DE2141387A1 - METHOD FOR EVAPORATION, DESTRUCTION, EXCITATION AND / OR IONIZATION OF SAMPLE MATERIAL LIMITED TO MICRO RANGES AND ARRANGEMENT FOR PERFORMING THE METHOD - Google Patents
METHOD FOR EVAPORATION, DESTRUCTION, EXCITATION AND / OR IONIZATION OF SAMPLE MATERIAL LIMITED TO MICRO RANGES AND ARRANGEMENT FOR PERFORMING THE METHODInfo
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Description
Verfahren zur auf Mikrobereiche beschränkten Verdampfung,Process for evaporation restricted to micro-ranges,
Zerstörung, Anregung und/oder Ionisierung von Probenmaterial soitfie Anordnung zur Durchführung des VerfahrensDestruction, excitation and / or ionization of sample material as well as an arrangement for carrying out the method
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur auf Mikrobereiche beschränkten Verdampfung, Zerstörung, Anregung und/oder Ionisierung von Probenmaterial mittels kohärenter elektromagnetischer Strahlung, die durch ein optisches System auf die Probe fokussiert wirdoThe invention relates to a method for evaporation, destruction and excitation restricted to micro-areas and / or ionization of sample material by means of coherent electromagnetic radiation generated by an optical System is focused on the sample o
Ein derartiges Verfahren kann entweder zum Erzeugen bestimmter gewünschter und zu untersuchender Veränderungen und Zerstörungen an der Probe selbst oder zum Erzeugen einer Emission von Atomen und Molekülen des Probenmate-Such a method can either be used to generate certain desired changes to be investigated and destruction of the sample itself or to generate an emission of atoms and molecules of the sample material
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rials im geladenen oder ungeladenen Zustand dienen, die dann mit weiteren Nachweismethoden, z.B. Massenspektrometrie, weiter analysiert werden. Anordnungen zur Durchführung eines solchen Verfahrens und Prinzipüberlegungen über seine Anwendbarkeit sind aus der OS 1 598 632 bekannt. Verhältnismäßig problemlos ist die Anwendung eines solchen Verfahrens dann, wenn es sich um stark absorbierendes Probenmaterial handelt und außerdem an die Kleinheit des zu analysierenden Bereichs keine besonders grossen Anforderungen gestellt werden.rials are used in the charged or uncharged state, which can then be used with further detection methods, e.g. mass spectrometry, further analyzed. Arrangements for carrying out such a procedure and considerations of principle Its applicability is known from OS 1,598,632. Using one is relatively problem-free such a method when it comes to strongly absorbing sample material and also to the smallness The area to be analyzed does not have particularly high requirements.
Der Erfindung liegt jedoch die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der genannten Art auf biologisches Probenmaterial anzuwenden und dabei Untersuchungen im subzellulären Bereich durchzuführen. Es soll also ein "Strahlenstichverfahren" geschaffen werden, mit dem aus kleinsten, wohl definierten Bereichen von biologischen Mikrostrukturen, z.B. Zellen bzw. Zellenbestandteilen, Materie entfernt werden kann, wobei entweder die hierdurch hervorgerufenen Veränt derungen und Zerstörungen und ihr Einfluß auf den betreffenden Mikroorganismus Gegenstand der Untersuchung sind (z.B. "Genchirurgie" und ähnliche Anwendungsgebiete) oder die Zusammensetzung des emittierten Materials gemessen und dadurch Aufschluß über die Verteilung bestimmter Substanzen innerhalb der Zellen gewonnen wird. Beispiele für solcheHowever, the invention is based on the object of a method of the type mentioned on biological sample material apply and carry out examinations in the subcellular area. So it is supposed to be a "radiation stab procedure" be created, with which from the smallest, well-defined areas of biological microstructures, e.g. Cells or cell components, matter can be removed, either the resulting Veränt Changes and destruction and their influence on the microorganism concerned are the subject of the investigation (e.g. "gene surgery" and similar fields of application) or the composition of the emitted material is measured and this provides information about the distribution of certain substances within the cells. Examples of such
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Untersuchungen sind z.B. die allgemeine Erforschung der Lebens- und Stoffwechselvorgänge und Transportmechanismen innerhalb der Zelle und ihre Steuerung durch Enzyme, die an Substrukturen der Zelle wie Membranen, Mitochondrien, Lysosomen und Myofilamente gebunden sind. Insbesondere interessiert dabei die subzelluläre Verteilung der für die Enzymtätigkeit wichtigen aktivierenden oder hemmenden Ionen (z.B. Na , K , Mg+) und ihre Ortsveränderungen. Ionenverteilungen innerhalb der Zelle spielen auch eine erhebliche Rolle bei der Erforschung von Herzmuskelerkrankungen, Nierenerkrankungen, in der Krebsforschung und dergleichen. Schließlich können auch allgemeine Erkenntnisse über die Wirksamkeit bekannter oder neuer Pharmaka durch Untersuchung der Verteilung des betreffenden Wirkstoffs innerhalb, der Zelle gewonnen werden =Investigations are, for example, the general research into the life and metabolic processes and transport mechanisms within the cell and their control by enzymes that are bound to substructures of the cell such as membranes, mitochondria, lysosomes and myofilaments. Of particular interest is the subcellular distribution of the activating or inhibiting ions (e.g. Na, K, Mg + ) that are important for enzyme activity and their changes in location. Ion distributions within the cell also play a significant role in research into cardiac muscle diseases, kidney diseases, cancer research and the like. Finally, general knowledge about the effectiveness of known or new pharmaceuticals can be obtained by examining the distribution of the relevant active ingredient within the cell =
Der Amrendung des eingangs genannten Verfahrens- auf diesem Aufgabengebiet stehen erhebliche Schwierigkeiten entgegen. Erfolgreiche Versuche, das Verfahren entsprechend anzupassen und diese Schwierigkeiten zu überwinden, sind bisher nicht bekannt geworden. Eine HauptSchwierigkeit besteht dann, wenn das Absorptionsvermögen biologischen Probenmaterials für die anregende Laserstrahlung sehr gering ist, insbesondere wenn es sich um mikroskopisch beobachtbare Dünnschichtpräparate mit Zellflüssigkeit enthaltendem Zellenmaterial handelt. Ein zweitesThe Amrendung of the procedure mentioned at the beginning this area of activity faces considerable difficulties. Successful attempts to match the procedure to adapt and to overcome these difficulties have not yet become known. One major difficulty exists when the absorption capacity of biological sample material for the stimulating laser radiation is very low, especially when it comes to microscopically observable thin-layer specimens with cell fluid containing cell material acts. A second
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Hauptproblem besteht in der Forderung nach äußerst kleinen Abmessungen des von der Laserstrahlung tatsächlich erfaßten und zur Emission bzw. Verdampfung von Material angeregten Bereiches. Für die Untersuchung subzellulärer Strukturen sollte die Abmessung dieses Bereiches in allen Richtungen maximal zwischen 1 und 2 μ, vorzugsweise aber unter 1 μ bis zu wenigen Zehnteln μ liegen. Einerseits gelangt man bei der Fokussierung Von Laserstrahlung auf derart kleine Bereiche bereits an die Grenze des durch Beugung und Wellenlänge gegebenen Auflösungsvermögens des optischen Systems, und andererseits wäre das Volumen eines derart kleinen Bereiches um mindestens zwei Grössenordnungen kleiner als die bei bisherigen Versuchen zur Laser-Verdampfung von Probenmaterial erfaßten Volumina, und entsprechend nimmt die Zahl der emittierten und nachweisbaren Ionen ab.The main problem is the requirement for extremely small ones Dimensions of the actually detected by the laser radiation and for the emission or evaporation of material excited area. For the study of subcellular structures, the dimension of this area should be in all Directions are between 1 and 2 μ, but preferably below 1 μ up to a few tenths of a μ. On the one hand arrived When focusing laser radiation on such small areas, one already reaches the limit of diffraction and wavelength given the resolving power of the optical system, and on the other hand would be the volume such a small area by at least two orders of magnitude smaller than the volumes recorded in previous attempts at laser evaporation of sample material, and accordingly the number of emitted and detectable ions decreases.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Erkenntnis, daß bei Erhöhung der Leistungsdichte im Fokus eines Laserstrahls die Absorption in schwach absorbierendem Probenmaterial wie z.B. biologischem Material, sich in einem verhältnismäßig engen Intervall sprunghaft erhöht, dessen Lage und Breite von dem betreffenden Material und der verwendeten Wellenlänge abhängen kann. Während man unterhalb der betreffenden Grenze praktischThe method according to the invention is based on the knowledge that when the power density is increased, the focus of a laser beam the absorption in weakly absorbing sample material such as biological material, the position and width of the material in question increases by leaps and bounds in a relatively narrow interval and the wavelength used. While you are practically below the relevant limit
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fehlende Absorption und kaum Emission von Atomen oder Ionen des Probenmaterials beobachtet, tritt oberhalb der Grenze eine sehr starke Absorption mit praktisch vollständiger Materialzerstörung ein.lack of absorption and hardly any emission of atoms or ions of the sample material observed occurs above the Limit a very strong absorption with practically complete material destruction.
Erfindungsgemäß ist nun ein Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gekennzeichnet, daß man zur Beeinflussung von biologischem Probenmaterial und Erzielung einer unter Zellengröße liegenden Ausdehnung des angeregten Bereiches der Probe die Leistungsdichte der Strahlung derart einstellt, daß sie im Fokus im Beugungsmaximum nullter Ordnung oberhalb, im Beugungsmaximum erster Ordnung dagegen unterhalb der Grenze liegt, bei der die sprunghafte Steigerung der Absorption im Probenmaterial eintritt.According to the invention, a method is now that of the introduction said type characterized in that one is used to influence biological sample material and achieve an extension of the excited area of the sample that is below the cell size, the power density of the radiation so that it is in focus in the zero order diffraction maximum above, in the first order maximum diffraction Order, on the other hand, is below the limit at which the sudden increase in absorption in the sample material entry.
Man erzielt hierdurch den Vorteil, daß man einerseits im Fokus im zentralen Beugungsscheibchen sehr starke Absorption und dementsprechend eine starke Emission von ungeladenen und geladenen Teilchen des Probenmaterials erhält und daß andererseits diese starke Absorption auf das zentrale Beugungsscheibchen beschränkt ist, während bereits im Beugungsmaximum erster Ordnung und in allen weiteren Beugungsringen praktisch keine Absorption der Strahlung mehr eintritt und das Probenmaterial somit unbeeinflußt bleibt. Hierdurch ist es möglich, die Abmes-This has the advantage that, on the one hand, there is a very strong focus in the central diffraction disk Absorption and, accordingly, a strong emission of uncharged and charged particles of the sample material and that on the other hand this strong absorption is limited to the central diffraction disk while Already in the first order diffraction maximum and in all further diffraction rings there is practically no absorption of the Radiation enters more and the sample material thus remains unaffected. This makes it possible to
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sungen des Areals, von dem Material aus der Probe austritt, sehr stark zu verkleinern und zwar noch unter die Grenze, die sich theoretisch nach den Gesetzen der Beugungsoptik für die Größe des Fokus ergibt. Erst hierdurch wird die Anwendung des·Verfahrens für die Untersuchung biologischen Probenmaterials im subzellulären Bereich möglich. Voraussetzung hierfür ist die Tatsache, daß die sprunghafte Erhöhung der Absorption so ausgeprägt ist, daß es möglich ist, das Austreten von Material nur im nullten, nicht aber im ersten Beugungsmaximum erfolgen zu lassen. Bei sorgfältiger Justierung und Konstanthaltung der Leistungsdichte kann es sogar möglich sein, die starke Absorption auf einen kleinen Bereich im Mittelpunkt bzw. Maximum des zentralen Beugungsscheibchens zu begrenzen, wodurch das Auflösungsvermögen noch weiter gesteigert werden kann.to reduce the size of the area from which material emerges from the sample, even below the Limit which theoretically results from the laws of diffraction optics for the size of the focus. Only then will apply the · procedure for investigation biological sample material in the subcellular area possible. The prerequisite for this is the fact that the sudden increase in absorption is so pronounced that it is only possible for material to escape in the zeroth, but not in the first diffraction maximum. With careful adjustment and keeping constant the power density may even make it possible to focus the strong absorption on a small area or to limit the maximum of the central diffraction disk, whereby the resolution can be increased even further.
Es wurde allerdings gefunden, daß beim Arbeiten in dem genannten Bereich der Leistungsdichte die Gefahr auftritt, daß sich die auf das zentrale Beugungsscheibchen konzentrierte Anregung und Aufheizung des Probenmaterials durch Sekundärprozesse, insbesondere vermutlich Stoßwellen, selbsttätig im Probenmaterial ausbreitet und zu einer explosionsartigen Vergrößerung des von der Abtragung und Verdampfung erfaßten Bereiches führt. Dieser Gefahr kann durch geeignete Wahl der Wellenlänge und/oderHowever, it has been found that when working in the specified range of power density, there is a risk of that the excitation and heating of the sample material concentrated on the central diffraction disk by secondary processes, in particular presumably shock waves, spreads and closes automatically in the sample material leads to an explosive enlargement of the area covered by the erosion and evaporation. This Danger can be caused by a suitable choice of wavelength and / or
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der Impulsdauer der verwendeten Laserstrahlung entgegengewirkt werden.the pulse duration of the laser radiation used can be counteracted.
Vorzugsweise sollte die Leistungsdichte im Fokus im Beugungsmaximum nullter Ordnung oberhalb, im Beugungsmaximum erster Ordnung unterhalb einer Grenze liegen, die für übliches biologisches Probenmaterial und für normaleThe power density in the focus should preferably be in the zero order diffraction maximum above, in the diffraction maximum first order are below a limit for normal biological sample material and for normal
7 9/2 Laserwellenlängen bei etwa 10 bis 10 W/cm liegt und sich für das jeweils vorliegende Probenmaterial und die benutzte "Wellenlänge durch einfache Versuche ermitteln läßt.7 9/2 laser wavelengths is around 10 to 10 W / cm and can be determined for the respective sample material and the "wavelength used" by means of simple experiments leaves.
Um einerseits die Absorption der verwendeten Strahlung im Probenmaterial zu erhöhen und dadurch mit geringeren Leistungsdichten"arbeiten zu können und um andererseits einen Fokus mit nach den Beugungsgesetzen kleineren Abmessungen zu erzielen, arbeitet man vorzugsweise mit einem im UV-Bereich emittierenden Laser oder einem Laser, dessen Strahlung durch Frequenzverdoppelung bzw. durch 'nichtlineare Effekte in den UV-Wellenlängenbereich transponiert wird.On the one hand, to increase the absorption of the radiation used in the sample material and thus to reduce it Power densities "and on the other hand to be able to work To achieve a focus with smaller dimensions according to the laws of diffraction, one preferably works with a laser emitting in the UV range or a laser whose radiation is generated by frequency doubling or by 'Nonlinear effects are transposed into the UV wavelength range.
Das Arbeiten in dem genannten Bereich der Leistungsdichte ist zwar besonders vorteilhaft im Hinblick auf die f" rohr kleiner Anregungsbereiche. Dabei kann je-Working in the mentioned range of power density is particularly advantageous with regard to the for small areas of excitation.
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doch der Nachteil auftreten, daß das Energiespektrum der vermutlich durch verschiedene Prozesse wie Verdampfung, Stoßionisation, Feldemission, den angeregten Bereich verlassenden geladenen Teilchen äußerst breit gezogen ist. Es reicht von 0 bis über 1000, bei mehrfach geladenen Ionen auch bis über 2000 eV. Es ist kaum ein Massenspektrometer bekannt, welches Ionen mit einem derartig breiten Energiespektfum aufnehmen und verarbeiten kann. Es wäre deshalb eine Vorselektion nach Energie notwendig, was einen starken Verlust an Nachweiswahrscheinlichkeit mit sich bringen würde. Um diese Schwierigkeit wenigstens teilweise auszuschalten, ist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung vorgesehen, daß man auf das Probenmaterial ein elektrisches und/oder magnetisches Feld zur Bremsung und Energiekonzentrierung der austretenden Ionen einwirken läßt. Hierzu kann man beispielsweise ein elektromagnetisches Hochfrequenzfeld verwenden. Besonders vorteilhaft ist es, wenn man die Probe direkt im Magnetfeld eines nachgeschalteten Massenspektrometers anordnet. Dieses Magnetfeld kann insbesondere dazu dienen, die zu Beginn des Verdampfungsprozesses aus dem Probenmaterial austretenden Elektronen in ihrer Bewegung so zu beeinflussen, daß dadurchderen nachbeschleunigende Wirkung auf die nachfolgenden Ionen ausgeschaltet wird. Weiterhin können diese Felder zur Ionisation von noch vorhandenen Neutralgasanteilen beitragen oder zur Führung der geladenen Teilchen in dasbut the disadvantage arises that the energy spectrum is presumably caused by various processes such as evaporation, Impact ionization, field emission, charged particles leaving the excited area is extremely broad. It ranges from 0 to over 1000, and with multiply charged ions even up to over 2000 eV. It's hardly a mass spectrometer known which ions with such a broad energy spectrum can absorb and process. A preselection for energy would therefore be necessary, which is a strong one Would entail a loss of detection probability. To at least partially eliminate this difficulty, is provided according to a preferred embodiment of the invention that one on the sample material an electrical and / or allows a magnetic field to act to slow down and concentrate the energy of the exiting ions. For example, an electromagnetic high-frequency field can be used for this purpose. It is particularly advantageous if the sample is placed directly in the magnetic field of a downstream mass spectrometer. This magnetic field can in particular serve to control the electrons emerging from the sample material at the beginning of the evaporation process to influence their movement in such a way that their post-accelerating effect on the subsequent ions is turned off. Furthermore, these fields can contribute to the ionization of any remaining neutral gas or to guide the charged particles into the
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Massenspektrometer. Ferner ist es möglich, die Energieverteilung der emittierten Ionen durch optimale Wahl von Impulsdauer und Wellenlänge günstig zu. beeinflussen.Mass spectrometry. It is also possible to optimize the energy distribution of the emitted ions by choosing Pulse duration and wavelength are favorable too. influence.
Die Erfindung betrifft auch eine Anordnung zum Durchführen des genannten Verfahrens mit einem Laser, einer die Laserstrahlung fokussierenden Optik, einer im Fokus angeordneten Probe und einem das emittierte Probenmaterial auffangenden Massenspektrometer. Eine solche Anordnung ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß die Probe im Magnetfeld des Massenspektrometers oder einem diesem vorgeschalteten Magnet- und/oder Hochfrequenzfeld angeordnet ist.The invention also relates to an arrangement for performing the aforementioned method with a laser, an optical system that focuses the laser radiation, an im Focus arranged sample and a mass spectrometer collecting the emitted sample material. Such an arrangement is characterized according to the invention in that the sample in the magnetic field of the mass spectrometer or a this upstream magnetic and / or high-frequency field is arranged.
Vorzugsweise dient das Objektiv eines zur visuellen Beobachtung der Probe angeordneten Mikroskops gleichzeitig als fokussierende Optik für die seitlich in das Mikroskop eingeleitete Laserstrahlung.The objective of a microscope arranged for visual observation of the sample is preferably used at the same time as focusing optics for the laser radiation introduced into the side of the microscope.
Gemäß der Erfindung werden vorzugsweise biologische Proben mit die Zellflüssigkeit noch enthaltenden Zellen untersucht. Mikroskopische Dünnschichtproben derartigen Materials können nur im tiefgeforenen Zustand hergestellt werden, und deshalb ist vorzugsweise die Anordnung mit einer Einrichtung zur Probentiefkühlung ausgerüstet. Dabei kommt es bei den erfindungsgemäß zu untersuchenden According to the invention, biological samples are preferably used with cells still containing the cell fluid examined. Microscopic thin-film samples of this type of material can only be produced in a deep-frozen state and therefore the arrangement is preferably equipped with a device for sample freezing. It occurs in those to be examined according to the invention
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biologischen Proben darauf an, sie nach extrem schneller Tiefkühlung, die außerhalb der Apparatur erfolgt, und nach Überführung in die Apparatur weiterhin wirksam und vor allem in allen Bereichen gleichmäßig zu kühlen. Hierzu genügt in der Regel eine Kühlung lediglich der Probenhalterungnicht, und es muß eine sehr wirksame und direkte Kühlung der Probe vorgenommen werden. Erfindungsgemäß wird hierzu vorgeschlagen, den Raum zwischen der Probe bzw. einem die Probe berührenden Fenster und dem die Laserstrahlung fokussierenden Objektiv mit einer insbesondere zirkulierenden Kühlflüssigkeit auszufüllen, die aufgrund ihrer optischen Eigenschaften gleichzeitig als Immersionsmedium wirkt. Geeignete Kühlflüssigkeiten, die einen ausreichend niedrigen Dampfdruck haben, noch bei sehr tiefen Temperaturen flüssig bleiben und für UV-Licht durchlässig sind, sind fluorierte Kohlenwasserstoffe, insbesondere Frigen 23· Durch diese Verwendung eines Kühlmittels als Immersionsflüssigkeit werden die Probe und auch das Objektiv so wirksam gekühlt, sq daß der Entstehung von Temperaturgradienten zwischen Probe, Probenhalterung und Objektiv entgegengewirkt wird.biological samples on them after extremely rapid freezing, which takes place outside the apparatus, and after Transfer to the apparatus continues to be effective and, above all, to cool evenly in all areas. For this As a rule, cooling only the sample holder is not sufficient, and it must be very effective and direct Cooling of the sample can be made. According to the invention, it is proposed to this end that the space between the sample or a window that touches the sample and the lens that focuses the laser radiation with a particular fill the circulating coolant, which due to its optical properties also acts as an immersion medium. Suitable coolants that give you enough have low vapor pressure, remain liquid at very low temperatures and allow UV light to pass through are, are fluorinated hydrocarbons, especially Frigen 23 · By this use of a coolant as Immersion liquid cools the sample and the objective so effectively that temperature gradients are created between the sample, sample holder and objective is counteracted.
Bei einer anderen Anordnung kann das durch eine Kühlflüssigkeit gekühlte Objektiv zusammen mit der Probe imIn another arrangement, the objective cooled by a cooling liquid can be used together with the sample in the
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Vakuumraum angeordnet sein.'Auch in diesem Fall wird die Wärmeleitung vom Objektiv her ausgeschaltet.In this case, too, the Thermal conduction from the lens switched off.
Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Anordnung mit Zusatzeinrichtungen für zusätzliche Messungen ausgerüstet, z.B. zum Messen von UV-Tieftemperatur-Lumineszenz sowie mit spektrophotometrischen Einrichtungen zur Messung von Absorption, Fluoreszenz, Streuung und/oder Phasendrehung von sichtbarem oder unsichtbarem Licht..The arrangement according to the invention is preferably with Additional devices equipped for additional measurements, e.g. for measuring UV low-temperature luminescence as well as with spectrophotometric devices for measuring absorption, fluorescence, scattering and / or phase rotation of visible or invisible light ..
Um den extrem kleinen wirksamen Brennfleck der Laserstrahlung exakt auf eine gewünschte Stelle der Probe, z.B. eine bestimmte Zellensubstruktur, richten zu können, ist es vorteilhaft, eine Einrichtung vorzusehen, die es ermöglicht, vor Auslösung eines Laserimpulses den betreffenden Bereich der Probe exakt in den Brennfleck des Laserlichtes einzustellen, wobei wegen der außerordentlich geringen Schärfentiefe die Einstellung außer in den X-und Y-Koordinaten der Probenebene auch in der dazu senkrechten Z-Richtung erfolgen muß. In vorteilhafter weiterer Ausgestaltung der Erfindung ist deshalb eine kontinuierlich brennende Lichtquelle für sichtbares Licht vor der die Laserstrahlung fokussierenden Optik derart angeordnet, daß diese einen als Zielmarkierungen dienenden sichtbaren Brennfleck erzeugt, der mit dem Brennfleck des Laserlichtes nach Lage und Schärfenebene zusammenfällt. Insbe- In order to precisely target the extremely small effective focal spot of the laser radiation at a desired location on the sample, e.g. To be able to direct a certain cell substructure, it is advantageous to provide a device that enables Before triggering a laser pulse, place the relevant area of the sample exactly in the focal point of the laser light set, with the setting except in the X and Y coordinates because of the extremely shallow depth of field the specimen plane must also take place in the perpendicular Z-direction. In an advantageous further embodiment of the invention is therefore a continuously burning light source for visible light in front of the Laser radiation focusing optics arranged in such a way that they serve as target markings visible Generates a focal spot that coincides with the focal spot of the laser light according to position and plane of focus. Especially
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sondere kann die Lichtquelle ein kontinuierlich betriebener Laser mit.geringer Leistungsdichte sein, dessen Strahlengang derart mit dem des Haupt- oder Leistungslasers zusammenfallen kann, daß er auch'zur VorJustierung des Hauptlasers dienen kann.The light source can be a continuously operated Laser with low power density, the beam path of which can coincide with that of the main or power laser in such a way that it can also be used for pre-adjustment of the main laser can serve.
Bei tiefgekühlten Proben sind die Zellen und ihre Substrukturen. ortsfest, so daß für das Einstellen mit dein Hilfsbrennfleck und das anschließende manuelle Auslösen des Laserimpulses ausreichend Zeit zur Verfügung steht. In manchen Fällen, insbesondere zur Anwendung des Strahlenstichs bei lebenden Zellorganismen, muß mit ungekühlten Proben gearbeitet werden, bei denen die zu erfassenden Zellen oder Mikroorganismen in der sie umgebenden Flüssigkeit frei beweglich sind und teils aufgrund der Braunschen Molekularbewegung und teils durch ihre eigenen Fortbewegungsorgane außerordentlich schnelle Ortsveränderungen durchführen. Die Zeit, in der eine solche biologische MikroStruktur durch den Zielbrennfleck läuft, ist dann meistens kürzer als die bis zur Auslösung des Laserimpulses erforderliche menschliche Reaktionszeit. Um eine automatische Auslösung des Laserimpulses zu bewirken, wird erfindungsgemäß die unterschiedliche Lichtstreuung an den zu beobachtenden Mikrostrukturen und dei* sie umgebenden Flüssigkeit ausgenutzt. Hierzu sind ein oder mehrere, vor und/oder hinter der Probe angeordneteIn the case of frozen samples, the cells and their substructures are. stationary, so that for setting with your auxiliary focal point and the subsequent manual triggering of the laser pulse have sufficient time stands. In some cases, especially for the use of the radiation sting in living cell organisms, must be with uncooled Samples are worked in which the cells or microorganisms to be detected are in the surrounding them Liquid are free to move and partly due to Braun's molecular motion and partly by their own Locomotion organs carry out extremely rapid changes of location. The time when such a biological microstructure running through the target focal point is then usually shorter than the one up to the triggering of the Laser pulse required human reaction time. In order to cause an automatic triggering of the laser pulse, is the different light scattering according to the invention on the microstructures to be observed and the * they exploited surrounding liquid. To do this are a or several, arranged in front of and / or behind the sample
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Photoempfänge für an der Probe gestreutes Licht der Hilfslichtquelle und eine von den Photoempfängen gesteuerte Auslösevorrichtung für die Laserimpulse vorgesehen.Photoreceptors for light from the auxiliary light source that is scattered on the sample and a triggering device for the laser pulses controlled by the photoreceptors is provided.
Die Erfindung vri.rd im folgenden anhand der Zeichnungen näher erläutert.The invention vri.rd in the following with reference to the drawings explained in more detail.
Fig. 1 zeigt eine Prinzipskizze der erfindungsgemäßen Vorrichtung.Fig. 1 shows a schematic diagram of the device according to the invention.
Fig. 2 zeigt schematisch die Wirkungsweise des Verfahrens an einer mikrobiologischen Probe.Fig. 2 shows schematically how the method works on a microbiological sample.
In Fig. 1 ist mit 1 eine Lasereinrichtung üblicher und im Handel erhältlicher Art bezeichnet, bestehend aus Leistungslaser, Laseroptik, Frequenzverdoppler bzw. nichtlineares optisches Element, Blenden usw. Durch den Frequenzverdoppler kann die Wellenlänge der Laserstrahlung in den UV-Bereich verlegt werden. Der Laser arbeitet im Impulsbetrieb, wobei die Impulsdauer je nach Art des Probenmaterials und des gewünschten Anregungs- oder Zerstörungseffektes im Bereich von με oder ns liegen kann. Sehr kurze Impulcse im Bereich von 20 ns und darunter kann man durch sogenannte Poekels-Zellen steuern.In Fig. 1, 1 denotes a laser device of the usual and commercially available type, consisting of a power laser, laser optics, frequency doubler or non-linear optical element, diaphragms, etc. The frequency doubler allows the wavelength of the laser radiation to be shifted into the UV range. The laser works in pulsed mode, whereby the pulse duration can be in the range of με or ns, depending on the type of sample material and the desired excitation or destruction effect. Very short Impul c se in the range of 20 ns and below one can control cells by so-called pickle.
Die Laserstrahlung wird z.B. seitlich in ein Mikros-The laser radiation is, for example, laterally in a microscope
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kop 2 eingeleitet und durch einen Spiegel 3 zum Objektiv 2b des Mikroskops gelenkt. Das Objektiv 2b befindet sich in einer Kühlflüssigkeit 4, die durch eine (nicht dargestellte) Kühleinrichtung zirkuliert und dort z.B. mit flüssigem Stickstoff ständig auf eine tiefe Temperatur von z.B. 77° K gekühlt wird. Diese das Objektiv 2b kühlende Flüssigkeit 4 wirkt gleichzeitig aufgrund ihrer optischen Eigenschaften als Immersionsflüssigkeit zur Vergrößerung der numerischen Apertur des Mikroskops. Als Kühl- und Immersionsflüssigkeit kann insbesondere Frigen 23 verwendet werden.kop 2 initiated and through a mirror 3 to the lens 2b of the microscope steered. The lens 2b is located in a cooling liquid 4, which is supplied by a (not shown) Cooling device circulates and there, e.g. with liquid nitrogen, constantly at a low temperature of e.g. 77 ° K is cooled. This liquid 4 cooling the lens 2b acts at the same time due to its optical properties as immersion liquid for enlarging the numerical aperture of the microscope. In particular, Frigen 23 can be used as the cooling and immersion liquid.
Die vom Objektiv 2b fokussierte Laserstrahlung gelangt durch ein Fenster 6 in eine Vakuumkammer 5» in der durch (nicht dargestellte) Einrichtungen ständig ein hohes Vakuum aufrechterhalten wird. In der Vakuumkammer befindet sich die zu untersuchende Probe 7 auf einer tiefgekühlten Probenhalterung 7a. Eine Verbindungsstange zu einem (nicht dargestellten) Probenmanipulator zum Verschieben der Probenhalterung 7a ist durch eine Vakuumdurchführung 9 aus der Vakuumkammer 5 herausgeführt und weist ferner eine Verbindung 11 zu einem Kühlmittel 12 auf. Während bei der dargestellten Ausführungsform die Probe 7 ausschließlich durch die Probenhalterung 7a gekühlt wird, kann die Anordnung auch so getroffen werden, daß die Probe 7 in direktem Kontakt am Vakuumfenster 6The laser radiation focused by the objective 2b passes through a window 6 into a vacuum chamber 5 »in the a high vacuum is constantly maintained by means (not shown). In the vacuum chamber the sample 7 to be examined is located on a frozen sample holder 7a. A connecting rod to a (not shown) sample manipulator for moving the sample holder 7a is through a vacuum feed-through 9 leads out of the vacuum chamber 5 and also has a connection 11 to a coolant 12 on. While in the embodiment shown, the sample 7 is cooled exclusively by the sample holder 7a the arrangement can also be made such that the sample 7 is in direct contact with the vacuum window 6
- 14 3 09808/1103- 14 3 09808/1103
anliegt, so daß die Kühlung auch direkt durch die Kühl- und Imrnersionsflüssigkeit 4 stattfindet.is applied so that the cooling is also carried out directly by the cooling and immersion liquid 4 takes place.
Die Laserstrahlung wird durch das Objektiv 2b auf die Probe 7 fokussiert. Durch die Laserstrahlung werden aus der Probe 7 geladene und ungeladene Atome und" Moleküle verdampft bzw. durch direkte Emission herausgeschlagen. Die geladenen Teilchen -werden mittels eines unterhalb der Probe angeordneten Massenspektrometers 15 mit Nachweisdetektor 16, z.B. Sekundärelektronenvervielfacher, empfangen und hinsichtlich ihrer Masse analysiert.The laser radiation is focused on the sample 7 through the objective 2b. By the laser radiation from the sample 7 charged and uncharged atoms and "molecules evaporated or knocked out by direct emission. The charged particles are carried along by means of a mass spectrometer 15 arranged below the sample Detection detector 16, e.g. secondary electron multiplier, received and analyzed with regard to their mass.
Um die emittierten geladenen Teilchen energiemäßig zu homogenisieren und um gegebenenfalls ungeladene Teilchen nachträglich zu ionisieren, kann eine Vorrichtung zur Erzeugung eines magnetischen, elektrischen und/oder Hochfrequenzfeldes vorgesehen sein, die durch eine Spule 8 im Innern der Vakuumkammer 5 angedeutet ist. Eine weitere felderzeugende Einrichtung 18 außerhalb der Vakuumkammer 5 kann die Wirkung unterstützen. Statt dieser Anordnung mit einer besonderen Einrichtung zur Erzeugung eines Feldes kenn die Vorrichtung auch so ausgestaltet nein, daß die Probe 7 direkt im Magnetfeld des Massenr;oektrometer-a 15 angeordnet ist.In order to homogenize the emitted charged particles in terms of energy and, if necessary, to avoid uncharged particles to subsequently ionize, a device for generating a magnetic, electrical and / or High-frequency field can be provided, which is indicated by a coil 8 in the interior of the vacuum chamber 5. Another Field-generating device 18 outside the vacuum chamber 5 can support the effect. Instead of this arrangement with a special device for generating a field, the device is also designed in this way no, that the sample 7 is directly in the magnetic field of the mass spectrometer-a 15 is arranged.
\"ie'< C(Ji-C untorhal.b der Probe 7 nngeordne be Hilfs- \ "ie '<C (Ji-C untorhal.b of the sample 7 nngeordende be auxiliary
-Vj--Vj-
3 0 H B Π 8 / 1 1 Q 33 0 H B Π 8/1 1 Q 3
2K13872K1387
und Nachweiseinrichtungen sind ein Monitor 13, bestehend aus einem Kollektor oder Sekundärelektronenvervielfacher, zur Überwachung einer gleichmäßigen Emissionsrate von der Probe, eine Beleuchtungseinrichtung 14 für die mikroskopische Beobachtung der Probe im Hellfeld, Dunkelfeld, mit Phasenkontrast usw., sowie eine Vorrichtung 17 (die hinter der Beleuchtungseinrichtung 14 nach hinten ausgestellt zu denken ist) zur Beobachtung der Lumineszenz. Ferner kann ein (nicht dargestellter) Monitor zur Überwachung der Konstanz der Laserstrahlung vor und/oder hinter der Probe angeordnet sein.and detection devices are a monitor 13, consisting of a collector or secondary electron multiplier, for monitoring a uniform emission rate from the sample, an illumination device 14 for the microscopic Observation of the sample in brightfield, darkfield, with phase contrast, etc., as well as a device 17 (the behind of the lighting device 14 is to be thought issued to the rear) for observing the luminescence. Furthermore can a monitor (not shown) for monitoring the constancy of the laser radiation is arranged in front of and / or behind the sample be.
Die Einrichtungen 13, 14, 15 und 17 können beispielsweise an einer schwenkbaren Revolverhalterung austauschbar angeordnet sein und wahlweise in ihre Betriebsstellung eingeschwenkt werden.The devices 13, 14, 15 and 17 can for example be arranged interchangeably on a pivotable turret holder and optionally pivoted into its operating position will.
Bei Betrieb der Vorrichtung wird folgendermaßen vorgegangen: Durch zirkulierende Kühlflüssigkeit 4 wird das Objektiv 2b gekühlt. Die Probe wird in einer getrennten Vorrichtung in Form eines tiefgekühlten, wasserhaltigen Schnitts hergestellt, und zwar mit Hilfe der Kryotomietechnik und unter Anwendung einer so raschen Abkühlung, daß keine die Zellstrukturen zerstörende Kristallbildung eintritt. Die Probe wird durch Kühlung der Probenhalterung 7a sowie gegebenenfalls durch Kontakt am gekühltenWhen operating the device, the procedure is as follows: By circulating cooling liquid 4, the Lens 2b cooled. The sample is in a separate device in the form of a frozen, water-containing Incision made with the help of the cryotomy technique and using such a rapid cooling, that no crystal formation which destroys the cell structures occurs. The sample is cooled by the sample holder 7a and, if necessary, by contact with the cooled
- 16 309808/1103 - 16 309808/1103
Vakuumfenster 6 auf der erforderlichen Tieftemperatur gehalten. Durch Beobachtung durch das Okular 2a des Mikroskops 2 wird nun der zu untersuchende Bereich der Probe unter das Objektiv 2b eingestellt. Sodann wird die von der Einrichtung 1 erzeugte Laserstrahlung, ζ,B. in Impulsen von 20 ns oder kürzer, auf die gewünschte Stelle der Probe gerichtet. Beispielsweise zeigt Fig. 2 einen Ausschnitt aus einer Probe mit roten Blutkörperchen 20, die einen Durchmesser von etwa 8 μ haben. Die Leistungsdichte im Fokus des Laserstrahls verteilt sich zu etwa 96% auf das zentrale Beugungsmaximum 21, zu ca. 3% auf das Beugungsmaximum erster Ordnung 22 und zu weniger als Λ% auf die restlichen, zu vernachlässigenden Beugungsringe.Vacuum window 6 kept at the required low temperature. By observing through the eyepiece 2a of the microscope 2, the area of the sample to be examined is now set under the objective 2b. Then the laser radiation generated by the device 1, ζ, B. in pulses of 20 ns or shorter, directed to the desired location on the sample. For example, FIG. 2 shows a section from a sample with red blood cells 20 which have a diameter of approximately 8 μ. About 96% of the power density in the focus of the laser beam is distributed over the central diffraction maximum 21, approx. 3% over the first-order diffraction maximum 22 and less than 3/4% over the remaining, negligible diffraction rings.
Die Absorption der Laserstrahlung in dem organischen Probenmaterial ist bei geringer Leistungsdichte äußerst gering, d.h. nahezu null, und steigt bei zunehmender Leistungsdichte zunächst innerhalb eines verhältnismäßig engen Intervalls, dessen Mitte - je nach ProbenmaterialThe absorption of the laser radiation in the organic sample material is extreme at a low power density low, i.e. almost zero, and increases with increasing power density within a proportionately narrow interval, the middle of which - depending on the sample material
7 9/27 9/2
und Wellenlänge - im Bereich von ca. 10 - 10 W/cm liegen kann, sprunghaft an„ Dieser Bereich der sprunghaften Zunahme ist so eng, daß es möglich ist, die Leistungsdichte im zentralen Beugungsmaximum 21 höher und im Beugungsmaximum erster Ordnung 22 niedriger zu wählen-,, Bs findet dann nur im zentralen Beugungsmaximum 21 Absorption und eine Zerstörung und Verdampfung des Probenmate-and wavelength - are in the range of approx. 10-10 W / cm can, by leaps and bounds, “This area of rapid increase is so narrow that it is possible to increase the power density to be chosen higher in the central diffraction maximum 21 and lower in the first order diffraction maximum 22 -, Bs then only in the central diffraction maximum 21 there is absorption and destruction and evaporation of the sample material.
- 17 309808/1103 - 17 309808/1103
2U13872U1387
rials statt. Auf diese Weise können Bereiche 23, 24, 25 des Probenmaterials untersucht v/erden, die außerordentlich eng begrenzt sind. Je knapper die Leistungsdichte im zentralen Beugungsmaximum 21 oberhalb der Sprunggrenze liegt, desto kleiner wird der Durchmesser der entstehenden Krater, und er kann in günstigen Fällen bis zu 0,1 μ m und darunter erreichen.rials instead. In this way, areas 23, 24, 25 of the sample material can be examined which are extraordinarily are tightly limited. The closer the power density in the central diffraction maximum 21 above the jump limit is, the smaller the diameter of the resulting crater, and in favorable cases it can be up to Reach 0.1 μm and below.
Vor dem Auslösen eines Laserimpulses muß durch Verschieben des Probenträgers die gewünschte, zu untersuchende oder zu beeinflussende Stelle der Probe in den Brennfleck der Optik eingestellt werden. Dies gilt nicht nur für die Einstellung in den X- und !»Koordinaten in der Probenebene, sondern auch die Einstellung in der dazu senkrechten Z-Richtung muß wegen der durch die große numerische Apertur sehr geringen Schärfentiefe (ca. 0,1 μη) sehr genau erfolgen. Als Hilfsmittel hierfür dient eine Hilfslichtquelle 26, die aus einer einfachen Lampe, vorteilhafterweise aber aus einem kontinuierlich betriebenen und mit sichtbarem Licht arbeitenden Laser (z.B. He-Ne-Laser) besteht. Von der Hilfslichtquelle ausgehendes paralleles bzw. parallelgerichtetes Licht wird durch einen Spiegel 27 in den Strahlengang des impulsweise arbeitenden Lasers 1 gelenkt und fällt dann mit diesem zusammen, so daß sein vom Mikroskopobjektiv erzeugter Brennfleck an derselben Stelle und in derselben Schärfenebene liegt wieBefore triggering a laser pulse, the desired location of the sample to be examined or influenced must be set in the focal point of the optics by moving the sample carrier. This applies not only to the setting in the X and! »Coordinates in the specimen plane, but also the setting in the Z direction perpendicular to it must be very small due to the very small depth of field (approx. 0.1 μm) due to the large numerical aperture done exactly. An auxiliary light source 26, which consists of a simple lamp, but advantageously of a continuously operated laser working with visible light (eg He-Ne laser), serves as an aid for this. The parallel or parallel light emanating from the auxiliary light source is directed by a mirror 27 into the beam path of the pulsed laser 1 and then coincides with it, so that its focal point generated by the microscope objective is at the same point and in the same focal plane as
- 18 - ■
309808/1103- 18 - ■
309808/1103
der des Lasers 1. Dieser Brennfleck ist im Blickfeld des Mikroskops vom Okular 2a her durch den hallodurchlässigeri Spiegel 3 sichtbar und dient nach Art eines Fadenkreuzes als Marke für die Einstellung auf eine gewünschte Stelle der Probe. Kriterium für die richtige Einstellung einer Zellsubstruktur in der Z-Richtung ist dabei im wesentlichen die deutlich ansteigende Intensität des reflektierten bzw. gestreuten Lichts, die dann eintritt, wenn sich im Brennfleck eine Zelle oder Zellensubstruktur anstelle von durchsichtiger Probenflüssigkeit befindet.that of laser 1. This focal point is in the field of view of the Microscope from eyepiece 2a through the hallo-permeable Mirror 3 is visible and serves like a crosshair as a mark for setting the desired location the sample. The criterion for the correct setting of a cell substructure in the Z direction is essential the significantly increasing intensity of the reflected or scattered light, which occurs when a cell or cell substructure is located in the focal point instead of transparent sample liquid.
Dieser Effekt läßt sich auch für eine automatische Auslösung der Laserimpulse ausnutzen. Hierzu sind oberhalb und/oder unterhalb der Probe, z.B. an den mit 28 und 29 bezeichneten Stellen, d.h. außerhalb des direkten Strahlengangs, ein oder mehrere Photoempfänger angeordnet, die für die Strahlung der Hilfslichtquelle 26 vorzugsweise selektiv empfindlich sind. An die Photoempfänger ist ein Steuergerät 30 angeschlossen. Gelangt eine der in der Probenflüssigkeit schwimmenden Mikrostrukturen in den Brennfleck der Hilfslaserstrahlung, und steigt dadurch die von den Photoempfängern 28 bzw. 29 empfangene Streustrahlung über einen nach Erfahrung einzustellenden Schwellenwert an, so löst das Steuergerät 30 einen Impuls des Lasers 1 aus.This effect can also be used for an automatic triggering of the laser pulses. These are above and / or below the sample, e.g. at the points marked 28 and 29, i.e. outside the direct beam path, one or more photoreceivers arranged for the radiation of the auxiliary light source 26 preferably are selectively sensitive. A control device 30 is connected to the photoreceiver. Get one of the in the sample liquid floating microstructures in the focal spot of the auxiliary laser radiation, and thereby increases the of the photoreceivers 28 and 29 received scattered radiation above a threshold value to be set based on experience on, the control unit 30 triggers a pulse from the laser 1.
- 19 3 0 9 8 0 8/1103.- 19 3 0 9 8 0 8/1103.
2H13872H1387
Der Hilfslaser 26 kann außer zum Zielen im Betrieb auch zum Vor justieren der Vorrichtung verwendet werden."The auxiliary laser 26 can also be used to adjust the device in addition to aiming during operation. "
- 20 -- 20 -
309808/ 1 103309808/1 103
Claims (15)
optischer Effekte erzeugter kohärenter Strahlung im UV-Wellenlängenbereich oder einem im UV emittierenden Laser arbeitet.laser by means of frequency doubling or non-linear
Coherent radiation generated by optical effects in the UV wavelength range or a laser emitting in the UV works.
massenspektrometrischer Analyse des emittierten Probenmaterials, dadurch gekennzeichnet, daß
man auf das Probenmaterial ein elektrisches und/oder magnetisches Feld einwirken läßt, das zur Bremsung, Energiekonzentrierung, Nachionisation und Führung in das Massenspektrometer der austretenden Ionen dient.4. The method according to any one of claims 1 to 3 with
Mass spectrometric analysis of the emitted sample material, characterized in that
an electric and / or magnetic field is allowed to act on the sample material, which is used for braking, energy concentration, post-ionization and guiding the emerging ions into the mass spectrometer.
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