DE2148953C3 - Verfahren zur Herstellung von L-3,4-disubstituierten Phenylalaninen - Google Patents

Description

in der die Reste R¹ und R² gleich oder verschieden voneinander sein können und je ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe mit der Maßgabe bedeuten, daß R² keine Methylgruppe ist, wenn R¹ ein Wasserstoffatom ist, durch Umsetzen einer 3,4-disubstituierten Phenylbrenztraubensäure der allgemeinen Formel

R¹O

R²O--f~V-CH₂CHCOOH

NH,

R¹O

R²O

CH₂COCOOH (II)

in der die Reste R¹ und R² die vorstehend genannte Bedeutung haben, mit einem Aminierungsmittel in Gegenwart einer von Mikroorganismen erzeugten Transaminase im Temperaturbereich von 25 bis 45°C, einem pH-Wert von 6,5 bis 10,5 und einer Reaktionszeit von 20 bis 60 Stunden, dadurch gekennzeichnet, daß man eine von Bakterien der Gattungen Alcaligenes erzeugte Transaminase einsetzt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-3,4-disubstituierten Phenylalaninen der allgemeinen Formel

R¹O

R²O

CH₂CHCOOH
NH,

in der die Reste R¹ und R² gleich oder verschieden voneinander sein können und je ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe mit der Maßgabe bedeuten, daß R² keine Methylgruppe ist, wenn R¹ ein Wasserstoffatom ist, durch Umsetzen einer 3,4-disubstituierten Phenylbrenztraubensäure der allgemeinen Formel

R¹O

R²O

CH₂COCOOH (II)

in der die Reste R¹ und R² die vorstehend genannte Bedeutung haben, mit einem Aminierungsmittel in Gegenwart einer von Mikroorganismen erzeugten Transaminase im Temperaturbereich von 25 bis 45'^: C, einem pH-Wert von 6,5 bis 10,5 und einer Reaktionszeit von 20 bis 60 Stunden.

worin R¹ und R² ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe sein können, wobei beide Substituenten

gleich oder unterschiedlich sein können, und R² eine Methylgruppe ist, wenn R¹ ein Wasserstoffatom ist, bisher mittels physikalischer, chemischer Methoden und unter Verwendung von Enzymen hergestellt. Ein Gemisch der D- und L-Form eines 3,4-disubstituierten Phenylalanin (nachfolgend als »D- bzw. L-Verbindung« bezeichnet), wie es chemisch synthetisiert wird, kann bei der Aufspaltung in die optisch reinen Verbindungen von der L-Verbindung jedoch keine höhere Ausbeute als 50% erhalten werden, wenn nicht die D-Verbindung, die als Nebenprodukt erhalten wird, in die L-Verbindung umgelagert wird. Daher besitzt das Aufspaltungsverfahren zur Auftrennung in die optischen Bestandteile große Nachteile bei einer Durchführung im industriellem Maßstab.

Zur Herstellung von L-Dopa mittels Fermentation ist ein Verfahren vorgeschlagen worden, bei dem L-Tyrosinderivate, wie beispielsweise L-N-Formyltyrosin mit einer von Pilzen stammenden Polyphenoloxidase behandelt werden (Charles J. S i h et al.

₄o. »Journal of the American Chemical Society«, Bd. 91, S. 6204 [1969]). Bei einem anderen Verfahren wird Brenzkatechin mit einer speziellen Aminosäure kondensiert, wie beispielsweise mit Tyrosin, Serin oder Cystein. Dazu wird Tyrosinphenollyase verwendet, die aus Bakterien erhalten wird (Yamada, Ogata et al. »Biochemical and Biophysical Research Communications«, Bd. 34, S. 266 [1969]).

Aus der DT-OS 2041418 sind Mikroorganismen bekannt, die die Eigenschaft besitzen, 3,4-disubstituierte Phenylbrenztraubensäuren in L-3,4-disubstituierte Phenylalanine umzuwandeln. Dazu gehören die Bakterien Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Sarcina, Brevibacterium und die Schimmelpilzarten Aspergillus, Penicillium und Mucor, sowie die Hefearten Candida und Saccharomyces.

Es wurde nun ein vorteilhaftes und industriell durchführbares Verfahren zur Herstellung von L-3,4-disubstituierten Phenylalanin-Verbindungen (1) aus Verbindungen der allgemeinen Formel (II) gefunden.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von L-3,4-disubstituierten Phenylalaninen der eingangs beschriebenen Art, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine von Bakterien der Gattungen Alcaligenes erzeugte Transaminase einsetzt.

Bei dem Verfahren nach der Erfindung werden also Alcaligenes-Bakterien unter den genannten Bedin-

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gungen in einem Kulturmedium kultiviert, das eines oder mehrere der folgenden Stoffe enthält: Glucose, Saccharose, Maltose, Lactose oder Stärkehydrolysat als Kohlenstoffquelle, Fleischextrakt, Pepton, PoIypepton, Casaminosäure, Maiswasser, Ammoniumsalze oder Proteinhydrolysate als Stickstoffquelle sowie Natriumchlorid, Phosphate, Metallionen, Vitamine und Wuchsstoffe. So wird ein Enzym erhalten, das die in der allgemeinen Formel (II) dargestellten Verbindungen in die durch die allgemeine Formel (I) ,₀ dargestellten Verbindungen umwandeln kann, und zwar in der Bakterienzclle oder in ihren Fermentationsbrühen. Das Verfahren der Erfindung ergibt die Verbindungen der Formel (I) in sehr hohen Ausbeuten.

Obgleich diese optimalen Fermentationsbedingungen entsprechend dem gewählten Mikroorganismus variiert werden können, wurden bei den Untersuchungen folgende Produktivitätsergebnisse für die Produkte dieser Mikroorganismen erhalten:

Die Bakterien werden in das Kulturmedium okuliert, das aus 0,5 Gew.-% Fleischextrakt, 1,0 Gew.-% Pepton und 0,5 Gew.-% Natriumchlorid besteht. Es wird bei einer Temperatur von 30" C 48 Stunden kultiviert. In Gegenwart der erhaltenen nassen ZeI-len werden die Verbindungen entsprechend der allgemeinen Formel (II) bei einer Temperatur von 37'¹C 1 Stunde mit der Aminosäure zur Reaktion gebracht.

Die so hergestellten und durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Verbindungen werden quantitativ nach folgenden Methoden bestimmt.

Das L-3,4-Dihydroxyphenyl-alanin wird durch die Trihydroxyindol-Methode bestimmt (E u 1 e r, U. S. von: Hormones in Blood, Academic Press [1969]).

Das L - 3,4 - Dimethoxyphenyl - alanin und das L-3-Methoxy-4-hydroxyphenyl-alanin werden in den N-Trifluoracetyl-n-butylester nach dem in der folgenden Literaturstelle beschriebenen Verfahren umgewandelt: Charles W. Grehek et al., »Analytical Chemistry«, Bd. 37, S. 383 (1965). Der so hergestellte N-Trifluoracetyl-n-butylester wird durch Gas-Flüssigkeitschromatographie quantitativ bestimmt. Aus diesen analytischen Ergebnissen werden die enzymatischen Aktivitäten der Mikroorganismen bestimmt. Die Einheit der Enzymaktivitäten ist ausgedruckt durch die Menge des Enzyms, die 1 mg der durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Verbindung bei einer Temperatur von 37⁰C über einen Zeitraum von 1 Stunde bildet. Als enzymatisches Reaktionssystem wurde ein System verwendet, in dem die Enzymlösung, die aus einem ml der Kulturlösung resultiert, mit einer Lösung der folgenden Zusammensetzung versetzt ist:

0,5 m Phosphatpufferlösung 0,5 ml

0,01 % (Gew./Vol.) Pyridoxal-

phosphat 0,5 ml

V₁₆In Kalium-L-glutamat 0,5 ml

V₁₆ m Kalium-L-asparaginat 0,5 ml

V₈m Verbindungen der allgemeinen

Formel (II) 1,0 ml ^

Die Gesamtmenge wurde auf 5 ml aufgefüllt.

In der folgenden Übersicht zeigen die Verbindungen (A), (B) und (C) die Ergebnisse Tür L-3,4-Dihydroxyphenyl-alanin, L-3-Methoxy-4-hydroxy-phenyl-alanin bzw. L-S^-Dimethoxyphenyl-alanin.

Die Enzymmenge, die, in 100 ml der Fermentationsfür verschiedene Bakterien gebildet wurde, 953

wird durch die oben definierte Einheitenanzahl ausgedrückt.

Enzymmenge des aus Bakterien erhaltenen Produkts

Buklerium

Klassi- Enzym- (Einheiten/100 ml)
fikations- menge

nummer Ver- Ver- Verbindung bindung bindung

(A)

(B)

(C)

Alcaligenes 1015 98 53 69

IAM*)

faecalis

*) Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo, Tokyo, Japan.

Bei der so erhaltenen Transaminase, die die durch die allgemeine Formel (II) dargestellten Verbindungen in die durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Verbindungen mittels einer Transaminierungsreaktion umwandeln kann, ist es sehr von Vorteil, daß die Transaminase ^rür ein im industriellem Ausmaß durchgeführtes Verfahren zur Herstellung der L-3,4-disubstituierten Phenylalanin-Verbindungen nach der Formel (I) verwendet werden kann. Es können die vermahlene Zellflüssigkeit, die getrockneten oder nassen Zellen oder die Fermentationsbrühen dieser Mikroorganismen für die Transaminierung als Transaminase eingesetzt werden.

Als Aminierungsmittel können bei dem Verfahren nach der Erfindung L-Glutaminsäure, L-Alanin, L-Asparaginsäure, Glycin oder Mischungen davon, Pepton oder Proteinhydrolysate, wie beispielsweise Weizenproteinhydrolysate, verwendet werden.

Die Verbindungen nach der allgemeinen Formel (I) können leicht isoliert werden, indem man die Reaktionslösung mit einer Mineralsäure ansäuert, die Zellen oder das Mycel und das lösliche Protein von der Reaktionslösung abtrennt, die nichtumgesetzte Ketosäure mit organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Äthylacetat, extrahiert und man anschließend die so hergestellte gereinigte Lösung konzentriert. Dann wird durch Fällung beim isoelektrischen Punkt, mit Ionenaustauscherharzen oder mit Adsorptionsmitteln weitergearbeitet.

Von den erhaltenen Verbindungen nach Formel (I) können L-3-Methoxy-4-hydroxyphenyl-alanin oder L-3,4-Dimethoxyphenyl-alanin durch Entmethylierung in L-Dopa umgewandelt werden, das in einer hohen Ausbeute erhalten wird und einen optischen Reinheitsgrad von 100% besitzt.

Das Verfahren nach der Erfindung wird in den folgenden Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Alcaligenes faecalis IAM 1015 wurde in 5 1 eines Kulturmediums okuliert, das aus 0,5% Glucose, 0,5% Casaminsäure, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% Natriumchlorid, 0,1% Monokaliumphosphat und 0,05% Magnesiumsulfat bestand. Unter Bewegung und Belüftung wurde bei einem Ausgangs-pH-Wert von 7,0 und bei einer Temperatur von 30⁰C 64 Stunden kultiviert. Die bakteriellen Zellen wurden mittels Zentrifugieren aus der Kulturflüssigkeit entfernt. 35 g der so erhaltenen nassen Zellen wurden in 300 ml einer Lösung suspendiert, die durch Auflösen von

3 g 3,4 - Dihydroxyphenylbrenztraubensäure, 3 g L-Glutaminsäure und 3 g L-Asparaginsäure in wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt worden war. Diese Flüssigkeit wurde unter Bewegung beziehungsweise Rühren auf einer Temperatur von 30° C gehalten.

Nach 18 Stunden wurden die Zellen und das Protein von der Reaktionsflüssigkeit entfernt und die Reaktionsflüssigkeit auf Aktivkohle gegeben. Das adsorbierte L-Dopa wurde mit Wasser eluiert, und das Eluat wurde dann konzentriert und in der Kälte stehengelassen. Man erhielt 1,4 g roher Kristalle von L-3,4-Dihydroxyphenyl-alanin. 1,0 g reines L-Dopa wurde erhalten, indem das rohe L-Dopa aus Wasser umkristallisiert wurde. Mittels IR-Analyse und Dünnschichtchromatografie wurde festgestellt, daß das L-Dopa einem Standardprodukt entsprach.

Mi = -13,2° (c = 3,86 in In-HCl, 1=1).

B e i s ρ i e ! 2

^r

Alcaligenes faecalis IAM 1015 wurde in 400 ml eines Nährbodens okuliert, der aus 1,0% Glukose, 3,0% Polypepton, 0,3% Natriumchlorid, 0,15% Kaliumphosphat und 0,01% Magnesiumsulfat bestand. Unter Schütteln wurde bei einem Ausgangs-pH-Wert von 7,0 bei einer Temperatur von 30⁰C 48 Stunden kultiviert. Die Kulturflüssigkeit wurde mit 2 1 einer Lösung zusammengegeben, in der 12,0 g 3,4-Dimethoxyphenylbrenztraubensäure, 6,5 g L-Glutaminsäure und 6,5 g L-Asparaginsäure in einer 1 -n wäßrigen Kaliumhydroxydlösung aufgelöst worden waren, um den pH-Wert auf 8,3 einzustellen. Die so erhaltene Lösung wurde unter Bewegung 40 Stunden bei einer Temperatur von 30° C gehalten. Anschließend wurde der pH-Wert der Lösung mit 10%iger wäßriger Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt und zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde unter reduziertem Druck konzentriert, bis das gesamte Volumen auf etwa 600 ml eingeengt worden war. Die so erhaltene Lösung wurde zweimal mit etwa 300 ml Äthylacetatlösung gewaschen, um die nichtumgesetzte 3,4-Dimethoxyphenylbrenztraubensäure zu extrahieren und abzutrennen. Die wäßrige Lösung wurde auf etwa 300 ml konzentriert, und anschließend wurde der pH-Wert auf 4,5 eingestellt. Man ließ über Nacht stehen und erhielt 7,5 g rohe Kristalle von L-3,4-Dimethoxyphenyl-alanin. Das in der Mutterlauge verbleibende L-3,4-Dimethoxyphenyl-alanin wurde an Aktivkohle adsorbiert, und das Adsorbat wurde mit Wasser eluiert. Das Eluat wurde konzentriert, und man ließ in einem kalten Raum stehen. Dadurch erhielt man 1,8 g rohe Kristalle.

Die Reinheit dieser rohen Kristalle lag bei 89 und 94%, wie durch Gaschromatographie festgestellt werden konnte. Die rohen Kristalle wurden in 100 ml einer etwa 2%igen wäßrigen Salzsäurelösung aufgelöst und mit Äthylacetat gewaschen, wobei weiße Kristalle erhalten wurden. Diese weißen Kristalle wurden zweimal durch Fällung beim isoelektrischen Punkt umkristallisiert. Die danach erhaltenen weißen Kristalle wurden weiter aus Wasser umkristallisiert, und man erhielt 5,5 g reine L-3,4-Dimethoxyphenylalaninkristaiie, die mittels Dünnschicht- und Gas-Chromatographie untersucht wurden.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften dieser Kristalle waren wie folgt:

Schmelzpunkt: 203,0 bis 209,9"C (Zersetzung).

Optische Drehung: M" = -5,75" ic = 3,30, in In-HClJ = 1).

lR-Absorptionsspektrum (Nujol Mull) 3230 (NH₃ ⁺), 2150—2800, 1610 (COCT) [cm"¹],

Die Kristalle wurden mit Bromwasserstoffsäure zu L-Dopa entmethyliert, das eine optische Reinheit von 100% besaß.

[«]? = -12,7" (c = 3,56, in In-HCl, 1 = 1).

Beispiel 3

Alcaligenes faecalis IAM 1015 wurde in 500 ml eines Nährbodens okuliert, der aus 1,0% Glukose, 3,0% Polypepton, 0,3% Natriumchlorid, 0,15% Kaliumphosphat und 0,01% Magnesiumsulfat bestand. Es wurde unter Bewegung bei einem AusgangspH-Wert von 7,0 und bei einer Temperatur von 30⁰C 48 Stunden kultiviert. Die Kulturflüssigkeit wurde mit 2 1 einer Lösung zusammengegeben, in der 15,0 g 3 - Methoxy - 4 - hydroxyphenylbrenztraubensäure, 15,0 g L-Glutaminsäure und 15,0 g L-Asparaginsäure in 1-n wäßriger Kaliumhydroxydlösung aufgelöst worden waren, um den pH-Wert auf 8,5 einzustellen. Die so hergestellte Lösung wurde 20 Stunden unter Bewegung bei 30⁰C gehalten, und anschließend wurde der pH-Wert der Lösung mit 10%iger wäßriger Salzsäurelösung auf 2,5 eingestellt und zentrifugiert. Die dabei erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde unter reduziertem Druck konzentriert, bis das gesamte Volumen etwa 300 ml betrug. E>iese Lösung wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde zweimal mit der gleichen Menge Äthylacetat gewaschen wie bei der Extraktion und Gewinnung von 3-Methoxy-4-hydroxyphenylbrenztraubensäure aus dem Filtrat. Der pH-Wert der wäßrigen Schicht wurde auf 4,5 eingestellt, und die wäßrige Schicht wurde über Nacht in einem kalten Raum stehengelassen. Man erhielt 5,2 g roher Kristalle von L-3-Methoxy-4-hydroxyphenylalanin. Die Reinheit der Kristalle betrug 90% und wurde mittels Gas-Chromatographie bestimmt. Die Kristalle wurden in 100 ml einer etwa 2% igen wäßrigen Salzsäurelösung aufgelöst und dann mit Äthylacetat gewaschen. Die so behandelten Kristalle wurden zweimal durch Ausfällen beim isoelektrischen Punkt gereinigt, und man erhielt reinweiße Kristalle. Diese Kristalle wurden nochmals aus Wasser umkristallisiert, und man erhielt 3,6 g reine Kristalle von, L-3-Methoxy-4-hydroxyphenyl-alanin. Das Produkt wurde mittels Dünnschicht- und Gas-Chromatographie untersucht.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften dieser Kristalle waren wie folgt:

Schmelzpunkt: 208 bis 212⁰C (Zersetzung).

Optische Drehung: [«]!? = -5,60° (c = 3,05, 1 n-HCl, 1 = 1).

IR-Absorplionsspektrum (Nujol Mull) 3280 (NH₃ ⁺), 1627 (COO-) [cm-¹].

Diese Kristalle wurden mit Bromwasserstoffsäure entmethyliert. Man erhielt L-Dopa mit einer optischen Reinheit von 100%.

Mi? = -12,3° (c = 3,56, In-HCl, 1-1).

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von L-3,4-disubstituierten Phenylalaninen der allgemeinen Formel

   R¹O

   R²O

   CH₂CHCOOH
   NH-,

   Es ist bekannt, daß L-3,4-Dihydroxyphenyl-alanin (nachfolgend als »L-Dopa« bezeichnet) ein spezifisches pharmazeutisches Mittel gegen die Parkinsonsche Krankheit ist. L-3-Methoxy-4-hydroxyphenyl-alanin und L-3,4-Dimethoxyphenyl-alanin sind wichtige industrielle Ausgangsmaterialien für die Herstellung von L-Dopa.

   Bekanntlich wurde L-3,4-disubstituiertes Phenylalanin der folgenden allgemeinen Formel