DE2127392C3 - Biochemisches Verfahren zur Herstellung von mikrowellen proteinhaltigen Substanzen in Form von Hefezellen - Google Patents
Biochemisches Verfahren zur Herstellung von mikrowellen proteinhaltigen Substanzen in Form von HefezellenInfo
- Publication number
- DE2127392C3 DE2127392C3 DE2127392A DE2127392A DE2127392C3 DE 2127392 C3 DE2127392 C3 DE 2127392C3 DE 2127392 A DE2127392 A DE 2127392A DE 2127392 A DE2127392 A DE 2127392A DE 2127392 C3 DE2127392 C3 DE 2127392C3
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cells
- gram
- strains
- yeast
- mutants
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
- A61K36/062—Ascomycota
- A61K36/064—Saccharomycetales, e.g. baker's yeast
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
- A23J1/18—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/14—Yeasts or derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0002—Fungal antigens, e.g. Trichophyton, Aspergillus, Candida
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/26—Processes using, or culture media containing, hydrocarbons
- C12N1/28—Processes using, or culture media containing, hydrocarbons aliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/921—Candida
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/921—Candida
- Y10S435/924—Candida tropicalis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Botany (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein biochemisches Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen proteinhaltigen
Substanzen in Form von Hefezellen, welche leichter extrahierbar sind und durch Mensch und Tier leichter
verdaut werden können, wobei von einer fm Kohlenwasserstoff assimilierenden Hefe der Gattung
Candida ausgegangen wird.
Hefezellen werden wegen ihres hohen Protein- und Nucleinsäuregehalts und erheblichen Anteils an Nährzusätzen,
wie Vitaminen, für Nahrung, Futter und <>s Arzneimittel verwendet. Die Züchtung besonderer
Hefestämme mit Anpassung an bestimmte Medien wurde lange Zeit versucht. Derartige Züchtungen
wurden jedoch lediglich unter dem Gesichtspunkt einer möglichst wirtschaftlichen Herstellung von Hefezellen
durch Steigerung der Wirksamkeit der Assimilation des Kohlenstoffs im Kulturmedium, einer hohen Zellausbeute,
Vermehrungsrate usw. unternommen, jedoch wurde die Isolierung und Entwicklung von Stämmen ur.d
Mutanten mit hohem Nährwert im Hinblick auf Verdaubarkeit und Verwendung für Nahrung oder
Futter nicht durchgeführt
In der Tat haben Hefezellen um das Cytoplasma herum eine sehr feste Zellwand, deren Eigenart auf eine
komplizierte im wesentlichen aus Polysacchariden, wie Mannan, Glucan usw., zusammengesetzte höhere
Struktur zurückgeht (siehe D. H. Northcote, Biochemical Journal 51 [1952] 232 und P. A. Roe I fs
e η, Siochimica et Biophysica Acta, 10 [1953] 477), wie
aus Versuchen folgt, bei denen Hefezellen mit Polysaccharid hydroiysierenden Enzymen beispielsweise
von der Schnecke oder irgendwelchen Mikroorganismen behandelt wurden, wobei das Gefüge der Zellwand
aufgespalten wird bzw. zerfällt und in eine Protoplasmastruktur übergeht, bei der das Cytoplasma oder die
Zellmembran freiliegen. (Siehe S. Sugawara, Nature. 212 [1966] 92; G. S. Kobayashi u.a. Journal of
Bacteriology, 88 [1964] 795; R. E. Domanski, Journal of Bacteriology, % [1968] 270 und ). M ο η r e a I, journal
of Bacteriology, 94 [1967] 241).
Wegen ihrer sehr geringen Verdaubarkeit bei Verabreichung an Mensch und Tier ist die Hefezelle im
intakten Zustand jedoch als Nahrung oder Futter wenig wertvoll (siehe Journal of Japanese Society of Food and
Nutrition 23, 62 von 1970), da sich im Verdauungssaft höherer Lebewesen kein Polysaccharid hydrolysierendes
Enzym mit entsprechenden Fähigkeiten findet. Das ist der Hauptgrund für ein Zögern der Nahrungsmittel-
und Futtermittelindustrie hinsichtlich der Anwendung von Hefezellen.
Es wurden bereits zahlreiche Anstrengungen unternommen, die Hefezellwand /u entfernen, um die
Verdaubarkeit oder Extrahierbarkeit intrazellulärer Substanz der Hefezellen zu erhöhen. Zahlreiche
Aufsätze und Patentanmeldungen belassen sich mit der Anwendung von Chemikalien oder biologischen Mitteln
sowie einer mechanischen Zerstörung, wie mit Alkalioder Enzymbehandlungen, Autolyse, Plasmolyse, Schalleinwirkung,
Homogenisierung usw. Diese Behandlungen und Mittel sind jedoch für die industrielle
Anwendung hinsichtlich der Ausführung zu kompliziert und hinsichtlich der erforderlichen Ausrüstung zu teuer.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Hefezellen zu entwikkeln,
die von Mensch und Tier leichter verdaut werden können und deren intrazelluläre Substanz besser
isolierbar ist und die damit industriell besser ausnutzbar sind als herkömmliche Hefezellen.
Diese Hefezellen sollen für die industrielle Vermehrung und Züchtung geeignet und in Anbetracht einer
guten Verdaubarkeit als Ausgangsmaterial für Nahrung und Futter für Mensch oder Tier anwendbar sein. Dabei
ist ein besonderes Augenmerk auf eine wirksame und wirtschaftliche Herstellung unter milden Bedingungen
in industriellem Maßstab gerichtet.
Diese Aufgabe wird nun durch ein biochemisches Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen proteinhaltigen
Substanzen in Form von Hefezellen gelöst, die leichter extrahierbar sind und durch Mensch und Tier
leichter verdaut werden können, wobei von einer Kohlenwasserstoff assimilierenden Hefe der Gattung
Candida ausgegangen wird. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man
a) die Hefe durch chemische oder physikalische mutagene Mittel mutiert,
b) daß man eine die erhaltenen Mutanten enthaltende Suspension zur Bildung von Kolonien auf ein festes
Kulturmedium überimpft,
c) daß man sodann entweder
Ci) von den in b) erhaltenen Kolonien Kolonien mit
rauher Oberflächenschicht auswählt, daß man von den Zelien der Kolonien mit rauher Oberflächenschicht
mit Hilfe eines lichtoptischen Mikroskops Zellen von Kugelform gewinnt, daß man aus den
erhaltenen kugelförmigen Zellen nach Gram-Anfärbung gramnegative Zellen auswählt, daß man
aus den erhaltenen gramnegativen Zellen Zellen mit praktisch vernachlässigbarem Mannan-Gehalt
isoliert, oder
C_>) daß man die Zellen der in b) erhaltenen Kolonien
einer Gram-Anfärbung unterwirft, daß man von den erhaltenen grampositiven Zellen auf elektronenmikroskopischem
Wege solche auswählt, welche ein geringeres Elektronenstreuvermögen der äußeren Schicht der Zellwand besitzten, daß man
von den erhaltenen grampositiven Zellen, welche ein geringeres Elektronenstreuvermögen der äußeren
Schicht der Zellwand besitzen, solche Zellen isoliert, deren Mannan-Gehalt unter 7O1Vb des
Mannan-Gehaltes des unter gleichen Bedingungen gezüchteten Mutterstammes liegt,
d) daß man die nach C,) oder C_>) ausgewählten Mutanten in einem Kulturmedium aerob vermehrt
und
e) daß man schließlich die vermehrte Zellmassc gewinnt.
Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu Hefezellen, die gut verdaubar sind, deren intrazelluläre
Substanzen leicht isoliert werden können und die ihrer Zellwand-Integrität beraubt sind.
Der Grund für die Auswahl von Mutanten mit runder Form und weitere Isolierung eines gramnegativen
Stamms beruht auf der Erwägung der Erfinder, daß eine ihrer Zellwand-Integrität beraubte Hefezelle die Kugelform
annimmt, um ihre Oberfläche möglichst klein zu machen, da sie andernfalls den von außen wirkenden
Druck nicht aushalten kann und auf der Feststellung, daß der Sitz der Fixierung der primären Anfärbung mit
Kristall violett bei der Gram-Anfärbung die Zeilwand ist, was bedeutet, daß die Abgabe von an der Zellwandstruktur
fixiertem Kristallviolett merklich verzögert ist, wenn angefärbte Zellen nach der Anfärbung mit einem
organischen Lösungsmittel gespült werden (siehe Bacteriological Review, 16 [1952] 1, Stain Technology,
40 [1965] 79 und The Microbial World«, 2 Aufl., S. 169,
Prentice-Hall Inc., Englewood Cliffs, N. J. USA).
Weiter kann eine Mutante mit veränderter Struktur der Zellwand, die ihrer Unangreifbarkeit partiell
beraubt ist, auch bei Gram-positiver Färbung durch Beobachtung mit einem Elektronenmikroskop leicht
erkannt werden. Die Zelle mit geringer »Elektronendichte« bzw. geringem Streuvermögen der äußeren
Schicht der Zellwand bei elektronenmikroskopischer Beobachtung ist eine Zelle mit veränderter Wandstruktur,
bei welcher der den Hauptbestandteil der Zellwand bildende Mannangehalt verringert und die Zellwand-Integrität
teilweise verloren gegangen ist.
Das Grundprinzip der Erfindung besteht in der Entwicklung einer solchen Mutante, deren intrazelluläre
Substanz wirksam ausgenutzt und leicht extrahiert werden kann unter Anwendung der oben beschriebenen
Methode bei einer Kohlenwasserstoff assimilierenden Hefe der Genus Candida zur Erzielung einer Mutante,
s die vollständig oder teilweise ihrer Zellwand-Integrität beraubt ist, sowie in der Züchtung solcher Mutanten und
Ausnutzung der intrazellulären Bestandteile solcher Zellen.
Die erfindungsgemäßen Mutanten können in bzw. auf
ίο einem YM-Medium oder einem Sulfitpulpeablauge,
Kohlenwasserstoff oder Abfallmelasse als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Kulturmedium gezüchtet
werden, und die Abtrennung intrazellulärer Substanz aus den erhaltenen Zellen kann durch Behandlung mit
is chemischen oder physikalischen Mitteln, wie alkalische
Behandlung oder Behandlung mit Schallwellen, erfolgen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Figuren und Kurvenblätter näher erläutert. Auf diesen zeigt
ίο Fig. 1 mikroskopische Aufnahmen von gramangefärbten
Zellen von M-7002, M-7005, M-7 und Candida albicans ATCC 10259,
Fig. 2 elektronenmikroskopische Aufnahmen von Zellen von M-7002, M-7OO7 und M-7,
i.s F i g. 3 die Verdauung von Zellprotein der Gruppen A
und B sowie von Kontroll- und CA-Stämmen durch gastrisches Pepsin vom Rind als Funktion der
Verdauungszeit und
F i g. 4 die Verdauung von Zellprotein der Gruppen A
»o und B sowie der Kontroll- und von CA-Sätmme durch
proteolytisches Enzym, das vom Pankreas des GeIbschwanzfischs erhalten wurde, in Abhängigkeit von der
Verdauungszeit.
Gemäß der Erfindung werden die Zellen von
is Kohlenwasserstoff assimilierender Hefe der Genus
Candida zunächst chemischen oder physikalischen mutagenen Mitteln ausgesetzt. Als chemische mutagene
Mittel können N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, salpetrige Säure, Acriflavin, 4-NitrochinoIin-N-oxid und
Äthylmethansulfonat angewandt werden. Als physikalische mutagene Mittel kommen Bestrahlung mit
UV-Licht, Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder Bestrahlung mit ionisierenden Strahlen in Frage.
Das Verfahren zur Induzierung und Isolierung einer
Das Verfahren zur Induzierung und Isolierung einer
-is Mutante gemäß der Erfindung kann an einem Beispiel
wie folgt erläutert werden:
(1) Erzielung von Mutanten durch
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
so Nach Lodder (J. Lodder und N. ). W. K reger-Va
η Rij: »The Yeast« 2. Aufl., Seite 370, North-Holland Publishing Company, Amsterdamm,
1967) wurden Hefestämme der Genus Candida von japanischer Erde isoliert und Zellen von einem so
ss isolierten Candida-Stamm, dem Stamm M-7, wurden in YM-Medium von pH 6 (Zusammensetzung: 0,3%
Malzextrakt; 0,3% Hefeextrakt; 0,5% Peptor und 1% Glucose) eingeimpft und bis zur exponentiellen
Wachstumsphase inkubiert. Die Zellen wurden dann
(«) »geerntet« und erneut in YM-Medium auf eine Zelldichte von tO7/ml suspendiert. Nach 6 Stunden
langer Behandlung der Zellsuspension mit N-Methyl-N'-ni'ro-N-nitrosoguanidin
in einer Konzentration von 40 μg/ml bei 300C wurde sie mit sterilisierter Salzlösung
(>> auf das lOfache verdünnt. Die verdünnte Suspension
wurde zur Bildung isolierter Kolonien auf YM-Agarplatten inkubiert, die durch Zusatz von 2% Agar zu dem
oben angegebenen YM-Medium hergestellt worden
waren. Kolonien mit rauher Oberfläche wurden ausgewählt, die Zellen dieser Kolonien entnommen und
mit einem optischen Mikroskop untersucht zur Isolierung von etwa 200 Stämmen mit kreisförmigen bzw.
runden Zellen. Die einzelnen Stämme wurden *- gramangefärbt, und es wurden 3 gramnegative Stämme
isoliert und mit Candida periphelosum M-7002, M-7OO3 und M-7004 bezeichnet.
Die restlichen Stämme wurden nach Behandlung der Zellen mit Glutaraldehyd nach dem herkömmlichen
Verfahren mit Osmiumtetroxid fixiert oder gefärbt und mit Perimental fixiert (Cell Research, 20 [I960] 28), und
sie wurden dann mit dem Elektronenmikroskop nach Moore (Journal of Biochemical Cytology 3 [1957] 225)
untersucht. 1s
10 Stämme, deren Zellwände insbesondere in der äußeren Schicht eine geringe Elektronendichte bzw. ein
geringes Streuvermögen besaßen, d. h. bei denen die Schwärzung der Fotoplatte gering war, wurden
abgetrennt und jeweils einzeln 48 Stunden lang in dem oben angegebenen YM-Medium bei 37°C weiter
vermehrt, und die Zellen wurden dann »geerntet« und nach Lyophilisierung wurden die darin enthaltenen
Mengen an Mannan und Glucan nach W. E. Trevelyan (Biochemical Journal, 63 [1956] 23) 2s
bestimmt.
Dabei wurden eine Mutante mit einem Mannangehalt unter 2 g pro 100 g trockene Zellen aufgefunden und 2
Stämme in Übereinstimmung mit diesem Kriterium isoliert und als Candida periphelosum M-7007 und y>
M-7008 bezeichnet.
(2) Erzielung von Mutanten durch Bestrahlung
mit UV-Licht
mit UV-Licht
Zellen von Candida lipolytica NRRL-Y-6795 wurden js
aus der exponentiellen Wachstumsphase heraus gesammelt und in steriler Salzlösung mit einer Zelldichte von
107prol ml suspendiert.
1 ml dieser Suspension wurde in eine Petrischale mit 9 cm Durchmesser gebracht und nach 3 Minuten langer
Bestrahlung mit einer UV-Lampe von 15 Watt in einem Abstand von 30 cm mit steriler Salzlösung auf das
lOOfache verdünnt.
Die verdünnte Suspension wurde auf der oben angegebenen YM-Agarplatte zur Bildung isolierter
Kolonien inkubiert. Nach dem gleichen Verfahren wie unter (1) beschrieben wurden Kolonien mit rauher
Oberfläche ausgewählt und davon weiter etwa 200 Stämme mit kreisförmigen bzw. runden Zellen, die sich
als authentisch gramnegativ zeigten, isoliert. Die so einzelnen Stämme wurden nach dem oben angegebenen
Verfahren von Trevelyan chemisch auf ihren Mannangehalt hin untersucht Ein Stamm mit praktisch
vernachlässigbarem Mannangehalt wurde von diesen Stämmen isoliert und als Candida lipolytica M-7005
bezeichnet Dieses Verfahren der Auswahl von Stämmen mit Mannanmangel durch chemische Bestimmung
ist im Falle der Isolierung von Mutanten von Candida lipolytica aus Sicherheitsgründen erforderlich, da deren
Mutterstamm ursprünglich ein zwischen positiv und to negativ liegendes Verhalten hinsichtlich der Gram-Anfärbung zeigt, was die eindeutige Erkennung von
brauchbaren Mutanten über gramnegatives Verhalten in Frage stellt Dieses (chemisch-analytische) Verfahren
kann im Falle der Mutanten-Isolierung bei anderen Candida-Arten weggelassen werden, da diese authentisch grampositive Organismen sind.
Mutante mit vermindertem Mannangehalt von wenige als 70% des Mutterstamms durch das unter (1
beschriebene Verfahren aufgefunden.
Eine den oben angegebenen Kriterien entsprechend!
Mutante wurde isoliert und mit Candida lipolytici M-7009 bezeichnet.
(3) Erzeugung von Mutanten durch
salpetrige Säure
salpetrige Säure
Zellen von Candida guilliermondii IFO-1062, die irr
oben beschriebenen VM-Medium bis zur exponentieller Wachstumsphase vermehrt worden waren, wurder
gesammelt und in 0,1 m Acetatpuffer von pH 4,5 mi 0,05 m Natriumnitrit auf eine Zelldichte von 10' pro 1 m
suspendiert.
Nach 40 Minuten Stehenlassen bei 30"C wurden die
Zellen durch Zentrifugieren gesammelt und nach derr Waschen in einer sterilisierten Lösung mit 1% Peptor
und 5% NaCI (Gewicht pro Volumen mal 100 suspendiert und verdünnt.
Die verdünnte Suspension wurde auf YM-Agarplai
ten zur Bildung ^on Kolonien inkubiert. Danach wurder
nach dem gleichen Verfahren wie unter (1) beschrieben etwa 300 Stämme mit kreisförmigen Zellen von der
Zellen mit rauher Oberfläche getrennt und ein Stamrr einer gramnegativen Mutante davon isoliert und mil
Candida guilliermondii M-7006 bezeichnet.
(4) Gewinnung von Mutanten durch Acriflavin
Zellen von Candida guilliermondii IFO-1062 wurden in YM-Medium auf eine Zelldichte von 10' pro 1 ml
suspendiert, die Suspension mit Acriflavin in einer Konzentration von 4 μg/ml versetzt und die Mischung
10 Stunden lang bei 300C inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt und nach dem Waschen mit einer sterilen
Salzlösung mit dem lOOfachen Volumen an Salzlösung verdünnt.
Die verdünnte Suspension wurde einer Koloniebildung auf YM-Agarplatten unterworfen. Nach dem
gleichen Verfahren wie unter (1) beschrieben wurde einer der mutanten Stämme mit einem geringeren
Mannangehalt als der Mutterstamm aufgefunden und mit Candida guilliermondii M-7010 bezeichnet.
Neun nach obigem Verfahren erhaltene Stämme von Hefemutanten der Genus Candida besitzen die Fähigkeit,
normales Paraffin zu assimilieren; unter diesen haben die Stämme M-7002, M-7003, M-7004, M-7OO5
und M-7006 (die nachfolgend als Gruppe A bezeichnet werden) eine rauhe Kolonieoberfläche, kreisförmige
bzw. runde Zellform und sind gramnegativ, während die Stämme M-7007, M-7008 und M-7010 (die nachfolgend
als Gruppe B bezeichnet werden) ähnlich wie wilde Stämme hinsichtlich der Kolonieoberfläche glatt und
grampositiv sind. Der Stamm M-7009 erweist sich hinsichtlich der Kolonieoberfläche ähnlich wie die
Stämme M-7007, M-7008 und M-7010, er zeigt jedoch ein zwischen grampositiv und gramnegativ liegendes
Verhalten.
Die mikrobiologischen Eigenschaften dieser Hefemutanten der Genus Candida sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Von diesen Stämmen sind die Stämme M-7002,
M-7005, M-7006, M-7007 und M-7010 nachfolgend mit ihren entsprechenden ATCC-Registriernummern aufgeführt Von diesen Stämmen wurden Proben beim
American Type Culture Collection in Washington, D.C. am 24. Februar 1971 hinterlegt
Name· dor Mikrooryanisnien
Λ T(C-Nummer
Candida pcriphclosiim M-7(X)2 20314
Candida lipolylica M-7OO5 20315
Candida guillicrmondii Μ-7(Χ)ίι 20316
Candida pcriphelosum M-7(X)7 20317
Candida guilliermondii M-7010 201UX
M-7OO2 als typisches Beispiel der obigen Gruppe A,
M-7OO7 als typisches Beispiel für die Gruppe B und Candida albicans ATCC 10259 als typisches Beispiel für
herkömmliche wilde Stämme wurden zur Erzielung isolierter Kolonien auf oben beschriebenen Y-Agarplalten
3 Tage lang bei 30°C inkubiert.
Es wurde gefunden, daß die Kolonieoberfläche von M-7002 rauh ist, während M-7OO7 und Candida albicans
glatte Oberflächen zeigen.
Gruppe Λ
(M-7M2 bis
M-7(K)6)
(M-7M2 bis
M-7(K)6)
Gruppe B
<M-7<X>7 bis
M-7010)
M-7010)
Assimilation von organischen
C-haltigcn Verbindungen
C-haltigcn Verbindungen
Gebrauch von Stickstoffverbindungen
Vitaminbedarf
Gram-Anlarbung
Zcllform
Zclldimcnsioncn
Kolonicobcrflächc
*) M-7IKW macht eine Ausnahme als Gram ±.
Andere Stämme der Gruppe A, andere Stämme der Gruppe B und andere herkömmliche wilde Stämme, zu
denen Candida lipolytica, Candida guilliermondii und Candida utilis etc. gehören, waren hinsichtlich der
Kolonieoberfläche ähnlich wie M-7002, M-7007 und Candida albicans.
Die Mutanten der Gruppe A unter diesen Gruppen der Genus Candida zeigen einen bemerkenswerten
Unterschied gegenüber herkömmlichen wilden Stämmen, wie M-7 [Kontrolle (I)], Candida guilliermondii
IFO 1062, einem authentischen Beispiel für Kohlenwasserstoff assimilierende Hefe [Kontrolle (U)] und
Candida albicans ATCC 10259 [Kontrolle (IH)], der
darin besteht, daß die Mutanten gramnegativ sind und kein Mannan enthalten.
Obgleich die Mutanten der Gruppe B einen geringeren Mannangehalt besitzen als die herkömmlichen wilden Stämme, sind sie trotzdem ähnlich wie die
Kontrollstämme grampositiv. M-7009 fällt dabei aus dem Rahmen, indem er eine Zwischenstellung zwischen
grampositiver und gramnegativer Anfärbung einnimmt.
Glucose | + | H |
Galactose | + | Λ |
Lactose | - | - |
Maltose | + | Λ |
Sucrose | + | Λ |
Äthanol | + | Λ |
n-1'arallln | + | Λ |
l'cplon | + | Λ |
Harnstoff | + | ± |
NII4CI | + | |
KNO, | - | - |
Biotin | + | + |
Inosin | - | - |
Nicotinsäure | - | - |
Pantothensäure | - | - |
Pyridoxin | - | - |
Thiamin | - | - |
p-Aminobcnzocsäurc | - | - |
negativ | positiv*) | |
Kugel | Stäbchen | |
5 bis 6 μ | 3 μ | |
rauh | glatt | |
0 bis 37 C | 0 bis 37 ( | |
59% | 59% |
Beweise für obige Schlußfolgerung werden nachfolgend angeführt: Die oben beschriebenen 12 Stämme
so und Candida lipolytica NRRL-6795 und Candida
tropicalis IAM-4147 (diese beiden Stämme werden nachfolgend abgekürzt als CA-Stämme bezeichnet),
d. h. insgesamt 14 Stämme wurden durch Schütleln in einem Kulturmedium von pH 6,8 folgender Zusammen-
Setzung: 1% normales Paraffin mit 14 bis 18
Kohlenstoffatomen; 03% NH4Cl; 0,7% KH2PO4; 0,02%
FeSO4-7 H2O; 0,001% MnSO3 · 7 H2O; 0,01%
CaCl2 · 2 H2O und 0,05% Hefeextrakt 48 Stunden lang
bei30°Cinkubieru
fio Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt
und ein Teil derselben gramangefärbt und unter dem Mikroskop untersucht
Mikroskopische Aufnahmen (Vergrößerung: 2000fach) der Mutanten M-7002 und M-7005 als
f>5 typische Beispiele und der Kontrolle (I) und Kontrolle
(IH) nach Gram-Anfärbung sind in Fig. 1 wiedergegeben. Violett gefärbte Zellen sind solche, an deren
Zellwand das Kristallviolett nach primärer Anfärbung
809 609/1»
fixiert war; diese werden als gramposiliv bezeichnet, während grüngefärbte Zellen solche Zellen sind, bei
denen das Kristallviolett nicht fixiert sondern durch Behandlung mit organischem Lösungsmittel eluiert
wurde und die bei der zweiten Anfärbung mit Methylgrün reagierten; diese wurden als gramnegativ
identifiziert.
Nach Fig. I ist es klar, daß M-7002 und M-7005 gramnegativ sind, während die Kontrollen (I) und (III)
grampositiv sind. Das Verhalten von M-7OO3, M-7004 und M-7005 gegenüber der Gram-Anfärbung war mit
demjenigen von M-7002 völlig identisch, und diese Mutanten wurden daher als gramnegativ klassifiziert.
M-7007, M-7008 und M-7010 sprachen dagegen auf die Anfärbung auf gleiche Weise an wie der herkömmliche
wilde Stamm und wurden daher als gramposiiiv definiert. M-7OO9 zeigte ein Zwischenverhalten zwischen
grampositiv und gramnegativ.
Nachfolgend wurden Zellen der 9 Mutanten, 3 Kontrollstämme und 2 CA-Stämme gesammelt und
nach Waschen lyophilisiert und auf ihren Mannan- und Clucangehalt nach der oben beschriebenen Methode
von Trevelyan geprüft (Angabe in Prozent).
Daneben wurde auch der relative Mannangehalt der Mutanten bezogen auf einen Gehalt von 100% im
Kontrollstamm berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Aus dieser Tabelle ist
ersichtlich, daß die Mutanten M-7002, M-7003, M-7004, M-7005 und M-7006, d.h. Stämme der Gruppe A,
bemerkenswerte Unterschiede gegenüber den Kontrollstämmen zeigen, indem sie gramnegativ sind und
praktisch keinen Mannangehalt besitzen, während M-7007, M-7008 und M-7010, d. h. Stämme der Gruppe
Ii, grampositiv wie die Konirollstämme sind, aber bezogen auf die Kontrollstämmme einen verminderten
Mannangehalt von 71,4 bis 10,7% besitzen.
Candida lipolytica und M-7009 waren die einzigen Ausnahmen, die ein intermediäres Verhalten gegenüber
der Gram-Anfärbung zeigten; der Mannangehalt der Mulante lag jedoch innerhalb des Bereiches der Gruppe
B.
Nach den Untersuchungen der Erfinder waren die Mannangehaitc von 3 anderen herkömmlichen Stämmen,
nämlich Candida parapsilosis, Candida intermedia
und Candida robusta, die unter den oben angegebenen Bedingungen inkubiert wurden, relativ hoch (Wert:
3,0+0,2 g/100 g trockene Zellen).
Cinuii- l'ol\sacchahil-
Tabelle 2 | Ciram- Polysaccharid- | trockene | Relativer |
Anlar- gehalt | Mannan | ||
hung (g/IOOg | Mannan | gchalt | |
Zellen) | 2,81 | ||
Glucan | 2,8 | ||
+ 7,2 | 3,Ol | ||
Kontrolle (I) | + 7,0 | 0 | (100) |
Kontrolle (II) | + 6,7 | 0 | |
Kontrolle (III) | 6,2 | 0 | 0 |
M-7002 | 6,6 | 0 | 0 |
M-7003 | 6,6 | 0 | 0 |
M-7004 | 6,3 | 0,3 | 0 |
M-7005 | 6,4 | IJ | 0 |
M-7006 | + 6,2 | 2,0 | 10,7 |
M-7007 | + 6,6 | 39,3 | |
M-7008 | + 6,6 | 71,4 | |
M-7009 | |||
Anlar- | [ichalt . | trockene | Mannan | |
Ιιιιημ | (μ/KK) μ | gehalt | ||
/eilen) | M.Hinan | |||
(ilucan | I,S | |||
M-7010 | t | 6,4 | 2,1 | ί)4,.ί |
Candida | J_ | (>,ι | 7\2 | |
lipoiyiiea | ||||
NRRL-6795 | 2,3 | |||
Candida | H- | X2,2 | ||
tropical is | ||||
ΙΛΜ-1147 | ||||
Aus der Tabelle 2 ist ebenfalls ersichtlich, daß der auf
die Kontrollstämme bezogene relative Mannangehalt der beiden CA-Stämme, der am Ende der Tubelle
angegeben wird, bei 75,0 und 82,2% liegt, obwohl die CA-Stämme herkömmliche wilde Stämme sind. Diese
Werte liegen in dem Bereich, der bei einigen Mutanten gemäß der Erfindung gefunden wird. Die experimentellen
Ergebnisse, aus denen ersichtlich ist, daß diese CA-Stämme einen geringeren Mannangehalt als andere
herkömmliche wilde Stämme haben, wurden von Nabeshimga u.a. (Journal of Technology 48 [1970]
556) angegeben. Bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung dieser CA-Stämme zeigt sich jedoch, daß
ihre Zellwand ein hohes Streuvermögen besitzt und schwer angreifbar ist. Das heißt die günstigen
Eigenschaften der Mutanten gemäß der Erfindung, wie sie nachfolgend angegeben werden, sind den CA-Stämmen
nicht eigen.
Nachfolgend wurden Zellen von den Stämmen M-7002, M-7007 und M-7 als Vertreter für die Mutanten
der oben beschriebenen Gruppen A und B sowie die Kontrollstämme nach dem unter (1) beschriebenen
Verfahren el'iktronenmikroskopisch untersucht (Vergrößerung
20 OOOfach). Die Ergebnisse sind in F i g. 2 wiedergegeben.
Beim Kontrollstamm und dem Stamm M-7007 wird eine deutliche Zellwand im Umfangsbereich der Zelle
beobachtet, während die Dicke des Zellwandbereichs beim Stamm M-7002 gering und das Elektronenstreuvermögen
schwach ist. Daraus wird deutlich, daß der
Stamm M-7002 seiner Zellwand-Integrität beraubt und im Vergleich zum Kontrollstamm etwa doppelte
Zellbreite besitzt. Aus elektronenmikroskopischen Beobachtungen folgt ebenfalls, daß die Stämme M-7003,
M-7004, M-7005 und M-7006 in ähnlicher Weise ihrer Zellwand-Integrität beraubt sind.
Wie bereits den obigen Ausführungen z.T. zu entnehmen ist, wurde aus den Tatsachen, daß der Sitz
der primären Anfärbung durch Kristallviolett die Zellwand ist und M-7002, M-7003, M-7004, M-7005 und
M-7006 gramnegativ sind und daß die Hauptkomponen te der Zeilwand Mannan ist und die Mutanten gemäß
der Erfindung kein Mannan oder weniger als die natürlichen Stämme enthalten und daß M-7002, M-7003,
M-7004, M-7005 und M-7006 bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung eine mangelhafte Zellwandstruktur zeigen, geschlossen, daß M-7C02, M-7003,
M-7004, M-7005 und M-7006, d. h. die Mutanten der Gruppe A, ihrer Zellwand-Integrität beraubt sind,
während M-7007, M-7008, M-7009 und M-7010, d. h. die Mutanten der Gruppe B, der Zellwand-Integrität nur
partiell beraubt sind.
Aus der Tatsache, daß die Verdaiibarkeil und Ausnutzbarkeit der intrazellulären Substanzen der
Hefezelle durch die (üblicherweise schwer angreifbare) Zellwand vermindert wird, kann wiederum geschlossen
werden, daß die oben beschriebenen Mutanten gemäß der Erfindung sowohl hinsichtlich der Verdaubarkeit als
auch der Ausnutzbarkeit von intrazellulärem Protein im Vergleich zu dem herkömmlichen Stamm deutlich
ausgezeichnet sind.
Nachfolgend wurde die Verdaubarkeit und Extrahierbarkeit
von Protein aus den Zellen bei den erfindungsgemäßen Mutanten untersucht. Dabei wurden folgende
Ergebnisse erzielt:
Zunächst wurde das Zellprotein von 9 Stämmen der oben beschriebenen Mutanten der Genus Candida, 'J
Koiurolisiäninien und 2 Ca-Siämmen auf seine Verdaubarkeit
durch gastrisches Pepsin vom Rind und durch ein aus der Bauchspeicheldrüse des Gelbschwanzfisches
präpariertes proteolytisches Enzym untersucht. Da/i
wurden die 14 Hefestämme durch Schütteln in dem oben beschriebenen normal-Paraffinmediuni 48 Stunden
lang bei JO0C inkubiert und die durch Vermehrung entsandenen Zellen durch Zentrifugieren gesammelt.
Nach Waschen und Trocknen wurde die Zellmasse jeweils in Salzsäure von pH 1,8 auf 1% Zelldichte
suspendiert. Zu den einzelnen Suspensionen wurden 0,5% (Gewicht pro Volumen) gastrisches Pepsin vom
Rind (2x kristallisiert und lyophilisert; 153-1370-1)
hinzugegeben und die Mischungen bei 37°C aufbewahrt.
Zu verschiedenen Zeiten (siehe Fig. 3) wurden Anteile der Reaktionsmischung abpipettiert, und nach
Zentrifugieren wurde der Stickstoffgehalt in der überstehenden Flüssigkeit nach Kjeldahl bestimmt.
Die Protein-Verdauungsgeschwindigkeil (obiger Stickstoffgehalt zum Gesamtstickstoff der Zellmasse vor der
Verdauung; ausgedrückt in °/o) wurde ebenfalls bestimmt. Die Ergebnisse werden in F i g. 3 gezeigt.
In Fig. 3 ist längs der Ordinate die Verdauung des
intrazellulären Proteins der Hefe durch gastrisches Pepsin vom Rind in % und längs der Abszisse die
zugehörige Verdauungszeit in Stunden aufgetragen. Die erhaltenen Kurven A, B, CA und »Kontrolle« zeigen die
mittleren Verdaubarkeiten der Mutanten der Gruppe A,
der Mutanten der Gruppe 3, der CA-Stämme und der Kontrollstämme.
Wie F i g. 3 zeigt, ist die Verdaubarkeit der Mutanten
der Gruppe A im Mittel etwa 2,7mal höher als die des bekannten wilden Stamms, wenn man die entsprechenden Werte 24 Stunden nach Beginn der Verdauung
miteinander vergleicht und die mittlere Verdaubarkeit der Mutanten Jer Gruppe B ist etwa l,6mal höher als
diejenige des herkömmlichen wilden Stamms.
Darüber hinaus nimmt die Verdauung der Mutanten gemäß der Erfindung sogar 20 Stunden nach Beginn der
Verdauung noch zu, während diejenige des herkömmlichen Stamms 10 Stunden nach Beginn der Verdauung
einen konstanten Wert erreicht. Die gemäß der Erfindung isolierten Hefemutanten erwiesen sich mithin
als sehr leicht verdaubar.
Nachfolgend wurde die Verdaubarkeit der Mutantenzellen durch proteolytisches Enzym vom Fisch geprüft,
um die Verdaubarkeit der erfindungsgemäßen Produkte für den Fall der Verwendung als Futter für Fischkulturen nachzuweisen. Dazu wurden die Zellen in 0,1 M
Borat-Puffer (pH 8,0) auf 1 % Zelldichte suspendiert und die Suspension mit von der Bauchspeicheldrüse eines
Gclbschwanzfisches nach dem Laskowski-Verfahren (»Methods of Enzymology«, Bd. II, Seite 8, 1. Aufl.;
herausg. von S. P. Co Io wick und N. O. Kaplan,
Academic Press Inc., New York, 1955) hergestelltem proteolytischen Enzym sowie 0,005 M CaC^ bis zu einur
Konzentration von 0,5% (Gewicht pro Volumen) versetzt. Die Mischung wurde bei 37"C der Verdauung
überlassen und die Verdai'barkeit nach dem gleichen Verfahren wie bei der Untersuchung mit gastrischem
Pepsin vom Rind bestimmt. Die Ergebnisse sind in F i g. 4 wiedergegeben.
in Fig. 4 ist längs der Ordinate die Verdauung des Hefezellproteins durch proteolytisches Enzym von der
Bauchspeicheldrüse eines Gelbschwanzfisches und längs der Abszisse die Verdauungszeit aufgetragen. Die
Verdaubarkeit der Mutanten der Gruppe A, der Mutanten der Gruppe B, der Kontrollstämme und der
CA-Stämme wird durch die Kurven A, B, Kontrolle und CA veranschaulicht. Wie man sieht, zeigen die Mutanten
der Gruppen A und B eine 2,2 bzw. l,8mal höhere Verdaubarkeit als die Kontrollstämme bei der Verdauung
durch Bauchspeicheldrüsenenzym voiv GcIbschwanzfisch.
Das heißt die Verdaubarkeit der Mutanten gemäß der Erfindung und insbesondere der
Mutanten der Gruppe A ist im Vergleich zu derjenigen der Kontrollstämme merklich verbessert.
Die CA-Stämme erweisen sich bei diesen Prüfungen hinsichtlich der Verdaubarkeil jeweils als den Kontrollstämmen
vergleichbar. Obgleich also die CA-Stämme, wie Tabelle 2 zeigt, einen etwas geringeren Mannangehait
als die Kontrollstämme haben, sind sie doch den Mutanten gemäß der Erfindung hinsichtlich der
Verdaubarkeit des Zellproteins merklich unterlegen. Diese CA-Stämme wurden keiner mutationsinduzierenden
Behandlung gemäß der Erfindung unterworfen und zeigten ein hohes Streuvermögen der peripheren
Bereiche der Zelle bei Beobachtung im Elektronenmikroskop.
Danach kann angenommen werden, daß die geringe Angreifbarkeit der Zellwand bei diesen CA-Stämmen
nicht verlorengegangen ist. Bei den Mutanten gemäß der Erfindung ist dagegen abweichend von den
Kontroll- und CA-Stämmen das Zellprotein in leicht verdaubarem Zustand, da diese Mutanten gernäß der
Erfindung nicht nur keinen oder einen verminderten Mannangehalt besitzen, sonderen ihr Cytoplasma oder
ihre Zellmembran dem umgebenden Medium direkt ausgesetzt ist, während die Zellwand-Integrität vollständig
oder teilweise verlorengegangen ist.
Anschließend wurde die Extrahierbarkeit der intrazellulären Substanzen dieser Mutanten, der Kontrollstämme
und der CA-Stämme durch chemische Reagenzien oder physikalische Mittel bestimmt, um
Vorrichtungen zur Extraktion und Isolierung intrazellulärer Substanz festlegen zu können.
5:1 Tabelle 3 | to | Prolein aus den Zellen | durch |
Extraktion von | Schalloszil- | ||
Hefestämme | lationcn | ||
fts M-7002 | % extrahiertes Protein | 79,3 | |
M-7003 | durch | 72,5 | |
M-7004 | Alkali | 69,9 | |
M-7005 | lösung | 73.2 | |
49,5 | |||
51,2 | |||
50,0 | |||
49.5 |
I-OrI sut/unu
llcl'cstiimmc
durch
Alkalilös ling
Alkalilös ling
durch
hilioncn
M-7006 | 49,9 | 75,2 |
M-7007 | 49 5 | 69,3 |
M-7008 | 3j,2 | 60,0 |
M-7009 | 28.6 | 45,5 |
M-7010 | 34,0 | 52,2 |
Kontrolle (I) | 23,6 | 22,6 |
Kontrolle (11) | 25,2 | 27,2 |
Kontrolle (III) | 24,8 | 25,4 |
Candida lipolylica | 25,6 | 29,3 |
NRRL-6795 | ||
Candida lropicalis | 23,5 | 25,9 |
ΙΛΜ-4147 |
In gleicher Weise wie für die Untersuchungen gemäß F i g. 3 und 4 wurden 9 Stämme der oben beschriebenen
Mutanten, 3 Kontrollstämme und 2 CA-Stämme in normal-Paraffinmedium gezüchtet bzw. vermehrt. Die
Zellen wurden dann gesammelt und in 0,05 n-Natronlauge auf 1% Zelldichte suspendiert und 2 Stunden lang auf
500C erwärmt; nach dem Zentrifugieren wurde der Stickstoffgehalt im überstehenden Anteil nach K j e 1 d
a h 1 bestimmt und die F.xtraktionsrate (%) über das Verhältnis der durch Natronlauge extrahierten Stickstoffmengen
zum Gesamtstickstoff der Zelle vor der Behandlung berechnet. Die Ergebnisse sind in Spalte 2
der Tabelle 3 wiedergegeben.
Zellen der oben beschriebenen 3 Gruppen wurden weiter in einer sterilisierten Salzlösung auf 5%
Zelldichte suspendiert und es wurden dann 5 ml Portionen dieser Suspensionen mit einem 1OkHz
(10 KC) Schall-Disintegrator 5 Minuten lang behandelt bzw. zerrissen und anschließend zentrifugiert, wonach
der Stickstoffgehalt in der überstehenden Fraktion bestimmt wurde. Die Extraktionsrate (%) wurde in
gleicher Weise wie oben angegeben berechnet. Die Ergebnisse sind in Spalte 3 der Tabelle 3 wiedergegeben.
Aus Tabelle 3 ist klar ersichtlich, daß die gemäß der
Erfindung erzielten Mutanten im Vergleich zu den Kontrollstämmen eine merklich höhere Proteinextraktionsrate
sowohl bei Verwendung von Alkalilösung als auch bei Schalleinwirkung aufweisen und daß die
Proteinextraktionsrate ähnlich wie bei der Verdaubarkeitsprüfung mit Enzymen in Abhängigkeit von der
Abnahme des Mannangehalts zunimmt. Die CA-Stämme bleiben dagegen trotz ihres geringeren Mannangehalts
hinsichtlich der Proteinextraktionsrate in ähnlichen Bereichen wie die herkömmlichen Stimme.
Wie anhand der zu F i g. 3 und 4 führenden Untersuchungen bereits beschrieben wurde, ist es
ebenfalls klar, daß die gemäß der Erfindung erhaltenen Mutanten nicht nur durch einen mangelnden Mannangehalt
hervorstechen, sondern auch durch genetisch fehlerhafte Zellwandstrukturen, was im Vergleich zu
den Kontroll· und CA-Stämmen zu einer bemerkenswerten Verbesserung der Proteinextraktion durch
Alkalibehandlung oder Schalleinwirkung führt.
Darüber hinaus sind die Mutanten gemäß der
Erfindung den herkömmlichen wilden Stämmen hinsichtlich der Extrahierbarkeit intrazellulärer Substanzen
bei Harnstoffbehandlung, Autolyse, mechanischem Mahlvorgang oder Gefrier- und Auftaubehandlungen
überlegen.
Aus der Tatsache, daß die Stämme M-7002, M-7OO3.
M-7OO4, M-7005 und M-7006 unter den erfindungsgemäß isolierten Hefemutanten der Genus Candida
gramnegativ sind, während sich alle herkömmlichen Hefestämme unabhängig von Wachstumsbedingungen
und Wachstumsphase als grampositiv erweisen (unter der berechtigten Annahme, daß die Gram-Anfärbu'·.^
ein Mittel zur Unterscheidung der Beschaffenheit von Zellwänden ist), sowie aus der elektronenmikroskopischen
Beobachtung und den experimentellen Ergebnissen bei der Prüfung der Verdaubarkeit durch Enzyme
und aus der hohen Proteinextraktionsrate kann geschlossen werden, daß sich diese erfindungsgemäßen
Hefemutanten der Genus Candida von herkömmlichen Arten in positiver Weise unterscheiden und durch
mangelnde Zellwand-Integrität auszeichnen, wobei Cytoplasma oder Zellmembran frei liegen.
Von den 4 übrigen Mutanten sind die Stämme M-7007, M-7008 und M-7010 ähnlich wie die herkömmlichen
Hefestämme bei Inkubation unter gleichen Bedingungen grampositiv, und der Stamm M-7009
nimmt eine Zwische..stellung zwischen grampositiv und gramnegativ ein, jedoch ist ihr Mannangehalt im
Vergleich zu den Kontrollstämmen der Genus Candida auf 70—10% vermindert. Aus der Tatsache, daß die
Werte von Proteinverdauungs- oder Extraktionsratc bei diesen Mutanten in einem mittleren Bereich zwischen
derjenigen der ihrer Zellwand-Integrität beraubten Mutanten und derjenigen der Kontrollstämme liegen,
kann geschlossen werden, daß diese 4 Mutanten ihrer Zellwand-Integrität partiell beraubt sind.
Unter den herkömmlichen Hefestämmen der Genus Candida haben die CA-Stämme, Candida lipolytica und
Candida tropicalis einen etwas geringeren Mannangchalt als die Kontrollstämme, und Candida lipolytica
nimmt eine Zwischenstcllung zwischen grampositiv und gramnegativ ein. Diese CA-Stämme haben jedoch eine
bemerkenswert geringere Proteinverdaubarkeit und -extrahierbarkeit als die Mutanten gemäß der Erfindung
und unterscheiden sich mithin recht deutlich von diesen.
Die wie oben beschrieben isolierten Hefemutanten der Genus Candida gemäß der Erfindung sind mithin
Mutanten, die der Zellwand-Integrität beraubt, gramnegativ und praktisch mannanfrei oder aber grampositiv
sind und einen partiell verringerten Mannangchalt besitzen und im Gegensatz zu den üblichen bekannten
wilden Hefestämmen durch abbauendes Enzym gut verdaubar sind und deren intrazelluläres Protein durch
unterschiedliche Behandlungen sehr leicht extrahiert werden kann.
Bei Verwendung von Hefezellen für menschliche Nahrung und Futter für Haustiere oder Fische bilden die
Hefemutanten der Genus Candida gemäß der Erfindung mithin sehr gut verdaubare Produkte, und es ist damit
möglich, Nährmittel von hohem Nährwert und nährende Medikamente zu erzeugen. Im Falle einer industriellen
Isolierung und Abtrennung intrazellulärer Substanzen von der Hefe können daher die Kosten für die
Anlage und die Betriebskosten vermindert werden wenn Hefemutanten gemäß der Erfindung zum Einsat7
kommen, und es kann weiter ein Abbau und eine Denaturierung des Produktes weitgehend gehemmi
werden, da die Isolierung und Abtrennung det intrazellulären Substanzen und Autolyse unter milder
Bedingungen durchgeführt werden kann. Auch irr
Hinblick auf die Extraktion und Ausnutzung biologisch
wirksamer Substanzen, wie Enzyme, kann das erfindungsgemäße Verfahren im Vergleich zu den üblichen
Methoden mit bemerkenswertem Vorteil angewandt werden.
201 Kulturmedium (pH 53) mit folgender gewichtsmäßiger Zusammensetzung: 1% normal Paraffin mit 14
bis 18 Kohlenstoffatomen; 0,5% NH4CI; 0.7% KH2PO4;
0,001 % FeSO4 · 7 H2O; 0,02% MgSO4 - 7 H2O; 0,001 %
MnSO4 ■ 7 H2O; 0,01% CaCI2 2 H2O und 0,05%
Hefeextrakt wurden sterilisiert. Nach Einimpfen der
Mutante M-7OO2 ( = ATCC 20314) wurde die Mischung 24 Stunden lang unter Belüftung bei 30° C inkubiert
Danach wurde dieses Kulturmedium zu 5001 sterilisiertem Kulturmedium der oben beschriebenen Art
hinzugegeben mit weiterer 48stündiger Inkubation bei 30° C unter Belüftung und Einstellung des pH-Wertes.
Danach wurden die Zellen mit einem Zentrifugiertrockner gesammelt und 23 kg trockene Hefezellen von
hoher Verdaubarkeit erzielt 2 kg der trockenen Zellmasse wurden abgenommen und mit 12 kg Weizenmehl versetzt Nach dem Durchkneten wurde die
Mischung mit 6 kg weißem Fischmehl gemischt zur Erzielung von Fischfutter.
201 Kulturmedium (pH 6,0) mit 5% (als Kohlehydratkonzentration) Gärmelasse, 0,25% (NH4J2SO4; 03%
KH2PO4; 0,02% MgSO4 · 7 H2O und 0,04% Hefeextrakt (gewichtsmäßige Zusammensetzung) wurden nach
dem Aufkochen nitriert und sterilisiert. Danach wurde die Mutante M -7005 (= ATCC 20315) eingeimpft und 24
Stunden lang bei 30° C präinkubiert Diese Mischung wurde dann zu 5001 des oben beschriebenen sterilisierten Kulturmediums hinzugegeben, und es folgte eine
Inkubation unter Belüftung, die 36 Stunden bei 30° C und 12 Stunden bei 40° C durchgeführt wurde. Die Zellen
wurden durch Zentrifugieren gesammelt und nach Waschen mit Wasser in einem Trommeltrockner
getrocknet zur Erzielung von 3 kg trockener Hefezellen.
Eine 2 kg Portion wurde davon entnommen und mit 20 kg 0,1 n-NaOH versetzt und nach 2 Stunden langem
Stehenlassen bei 500C zentrifugiert Die überstehende Fraktion wurde zur Ausfällung von Protein mit HCI
versetzt wobei der pH-Wert auf 4,8 eingestellt wurde. Das ausgefällte Protein wurde durch Zentrifugieren
abgetrennt und mit einem kleinen Sprühtrockner getrocknet zur Erzielung von 500 g trockenem Zellprotein. 50 kg Wasser und 1 kg Glucose wurden zu den
500 g Protein hinzugegeben. Die Mischung wurde mit Lactobacillus acidophilus geimpft und 30 Stunden lang
bei 37° C zur Bildung von Milchsäure vergoren. Abschließend wurden Zucker und Geschmacksstoffe in
geeigneter Menge hinzugegeben und ein schmackhaftes und nährendes hochproteinhaltiges Getränk erhalten.
Die Mutante M-7006 (-ATCC 20316) wurde in 201 Kulturmedium (pH 6,0) mit folgender gewichtsmäßiger
Zusammensetzung: 4% (als Kohlehydratkonzentration) von Sulfit befreiter Sulfitpülpeliquor; 0,2% (NH4J2SO4;
0,1% KH2PO4; 0,25% MgSO4 7 H2O und 0,3%
Hefeextrakt eingeimpft Nach 48stündiger Inkubation bei 30° C wurde die Flüssigkeit zu 5001 des oben
beschriebenen sterilisierten Kulturmediums hinzugefügt
und unter Belüftung 48 Stunden lang bei 300C inkubiert.
Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und nach Waschen mit Wasser in einem Trommeltrockner
getrocknet zur Erzielung von 23 kg trockener Hefezel-S len, die dann mit einem Mahlwerk pulverisiert wurden
zur Erzielung eines Nährmedikaments mit hohem
Protein- und Vitamingehalt sowie guter Verdaubarkeit
ίο 201 Kulturmedium (pH 6,0) mit folgender gewichtsmäßiger Zusammensetzung: 1% normal Paraffin mit 14
bis 18 Kohlenstoffatomen; 03% NH4Cl; 0,7% KH2PO4;
0,001% FeSO4 · 7 H2O; 0,02% MgSO4 · 7 H2O; O1OTl %
MnSO4 -7 H2O; 0.01% CaQ2 · 2 H2O und 0,05%
Hefeextrakt wurden sterilisiert Diese Flüssigkeit wurde mit der Mutante M-7010 («ATCC 20318) geimpft und
24 Stunden lang unter Belüftung bei 30°C inkubiert
Anschließend wurde die Mischung zu 5001 des oben beschriebenen sterilisierten Kulturmediums hinzugege
ben, und es folgte eine weitere 48stQndige Inkubation
bei 30°C unter Belüftung, wobei der pH-Wert kontrolliert wurde. Danach wurden die Zellen durch
Zentrifugieren gesammelt und nach Waschen mit Wasser bei 50° C getrocknet zur Erzielung von 2,8 kg
trockener Hefezellen hoher Verdaubarkeit 1 kg wurde davon entnommen und mit 3 kg Getreide-Schrotmehl;
43 kg Reiskleie; 1 kg Sojamehl; 50 g Salz und 50 g Calciumcarbonat gemischt zur Erzielung einer Futtermischung für Rindvieh.
201 Kulturmedium (pH 6,0) mit folgender gewichtsmäßiger Zusammensetzung: 5% (als Kohlehydratkonzentration) Gärmelassen; 0,25% (NH4J2SO4; 03%
KH2PO4; 0,02% MgSO4 · 7 H2O und 0,04% Hefeextrakt wurden nach Aufkochen filtriert und sterilisiert.
Die Mutante M-7OO7 (-ATCC 20317) wurde darin eingeimpft und unter Belüftung 24 Stunden lang bei
30° C inkubiert Die erhaltene Mischung wurde zu 5001
des oben beschriebenen sterilisierten Kulturmediums
hinzugegeben, und es folgte eine Inkubation unter Belüftung bei 30° C (36 Stunden) und dann bei 400C (12
Stunden). Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und nach Waschen mit Wasser in einem
Trommeltrockner getrocknet zur Erzielung von 3 kg trockner Hefezellen.
2 kg wurden davon entnommen und mit 20 kg 0,1 n-NaOH versetzt und 2 Stunden lang bei 50° C
stehengelassen und dann zentrifugiert Die überstehen
de Flüssigkeit wurde zur Ausfällung von Protein mit
1 n-HCl versetzt, wobei der pH-Wert auf 4,8 eingestellt
wurde; das Protein wurde .dann durch Zentrifugieren abgetrennt und mit einem kleinen Sprühtrockner
getrocknet zur Erzielung von 500 g trockenem intrazel
lulärem Hefeprotein.
50 kg Wasser und 1 kg Glucose wurden zu den 500 g Protein hinzugefügt Die Flüssigkeit wurde durch 30
Stunden langes Inkubieren mit Lactobacillus acidophilus bei 37° C einer Milchsäuregärung unterworfen und dann
mit Zucker und Geschmacksstoffen versetzt zur Erzielung eines schmackhaften nährenden proteinreichen Getränks.
1 kg der gemäß Beispiel 3 erhaltenen Hefezellen wurden mit 5 kg Weizenmehl, 40 g Salz, 20 g Honig und
2 kg Wasser und weiter mit 3,5 kg Gluten, 300 g eßbarem öl und Geschmacksstoffen versetzt. Die
Mischung wurde in einem Ofen 30 Minuten lang bei 120° C gebacken zur Erzielung einer knusprigen
Imbiß-Diät mit einer abgeglichenen Aminosäurezusammensetzung.
4 kg nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 hergestellte trockene Hefezellen wurden zu 20 kg
0^n-NaOH hinzugegeben, 2 Stunden lang bei 50° C stehengelassen und dann zur Abtrennung der intrazellu-
lären Substanzen enthaltenden überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert Zwei kg CaCl2 · 2 H2O und 0,2 kg
Ca(OH)2 wurden in 15 kg Wasser von 90° C suspendiert
und dann mit der obigen übersiehenden Flüssigkeit unter Rühren versetzt Nach 30 Minuten Stehenlassen
wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und dann in Wasser
suspendiert und der pH-Wert mit 6 n-HCl auf etwa 7 eingesteUt Der Niederschlag wurde zentrifugiert zur
Erzielung eines flockenähnlichen und fleischähnlich texturierten Nahrungsmittels.
Claims (2)
1. Biochemisches Verfahren zur Herstellung von mikrowellen proteinhaltigen Substanzen in Form
von Hefezellen, welche leichter extrahierbar sind und durch Mensch und Tier leichter verdaut werden
können, ausgehend von einer Kohlenwasserstoff assimilierenden Hefe der Gattung Candida, dadurch
gekennzeichne t, daß man
a) die Hefe durch chemische oder physikalische mutagene Mittel mutiert,
b) daß man eine die erhaltenen Mutanten enthaltende Suspension zur Bildung von Kolonien auf
ein festes Kulturmedium überimpft, ι s
c) daß man sodann entweder
Ci) von den in b) erhaltenen Kolonien, Kolonien mit rauher Oberflächenschicht auswählt, daß
man von den Zellen der Kolonien mit rauher Oberflächenschicht mit Hilfe eines lichtopti- m
sehen Mikroskops Zellen von Kugelform gewinnt, daß man aus den erhaltenen kugelförmigen
Zellen nach Gram-Anfärbung gramnegative Zellen auswählt, daß man aus den erhaltenen gramnegativen Zellen Zellen mit
praktisch vernachlässigbarem Mannan-Gehalt isoliert, oder
C;) daß man die Zellen der in b) erhaltenen Kolonien einer Gram-Anfärbung unterwirft,
daß man von den erhaltenen grampositiven Zellen auf elektronenmikroskopischem Wege
solche auswählt, welche ein geringeres Elektronenstreuvermögen
der äußeren Schicht der Zellwand besitzen, daß man von den erhaltenen grampositiven Zellen, welche ein geringeres .»5
Elektronenstreuvermögen der äußeren Schicht
der Zellwand besitzen, solche Zellen isoliert, deren Mannan-Gehalt unter 70% des Mannan-Gehaltes
des unter gleichen Bedingungen gezüchteten Mutterstammes liegt, 4c
d) daß man die nach Ci) oder C>) ausgewählten
Mutanten in einem Kulturmedium aerob vermehrt und
e) daß man schließlich die vermehrte Zellmasse gewinnt.
2. Verwendung der nach Anspruch 1 erhaltenen mikrobiellen proteinhaltigen Substanzen in Form
von Hefezellen bei der Herstellung von Fischkulturfutter, von proteinreichem Getränk, von Nährmedikamenten,
von Tierfutter, von Nähr-lmbiß und von fleischähnlichen Nahrungsmitteln.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP45057783A JPS519832B1 (de) | 1970-07-03 | 1970-07-03 | |
JP45102408A JPS5111195B1 (de) | 1970-11-20 | 1970-11-20 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2127392A1 DE2127392A1 (de) | 1972-01-05 |
DE2127392B2 DE2127392B2 (de) | 1977-07-14 |
DE2127392C3 true DE2127392C3 (de) | 1978-03-02 |
Family
ID=26398852
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2127392A Expired DE2127392C3 (de) | 1970-07-03 | 1971-06-02 | Biochemisches Verfahren zur Herstellung von mikrowellen proteinhaltigen Substanzen in Form von Hefezellen |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US3855063A (de) |
BE (1) | BE767789A (de) |
CA (1) | CA982965A (de) |
DE (1) | DE2127392C3 (de) |
FI (1) | FI48752C (de) |
FR (1) | FR2100857B1 (de) |
GB (1) | GB1312181A (de) |
NL (1) | NL155050B (de) |
NO (1) | NO135641C (de) |
SE (1) | SE398513B (de) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2364968A1 (fr) * | 1976-09-21 | 1978-04-14 | Anvar | Procede d'obtention de souches hybrides de levures |
US4439525A (en) * | 1981-09-09 | 1984-03-27 | Phillips Petroleum Company | High methionine content Pichia pastoris yeasts |
AU547928B2 (en) * | 1981-11-03 | 1985-11-14 | Sutka, K. | Antigenic preparation from candida guilliermondii |
US5250436A (en) * | 1984-11-28 | 1993-10-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Glucan compositions and process for preparation thereof |
DE3514550A1 (de) * | 1985-04-23 | 1986-10-23 | Hüls AG, 4370 Marl | 3-hydroxydicarbonsaeuren und ein verfahren zu ihrer herstellung |
US6387420B1 (en) * | 1996-12-23 | 2002-05-14 | Juhani Vuorenmaa | Procedure for preparing a food additive, and an additive and its use |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS4832350B1 (de) * | 1965-09-02 | 1973-10-05 | ||
RO77169A (ro) * | 1969-03-25 | 1981-06-22 | Albert Rolland Sa,Fr | Procedeu de obtinere si conservare a unei variante stabile de proteusrettgori |
-
1971
- 1971-05-12 US US00142530A patent/US3855063A/en not_active Expired - Lifetime
- 1971-05-14 CA CA112,986A patent/CA982965A/en not_active Expired
- 1971-05-25 GB GB1694771A patent/GB1312181A/en not_active Expired
- 1971-05-28 SE SE7106956A patent/SE398513B/xx unknown
- 1971-05-28 BE BE767789A patent/BE767789A/xx unknown
- 1971-06-01 NO NO2040/71A patent/NO135641C/no unknown
- 1971-06-02 DE DE2127392A patent/DE2127392C3/de not_active Expired
- 1971-06-11 FI FI711650A patent/FI48752C/fi active
- 1971-06-29 FR FR7123750A patent/FR2100857B1/fr not_active Expired
- 1971-07-01 NL NL717109065A patent/NL155050B/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SE398513B (sv) | 1977-12-27 |
NL155050B (nl) | 1977-11-15 |
US3855063A (en) | 1974-12-17 |
DE2127392B2 (de) | 1977-07-14 |
CA982965A (en) | 1976-02-03 |
FI48752C (fi) | 1974-12-10 |
NO135641C (de) | 1977-05-04 |
FI48752B (de) | 1974-09-02 |
NO135641B (de) | 1977-01-24 |
FR2100857A1 (de) | 1972-03-24 |
DE2127392A1 (de) | 1972-01-05 |
FR2100857B1 (de) | 1975-02-07 |
NL7109065A (de) | 1972-01-05 |
GB1312181A (en) | 1973-04-04 |
BE767789A (fr) | 1971-10-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2813733C2 (de) | ||
DE69112643T2 (de) | Formulierung zur behandlung von silage. | |
DE112014003580T5 (de) | β-1,3-Glucanase, Polynukleotid, rekombinanter Vektor, Transformant, Herstellungsverfahren für β-1,3-Glucanase, Enzymherstellung und Herstellung von Paramylon mit reduziertem Molekulargewicht | |
Harris et al. | Gut microflora of two saltmarsh detritivore thalassinid prawns, Upogebia africana and Callianassa kraussi | |
DE69723576T2 (de) | Die eierschalen von geflügel stärkende zusammensetzung | |
DE2547098A1 (de) | Einzelliges proteinmaterial mit verringertem puringehalt und hohem naehrwert | |
DE2524753A1 (de) | Verfahren zur entfernung wasserloeslicher kohlenhydrate bei der herstellung von pflanzenproteinprodukten | |
DE2939269C2 (de) | Verfahren zur optischen Trennung von DL-2-Amino-4-hydroxy(methyl)phosphinoylbuttersäure | |
DE2127392C3 (de) | Biochemisches Verfahren zur Herstellung von mikrowellen proteinhaltigen Substanzen in Form von Hefezellen | |
DE3856044T2 (de) | Zellulosespaltende n2-fixierende bakterien und deren verwendung | |
DE2705878A1 (de) | Verfahren zur foerderung der milchsekretion bei tieren | |
DE2153232A1 (de) | Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Amylase | |
DE2434874A1 (de) | Verfahren zur herstellung von galactose sowie von getraenken auf galactosebasis aus loesungen von lactose als ausgangsstoff | |
DE69014549T2 (de) | Enzyme aus dem bacillus pabuli zum abbau der zellwand. | |
US3889006A (en) | An animal feed of high digestibility | |
DE69729951T2 (de) | Verfahren zur herstellung eines nahrungsmittelzusatzes, nahrungsmittelzusatz und dessen verwendung | |
DE69818181T2 (de) | Verdauungsenzymen enthaltenden Inaktivierten Mikroorganismen, Verfahren zu deren Herstellung, und ihre Verwendung im Lebensmittelbereich | |
DE2164018C3 (de) | Verfahren zur biotechnischen Her stellung von Uncase | |
DE60108116T2 (de) | Immunoaktivator | |
DE3118148A1 (de) | Antiallergisches praeparat und verfahren zu seiner herstellung | |
DE2011935C3 (de) | Enzym mit der Fähigkeit zur Lyse der Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen, Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms sowie ein Präparat zur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries | |
DE2554407A1 (de) | Herstellung thermostabiler lactase | |
DE1492823A1 (de) | Verfahren zum Herstellen von Milchprodukten | |
DD212401A5 (de) | Neues verfahren zur herstellung einer substanz mit carcinostatischer und immunostimulierender aktivitaet | |
DE2261270C3 (de) | Verfahren zur Herstellung zellwändelysierender Enzymkomplexe, so erhältliche Enzymkomplexe und deren Verwendung |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |