DE2146597A1 - Method for stabilizing an enzyme lyolysing microorganism cells - Google Patents

Description

Verfahren zum Stabilisieren eines Mikroorganismenzellen lyolysierenden Enzyms. A method for stabilizing an enzyme which lyses microorganism cells.

(Zusatzanmeldung zu P 20 11 93511 und P 20 kO (Additional registration to P 20 11 93511 and P 20 kO

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Stabilisieren eines Mikroorganismenzellen lyolysierenden Enzyms; sie betrifft zugleich stabile Präparate, welche dieses Enzym und einen Stabilisator enthalten. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Stabilisieren eines Enzyms, das in der Lage ist, die Zellen von kariogenen Mikroorganismen zu lyolysieren, die zum Stamme Streptococcus gehören, wie z.B. kariogene Streptokokken und Lactobazillus, und betriift insbesondere stabile Präparate, welche das Enzym und einen Stabilisator enthalten.The invention relates to a method of stabilization an enzyme lyolysing microorganism cells; it also affects stable preparations that contain this enzyme and a stabilizer. The invention particularly relates to a method for stabilizing a Enzyme capable of lyolyzing the cells of cariogenic microorganisms belonging to the Streptococcus strain such as cariogenic streptococci and lactobacillus, and particularly concerns stable preparations, which contain the enzyme and a stabilizer.

209817/1260209817/1260

Bei der Suche nach Mikroorganismen, die in der Lage sind, ein die Zellen von Karies hervorrufenden Mikro Organismen lyolysierendes Enzym zu bilden, wurden einige Mikroorganismen entdeckt, die zum Stamme Streptomyces gehören, wie z.B. S-I Stamm (Streptomyces diastatochromogenes; ATCC No. 2148I, FERM-P No. 326), H-I9I Stamm (Streptomyces farinosus: ATCC No. 21482, FERM-P No. 327), H-402 Stamm (Streptomyces griseus var. H-402: ATCC No. 21483, FERM-P No. 328) und B-I829 Stamm (Streptomyces . ^>} i ATCC No. 21553, FERM-P No. 596), wobei ATGC für American Type Culture Collection, USA, und FERM für Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, steht.In the search for microorganisms capable of producing an enzyme lyolysing the cells of caries causing microorganisms, some microorganisms belonging to the strain Streptomyces, such as SI strain (Streptomyces diastatochromogenes; ATCC No. 2148I, FERM -P No. 326), H-I9I strain (Streptomyces farinosus: ATCC No. 21482, FERM-P No. 327), H-402 strain (Streptomyces griseus var. H-402: ATCC No. 21483, FERM-P No. . 328) and B-1829 strain (Streptomyces. ^>} I ATCC No. 21553, FERM-P No. 596), with ATGC for American Type Culture Collection, USA, and FERM for Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology , Japan, stands.

Diese zum Stamme Streptomyces gehörenden Mikroorganismen sind in der Lage, bei Züchtung in einem geeigneten Nährmedium ein Enzym zu produzieren, das zur Lyolysierung der Zellen von Karies erzeugenden Mikroorganismen befähigt ist. Das auf diese Weise gewonnene Enzym ist für die Verhütung und Behandlung von Zahn karies sehr wertvoll und kann hierfür mit verschiedenen herkömmlichen Trägern, wie Wasser, Zahnpasten, Zahnpulver, Salben usw. zu Präparaten für die Verhütung und Behandlung von Zahnkaries verarbeitet werden. Es kann auf unterschiedliche Weise angewendet werden: als Zahnpasta, Zahnpulver, Salbe, Mundwasser, Gurgelwasser, Kaugummi, Lutschbonbon usw.·These microorganisms, which belong to the strain Streptomyces, are able, when cultivated in a suitable Nutrient medium to produce an enzyme that lyolyses cells of tooth decay-producing microorganisms is capable. The enzyme obtained in this way is used to prevent and treat dental caries very valuable and can be used for this with various conventional carriers, such as water, toothpaste, tooth powder, Ointments, etc., are made into preparations for the prevention and treatment of dental caries. It can can be used in different ways: as toothpaste, tooth powder, ointment, mouthwash, gargle, Chewing gum, lolly, etc.

Die Herstellung des Enzyms und der Präparate, die dieses Enzym enthalten, sind bereits in den Patentanmel-The production of the enzyme and the preparations containing this enzyme are already in the patent applications.

geändert r^m&ß Eingabe eingegangen am ^J^ changed r ^ m & ß input received on ^ J ^

209817/1260209817/1260

214659?214659?

■ - 3 -■ - 3 -

düngen P 20 11 935,1 und P 20 i+0 Mi-O, ^ beschrieben.fertilize P 20 11 935.1 and P 20 i + 0 Mi-O, ^ described.

Das dort beschriebene Enzym ist jedoch gegen Hitze unbeständig; es verliert den größten Teil seiner Wirksamkeit, wenn es 20 Minuten bei 80⁰C gehalten wird, und etwa 80 % seiner Wirksamkeit, wenn es 20 Minuten bei 55° C gehalten wird. Auch dann, wenn das Enzym oder die dieses Enzym enthaltenden Präparate lange Zeit bei Raumtemperatur gehalten werden, wird das Enzym allmählich entaktiviert. Das Enzym ist also sehr instabil, und es geht nicht nur bei der Reinigung des lyolysierenden Enzyms in der Nährkultur, die durch Züchtung eines Streptomyces-Mikroorganismen gewonnen wurde, sondern auch bei der Zubereitung und Lagerung der dieses Enzym enthaltenden Präparate ein großer Teil seiner Wirksamkeit verloren.However, the enzyme described there is not resistant to heat; it loses most of its effectiveness when it is held for 20 minutes at 80 ⁰ C, and about 80% of its potency when it is held for 20 minutes at 55 ° C. Even if the enzyme or preparations containing the enzyme are kept at room temperature for a long time, the enzyme is gradually deactivated. The enzyme is therefore very unstable and a large part of its effectiveness is lost not only in the purification of the lyolyzing enzyme in the nutrient culture obtained by cultivating a Streptomyces microorganism, but also in the preparation and storage of the preparations containing this enzyme .

Ziel der vorliegenden Erfindung sind daher ein Verfahren zum Stabilisieren eines Mikroorganismenzellen lyolysierenden Enzyms, das durch Züchtung von Streptomyces-Mikroorganismen gewonnen worden ist, die Herstellung von stabilen Lösungen, Pulvern und anderen Präparaten, die dieses Enzym und einen Stabilisator enthalten, sowie die Verhütung und Bekämpfung von Zahnkaries unter Verwendung dieses Enzyms und eines damit vermischten Trägers.The aim of the present invention is therefore a method for stabilizing a microorganism cell lyolyzing enzyme produced by culturing Streptomyces microorganisms the production of stable solutions, powders and other preparations, containing this enzyme and a stabilizer, as well as the prevention and control of dental caries using this enzyme and a carrier mixed with it.

Bei der Suche nach einem wirksamen Stabilisator unter verschiedenen Sacchariden, Aminosäuren, oberflächenaktiven Mitteln usw. wurde nun überraschend gefunden, daß Sorbit, Saccharose, Mannose, Sorbose, Prolin und lösliche Stärke das betreffende Enzym außerordentlich wirksam stabilisieren. Unter diesen Stabilisatoren erweistWhen looking for an effective stabilizer among various saccharides, amino acids, surface active agents Agents etc. has now surprisingly been found that sorbitol, sucrose, mannose, sorbose, proline and soluble Starch stabilize the enzyme in question extremely effectively. Among these stabilizers it turns out

209817/1260209817/1260

sich Stärke als unwirksam in wässrigem Zustand, jedoch als wirksam in festem Zustand, und sie kann daher nicht in wässrigen Präparaten, sondern nur in festen Präparaten verwendet werden.Starch turns out to be ineffective in an aqueous state, however as effective in the solid state, and it cannot therefore be used in aqueous preparations, but only in solid preparations be used.

Erfindungsgemäß wird einer oder werden mehrere der Stabilisatoren Sorbit, Saccharose, Mannose, Sorbose, Prolin und lösliche Stärke dem Enzym oder der das Enzym enthaltenden Lösung zugesetzt, um diese zu stabilisieren. Gegebenenfalls, insbesondere im Falle der Verwendung von Stärke als Stabilisator, wird die Lösung zu einem stabilen Enzympulver gefriergetrocknet.According to the invention, one or more of the stabilizers sorbitol, sucrose, mannose, sorbose, Proline and soluble starch added to the enzyme or the solution containing the enzyme in order to stabilize it. If necessary, especially in the case of using starch as a stabilizer, the solution becomes too a stable enzyme powder freeze-dried.

Die derart erhaltenen, stabilen Enzymlösungen oder pulver können als Mundspülwasser verwendet werden, nachdem sie mit Wasser verdünnt oder in Wasser aufgelöst worden sind, oder sie können mit einem Träger zu stabilen Präparaten vermischt werden. Die erfindungsgemäßen Stabilisatoren können auch während der Zubereitung der das Enzym enthaltenden Präparate diesen zugesetzt werden.The stable enzyme solutions or powders obtained in this way can be used as mouthwash water after They have been diluted with water or dissolved in water, or they can be stabilized with a carrier Preparations are mixed. The stabilizers according to the invention can also be used during the preparation of the Enzyme-containing preparations are added to these.

Bei der Zubereitung der erfindungsgemäßen, stabilen Präparate können die üblichen Träger, wie z.B. Wasser, Zahnpasta, Salbe usw. verwendet werden. Im Falle der Verwendung von Sorbit, Saccharose, Mannose oder Sorbose als Stabilisator können zwar alle herkömmlichen Träger verwendet werden, jedoch wird die Verwendung von Wasser, Zahnpasta oder Salben deshalb vorgezogen, weil die den Stabilisator enthaltenden Präparate in festem Zustand hygroskopisch sind. Im Falle der Verwendung von löslicherWhen preparing the stable preparations according to the invention, the usual carriers, such as water, Toothpaste, ointment, etc. can be used. In the case of using sorbitol, sucrose, mannose or sorbose All conventional carriers can be used as a stabilizer, but the use of water, Toothpaste or ointments are preferred because the preparations containing the stabilizer are in a solid state are hygroscopic. In the case of using soluble

209817/1260209817/1260

2H65972H6597

Stärke als Stabilisator kann die Verwendung von Zahn pulver vorzuziehen sein, weil lösliche Stärke in einem wasserhaltigen Präparat nicht wirksam ist. Zahnpasta oder Zahnpulver können herkömmliche Zusatzstoffe, wie wasserunlösliche Poliermittel, z.B. Dicalziumphosphat, Tricalziumphosphat, Calziumcarbonat, Calziumsulfat , Magnesiumcarbonat usw., ein Plastifiziermittel, z.B. Wasser, Glycerin, Sorbit, Propylenglycol, Monoglycerinstearat, Petrolatum (Vaseline), Cetylalkohol usw., ein Geliermittel, wie z.B. Natriumcarboxymethylzellulose, Hydroxyäthylzellulpse, Polyvinylpyrrolidon, Traga canthgummi und außerdem ein Metallsalz eines höheren Alkoholsulfats, wie z.B. Natriumlaurylsulfat oder Kaliumlaurylsulfat oder Borax enthalten. Ein Zahnpulver enthält in der Regel ein Poliermittel. Als Salbengrundlage können Glycerin und Natriumcarboxymethylzellulose verwendet werden, die eine gelartige oder kremige Salbe ergeben.Starch as a stabilizer may be preferable to the use of tooth powder because it is soluble in starch water-based preparation is not effective. Toothpaste or tooth powder can contain conventional additives, such as water-insoluble polishing agents, e.g. dicalcium phosphate, Tricalcium phosphate, calcium carbonate, calcium sulfate, magnesium carbonate, etc., a plasticizer, e.g. Water, glycerin, sorbitol, propylene glycol, monoglycerin stearate, petrolatum (petrolatum), cetyl alcohol, etc. Gelling agents, such as sodium carboxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, gum tragacanth and also a metal salt of a higher alcohol sulfate such as sodium lauryl sulfate or potassium lauryl sulfate or contain borax. A tooth powder usually contains a polishing agent. As an ointment base Glycerin and sodium carboxymethyl cellulose can be used, which make a gel-like or creamy ointment result.

Die erfindungsgemäßen, stabilen Präparate können auch andere Zusätze enthalten, wie z.B. Sterilisatoren, Geschmack- und Farbstoffe, sofern diese nicht eine hemmende oder zersetzende Wirkung auf das Enzym oder den Stabilisator ausüben.The stable preparations according to the invention can also contain other additives, such as sterilizers, flavorings and colorings, provided these are not inhibitory or exert a decomposing effect on the enzyme or the stabilizer.

Die erfindungsgemäßen, stabilen Enzymlösungen oder pulver können nicht nur in der Form von Mundwassern, Zahnpasten, Zahnpulvern, Salben usw. verwendet werden, sondern auch in Form von Kautabletten und Lutschbonbons.The stable enzyme solutions or powder according to the invention not only can be used in the form of mouthwashes, toothpastes, tooth powders, ointments, etc., but also in the form of chewable tablets and lozenges.

209817/1260209817/1260

2H65972H6597

Bei der Herstellung solcher Kautabletten oder Bonbons können solche herkömmlichen Träger, wie z.B. Mannit, Sorbit, sowie Gleitmittel, Süßstoffe, Farbstoffe usw. verwendet werden.In the production of such chewable tablets or candies, conventional carriers such as mannitol, sorbitol, as well as lubricants, sweeteners, coloring agents, etc. can be used.

Die für die Zubereitung der erfindungsgemäßen Präparate verwendete Menge an Enzym kann mit der Art der Präparate und der Anwendungsmethode schwanken, jedoch können etwa 1 bis etwa 5 000 Einheiten, vorzugsweise 10 bis 3 000 Einheiten des Enzyms auf einmal eingemischt werden.The amount of enzyme used for the preparation of the preparations according to the invention can vary with the type of preparation and the method of application, however, about 1 to about 5,000 units, preferably 10 to 3,000 units of the enzyme are mixed in at one time.

Der erfindungsgemäße Stabilisator kann allein oder im Gemisch mit anderen Stabilisatoren zu einer Lösung oder einem Präparat dieses Enzyms in einem Mengenverhältnis von etwa 0,5 bis etwa 100 Gewichtsteilen, vorzugsweise von etwa 1 bis J>0 Gewichtsteilen auf 1 Gewichtsteil Enzyms zugesetzt werden.The stabilizer according to the invention can be added alone or in a mixture with other stabilizers to a solution or a preparation of this enzyme in a proportion of about 0.5 to about 100 parts by weight, preferably about 1 to> 0 parts by weight to 1 part by weight of enzyme.

Das erfindungsgemäß zu verwendende Enzym kann gewonnen werden, indem ein Mikroorganismus des Stammes Streptomyces, der in der Lage ist, ein Enzym zu erzeugen, das Zahnkaries verursachende Mikroorganismenzellen zu lyolysieren vermag, bei 20 bis 40⁰C mehrere Stunden bis mehrere Tage in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet wird, welches z.B. ein geeignetes Saccharid, Stickstofflieferanten, anorganische Salze und gegebenenfalls organische Stimulantien enthält.The enzyme according to the invention to be used can be obtained by producing a microorganism of the genus Streptomyces which is capable of an enzyme capable of lyolysieren the dental caries causing microorganisms cells at 20 to 40 ⁰ C for several hours to several days in an appropriate nutrient medium is cultured, which contains, for example, a suitable saccharide, nitrogen suppliers, inorganic salts and optionally organic stimulants.

Die verwendbaren Mikroorganismen sind nicht auf die eingangs erwähnten Streptomyceen-Stämme beschränkt, sondern können auch die Mutanten dieser Stämme umfassen, wie sieThe microorganisms that can be used are not limited to the Streptomyces strains mentioned at the outset, but rather may also include the mutants of these strains, like them

209817/1260209817/1260

durch natürliche Mutation oder mittels mutierender Methoden, wie z.B. Röntgenstrahlen, ultraviolettstrahlen, Stickstofflost usw. gewonnen werden.by natural mutation or by means of mutating methods, such as X-rays, ultraviolet rays, Nitrogen mustard etc. can be obtained.

Die Einheit an lyolysierender Aktivität des erfindungsgemäß zu verwndenden Enzyms wird nach der folgenden Methode berechnet: 0,4 ml einer Suspension von intakten Zellen oder erhitzten Zellen der zu lyolyslerenden Mikroorganismen, z.B. von kariogenem Streptococcus (BHT), 2 ml einer auf eine angemessene Konzentration verdünnten Enzymlösung und 1,6 ml eines O,025-molaren tris-HCl-Puffers (pH 7_f0) werden zu insgesamt if ml Volumen vermischt. Dieses Gemisch wird 5 Minuten bei 37°C gehalten und auf diese Weise der Zellen lyolysierenden Reaktion unterworfen. Dann wird mittels eines photoelektrischen Colorimeters die optische Dichte des Reaktionsgemisches bei 600 mu. gemessen und die Einheit der lyolysierenden Wirksamkeit des betreffenden Enzyms anhand der nachstehenden Gleichung berechnet. Eine Einheit der Aktivität wird definiert als die Menge an Enzym, die eine anfänglich lineare Abnahme der optischen Dichte von 0,001/ Minute ergibt. In der Kontrollprobe werden 2 ml Wasser anstelle von 2 ml Enzymlösung verwendet:The unit of lyolysing activity of the enzyme to be used according to the invention is calculated according to the following method: 0.4 ml of a suspension of intact cells or heated cells of the microorganisms to be lyolysed, e.g. of cariogenic streptococcus (BHT), 2 ml of a diluted to an appropriate concentration Enzyme solution and 1.6 ml of a 0.025 molar tris-HCl buffer (pH 7 _f 0) are mixed to a total of if ml volume. This mixture is kept at 37 ° C. for 5 minutes and thus subjected to the cell lyolysing reaction. The optical density of the reaction mixture is then measured at 600 μm using a photoelectric colorimeter . measured and the unit of lyolyzing activity of the enzyme in question calculated from the equation below. One unit of activity is defined as the amount of enzyme that gives an initial linear decrease in optical density of 0.001 / minute. In the control sample, 2 ml of water are used instead of 2 ml of enzyme solution:

(a - b) - (a - c) c - b Einheit/ml oder mg - _____________ ~ _______________(a - b) - (a - c) c - b unit / ml or mg - _____________ ~ _______________

0,001 . t · ν 0,001 · % · ν0.001. t · ν 0.001 · % · ν

a: Optische Dichte des Reaktionsgemisches bei 600 m/u, zur Zeit Null;a: optical density of the reaction mixture at 600 m / u, at time zero;

b: Optische Dichte des Reaktionsgemisches bei 600 m/ib: optical density of the reaction mixture at 600 m / i

209817/1260209817/1260

nach t Minuten}after t minutes}

c: Optische Dichte der Kontrollprobe bei 600 m^t nach t Minuten;c: Optical density of the control sample at 600 m ^ t after t Minutes;

t: Reaktionszeit (Minuten);t: reaction time (minutes);

v: Menge (ml oder mg) an tatsächlich verwendeter Original-Enzymlösung oder Enzympulver.v: Amount (ml or mg) of the original enzyme solution actually used or enzyme powder.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert.The invention is illustrated in more detail by the following examples.

Bezugsbeispiel 1:Reference example 1:

Der isolierte B-l829-Stamm wurde auf einer Agar-Schrägkultur inokuliert, die 1 % Glucose, 0,2 % Pepton, 0,1 % Hefeextrakt, 0,1 % Fleischextrakt und 1,5 % Agar enthielt, und wurde 7 Tage bei 30⁰C kultiviert. Die erhaltenen Sporen wurden in einen 500 ml-Sakaguchi-Kolben übertragen, der 50 ml flüssiges Medium vom pH 7,5 aus 2 % Dextrin, 0,5 % Sojabohnenpulver, 0,25 % Pepton, 0,5 % Dinatriumhydrogenphosphat, 0,1 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1 % Magnesiumsulfat und 0,5 % Natrium Chlorid enthielt, und wurde 3 Tage bei 30⁰C geschüttelt. Die dabei erhaltene Kulturbrühe wurde durch Filtration abgetrennt und ergab If9i5 &1 Enzymlösung.The isolated B-1829 strain was inoculated on an agar slant containing 1 % glucose, 0.2 % peptone, 0.1 % yeast extract, 0.1 % meat extract and 1.5 % agar, and was used for 7 days 30 ⁰ C cultivated. The obtained spores were transferred to a 500 ml Sakaguchi flask containing 50 ml of liquid medium, pH 7.5, consisting of 2 % dextrin, 0.5 % soybean powder, 0.25 % peptone, 0.5 % disodium hydrogen phosphate, 0.1 % Potassium dihydrogen phosphate, 0.1 % magnesium sulfate and 0.5 % sodium chloride, and was ^{shaken at 30 °} C. for 3 days. The culture broth thus obtained was separated off by filtration and gave If9i5 & 1 enzyme solution.

Bezugsbeispiel 2;Reference example 2;

Auf die gleiche Weise, wie im Bezugsbeispiel 1 beschrieben, wurde der isolierte B-l829-Stamm kultiviert. Die Zellen wurden mittels Zentrifuge von der Kultur -In the same manner as described in Reference Example 1, the isolated B-1829 strain was cultivated. The cells were removed from the culture using a centrifuge.

209817/1260209817/1260

brühe abgetrennt. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch Sättigung mit Ammoniumsulfat auf 60 % Sättigung ausgesalzen. Der gebildete Niederschlag wurde in 5 ml eines 0,01-molaren Phosphatpuffers (pH 7,0) gelöst und gegen fließendes Wasser Zl\ Stunden dialysiert, wobei 5 ml Lösung erhalten wurden. Die gewonnene Enzymlösung wurde zu 10 mg Enzympulver gefriergetrocknet.broth separated. The supernatant liquid was salted out to 60% saturation by saturation with ammonium sulfate. The precipitate formed was dissolved in 5 ml of a 0.01 molar phosphate buffer (pH 7.0) and dialyzed against running water for 10 hours, 5 ml of solution being obtained. The enzyme solution obtained was freeze-dried to give 10 mg of enzyme powder.

Beispiel 1:Example 1:

In 5 ml eines 0,01-molaren Phosphatpuffers (pH 6,5) wurden 1 mg des gemäß Bezugbeispiels 2 gewonnenen Enzympulvers sowie verschiedene Stabilisatoren gelöst, und das Gemisch wurde 1 Stunde auf 55° C erwärmt. In der erhaltenen Lösung wurde die Aktivität an Enzym gemessen, um ein Maß für die verbliebene Wirksamkeit des Enzyms zu erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt:In 5 ml of a 0.01 molar phosphate buffer (pH 6.5) 1 mg of the enzyme powder obtained according to Reference Example 2 and various stabilizers were dissolved, and that Mixture was heated to 55 ° C for 1 hour. The enzyme activity was measured in the obtained solution to obtain a Measure of the remaining effectiveness of the enzyme. The results are summarized in Table 1:

ArtArt Tabelle 1:Table 1: Verbliebene WirksamRemaining effective Stabilisatorstabilizer KontrollprobeControl sample keit an Enzym (%)enzyme (%) SorbitSorbitol Konzentration
(Gew.-%) concentration
(% By weight ) 15,715.7 SorbitSorbitol -- 89,489.4 MannoseMannose 5050 94,894.8 SaccharoseSucrose 7070 82,082.0 ProlinProline 7070 82,782.7 ProlinProline 7070 69,469.4 3030th 73,473.4 4040

209817/1260209817/1260

Prolin
SorboseProline
Sorbose

- 10 ■ Tabelle 1 (Fortsetzung);- 10 ■ Table 1 (continued);

50 6050 60

88,3 68,588.3 68.5

PolyäthylenglycolPolyethylene glycol

3030th

Polyoxyäthylen-
sorbitanmonooleat
(Tween 80)Polyoxyethylene
sorbitan monooleate
(Tween 80) 0,010.01 Sorbitanmonooleat
(Span 80)Sorbitan monooleate
(Span 80) 0,010.01 MaltoseMaltose 5050 Glucoseglucose 7070 GlycerinGlycerin 2020th MannitMannitol 1010 Lösliche StärkeSoluble starch 1010 LactoseLactose 1010 XyloseXylose 7070 InositolInositol 1010 GlycinGlycine 0,50.5 Cystein-HClCysteine HCl 0,50.5 NatriumglutamatSodium glutamate 11

12,812.8

14,714.7

11,511.5

12,5 ^,1 17,1 25>7 24,6 21,6 13,3 25,0 19,0 15,3 26,712.5 ^, 1 17.1 25> 7 24.6 21.6 13.3 25.0 19.0 15.3 26.7

Wie aus diesen Ergebnissen klar hervorgeht, geht unter diesen strengen Bedingungen in der Kontrollprobe fast die gesamte Wirksamkeit verloren, während in den Lösungen mit den erfindungsgemäßen Stabilisatoren mit Ausnahme der löslichen Stärke das Enzym wirksam stabilisiert wird (lösliche Stärke ist nicht wirksam in einer wässrigen Lösung, jedoch in festen Präparaten).As is clear from these results, the control sample goes under these severe conditions almost all of its effectiveness is lost while using the stabilizers according to the invention in the solutions Except for soluble starch the enzyme is effectively stabilized (soluble starch is not effective in a aqueous solution, but in solid preparations).

209817/1260209817/1260

- li -- li -

Beispiel 2:Example 2:

In 150 ml einer 70 gew.%-igen wässrigen Lösung von Sorbit wurden 150 mg Enzympulver gelöst, das auf die gleiche Weise, wie im Bezugsbeispiel 2 beschrieben, gewonnen war, und das Gemisch wurde einen Monat bei 30 C stehen gelassen. Die Änderung der verbliebenen Wirksamkeit des Enzyms wurde ermittelt. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 2:In 150 ml of a 70% strength by weight aqueous solution of In sorbitol, 150 mg of enzyme powder, which was obtained in the same manner as described in Reference Example 2, was dissolved and the mixture was allowed to stand at 30 ° C for one month. The change in the remaining effectiveness of the enzyme was determined. The results are shown in Table 2:

Tabelle 2:Table 2:

Verbliebene Wirksamkeit an EnzymRemaining enzyme activity

KontrollprobeControl sample SorbitzusatzSorbitol additive 100,0100.0 100,0100.0 22,522.5 99,699.6 11,111.1 88,1 .88.1. 7_tB7 _t B 76,776.7 7,27.2 71,671.6

TageDays

Beispiel 3:Example 3:

Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 beschrieben, jedoch unter Verwendung einer 50 gew,#-igen wässrigen Lösung von Prolin anstelle einer 70 gew.S6-igen wässrigen Lösung von Sorbit, wurde die stabilisierende Wirkung von Prolin getestet. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 3·In the same way as described in Example 2, however, using a 50% strength by weight aqueous Solution of proline instead of a 70% by weight S6 aqueous solution Solution of sorbitol, the stabilizing effect of proline was tested. The results are shown in Table 3

209817/1260209817/1260

Tabelle 3:Table 3:

KontrollprobeControl sample 4:4: Verbliebene Wirksamkeit anRemaining effectiveness on 100,0100.0 Enzym {%) Enzyme {%) TageDays 23,423.4 ProlinzusatzProline addition OO 13,213.2 100,0100.0 77th . 8,5. 8.5 100,0100.0 1414th 7,87.8 94,194.1 2121st 82,282.2 3030th 76,976.9 Beispielexample

In 1 ml Wasser wurden 15 mg des gemäß Bezugbeispiel 2 erhaltenen Enzympulvers und außerdem 20 mg Sorbit gelöst. Das Gemisch wurde gefriergetrocknet. Nachdem das Produkt 3 Monate bei 30 C stehen gelassen wurde, wurde die Aktivität des Enzyms gemessen und nur eine geringe Erniedrigung der Wirksamkeit beobachtet.In 1 ml of water, 15 mg of the according to reference example 2 obtained enzyme powder and also dissolved 20 mg of sorbitol. The mixture was freeze dried. After that The product was left to stand at 30 ° C. for 3 months the activity of the enzyme was measured and only a slight decrease in the effectiveness was observed.

Beispiel 5:Example 5:

In 1 ml Wasser wurden 15 mg des gemäß Bezugsbeispiels 2 gewonnenen Enzympulvers und außerdem 10 mg Saccharose gelöst. Das Gemisch wurde gefriergetrocknet, Nachdem das Produkt 3 Monate bei 30⁰C stehen gelassen wurde, wurde die Wirksamkeit des Enzyms gemessen und eine Erniedrigung der Aktivität von weniger als 10 % festgestellt.15 mg of the enzyme powder obtained according to Reference Example 2 and also 10 mg of sucrose were dissolved in 1 ml of water. The mixture was freeze-dried. After the product had been ^{left to stand for 3 months at 30 °} C., the activity of the enzyme was measured and a reduction in activity of less than 10 % was found.

209817/1260209817/1260

2U65972U6597

- 13 Beispiel 6: - 13 Example 6:

Ein gefriergetrocknetes Produkt aus 2 ml der gemäß Bezugsbeispiel 1 erhaltenen Enzymlösung, 10 g Sorbitpulver, 360 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na₂HPO, »12 HA freeze-dried product made from 2 ml of the enzyme solution obtained according to reference example 1, 10 g sorbitol powder, 360 g disodium hydrogen phosphate (Na ₂ HPO, »12 H

g Kalxumdihydro genpho sphat (KH_PP0,), 1 g Saccharin und 0,5 g Geschmackstoffen wurde zu einem pulverigen Gemisch vermengt. Das Gemisch kann mit destilliertem Wasser auf das 200-fache Volumen verdünnt und dann als Mund Spülwasser verwendet werden.g Kalxumdihydrogenpho sphat (KH _P P0,), 1 g saccharin and 0.5 g flavorings were mixed to a powdery mixture. The mixture can be diluted 200 times its volume with distilled water and then used as a mouth rinse.

Beispiel 7-11:Example 7-11:

Wässrige Lösungen von löslicher Stärke mit verschiedenen Konzentrationen wurden zubereitet, indem lösliche Stärke unter Erwärmen in Wasser gelöst und dann das Gemisch gekühlt wurde. In 5 Ml jeder dieser wässrigen Lösungen wurden 60 mg Enzympulver gelöst. Die Gemische wurden zu Pulvern gefriergetrocknet. Diese Pulver wurden Tage bei ifO C stehen gelassen, und dann wurde die verbliebene Aktivität gemessen. Die.Ergebnisse zeigt Ta belle l\\ . Aqueous solutions of soluble starch having various concentrations were prepared by dissolving soluble starch in water with heating and then cooling the mixture. 60 mg of enzyme powder were dissolved in 5 ml of each of these aqueous solutions. The mixtures were freeze dried to powders. These powders were left to stand at ifO C for days, and then the remaining activity was measured. The results are shown in table l \\.

209817/1260209817/1260

NJ O CO 00NJ O CO 00

ro cn ro cn

Konzentration anFocus on KontrollprobeControl sample Tabelle 4:Table 4: 00 (Einheit/ml)(Unit / ml) Beispielexample löslicher Stärkesoluble starch EnzymwirksamkeitEnzyme effectiveness 270270 Nr.No. (mg/5 ml)(mg / 5 ml) TageDays 3h03h0 99 IfOOIfOO 283283 252252 77th 300300 253253 220220 88th 200200 138138 160160 99 100100 216216 8080 1010 5050 1919th 1111 66th

Verbliebene
Enzymwirksamkeit (%)Remaining
Enzyme efficiency (%)

93,3 64,7 58,7 31,6 13,8 2,893.3 64.7 58.7 31.6 13.8 2.8

2U65972U6597

- 15 Beispiel 12: - 15 Example 12:

Das gemäß Beispiel 11 erhaltene Pulver und ein Kontrollpulver wurden 6 Monate bei 30°C stehen gelassen. Dann wurde die verbliebene Aktivität gemessen. In der Kontrollprobe sank die Wirksamkeit auf 3>8 %> während in dem die lösliche Stärke enthaltenden Pulver eine fast 100 %-ige Wirksamkeit zurückblieb.The powder obtained in Example 11 and a control powder were left to stand at 30 ° C. for 6 months. The remaining activity was then measured. In the control sample the potency decreased to 3> 8 %> while in the powder containing the soluble starch an almost 100% potency remained.

Beispiel 13:Example 13:

Zu 2 ml Wasser wurden 130 mg lösliche Stärke gegeben, das Gemisch wurde zur Lösung der Stärke erhitzt und dann gekühlt. In der wässrigen Stärkelösung wurden 20 mg gefriergetrocknetes Enzym gemäß Bezugsbeispiel 2 gelöst, und das Gemisch wurde zu 150 mg eines stabilisierten Enzympulvers gefriergetrocknet.To 2 ml of water was added 130 mg of soluble starch, the mixture was heated to dissolve the starch, and then chilled. 20 mg of freeze-dried enzyme according to Reference Example 2 were dissolved in the aqueous starch solution, and the mixture was freeze-dried to 150 mg of a stabilized enzyme powder.

Nach Auflösen in 100 ml Wasser kann dieses Pulver als Mundspülwasser verwendet werden.After dissolving in 100 ml of water, this powder can be used as a mouthwash.

Beispiel 14:Example 14:

Eine Zahnpasta wurde nach der folgenden Rezeptur hergestellt: A toothpaste was made according to the following recipe:

Glycerin 25,50Glycerin 25.50

Natriumcarboxymethylzellulose 0,95Sodium carboxymethyl cellulose 0.95

Destilliertes Wasser 20,00Distilled water 20.00

Dicalziumphosphat 4-6,00Dicalcium phosphate 4-6.00

209817/1260209817/1260

2H65972H6597

Calziumcarbonat 5,80Calcium carbonate 5.80

Sorbit 0,85Sorbitol 0.85

Saccharin 0,15Saccharin 0.15

Geschmack 0,35Taste 0.35

Enzymlösung gemäß Bezugsbeispiel 1 '^Enzyme solution according to Reference Example 1 '^

Zusammen 100,00Total 100.00

Beispiel 15:Example 15:

Ein Zahnpastapulver wurde nach der folgenden Rezeptur hergestellt:A toothpaste powder was made according to the following recipe:

liatriumlaurylsulfatliatrium lauryl sulfate 0,30.3 NatriumcarboxymethylzelluloseSodium carboxymethyl cellulose 11 Dinatriumpho s phatDisodium phosphate 22 SaccharoseSucrose 0,50.5 SaccharinSaccharin 0,20.2 Geschmacktaste 1,01.0 Enzympulver gemäß Bezugsbeispiel 2Enzyme powder according to reference example 2 0,010.01 DicalziumphosphatDicalcium phosphate Restrest Beispiel 16:Example 16:

Ein Mundspülwasser wurde nach der folgenden Rezeptur zubereitet:A mouthwash was prepared according to the following recipe:

209817/1260209817/1260

Enzymlösung gemäß Bezugsbeispiel 1 0,5Enzyme solution according to Reference Example 1 0.5

Äthylalkohol 5,0 'Ethyl alcohol 5.0 '

Prolin 0,6Proline 0.6

Saccharin 0,2Saccharin 0.2

Geschmack 0,3Taste 0.3

Destilliertes Wasser RestDistilled water remainder

Beispiel 17:Example 17:

Eine Zannputzkrem wurde nach der folgenden Rezeptur hergestellt:A Zannputzkrem was made according to the following recipe manufactured:

Glycerin 15»0Glycerin 15 »0

Natriumcarboxymethylcellulose 5»0Sodium carboxymethyl cellulose 5 »0

Glycerinmonostearat 5>0Glycerol monostearate 5> 0

Weißes Petrolatum 2,0White petrolatum 2.0

Wasser 56,k Water 56, k

Cetylalkohol 3^ Cetyl alcohol 3 ^

Prolin 10,0Proline 10.0

Enzymlösung gemäß Bezugsbeispiel 1 O₁K Enzyme solution according to Reference Example 1 O ₁ K

Saccharin 0,2Saccharin 0.2

Geschmack 0,5Taste 0.5

Zusammen 100,0Together 100.0

209817/1260209817/1260

Claims (5)

eingegangen Betr.: Patentanmeldung P 21 k6 591Λ Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. - unsere Nr. 17 577 - Patentansprüche:received Re: Patent application P 21 k6 591Λ Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. - our No. 17 577 - patent claims: 1. Verfahren zum Stabilisieren eines Enzyms, das in der Lage ist, Zellen von Karies bewirkenden Mikroorganismen zu lyolysieren, und das durch Züchtigung eines Streptomyces-Mikroorganismus gewonnen wurde, dadurch gekennzeichnet, daß diesem Enzym mindestens eine der folgenden Verbindungen Sorbit, Saccharose, Mannose, Sorbose, Prolin und lösliche Stärke als Stabilisator zugesetzt wird.1. A method of stabilizing an enzyme capable of removing cells from caries-causing microorganisms to lyolyze, and which was obtained by culturing a Streptomyces microorganism, characterized in that that this enzyme contains at least one of the following compounds sorbitol, sucrose, mannose, sorbose, proline and soluble Starch is added as a stabilizer. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stabilisator in einem Verhältnis von etwa 0,5 bis 100 Gewichtsteile auf 1 Teil Enzym zugesetzt wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the stabilizer in a ratio of about 0.5 to 100 Parts by weight to 1 part of enzyme is added. 3. Stabilisierte Enzymlösung oder Enzympulver, bestehend aus einem Enzym, das in der Lage ist, Zellen von Zahnkaries bewirkenden Mikroorganismen zu lyolisieren und durch Züchtigung eines Streptomyces-Mikröorganismus gewonnen wurde, und mindestens einer der folgenden stabilisierenden Verbindungen Sorbit, Saccharose, Mannose, Sorbose, Prolin und lösliche Stärke.3. Stabilized enzyme solution or enzyme powder, consisting of from an enzyme that is able to lyolize cells of dental caries-causing microorganisms and by culturing of a Streptomyces microorganism, and at least one of the following stabilizing compounds Sorbitol, sucrose, mannose, sorbose, proline and soluble starch. If. Stabilisierte Enzymlösungen oder Enzympulver nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem herkömmliche Trägerstoffe und/oder Streckmittel, wie z.B. Wasser, Zahnpasten oder Salbengrundlagen enthalten.If. Stabilized enzyme solutions or enzyme powders according to claim 3, characterized in that it is also conventional Contain carriers and / or extenders such as water, toothpastes or ointment bases. 5. Mittel zur Verhütung und Behandlung von Karies enthaltend -.-die stabilisierte Enzymlösung oder das Enzympulver5. Means for the prevention and treatment of caries containing -.- the stabilized enzyme solution or the enzyme powder 209817/1260209817/1260 ORIGINAL INSPECTEDORIGINAL INSPECTED 2U65972U6597 eingegangen ntn UWA received ntn UWA nach Anspruch 3 oder 4 als Wirkstoffaccording to claim 3 or 4 as an active ingredient Für: Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd, Osaka /For: Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd, Osaka / (Dr.H.J.Wolff) Rechtsanwalt(Dr H.J. Wolff) Lawyer 209817/1260209817/1260