkste Lebensfähigkeit und sein stärkstes Wachstum besitzt. Wenn die Wachstumsbedingungen eingestellt sind und bestimmt wurde, daß die Kultur, die verwendet werden soll, keine Mutante darstellt, wird ein abgemessenes Volumen der Kultur zu einem abgemessenen Volumen des Suspensionsmediums zugegeben, und mit Hilfe einer Präzisionsvorrichtung wird ein sehr kleiner Anteil des Standards auf eine Membran

♦5 aufgebracht.

Die vorliegende Erfindung ist anwendbar auf eine große Anzahl bekannter Organismen, z. B. Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes, Streptococcus faecalis, Diplococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Klebsieila pneumoniae, Escherichia coli, Proteus mirabilis, , Salmonella sp., Hefe, Pilze u. ä.

Es hat sich gezeigt, daß irgendeine der inerten kolloidalen mikrobiologischen Substanzen als Suspensionsmittel verwendet werden kann. Der Ausdruck »mikrobiologisch inert« bedeutet hierbei, daß das Mittel keinesfalls eine nachteilige Wirkung auf den zu verwendenden Mikroorganismus ausüben darf. Es ist vorzuziehen, ein derartiges Mittel und in einer solchen Menge zu verwenden, daß es kein Gel bildet. Von den inerten kolloidalen Mitteln, die sich erfindungsgemäß als geeignet erwiesen haben, sind die sauren Polysaccharide mit vereslerten oder freien Carboxylgruppen, wie Pectinc, pectinisches Araban und Galactan und Tangpolysaccharide, wie Carrageene und Alginate geeignet. Eine andere Gruppe von inerten kolloidalen Mitteln, die erfindungsgemäß geeignet sind, umfaßt Gelatine und ähnliche Protein-

abbauprodukte, natürliche Gummen und die Celluiosegummen, wie Methylcellulose, und kolloidales Siliciumdioxyd.

Die Konzentration des Suspensionsmittels hängt von den speziellen gelbildenden oder Verdickungs_cigen»chaflen des ausgewählten Mittels ab. Im allntMiicinen wird jedoch so viel Suspensionsmittel verwende!, daß wenn der Mikroorganismus in Form ^iner wäßrigen Suspension vorliegt, ungefähr 0,1 bis I ο t iewichtsprozent Suspensionsmittel in der wäßl.ösung vorhanden sind.

hat sich gezeigt, daß die wasserlöslichen Algihesonders günstige Suspensionsmittel für die iiende Erfindung sind. I hat sieh gezeigt, daß ahr 0,1 bis 0,5 Gewichtsprozent Nalriumalginat ilhaft als Suspensionsmittel verwendet werden Wür::.:n. Dieses wirkt nicht nur als kolloidales Sus-

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Die in Fig. 1 gezeigte |

poröse Membranscheibe 11, deren u hydrophilen Mittelteil 13 und einen äußeren Teil 12 besitzt. Der auiitri. „ , .,

ό seinen hydrophoben Charakter durcn dl» »

mit mikrobiologisch inerten hydrophon^ _dm[._h iien, wie Siliconölen, Paraffinwachsen u. a., - ^ Erhitzen erhalten, wobei die 1 orositai unu ua ^ hydrophile Charakter zerstört werclen. ■

teil 13 der Überseite der Scheibe Ii Kuiii

Handlung mit einor inerten oberflächen- J η sung, wie einer 0,1 ",.gen Losung von in.>> üthylen)-sorbiianmonooleat, hyuropnu y-> ... _f, den sein. Eine derartige Behandlung isi \«.ι

„ da sie dazu führt, daß eine Mikmorganisnens H^ sion, die auf den Ob.rilache:iteil IJ auigema sich gleichmäßig über den gesamten ^unL"^u'^L

^des

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ein·.

erfindungsgemäßen Mittel umfassen eine Man Form einer mikroporösen Membran, auf der *enau abgemessene, vorherbestimmte Menge by konzentration eines Mikroorganismus zusamnuMi mit dem oben beschriebenen Suspensionsmittel au! jbracht worden ist. Die Matrix odor das mikro- t,»c Filter ist ein dünner Körper, enthaltend eine L o^gisch inerte und chemisch reine celluloseartige ο kr andere polymere Substanz, die Poren einer spc-ζ Hüllen und gleichmäßigen Größe besitzt. Die Poren dta Membranen oder Filter, wie sie oft genannt irden, variieren in der Größe von ungefähr 0,01 bis U oder mehr μ.η Durchmesser, wobei die Porosität oder Porengröße so gewählt wird, um den auf dem Ende eines Grills oder Träg sein, der die Form eines langen flaüicn Strul. η halbstarrem Papier oder Piast.k ol.e ^l^'^J ^; Ein derartiger Träger 10 «leichurt ait l -

und Anbringung der Scheibe U bti dtr Hcrsic. ^

und Anwendung. mikmnoröse Mem-

Die Fig. 2 und 3 zeigen eine !"'^"f^J _s^_lit. branseheibe 21. deren Oberseite ein hydroph Ls MU

telstüek 23 und e.ncn äußeren Tt.l 24 b sU/t. Teil 23 ist mit dem ^trockneten Rückstand u. Suspension einer M.kmorganismenkuhur 33 b deck ^ Die Memhransche.be 21 «im IWJ cm s men Klebemittels auf einer Pap.ern atjix-2 d s _fcl_t

Durchmessers w,e die Schub, -I befcs igt, J

Die Membran soll eine Porosität besitzen, die ausreichend klein ist, um den Durchgang des zu verwendenden Mikroorganismus zu verhindern, wahrend t Nährstoffe und anderen Lösungen hindurchgehen konnen und mit dem Mikroorganismus in Beruhrinnt kommen Da die kleinsten Bakterien ungefähr Γ'!,mTurchmcser besitzen, kann eine Membran _mit einer Porengröße von ungefähr 0.01 bis 0,2^m vorteilhaft verwendet werden. Wenn jedoch größere Organismen wie Hefen, verwendet werden, und eine SSr^"Heßgeschwindigkeit der Lösung durch die ₅, Membran gewünscht wird, kann selbstverständlich

^Mrs ss*^{vün abcr} "·² "^m

5Ä den Beispielen naher ^™^^^Γ Vorrichtung

F , g. 4 ze.gt eine sch .b,nform ,j Vornj^ in F1 g. 1 beschriebenen Art . acnluc einer Nährlösung und —^ und Entwicklung der

men 43. i.„_ntrnll.· i

Bei der Verwendung zur Qualrtabk^o U^

vorgesehen, daß eine Re hc des SunAmfe Vorrichtungen verwendet wird, um emc Medien, wie Agargel usw zu un«-reuen die -inimale AnzaJ-" ^'^η dc „^e .st, um ein Wachstum cin/uie ten

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Ansich. einer _aus- ₅„ch. «cricn mi. «ter Rcil.c 0.» S,ancj»J*

A„«h, einer C₁₅ Wachem *.

« Ä ^Schlli" ^cn"°"^s""'

4 ist eir. Aufriß einer erfindungsgemäßen 65 wachstum ergeben.

Dazu dient die in Fig. 2 gezeigte Vorrichtung, die in bekannter Weise bebrütet wird.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Eine Kultur von Escherichia coli wurde durch Beimpfung eines stabilisierten Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung erhalten:

Pepton 0,5 g

Natriumalginal 0,5 g

Steriles destilliertes Wasser auf 100,0 ml.

Die Kultur wurde über Nacht bei 37° C bebrütet.

Am nächsten Morgen wurden 7 ml der Kultur sorgfältig 2 Minuten lang mit einer Mischvorrichtung gemischt, und nach weiteren 3 Minuten wurde ein zweites Röhrchen mit dem oben angegebenen Kulturmedium mit 0,01 ml der ersten Kultur beimpft. Die zweite Kultur wurde 8 Stunden bei 37° C bebrütet. Eine dritte Kultur wurde auf die oben beschriebene Weise hergestellt und über Nacht bei 37 ' C bebrütet.

Unter Verwendung der dritten Kultur wurde eine weitere Kultur hergestellt, indem 0,01 ml davon zu 10,0 ml des stabilisierten Kulturmediums zugegeben wurden. Die Bebrütung dauerte genau 8 Stunden bei 37 C. Von dieser Kultur wurde dann eine Bakterieubusperiäion hergestellt, indem man 0,01 ml der verwendeten Kultur zu 15,0 ml eines Suspensions/ Lyophilisierungsmediums der folgenden Zusammensetzung zugab:

Beispiele 5 bis 7

Das Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die folgenden Suspensionsmittel in dem Kulturmedium verwendet wurden:

Beispiel	Mittel	Konzentration (Gewichtsprozent)
¹⁰ 5 6 7	Gelatine fötales Kalbsserum kolloidales SiO₀	0,1 1,0 0,1

Beispiel 8

Mit Hilfe einer Mikromeßvorrichtung wurden 0,02 ml der verdünnten Baktcriensuspcnsion, die in Beispiel 1 beschrieben ist, auf eine 12 mm große Scheibe aus einem Membranfilter gegeben, enthalao tend gemischte Ester von Cellulose mit den folgenden Charakteristika:

Mittlere Porengröße 0,45 μηή

Fl'.eßgeschwindigkeit(Wasser) .. 52 ml/min

prozentuale Porosität 79

Brechungsindex 1,510

*) Bei 25° C und 70 cm Hg Druckdifferenz.

cm²*)

Pcpton

Natriumalginat

Glukose

Steriles destilliertes

Wasser auf

0.5 g

0,5 g

7,5 g

100,0 ml.

Unter Verwendung einer Präzisionsmcßvorrichtung wurden 0,02 ml verdünnte Bakteriensuspension in ein 5 ml Glasgefäß gegeben. Die Suspension wurde gefriergetrocknet und das Gefäß unter Vakuum dicht verschlossen. Der gefriergetrocknete Anteil wurde dann auf das ursprüngliche Volumen aufgefü.U und auf eine Agarplatlc gegeben und untersucht. Es zeigte sich, daß er 30 Kolonien von E. coli enthielt.

Weitere Proben der verdünnten Baktcriensuspcnsion wurden in einzelne Glasgefäße gegeben und wie oben angegeben gefriergetrocknet. Nach dem Aufbringen auf die Agarplatte zeigte es sich, daß die Anzahl der Kolonien von 27 bis 33 pro Gefäß variierte.

Vor der Zugabe des Anteils der Suspension auf die Scheibe wurde ein 1 mm breiter Rand der Scheibe durch Erhitzen hydrophob gemacht, so daß die Flüssigkeit nicht über den äußeren Rand der Membran hinausdringen konnte. Die auf die Scheibe gegebene Suspension bildete einen kreisförmigen Fleck von 11 mm Durchmesser und wurde gefriergetrocknet. Anschließend wurde die Scheibe in ein Glasgefäß gegeben und unter Vakuum gehalten.

Beispiel 9

Entsprechend Beispiel 8 wurden Scheiben hergestellt und auf Agargelplattcn gegeben, wobei die Oberfläche der Scheibe, auf der sich die Mikroorganismen befanden, von dem Agargel abgewandt war. Die Plptten wurden 12 Stunden bei 37' C bebrütet, wobei sich auf der Oberfläche der Scheibe 30 Kolonien bildeten. Es wurden weitere Scheiben auf die gleiche Weise behandelt und die Anzal·, der Kolonien schwankte von 27 bis 33 Kolonien.

Beispiel 2

Das Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß Staphylococcus aurcus an Stelle von I'. coli verwendet wurde. Man erhielt eine ähnliche 55 war: Reproduzierbarkeil wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

Das Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß M. lysodeiklicus an Stelle von E. coli verwendet wurde. Man erhielt'eine ähnliche Reprodu/icrlinrkcil wie in Beispiel 1.

Beispiel 10

Es wurden Scheiben entsprechend Beispiel 8 hergestellt und auf Kissen mit Nährmedium befestigt, umfassend ein 1 mm dickes Filterpapier, das mit der folgenden Nährlösung imprägniert und getrocknet

Fleischextrakt

NaCl

Tryplosc

Gewichtsprozent 0,3 0,5 1,0

B c i s ρ i c I 4

Das Beispiel I wiinle wiederholt mit der Ausit:ilimt-, iliil'· «Ins Volumen des Stispcnsions/I .yophi-Ir nMiiii'snuiliuiiis .ml .'MO ml iiliolit wurde. Die An-/1I1I cd 1 KnI(IiHi 11 valin Hi von i ? ins in.

Die Befestigung des Kissens unter der Membran wurde unter Verwendung einer Lösung von 2 Gewichtsprozent Natriumalginat als Klebemittel erreicht.

Das NährslolTkissen wurde dann mit destilliertem Wasser angefeuchtet und die Vorrichtung 12 Stunden hei 37 C inkubiert. Am HmIe der Bebriiliingszeit waren 30 K"lnnirn entstanden.

philisierungsmittels auf 200 ml erhöht wurde. Die Anzahl der erhaltenen Kolonien mit derartigen Scheiben variierte von 13 bis 16.

Beispiele 14 bis 16

Das Beispiel 8 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die folgenden Suspensionsmittel in dem Kulturmedium verwendet wurden:

Derartige Vorrichtungen dienen zur Selbstkontrolle der Lebensfähigkeit des in den entsprechend Beispie! _ hergestellten und entsprechend Beispiel 2 verwendeten Scheiben.

Beispiel 11

Die Beispiele 8 und 9 wurden wiederholt mit der Ausnahme, daß Staphylococcus aureus an Stelle von E. coli verwendet wurde. Man erhielt eine ähnliche Reproduzierbarkeit wie in Beispiel 9.

Beispiel 12

Die Beispiele 8 und 9 wurden wiederholt mit der Ausnahme, daß M. lysodeikticus an Stelle von E. coli verwendet wurde. Man erhielt eine ähnliche Reproduzierbarkeit wie in Beispiel 9.

Beispiel 13

Die Betspiele 8 und 9 wurden wiederholt mit der Die erhaltenen Ergebnisse waren mit denjenigei

Ausnahme, daß das Volumen des Suspensions/Lyo- 20 des Beispiels 8 vergleichbar.

Beispiel

Mittel

Konzentration (Gewich tsprozent)

14
15
.16

Gelatine

fötales Kalbsserum

kolloidales SiO,

0,1

1,0 0,1

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Mittel zur Qualitätsbewertung mikrobiologischer Wuchstiimsmedicn, dadurch gekennzeichnet, daß auf einer bekannten mikroporösen Membran eine Anzahl von Mikroorganismen bestimmter Art, suspendiert in einem mikrobiologisch inerten kolloidalen Suspensionsmittel, fixiert ist.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mikroporöse Membran einen 1 mm breiten, durch Erhitzen hydrophob gemachten Rand aufweist.