DE2154993A1 - Alkaline phosphatase determination - using 4-nitrophenyl phosphate as substrate and diethanolamine organic salts as buffer - Google Patents

Alkaline phosphatase determination - using 4-nitrophenyl phosphate as substrate and diethanolamine organic salts as buffer

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Abstract

In the determination of alkaline phosphatase in body fluids (esp. serum) using p-nitrophenyl phosphate (I) as substrate, the p-nitrophenol released by the enzymatic reaction being determined photometrically, an organic salt of diethanolamine (pref. the formate or glutarate) is used instead of diethanolamine hydrochloride as buffer substance. This gives increased turnover of substrate and increases the sensitivity of the determination. Since solutions of (I) are unstable, it is advantageous to prepare a lyophilisate of (I) together with a protective substance which does not interfere with the enzymatic reaction (pref. glucose) and to add the lyophilisate to the buffer soln. immediately before carrying out the determination.

Description

Verfahren zur Bestimmung der alkalischen Phosphatase in Körperflüssigkeiten.Method for the determination of alkaline phosphatase in body fluids.

Die Aktivitit der alkalischen Phosphatase in Körperflüzsigkeiten, vornehmlich im Serum, ist für die Beurteilung von Knochen und Lebererkrankungen von Bedeutung.The activity of alkaline phosphatase in body fluids, primarily in the serum, is used for the assessment of bone and liver diseases significant.

Für die Bestimmung dieses Ferments gibt es mehrere Verfahren, die sich durch die Verwendung verschiedener Substrate und verschiedener Pufferzusammensetzungen und Konzentrationen unterscheiden. Unter anderem haben Bessey, Lowry und Brock (J.Biol.Chem.164 (1946 321) ein Verfahren beschrieben, bei dem p-lMitrophenylphosphat als Substrat in einem Glaycin-NaOH-Puffer verwendet wird. Das durch die Phosphatasereaktion freigesetzte p-Nitrophenol wird nach gemessener Reaktionsdauer photometrisch bestimmt und stellt ein Maß für die in der Zeiteinheit umgesetzte Substratmenge dar.There are several methods for determining this ferment by using different substrates and different buffer compositions and differentiate between concentrations. Bessey, Lowry and Brock (J.Biol.Chem. 164 (1946 321) described a process in which p-l-nitrophenyl phosphate as substrate in a glaycin-NaOH buffer. The one released by the phosphatase reaction p-Nitrophenol is determined photometrically after the measured reaction time and represents represents a measure of the amount of substrate converted in the unit of time.

Unter Verwendung des gleichen Substrats haben Helger, Rick und Hausamen mit einem Diäthanolaminhydrochloridpuffer 1 molarer Konzentration einen etwa 3-fach höheren Substratumsatz erzielen konnen (DBP 1300710) Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß sich diese Aktivität nochmals steigern läßt, wenn man an Stelle des salz sauren Salzes des Diäthanolamins die Salze gewisser organischer Säuren mit Diathanolamin verwendet.Using the same substrate, Helger, Rick, and Hausamen did with a diethanolamine hydrochloride buffer of 1 molar concentration an approximately 3-fold can achieve higher substrate turnover (DBP 1300710) Surprisingly, now found that this activity can be increased again if one takes the place of the Salt of acidic salt of diethanolamine with salts of certain organic acids Diethanolamine used.

Es wurde festgestellt, daß diese Aktivitätssteigerung bei einbasischen organischen Säuren im umgekehrten Verhältnis zur Molekülgröße steht, so daß nur das Salz der Ameisensaure eine Steigerung der Aktivität gegenüber dem Salz der Chlorwasserstoffsäure bewirkt.It was found that this increase in activity in monobasic organic acids is in inverse proportion to the molecular size, so that only the formic acid salt shows an increase in activity compared to the hydrochloric acid salt causes.

Bei den Dikarbonsäuren dagegen zeigen die Salze des Diäthanolamine mit der Glutarsäure eine Aktivitätssteigerung, die höher ist als die der homologen Oxalsäure, Malonsäure und Bernsteinsäure. In the case of the dicarboxylic acids, on the other hand, the salts of diethanolamine show with glutaric acid an increase in activity which is higher than that of the homologous ones Oxalic acid, malonic acid and succinic acid.

Eine geringere Wirkung haben auch die @-Ketoglutarsäure und die Glutaminsäure, die als Salze des Diäthanolamins die Wirkung des Diathanolaminhydrochloridpuffers nur geringfügig übertreffen. @ -Ketoglutaric acid and glutamic acid also have a lesser effect, which, as salts of diethanolamine, have the effect of diethanolamine hydrochloride buffer only marginally outperform.

Die nachstehende Tabelle gibt Auskunft über die prozentuale Steigerung der Phosphataseaktivität beim gleichen Serum, bei Verwendung der genannten organischen walze des Diäthanolamins im Vergleich mit dem Hydrochlorid. The table below provides information about the percentage increase the phosphatase activity in the same serum when using the organic ones mentioned roll of diethanolamine in comparison with the hydrochloride.

Ansatz: pH: 10,2, Substrat:p-Nitrophenylphosphat 1,5 x 10-² M Temperatur 250, Serum 0,2 ml, Puffersubstratlösung 2,0 ml Gesamtvolumen 2,2 ml Diäthanolamin- Diäthanolamin- Hydrochlorid Formiat Serum Nr. Extinktion E/min. Extinktion E/min. Steigerung 1 A 0,100 0,100 1. 0,119 0,019 0,122 0,022 2. 0,138 0,019 0,144 0,022 13,5% 3. 0,159 0,021 0,167 0,023 2 A 0,100 0,100 1. 0,121 0,021 0,123 0,023 2. 0,142 0,021 0,146 0,023 9,5% 3. 0,163 0,021 0,169 0,023 3 A 0,100 0,100 1. 0,113 0,013 0,118 0,018 2. 0,126 0,013 0,137 0,019 46,0% 3. 0,138 0,012 0,157 0,019 4 A 0,100 0,100 1. 0,119 0,019 0,123 0,023 2. 0,137 0,018 0,116 0,023 23 % 3. 0,155 0,018 0,168 0,022 Diäthanolamin- Diäthanolamin- Hydrochlorid Glutarat Serum Nr. Extinktion E/min. Extinktion E/min. Steigerung 5 A 0,100 0,100 1. 0,113 0,013 0,114 0,014 2. 0,126 0,013 0,128 0,014 10 % 3. 0,139 0,013 0,143 0,015 6 A 0,100 0,100 1. 0,117 0,017 0,119 0,019 2. 0,132 0,015 0,134 0,015 8,3 % 3. 0,148 0,016 0,152 0,018 7 A 0,100 0,100 1. 0,137 0,031 0,143 0,043 2. 0,175 0,038 0,187 0,044 16 % 3. 0,213 0,038 0,231 0,044 8 A 0,100 0,100 1. 0,180 0,080 0,192 0,092 2. 0,260 0,080 0,284 0,092 13,5 % 3. 0,380 0,080 0,373 0,089 Beispiel der Herstellung der Puffersubstratlösung.Approach: pH: 10.2, substrate: p-nitrophenyl phosphate 1.5 x 10-² M temperature 250, serum 0.2 ml, buffer substrate solution 2.0 ml, total volume 2.2 ml Diethanolamine- diethanolamine- Hydrochloride formate Serum No. absorbance U / min. Absorbance U / min. increase 1 A 0.100 0.100 1. 0.119 0.019 0.122 0.022 2.138 0.019 0.144 0.022 13.5% 3. 0.159 0.021 0.167 0.023 2 A 0.100 0.100 1. 0.121 0.021 0.123 0.023 2.142 0.021 0.146 0.023 9.5% 3. 0.163 0.021 0.169 0.023 3 A 0.100 0.100 1. 0.113 0.013 0.118 0.018 2.126 0.013 0.137 0.019 46.0% 3. 0.138 0.012 0.157 0.019 4 A 0.100 0.100 1. 0.119 0.019 0.123 0.023 2.137 0.018 0.116 0.023 23% 3. 0.155 0.018 0.168 0.022 Diethanolamine- diethanolamine- Glutarate hydrochloride Serum No. absorbance U / min. Absorbance U / min. increase 5 A 0.100 0.100 1. 0.113 0.013 0.114 0.014 2.126 0.013 0.128 0.014 10% 3. 0.139 0.013 0.143 0.015 6 A 0.100 0.100 1. 0.117 0.017 0.119 0.019 2.132 0.015 0.134 0.015 8.3% 3. 0.148 0.016 0.152 0.018 7 A 0.100 0.100 1. 0.137 0.031 0.143 0.043 2.175 0.038 0.187 0.044 16% 3. 0.213 0.038 0.231 0.044 8 A 0.100 0.100 1. 0.180 0.080 0.192 0.092 2.260 0.080 0.284 0.092 13.5% 3. 0.380 0.080 0.373 0.089 Example of the preparation of the buffer substrate solution.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden 10,5 g Diäthanolamin in ca. 70 ml dest. H20 gelöst und durch Einbringen von fester Glutarsäure aus pH 9,8 - 10,0 gebracht.According to the method according to the invention, 10.5 g of diethanolamine are in approx. 70 ml dist. H20 dissolved and by introducing solid glutaric acid from pH 9.8 - brought 10.0.

Die Glutarsäure wird unter Rühren so langsam zugegeben, daß sie sich sofort löst. Dann werden 10,2 mg MgCl2 x 6 H20 zugefügt und schließlich mit gesättigter wässriger Glutarsäurelösung auf pH 10,2 eingestellt, Mit dest.The glutaric acid is added slowly while stirring that it is solves immediately. Then 10.2 mg MgCl2 × 6 H20 are added and finally with saturated aqueous glutaric acid solution adjusted to pH 10.2, with dist.

wasser wird jetzt auf 100,0 ml aufgefüllt. In 10 ml dieser Pufferlösung werden 39,5 mg p-Nitrophenylphosphat eingewogen, so daß eine Substratkonzentration von 1,5 x 10 2 M vorhanden ist.water is now made up to 100.0 ml. In 10 ml of this buffer solution 39.5 mg of p-nitrophenyl phosphate are weighed in, so that a substrate concentration 1.5 x 10 2 sts.

Die Herstellung der Puffersubstratlösung mit Ameisensaure erfolgt in anologer Weise, wobei es ohnehin einfacher ist, mitder flüssigen Ameisensäure ein pH von 10,2 einzustellen.The buffer substrate solution is prepared with formic acid in an anologous way, although it is easier to do with the liquid formic acid to set a pH of 10.2.

Diese Substratpufferlösung muß unter Lichtausschluß im Kühlschrank aufbewahrt werden und ist selbst unter diesen Vorsichtemaßnahmen nur kurze Zeit heltbar. Es kommt sur spontanen Zersetzung des p-Nitrophenylphosphats. Daher ist es zweckmäßig, das Substrat in möglichst kleinen Portionen abzufüllen, womöglich in Portionen, die für einen Ansatz ausreichen (ca.8 mg).This substrate buffer solution must be kept in the refrigerator with exclusion of light stored and is only a short time even under these precautionary measures sustainable. It comes from spontaneous decomposition of p-nitrophenyl phosphate. It is therefore advisable to fill the substrate in as small portions as possible, possibly in portions that are sufficient for one approach (about 8 mg).

Bringt man diese Portionen in Tablettenform, so ist eine relativ große Menge eines Füllstoffs zuzusetzen um eine einigermaßen genaue Dosierung zu ermöglichen.If you bring these portions in tablet form, then one is relatively large Add amount of filler to allow reasonably accurate dosing.

Einfacher und genauer wäre es, eine Lösung des Substrats in solch kleinen Portionen in Fläschchen abzufüllen und zu lyophilysierenj so daß das trockene Substrat nur in der für einen Ansatz benotigten Pufferlösung (2 ml) aufgelöst werden kann. Diesem Vorgehen steht jedoch entgegen, daß sich p-Nitrophenylphosphat während der Gefriertrocknung in hohem Maße zersetzt und man beim Auflösen des Lyophilysats größtenteils schon p-Nitrophenol vorliegen hat. Dadurch kann die Fermntreaktion nicht mehr gemessen werden.It would be easier and more accurate to dissolve the substrate in such a Fill small portions into vials and lyophilize so that the dry The substrate must only be dissolved in the buffer solution (2 ml) required for one preparation can. This procedure is contrary to the fact that p-nitrophenyl phosphate during the freeze-drying decomposes to a high degree and one when the lyophilysate is dissolved for the most part, p-nitrophenol is already present. This can cause the remote reaction can no longer be measured.

Es wurde nun gefunden, daß die Gefriertrocknung einer p-Nitrophenylphosphatlösung ohne wesentliche Zersetzung der Substanz vor sich geht, wenn man der Lösung eine die Phosphatasereaktion nicht beinflußende Schutzsubstanz beifügt. Als besonders geeignet hat sich hierfür Glukose erwiesen.It has now been found that the freeze-drying of a p-nitrophenyl phosphate solution without substantial decomposition of the substance going on if one of the solution is used adds protective substance that does not affect the phosphatase reaction. As special Glucose has proven suitable for this.

Beispiel der Herstellung eines Substratiyophilysats.Example of the preparation of a substrate iophilysate.

800 mg p-Nitrophenylphosphat und 4,0 g Glukose werden in 10 ml Wasser gelöst. In Portionen von 0,1 ml wird diese Lösung in keine Gefäße gefüllt und rasch zum Gefrieren gebracht. Nach dem Trocknen im Vakuum werden die Gefäße mit Stickstoff gefüllt und verschloßen Bei Aufbewahrung im Kühlschrank ist die so hergestellte Substratportion über ein Jahr haltbar. Zur Verwendung wird der Inhalt der Gefäße in 2,0 ml Pufferlösung gelöst und ist nach Vorwärmen auf die Reaktionstemperatur sofort für die Bestimmung verfügbar.800 mg of p-nitrophenyl phosphate and 4.0 g of glucose are dissolved in 10 ml of water solved. In portions of 0.1 ml, this solution is not filled into any vessels and quickly frozen. After drying in vacuo, the vessels are filled with nitrogen filled and sealed. When stored in the refrigerator, the is made in this way Substrate portion can be kept for over a year. The contents of the vessels are used dissolved in 2.0 ml buffer solution and is after preheating to the reaction temperature immediately available for determination.

Beispiel der DurchführunR einer Bestimmung Zu 2 ml der Substrat-Pufferlösung in einer Küvette bei 25°C werden 0,02 ml frisches Serum zugesetzt und gut gemischt. Nach etwa einer Minute wird die Extinktion bei 405 nm bestimmt und unter Verwendung einer Stoppuhr genau jede Minute die Extinktion 3 Minuten lang gemessen.Example of carrying out a determination To 2 ml of the substrate buffer solution In a cuvette at 25 ° C, 0.02 ml of fresh serum is added and mixed well. After about one minute, the absorbance at 405 nm is determined and using a stopwatch measured the absorbance exactly every minute for 3 minutes.

Aus den Extinktionsdifferenzen pro Minute wird ein Mittelwert gebildet, der mit 5460 multipliziert, die Enzymkonzentration in m tr/ml Serum angibt.A mean value is formed from the absorbance differences per minute, which multiplied by 5460 gives the enzyme concentration in m tr / ml serum.

Claims (5)

Patentansprüche Claims Verfahren zur Bestimmung der alkalischen Phosphatase in Körperflüssigkeiten in an sich bekannter Weise unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat als Substrat und photometrische Messung des durch die Fermentreaktion freigesetzten p-Ditrophencis, dadurch gekennzeichnet, daß an Stelle von Diäthanolaminhydrochlorid als Puffersubstanz ein organisches Salz des Diäthanolcmmins vornehmlich Diäthanolamin-Formiat oder Diäthanomamin-Glutarat verwendet wird.Method for the determination of alkaline phosphatase in body fluids in a manner known per se using p-nitrophenyl phosphate as substrate and photometric measurement of the p-Ditrophencis released by the fermentation reaction, characterized in that instead of diethanolamine hydrochloride as a buffer substance an organic salt of diethanolamine notably diethanolamine formate or Diethanomamine Glutarate is used. 2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung durch die Säure auf pH 10,0 - 10,5 vornehmlich 10,2 eingestellt wird. 2. The method according to claim 1, characterized in that the buffer solution the acid is adjusted to pH 10.0-10.5, primarily 10.2. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß die pufferkonzentration 0,5 - 1,5 molar ist. 3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the buffer concentration is 0.5 - 1.5 molar. 4. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 - 3 dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat in lyophilysiertem Zustand in Finzelportionen zur Auflösung in der Pufferlösung bereitgestellt wird. 4. Means for performing the method according to claim 1-3 thereby characterized in that the substrate in the lyophilized state in Finzelportionen for Dissolution in the buffer solution is provided. 5. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1-4 dadurch gekennzeichnet, daß die Substratlösung vor der Gefriertrocknung mit der 4 - 6-fachen Menge einer Schutz substanz vornehmlich Glukose versetzt wird. 5. Means for performing the method according to claims 1-4 thereby characterized in that the substrate solution before freeze-drying with the 4-6 fold Amount of a protective substance mainly glucose is added.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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FR2325046A1 (en) * 1975-09-22 1977-04-15 Chembro Holdings Pty Ltd MEASURING ALKALINE PHOSPHATASE LEVELS IN HUMORS

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