DE2036875B2 - METHOD OF VIOCHEMICAL ISOLATION OF 1-MENTHOL - Google Patents
METHOD OF VIOCHEMICAL ISOLATION OF 1-MENTHOLInfo
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Description
trennt oder können andererseits direkt in Form der Zellkörper oder Kulturmedien, die Carbonsäureesterbydrolase enthalten, verwendet werden, wozu auf die ältere deutsche Offenlegungsschrift 1815 845 verwiesen wird.separates or can on the other hand directly in the form of the cell body or culture media, the carboxylic acid ester hydrolase contained, are used, for which reference is made to the older German Offenlegungsschrift 1815 845 will.
Es wurde ein weiteres Verfahren zur biochemischen Isolierung von 1-Menthol aus dl-Menthol oder einem Gemisch von dl-Isomeren, die dl-Menthol enthalten, vorgeschlagen. Das Verfahren besteht darin, daß ein organischer Carbonsäureester von dl-Menthol oder ein Gemisch dieses Esters mit organischen Carbontäureestern von dl-Mentholisomeren, die dl-Menthol enthalten, wobei die zur Veresterung verwendete organische Carbonsäure aus den gleichen, wie vorstehend aufgeführt, besteht, mit einem Enzym, spezifisch der Carbonsäuref-terhydrolase, behandelt wird, welches durch die Wirkung von Mikroorganismen der Klassen Candida, Saccharomyces, Hanseula, Rhodotorula, Toruopsis, Sehizosacchoromyces, Pichia, Sporobolomyces, Debaryomyces, Nadosonia, Trichosporon, Brettanomyces und Cryptococcus gebildet worden ist. Diese Enzyme werden aus ihren Zellkörpern oder ihrem Kulturmedium abgetrennt oder können andererseits direkt in Form der Zellkörper oder Kulturmedien, die das Enzym, nämlich die Carbonsäureesterhydrolase enthalten, verwendet werden, wozu auf die ältere deutsche Offeniegungsschrift 1 958 587 verwiesen wird.There was another method for the biochemical isolation of 1-menthol from dl-menthol or a Mixture of dl isomers containing dl menthol proposed. The procedure is that a organic carboxylic acid ester of dl-menthol or a mixture of this ester with organic carbonic acid esters of dl-menthol isomers containing dl-menthol, the organic used for esterification Carboxylic acid consists of the same as listed above, with an enzyme specifically the Carboxylic acid terhydrolase, which is treated by the action of microorganisms of the classes Candida, Saccharomyces, Hanseula, Rhodotorula, Toruopsis, Sehizosacchoromyces, Pichia, Sporobolomyces, Debaryomyces, Nadosonia, Trichosporon, Brettanomyces and Cryptococcus has been formed. These enzymes are separated from their cell bodies or their culture medium or else can directly in the form of the cell body or culture media containing the enzyme, namely the carboxylic acid ester hydrolase contained, are used, for which reference is made to the older German Offenlegungsschrift 1 958 587.
Das erfindungsgemäC; Verf. 'iren zur biochemischen Isolierung von 1-Menthol besteht demgegenüber darin, daß man einen Ameisensäure ster oder Ester aus dl-Menthol, gegebenenfalls im Gemisch mit anderen dl-Mentholisomeren, und einer Carbonsäure der allgemeinen Formel RCOOH, worin R Alkylgruppen oder Alkenylgruppen mit jeweils 1 bis 21 Kohlenstoffatomen bedeutet, bei einer Temperatur von etwa 25 bis etwa 450C mit einer Carbonsäureesterhydrolase behandelt, die durch Beimpfen eines Nährmediums mit Mikroorganismen der Stämme Sarcina aurantiaca, Nocardia gardinen, Micrococcus varians und lysodeikticus, Alcaligenes faecalis und viscolactis, Pseudomonas crudiviae, fluorescens, fragi und spec. Nr. 001-003, Brevibactenum helvorum und spec. Nr. 004, Aerobacter cloacae und aerogenes, Agrobacterium tumefaciens, Achromobacter spec. Nr. 005, Lactobacillus casei und helveticus, Streptococcus lactis und faecalis, Clostridium caproicum und acetobutyricum, Flavobacterium esteroaromaticum und flave^cens, Mycobacterium phlei, Arthrobacter simplex und ureafacicns gebildet worden ist, und das optisch aktive 1-Menthol aus dem Enzymrer.ktionsgemisch in üblicher WeiseThe inventiveC; The method for the biochemical isolation of 1-menthol, on the other hand, consists in using a formic acid ster or ester of dl-menthol, optionally in a mixture with other dl-menthol isomers, and a carboxylic acid of the general formula RCOOH, in which R is alkyl groups or alkenyl groups each means 1 to 21 carbon atoms, treated at a temperature of about 25 to about 45 0 C with a carboxylic acid ester hydrolase, which by inoculating a nutrient medium with microorganisms of the strains Sarcina aurantiaca, Nocardia gardinen, Micrococcus varians and lysodeikticus, Alcaligenes faecalis and viscolactis, Pseudiviaeomonas , fluorescens, fragi and spec. No. 001-003, Brevibactenum helvorum and spec. No. 004, Aerobacter cloacae and aerogenes, Agrobacterium tumefaciens, Achromobacter spec. No. 005, Lactobacillus casei and helveticus, Streptococcus lactis and faecalis, Clostridium caproicum and acetobutyricum, Flavobacterium esteroaromaticum and flave ^ cens, Mycobacterium phlei, Arthrobacter simplex and ureafacicns, and the optically active 1-Mentrerholns enzyme has been formed, and the optically active 1 usual way
ίο abtrennt.ίο disconnects.
Es sind auch andere Spezies der genannten Stämme in gleicher Weise wirksam.Other species of the strains mentioned are also effective in the same way.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird erreicht, daß im technischen Maßstab aus einem Mentholgemisch das interessierende 1-Menthol in sehr zufriedenstellenden Ausbeuten hergestellt werden kann. Ausbeuten in dieser Größenordnung sind großtechnisch durch stereospezifische Isomcr^ntrennung nicht zu erzielen.The process according to the invention achieves that on an industrial scale from a menthol mixture the 1-menthol of interest can be produced in very satisfactory yields. On an industrial scale, yields of this order of magnitude are not possible due to stereospecific isomer separation to achieve.
Der Versuch zur selektiven Hydrolyse der 1-Menthyiester durch die vorstehenden Mikroorganismen, die im Rahmen der Erfindung eingesetzt werden, wurde auf folgende Weise ausgeführt:The attempt at selective hydrolysis of the 1-menthyiester by the above microorganisms which are used in the context of the invention carried out in the following way:
In ein Reagenzglas mit einem Innendurchmesser von 18 mm und einer Länge von 180 mm wurden 10 ml eines Mediums aus 10 g Pepton, 4 g Fleischextrakt, 4 g Hefeextrakt und 1 g Glukose in 11 Wasser eingebracht. Dieses Medium wurde mit dem Versuchsorganismus nach der Sterilisierung beimpft, und das Reagenzglas wird 48 Stunden bei 30"C geschüttelt. Darn wurde ein emulgiertes Menthylacetatgemisch, das aus 80°/o eines Menthylacetatgemi ,ches mit der Zusammensetzung der folgenden Isomeren: dl-Menthylacetat 55,2 °/0, dl-Neomenthylacetat 34,3 °/0, dl-Isomenthylacetat 15,5% und eine Spur dl-Neoisomenthylacetat bestand, zu dem Medium in der in Tabelle I angegebenen Menge zugesetzt und die Gesamtmenge 48 Stunden geschüttelt. Das Kulturmedium wurde mit Äthyläther extrahiert, der aus dem Extrakt entfernt wurde. Der erhaltene Rückstand wurde gaschromatographisch analysiert. Das Hydrolyseverhältnis10 ml of a medium composed of 10 g of peptone, 4 g of meat extract, 4 g of yeast extract and 1 g of glucose in 1 liter of water were placed in a test tube with an inner diameter of 18 mm and a length of 180 mm. This medium was inoculated with the test organism after the sterilization, and the test tube is shaken for 48 hours at 30 ° C. An emulsified menthyl acetate mixture, which consists of 80% of a menthyl acetate mixture with the composition of the following isomers: dl-menthyl acetate 55 , 2 ° / 0 , dl-neomenthylacetate 34.3 % / 0 , dl-isomenthylacetate 15.5% and a trace dl-neoisomenthylacetate, added to the medium in the amount indicated in Table I and the total amount shaken for 48 hours Culture medium was extracted with ethyl ether, which was removed from the extract, and the residue obtained was analyzed by gas chromatography, and the hydrolysis ratio
1-Menthol (+ Hsomenthol) 1-Menthol (+ 1-Isomenthol) + unzersetzter Essigsäureester1-menthol (+ hsomenthol) 1-menthol (+ 1-isomenthol) + undecomposed acetic acid ester
wurde aus den Spitzenflächen des Gaschromatogramms berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt. Die Bezeichnung der Mikroorganismen, mit Ausnafime derjenigen der Japanese Federation of Culture Collections of Microorganisms, erfolgt nach Bergeys Manual od Determinative Bacteriology, 7. Auflage, 1957.was calculated from the peak areas of the gas chromatogram. The results are shown in Table I. The name of the microorganisms, with the exception of those of the Japanese Federation of Culture Collections of Microorganisms, based on Bergeys Manual od Determinative Bacteriology, 7th edition, 1957.
des Gemisches der
Essigsäureester
der di-Menthol-
isomcren
°/.Granted amount
of the mixture of
Acetic acid ester
the di-menthol
isomer
° /.
verhältnis
"/0hydrolysis
relationship
"/ 0
gebildetem
Isomeiithol
"/n Amount of
educated
Isomeiithol
"/ n
Nocardia gardineri IAM 0105
Micrococcus lysodeikticus IAM 1056
Klicrococcus varians IAM 1314
Alcaligenes faecalis IAM 1061
Alcaligenes viscolactis ΙΛΜ 1517
Pseudomonas crudiviae IAM 1048
Pseudomonas fluorescens IAM 1057 Sarcina aurantiaca IAM 1059
Nocardia gardineri IAM 0105
Micrococcus lysodeikticus IAM 1056
Klicrococcus varians IAM 1314
Alcaligenes faecalis IAM 1061
Alcaligenes viscolactis ΙΛΜ 1517
Pseudomonas crudiviae IAM 1048
Pseudomonas fluorescens IAM 1057
4
4
4
4
4
4
44th
4th
4th
4th
4th
4th
4th
4th
3,9
1,2
6,2
8,9
11,5
10,2
12,56.8
3.9
1.2
6.2
8.9
11.5
10.2
12.5
0,0
0,0
0,0
1,3
1,3
0,3
1,80.0
0.0
0.0
0.0
1.3
1.3
0.3
1.8
Fortsetzungcontinuation
des Gemisches der
Essigsäureester
der dl-Menthol-
isomeren
7oGranted amount
of the mixture of
Acetic acid ester
the dl menthol
isomers
7o
verliältnisHydrolysis-
loss
gebildetem
IsomentholAmount of
educated
Isomenthol
Pseudomonas sp. Nr. 001
Pseudomonas sp. Nr. 002
Pseudomonas sp. Nr. 003
Brevibacterium helvorum IAM 1637
Brevibacterium sp. Nr. 004
Aerobacter aerogenes IAM 1338
Aerobacter cloacae IAM 1134
Aerobacter aerogenes IAM 1539
Aerobacterium tumefaciens IAM 1625
Achromobacter sp. Nr. 005
Lactobacillus casei AHU 1055
Lactobacillus casei IFO 3425
Lactobacillus helveticus IFO 3219
Streptococcus lactis AHU 1089
Streptococcus fascalis AHU 1086
Clostridium acetobutyricum IFU 3346
Clostridium caproicum IAM 19228
Flavobacterium esteroaromaticum IFO 3751
Flavobacterium flavescens IFO 3085
Mycobacterium phlei IFO 3158
Arthrobacter simplex IAM 1660
Arthrobacter ureufaciens IAM 1658 Pseudomonas fragi IAM 1650
Pseudomonas sp. No. 001
Pseudomonas sp. No. 002
Pseudomonas sp. No. 003
Brevibacterium helvorum IAM 1637
Brevibacterium sp. No. 004
Aerobacter aerogenes IAM 1338
Aerobacter cloacae IAM 1134
Aerobacter aerogenes IAM 1539
Aerobacterium tumefaciens IAM 1625
Achromobacter sp. No. 005
Lactobacillus casei AHU 1055
Lactobacillus casei IFO 3425
Lactobacillus helveticus IFO 3219
Streptococcus lactis AHU 1089
Streptococcus fascalis AHU 1086
Clostridium acetobutyricum IFU 3346
Clostridium caproicum IAM 19228
Flavobacterium esteroaromaticum IFO 3751
Flavobacterium flavescens IFO 3085
Mycobacterium phlei IFO 3158
Arthrobacter simplex IAM 1660
Arthrobacter ureufaciens IAM 1658
8
8
8
4
8
2
2
2
2
4
2
2
2
2
2
4
4
4
4
2
4
24th
8th
8th
8th
4th
8th
2
2
2
2
4th
2
2
2
2
2
4th
4th
4th
4th
2
4th
2
21,8
26,9
24,6
6,3
19.4
0,9
1,5
4«
"',"*
13,1
2,8
14,5
11,2
1,6
4,7
7,9
19,4
9,9
6,4
3,6
7,1
7,87.8
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1.6
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9.9
6.4
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7.8
9,7
5,9
7,2
0,0
5,2
0,0
0,0
1,8
0,5
2,7
0,0
4,3
2,8
0,0
0,0
1,2
2,8
1,2
0,0
0,0
0,5
0,52.1
9.7
5.9
7.2
0.0
5.2
0.0
0.0
1.8
0.5
2.7
0.0
4.3
2.8
0.0
0.0
1.2
2.8
1.2
0.0
0.0
0.5
0.5
IAM: Tokyo University, applied Microorganism Laboratory IFO: Incorporated Foundation Fermentation Laboratory AHU: Hokkaido University, Agricultural Department, applied Mycology RoemIAM: Tokyo University, applied Microorganism Laboratory IFO: Incorporated Foundation Fermentation Laboratory AHU: Hokkaido University, Agricultural Department, applied Mycology Roem
Die eingesetzten Carbonsäureester von dl-Menthoi leiten sich von Ameisensäure und organischen Carbonsäuren der allgemeinen Formel RCOOH ab, worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 1 bis 21 Kohlenstoffatomen darstellt. Beispiele derartiger Säuren sind Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmiiinsäure, Stearinsäure, Acrylsäure, Oleinsäure und Erucasäure. Im allgemeinen werden jedoch niedrigere organische Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure bevorzugt, da die Hydrolyseaktivität der organischen Carbonsäure eine Neigung zur Verringerung sowohl hinsichtlich Geschwindigkeit als auch Selektivität zeigt, wenn die Länge der Kohlenstoffkette zunimmt. Essigsäure ist die vorteilhafteste Säure zur Verwendung als Veresterungskomponente und wird daher besonders bevorzugt. The dl-Menthoi carboxylic acid esters used derive from formic acid and organic carboxylic acids of the general formula RCOOH, where R represents an alkyl or alkenyl group having 1 to 21 carbon atoms. Examples of such acids are Acetic acid, propionic acid, butyric acid, caproic acid, caprylic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, Palmic acid, stearic acid, acrylic acid, oleic acid and erucic acid. In general, however lower organic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid and butyric acid are preferred, since the hydrolysis activity of the organic carboxylic acid has a tendency to decrease in terms of both Speed as well as selectivity shows as the length of the carbon chain increases. acetic acid is the most advantageous acid for use as the esterification component and is therefore particularly preferred.
Gemäß der Erfindung wird die Hydrolyse der Ester von 1-Menthol nicht nur durch Schütteln in Berührung mit den wachsenden Organismen oder den intakten Zellen derselben durchgeführt, sondern auch durch Vermischen der Ester mit einem von lebenden Zellen freien Kulturmedium und mit dem zellfreien Extrakt der vorstellend aufgeführten Mikroorganismen. Beispielsweise können die vorstehend aufgeführten Mikroorganismen in Pinem flüssigen Kulturmedium zur Ansammlung der Esterasen in den Zellkörpcrn oder dem Medium bebrütet werden, und anschließend kann ein organischer Carbonsäureester von dl-Menthol oder ein Gemisch von organischen Carbonsäureestern von dl-Mentholisomeren, die dl-Menthol enthalten, zu dem flüssigen Kulturmedium zugesetzt werden. Andererseits können nach der Abtrennung der Zellkörper aus dem flüssigen Kulturmedium die ZellkörperAccording to the invention, the hydrolysis of the esters of 1-menthol is not only achieved by shaking in contact carried out with the growing organisms or the intact cells of the same, but also through Mix the esters with a culture medium free of living cells and with the cell-free extract of the presented microorganisms. For example, the microorganisms listed above in pinem liquid culture medium for the accumulation of esterases in the cell bodies or be incubated in the medium, and then an organic carboxylic acid ester of dl-menthol or a mixture of organic carboxylic acid esters of dl-menthol isomers which contain dl-menthol, can be added to the liquid culture medium. On the other hand, after the separation of the cell body the cell bodies from the liquid culture medium
in einer geeignet gepufferten Flüssigkeit suspendiert werden und diese Suspension zu den vorstehend aufgeführten Estern zugesetzt werden. Weiterhin können sämtliche Materialien, wie Extrakte, die die Carbonsäureesterhydrolase enthalten, eingeengte flüssige Massen hieraus, rohe und gereinigte Carbonsäureesterhydrolase, die aus den Zellkörpern der vorstehend aufgeführten Mikroorganismen oder deren Kulturmedium nach üblichen Verfahren isoliert und gereinigt worden ist. Es können auch rohe oder gereinigtebe suspended in a suitably buffered liquid and this suspension to those listed above Esters are added. Furthermore, all materials, such as extracts, which the carboxylic acid ester hydrolase contain, concentrated liquid masses thereof, crude and purified carboxylic acid ester hydrolase, those from the cell bodies of the microorganisms listed above or their culture medium has been isolated and purified by conventional methods. It can also be raw or purified
So Carbonsilureesterhydrolasen, die durch Kombination mit irgendwelchen hochmolekularen Verbindungen unlöslich gemacht worden sind, verwendet werden.So carboxylic acid ester hydrolases obtained by combination insolubilized with any high molecular compounds can be used.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens beträgt dieWhen performing this procedure, the
Reaktionstemperatur 25 bis 45°C, vorzugsweise 30 bis 4OC, für einen wirtschaftlichen Betrieb. Die Reaktionszeit beträgt elva 5 bis 96 Stunden bei 30 bis 40GC. Jedoch kann diese Zeil durch Einstellung der Konzentration der organischen Carbonsäureester von dl-Menthol abgekürzt oder verlängert werden. Die Menge dieser Ester oder eines Gemisches von isomeren Estern, die dl-Menthol enthalten, liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 2 bis 20 Gewichtsprozent des Kulturmediums aus den vorstehend aufgeführten Mikroorganismen. Wenn Zellkörper oder die Carbonsäureesterhydrolase selbst verwendet werden, läßt sich die Menge der einzusetzenden Ester aus der berechneten Menge der Mikroorganismen im Kulturmedium bestimmen. Die organischen Carbonsäureester vonReaction temperature 25 to 45 ° C, preferably 30 to 40C, for economical operation. The reaction time is approximately 5 to 96 hours at 30 to 40 G C. However, this period can be shortened or lengthened by adjusting the concentration of the organic carboxylic acid esters of dl-menthol. The amount of these esters or a mixture of isomeric esters which contain dl-menthol is preferably in the range from about 2 to 20 percent by weight of the culture medium from the microorganisms listed above. If cell bodies or the carboxylic acid ester hydrolase itself are used, the amount of the ester to be used can be determined from the calculated amount of the microorganisms in the culture medium. The organic carboxylic acid esters of
dl-Menthol oder ein Gemisch der organischen Carbonsäureester von dl-Mentholisomeren, die dl-Menthol enthalten, können als solche oder in emulgiertcr Form mit Polyvinylalkohol oder anderen Emulgatoren zugegeben werden. Die Hydrolyse läßt sich ziemlich rasch ausführen, wenn die Ausgangsstoffe in emulgierter Form vorliegen.dl-menthol or a mixture of the organic carboxylic acid esters of dl-menthol isomers, the dl-menthol may be added as such or in emulsified form with polyvinyl alcohol or other emulsifiers will. The hydrolysis can be carried out fairly quickly if the starting materials are emulsified Form.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren unter Anwendung der von den vorstehend aufgeführten Mikroorganismen gebildeten Carbonsäureesterhydrolasen auf ein Gemisch von organischen Carbonsäureestern von dl-Mentholisomeren, die organische Carbonsäureester von dl-Menthol enthalten, unterliegt in vielen Fällen lediglich der organische Carbonsäureester von 1-Menthol der Hydrolyse, so daß lediglich 1-Menthol gebildet wird. In anderen Fällen wird jedoch neben 1-Menthol 1-Isomenthol gebildet. Die Ester der anderen Menthol-Isomeren unterliegen der Hydrolyse nicht.In the method according to the invention using the microorganisms listed above formed carboxylic acid ester hydrolases on a mixture of organic carboxylic acid esters of dl-menthol isomers, which contain organic carboxylic acid esters of dl-menthol, is subject to many Only cases of the organic carboxylic acid ester of 1-menthol of the hydrolysis, so that only 1-menthol is formed. In other cases, however, 1-isomenthol is formed in addition to 1-menthol. The esters of the others Menthol isomers are not subject to hydrolysis.
Wenn der Hydrolysegrad 80 bis 100% beträgt,, wird die Umsetzung abgebrochen und das Reaktionsprodukt, das- 1-Menthol und gelegentlich daneben 1-lsomenthol enthält, aus der Reaktionsflüssigkeit isoliert. Falls diese Isolierung auf Grund der Anwendung eines Emulgators schwierig wird, wird das Reaktionsprodukt mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert oder durch Dampfdestillation isoliert. i-Menthoi und i-isumeniiiu! können von den nicht umgesetzten organischen Carbonsäureestern durch Ausnützen der unterschiedlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften dieser Materialien, beispielsweise durch Absorptionschromatographie unter Anwendung von Aluminiumoxyd, durch Lösungsmittelextraktion oder fraktionierte Destillation aufgetrennt werden. Sollte das erhaltene 1-Menlhol auch 1-Isomenthol enthalten, lassen sich beide Menthole leicht durch Rektifizierung über die Cyanessigsäureester, Monochloressigsäureester und Phthalsäuremonoester, Umkristallisation und Chromatographie trennen.When the degree of hydrolysis is 80 to 100%, becomes the reaction stopped and the reaction product, das-1-menthol and occasionally next to it 1-isomenthol contains, from the reaction liquid isolated. If this isolation becomes difficult due to the use of an emulsifier, the reaction product will be extracted with an organic solvent or isolated by steam distillation. i-Menthoi and i-isumeniiiu! can not of them converted organic carboxylic acid esters by utilizing the different physical and chemical properties of these materials, for example by absorption chromatography under Application of aluminum oxide, separated by solvent extraction or fractional distillation will. Should the 1-Menlhol received too Contain 1-isomenthol, both mentholes can be easily removed by rectification via the cyanoacetic acid ester, Monochloroacetic acid ester and phthalic acid monoester, recrystallization and chromatography separate.
Die im Rahmen der Erfindung zu verwendenden Mikroorganismen bilden die gewünschte Carbonsäureesterhydrolase leicht, da sie eine hohe Wuchsgeschwindigkeit besitzen und in billigen Kulturmedien wachsen. Die eingesetzte Carbonsäureesterhydrolase hat vorteilhafterweise eine hohe Aktivität und Stabilität.The microorganisms to be used in the context of the invention form the desired carboxylic acid ester hydrolase easy because they have a high growth rate and grow in cheap culture media. The carboxylic acid ester hydrolase used advantageously has high activity and stability.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, wobei sämtliche Prozentsätze auf das Gewicht bezogen sind. In den Beispielen werden die folgenden Abkürzungen angewandt:The following examples serve to illustrate preferred embodiments of the invention, wherein all percentages are by weight. The following abbreviations are used in the examples applied:
IAM: Institute of Applied Microbiology,
University of Tokyo, Tokyo, Japan
IFO: Institute für Fermentation, Osaka, Japan
AHU: Faculty of Agriculture, Hokkaido University, Sapporo, JapanIAM: Institute of Applied Microbiology,
University of Tokyo, Tokyo, Japan
IFO: Institute for Fermentation, Osaka, Japan
AHU: Faculty of Agriculture, Hokkaido University, Sapporo, Japan
In einen Kolben wurden 100 ml eines Kulturmediums aus 0,5% Glukose, 0,5% Kaliumhydrogenphosphat, 0,7% Pepton und 0,5% Hefeextrakt eingebracht, sterilisiert und mit Sareina aurantiaca IAM 1059 beimpft. Nach dem Bebrüten unter Schütteln (Vibrationsamplitude 6 cm, Drehung100 ml of a culture medium composed of 0.5% glucose, 0.5% potassium hydrogen phosphate, 0.7% peptone and 0.5% yeast extract introduced, sterilized and treated with Sareina aurantiaca IAM 1059 inoculated. After incubation with shaking (vibration amplitude 6 cm, rotation
15 Umdr./Min. bei 30' C innerhalb von 24 Stunden wurde eine Emulsion von 2 g eines Gemisches von Ameiscnsäurccstcrn von di-Mcntholisomcrcn (55,2% dl-Mcnthylformiat, 15,3% dl-Isomcnthylformiat, 29,3% dl-Neomenthylformiat und eine Spur von dl-Neoisomenthylformiat) in 8 ml einer 2%igen wäßrigen Polyvinylalkohollösung zugesetzt und das Gemisch weitere 96 Stunden geschüttelt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit Hexan extrahiert. Eine Ausbeute von 1,73 g des Reaktionsproduktes wurden erhalten, das nach der gaschromalographischen Analyse 14,8% 1-Menthol und 0,4% 1-Isomenthol enthielt. 1,5 g des Reaktionsproduktes wurden in 30 ml15 rev / min. at 30 ° C within 24 hours an emulsion of 2 g of a mixture of formic acid components of di-methyl isomer (55.2% dl-methyl formate, 15.3% dl-isomethyl formate, 29.3% dl-neo-menthyl formate and a trace of dl-neoisomenthyl formate) in 8 ml of a 2% strength aqueous solution Polyvinyl alcohol solution was added and the mixture was shaken for a further 96 hours. Then became the reaction mixture extracted with hexane. A yield of 1.73 g of the reaction product was made obtained which, according to gas chromatographic analysis, contained 14.8% 1-menthol and 0.4% 1-isomenthol. 1.5 g of the reaction product were in 30 ml
ίο η-Hexan gelöst und in Menthol (0,21 g) und nicht umgesetzte Ester durch Chromatographie auf einer Aluminiumoxydkolonne aufgeteilt. Das Menthol wurde aus Nitromethan umkristallisiert Dabei wurden 0,13 g 1-Menthol erhalten, Schmelzpunkt 41rC, [\]fίο η-hexane dissolved and divided into menthol (0.21 g) and unreacted ester by chromatography on an aluminum oxide column. The menthol was recrystallized from nitromethane. This gave 0.13 g of 1-menthol, melting point 41 ° C., [\] f
=_ -49,7° (c - 1,5, Äthanol).= _ -49.7 ° (c - 1.5, ethanol).
100 ml des im Beispiel 1 beschriebenen Mediums wurde mit den Micrococcus-Varianten IAM 1314 beimpft und nach der Bebrütung durch Schütteln bei 30 C innerhalb von 24 Stunden mit 2 g eines Gemisches von Essigsäureestern von dl-Mentholisomcren (dl-Meniiiylacetat 55,2%, di-Isomenthylacelat 15,3%, dl-Neomenthylacetat 29,3% und dl-Neoisomcnthylacetat, Spur) versetzt. Nach dem Schütteln bei der gleichen Temperatur innerhalb von 72 Stunden wurde das Reaktionsnrodukt aus dem Kulturmedium durch Abzentrifugieren abgetrennt. Die Ausbeute des Reaktionsproduktes betrug 1,81 g, und die gaschromatographische Analyse ergab 13,4% 1-Menthol und 0,09% 1-Isomenthol. Das Reaktionsprodukt wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 behandelt. Dabei wurden 0,2g 1-Menthol erhalten, [\]i? 49,8100 ml of the medium described in Example 1 was inoculated with the Micrococcus variants IAM 1314 and after incubation by shaking at 30 C within 24 hours with 2 g of a mixture of acetic acid esters of dl-menthol isomers (dl-meniiyl acetate 55.2%, di-isomenthylacelate 15.3%, dl-neomenthyl acetate 29.3% and dl-neoisomethyl acetate, Track) offset. After shaking at the same temperature within 72 hours it became the reaction product is separated off from the culture medium by centrifugation. The yield of the reaction product was 1.81 g and gas chromatographic analysis found 13.4% 1-menthol and 0.09% 1-isomenthol. The reaction product was in treated in the same way as in Example 1. 0.2 g of 1-menthol were obtained, [\] i? 49.8
(c = 5, Äthanol).(c = 5, ethanol).
In einen Kolben wurde 1 1 eines Kulturmediums aus 1,5% Sojabohnenpulver, 0,1% Glukose und 0,2% Hefeextrakt eingebracht und sterilisiert. Das jNährmedium wurde mit Alcaligenes viscalactis IAM 1061 beimpft und bei 37°C 24 Stunden bebrütet. Nach der Entfernung des unlöslichen Materials in diesem Kulturmaterial unter Anwendung eines Filtertuchs wurden die Zellkörper abzentrifugiert und in 500 ml einer 0,1 m Phosphorsäurepufft. lösung (pH-Wert 7,5) suspendiert. 50 g eines Gemisches der Essigsäureester von dl-Mentholisomeren mit der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 2 wurden dann zugegeben. Nach dem Schütteln des Gemisches bei 37"C innerhalb von 72 Stunden wurde das Reaktionsprodukt durch Zentrifugieren gesammelt.In a flask was 1 l of a culture medium made of 1.5% soybean powder, 0.1% glucose and 0.2% yeast extract introduced and sterilized. The nutrient medium was made with Alcaligenes viscalactis IAM 1061 inoculated and incubated at 37 ° C for 24 hours. After removing the insoluble material in The cell bodies were centrifuged off this culture material using a filter cloth and placed in 500 ml of a 0.1 m phosphoric acid buffer. solution (pH 7.5) suspended. 50 g of a mixture of Acetic acid esters of dl-menthol isomers with the same composition as in Example 2 were then admitted. After shaking the mixture at 37 "C for 72 hours, the reaction product became collected by centrifugation.
Die Ausbeute des Reaktionsproduktes betrug 44,3 § und die gaschromatographische Analyse ergab 23,4°/, 1-Menthol und 6,8% 1-Isomenthol. Das Reaktionsprodukt wurde dann in 1-Menthol, 1-Isomentho! (13,2 g) und nicht umgesetzte Ester durch Chromatographie an einer Aluminiumoxydkolonne aufgeteilt Das Menthol wurde mit Monochloressigsäure ver estert und aus Methanol umkristallisiert, wobei 11,5 j Kristalle des Monochloressigsäureestcrs von !-Men thol erhalten wurden, die dann hydrolysiert wurden wobei 8,1 g Kristalle von 1-Menthol erhalten wurden [\]f 49,9 (r 5. Äthanol).The yield of the reaction product was 44.3 § and the gas chromatographic analysis showed 23.4 ° /, 1-menthol and 6.8% 1-isomenthol. The reaction product was then dissolved in 1-menthol, 1-isomentho! (13.2 g) and unreacted esters divided by chromatography on an aluminum oxide column The menthol was ver with monochloroacetic acid esters and recrystallized from methanol, with 11.5 j Crystals of the monochloroacetic acid ester of! -Menethol were obtained, which were then hydrolyzed 8.1 g crystals of 1-menthol were obtained [\] f 49.9 (r 5th ethanol).
B e i s ρ i e I 4B e i s ρ i e I 4
In einem Beckenfermentiergerät wurden 5 I eine Kulturmediums aus 30% Klciecxlrakt (erhallen durcl Extraktion von 1 Teil Kleie mit 5 Teilen heißerIn a basin fermenter, 5 l of a culture medium made up of 30% Klciecxlrakt (obtained durcl Extraction of 1 part of bran with 5 parts of hot
Wasser), 0.5 * „ Pepton und 0.1'',, Glukose eingebracht und sterilisiert. 25U ml eines Vorkulturmediums wurde mi' Pseudomonas fluorescens IAM 1057 beimpft und bei 37 C (Rühren 250 L'mdr. Min., Belü;;ung 2,5 I Min.) bebrütet. Nach der 24stündigen Bebrütung wurden 500 ml des Propionsäureesters \on dl-Menthol hinzugegeben und das Gemisch weiterhin bei 0,5 1, Min. 96 Stunden bebrütet. Dann wurde das Rühren abgebrochen und das oben schwimmende Reaktionsprodukt abgetrennt. Die Ausbeute des m Reaktionsproduktes betrug 418 g. wovon I-Menthol 37,6% betrug. Das Reaktionsprodukt wurde in I-Menthol und nicht umgesetzte Ester durch Chromatographie auf einer Aluminiumoxydkolonne aufgeteilt. Die Ausbeute an I-Menthol betrug 161 g, h)? 49,3" (c 5, Äthanol).Water), 0.5 * " peptone and 0.1""glucose introduced and sterilized. 25U ml of a preculture medium was inoculated with Pseudomonas fluorescens IAM 1057 and incubated at 37 ° C. (stirring for 250 lmdr. Min., Aeration; approx. 2.5 l min.). After the 24-hour incubation, 500 ml of the propionic acid ester were added and the mixture was further incubated for 0.5 min. 96 hours. The stirring was then stopped and the reaction product floating above was separated off. The yield of the reaction product was 418 g. of which I-menthol was 37.6%. The reaction product was divided into I-menthol and unreacted ester by chromatography on an alumina column. The yield of I-menthol was 161 g, h)? 49.3 "(c 5, ethanol).
In einen Kolben wurden 500 ml des Kulturmediums mit der Zusammensetzung gemäß Beispiel 1 eingebracht und sterilisiert. Es wurde mit Brevibacterium helvorum IAM 1637 beimpft und durch Schütteln bei 37'C 24 Stunden bebrütet. Anschließend wurden die Zellkörper abzentrifugiert und in 100 ml einer 0.1 m Phosphorsäurepufferlösung suspendiert. Mit eier Suspension wurde dann eine Ultraschallbehandlung (22 KCS, 200 Watt. 30 Minuten) unter Kühlung mit Eiswasser ausgeführt. Die Flüssigkeit wurde auf der Ultrazentrifuge zur Entfernung von unlöslichen Bestandteilen zentrifugiert und mit einer Emulsion von 5 g einci Gemisches von Ameiscr.säuree3tern von dl-Mentholisomeren mit der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 1 emulgiert mit 25 ml einer wäßrigen 2%igen Polyvinylalkohollösung, versetzt. Nach der 48stündigen Umsetzung bei 30' C wurde das Reaktionsprodukt mit Äther extrahiert. Die Ausbeute des Reaktionsproduktes betrug 4,8 g, und die gaschromatographische Analyse zeigte 13,4% I-Menthol und 3,4% I-Isomenthol. Nach der Chromatographie über einer Aluminiumoxydkolonne zur Auftrennung von I-Menthol und 1-Isomenthol von den nicht umgesetzten Estern wurden 0,5 g eines Gemisches aus I-Menthol und 1-Isomenthol erhalten. Dieses wurde in die Monochloressigsäureester überführt, welche da.in auf - 20 C abgekühlt wurden und dabei 0,41 g des Monochloressigsäureesters von I-Menthol erhalten wurden, welcher hydrolysiert wurde, so daß sich 0,23 g I-Menthol ergaben, Schmelzpunkt = 42,7°C, [*]? ^ -50,2 (c = 1,5, Äthanol).500 ml of the culture medium with the composition according to Example 1 were placed in a flask and sterilized. It was inoculated with Brevibacterium helvorum IAM 1637 and incubated by shaking at 37 ° C. for 24 hours. The cell bodies were then centrifuged off and suspended in 100 ml of a 0.1 M phosphoric acid buffer solution. Ultrasound treatment (22 KCS, 200 watts, 30 minutes) was then carried out with a suspension while cooling with ice water. The liquid was centrifuged on the ultracentrifuge to remove insoluble constituents and mixed with an emulsion of 5 g of a mixture of formic acids of dl-menthol isomers with the same composition as in Example 1 emulsified with 25 ml of an aqueous 2% polyvinyl alcohol solution. After the reaction for 48 hours at 30 ° C., the reaction product was extracted with ether. The yield of the reaction product was 4.8 g, and the gas chromatographic analysis showed 13.4% I-menthol and 3.4% I-isomenthol. After chromatography over an aluminum oxide column to separate I-menthol and 1-isomenthol from the unreacted esters, 0.5 g of a mixture of I-menthol and 1-isomenthol was obtained. This was converted into the monochloroacetic acid ester, which was cooled to -20 ° C. and 0.41 g of the monochloroacetic acid ester of I-menthol was obtained, which was hydrolyzed to give 0.23 g of I-menthol, melting point = 42.7 ° C, [*]? ^ -50.2 (c = 1.5, ethanol).
50 ml der mit Ultraschall behandelten Flüssigkeit nach Beispiel 5 wurden auf eine Kolonne mit einem vernetzten Dextrangel (Durchmesser 3,5 cm, Länge 75 cm) zur Sammlung der Carbonsäureesterhydrolase gegeben, welche dann durch die Methode der halbdurchlässigen Membrane konzentriert und durch Ver einigung mit 5 g »DEAE«-Cellulose (Diäthylaminoäthylcellulose) unlöslich gemacht wurde. 2 g des unlöslichen Produktes wurden in 50 ml einer 0,1 m Phosphorsäurepufferlösung suspendiert und die Esteremulsion hinzugegeben und in der gleichen . Weise 24 Stunden umgesetzt. Der gleiche Arbeitsgang wurde achtmal wiederholt, wobei das Reaktionsgemisch in jedem Fall durch Gaschromatographie analysiert wurde, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden: 50 ml of the ultrasound-treated liquid according to Example 5 were placed on a column with a cross-linked dextran gel (diameter 3.5 cm, length 75 cm) to collect the carboxylic acid ester hydrolase, which was then concentrated by the semi-permeable membrane method and combined with 5 g "DEAE" cellulose (diethylaminoethyl cellulose) has been made insoluble. 2 g of the insoluble product was suspended in 50 ml of a 0.1 M phosphoric acid buffer solution and the ester emulsion was added and in the same. Wise implemented 24 hours. The same operation was repeated eight times, the reaction mixture being analyzed by gas chromatography in each case, the following results being obtained:
<g>Yield.
<g>
C tl 1 memhol content
C t l
2 g des nach diesem Beispiel erhaltenen Reaktionsproduktes wurden durch Chromatographie über einer Aluminiumoxydkolonne entsprechend Beispiel 1 behandelt. Es wurden 0,3 g I-Menthol erhalten. [>]? ao = —49,9 (c = 1.5. Äthanol).2 g of the reaction product obtained according to this example were chromatographed over a Treated aluminum oxide column according to Example 1. 0.3 g of I-menthol were obtained. [>]? ao = -49.9 (c = 1.5. ethanol).
In einen Kolben wurden 100 ml des Kulturmediums mit der Zusammensetzung nach Beispiel 1 eingebracht, sterilisiert und mit Lactobacillus casei IFO 3425 beimpft. Nach dem Bebrüten durch Schütteln bei 37= C innerhalb von 48 Stunden wurden 2 g emes Gemisches der Essigsäureester der im Beispiel 2 angegebenen dl-Mentholisomeren hinzugegeben. Das Schütteln wurde bei der gleichen Temperatur 72 Stunden fortgesetzt und dann das Reaktionsprodukt mit Äther extrahiert. Die Ausbeute an Reaktionsprodukt betrug 1,74 g, und dieses enthielt entsprechend der gaschromatographischen Analyse 17,4% I-Menthol und 4,9% 1-Isomenthol. Das Reaktionsprodukt wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 3 behandelt. Es wurden 0,12 g I-Menthol erhalten, [\]jF -= -49.7° (c = 5, Äthanol). Schmelzpunkt 41.9 C.100 ml of the culture medium with the composition according to Example 1 were placed in a flask, sterilized and inoculated with Lactobacillus casei IFO 3425. After incubation with shaking at 37 C = within 48 hours 2 g of the mixture emes Essigsäureester was added to the dl-Mentholisomeren indicated in Example 2. Fig. Shaking was continued at the same temperature for 72 hours, and then the reaction product was extracted with ether. The yield of reaction product was 1.74 g and, according to the gas chromatographic analysis, this contained 17.4% I-menthol and 4.9% 1-isomenthol. The reaction product was treated in the same manner as in Example 3. 0.12 g of I-menthol were obtained, [\] jF - = -49.7 ° (c = 5, ethanol). Melting point 41.9 C.
Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 7, jedoch unter Anwendung von Streptococcus faecalis AHU 1086 an Stelle von Lactobacillus casci IFO 3425. betrug die Ausbeute des Reaktionsproduktes 1,83 g, und die gaschromatographische Analyse ergab 6,7% I-Menthol und 0,0% 1-Isomenthol. Das Reaktionsprodukt wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 3 behandelt. Es wurden 0,09 g I-Menthol erhalten, [\]f = -48.9" (c = 1, Äthanol), Schmelzpunkt 41,5'C B e i s ρ i e 1 9Following the procedure of Example 7, but using Streptococcus faecalis AHU 1086 in place of Lactobacillus casci IFO 3425. The yield of the reaction product was 1.83 g, and the gas chromatographic analysis showed 6.7% I-menthol and 0.0% 1-isomenthol. The reaction product was treated in the same manner as in Example 3. 0.09 g of I-menthol were obtained, [\] f = -48.9 " (c = 1, ethanol), melting point 41.5 ° C. Be i s ρ ie 19
Clostridium caproieum IAM 19228 wurde in 500 m eines Kulturmediums mit der gleichen Zusammen Setzung wie im Beispiel 1 gezüchtet. Das Gemiscl· wurde durch Schütteln bei 30J C innerhalb voi 48 Stunden bebrütet. 20 g eines Gemisches von Ca pronsäureestern der dl-Mentholisomeren (dl-Menthyl caproat 61%, dl-Isonienthylcaproat 22% und dl-Neo menthylcaproat 17%) wurden zugesetzt und nacl weiterem Schütteln 96 Stunden zur Sammlung de Reaktionsproduktes stehengelassen, welches nach obei schwamm. Die Ausbeute an Reaktionsprodukt betru. 19,7 g, und die gaschromatographische: Analyse zeigt 17,6% I-Menthol und 4,9% I-Isomenthol. Das Reak tionsprodukt wurde mit Wasserdampf destillien Dabei wurden 3,9 g eines Gemisches aus 1-Menthi Clostridium caproieum IAM 19228 was grown in 500 m of a culture medium with the same composition as in Example 1. The Gemiscl · was incubated by shaking at 30 J C within voi 48 hours. 20 g of a mixture of Ca pronic acid esters of the dl-menthol isomers (dl-menthyl caproate 61%, dl-isonienthyl caproate 22% and dl-neo menthyl caproate 17%) were added and, after further shaking, left to stand for 96 hours to collect the reaction product, which floated upwards . The yield of the reaction product was reduced. 19.7 g, and the gas chromatographic analysis shows 17.6% I-menthol and 4.9% I-isomenthol. The reaction product was distilled with steam. 3.9 g of a mixture of 1-menthi were thereby obtained
' und Isomenthol (I-Menthol 79%, 1-Isomenthol 21 ·/, erhalten. Das Gemisch wurde, wie im Beispiel 5, gc'and isomenthol (I-menthol 79%, 1-isomenthol 21 /, obtain. The mixture was, as in Example 5, gc
leinigt. Es wurden 2,3 g I-Menthol erhalten, [λ]? ·= -49,9 (c r 5, Äthanol).cleans. 2.3 g of I-menthol were obtained, [λ]? · = -49.9 (c r 5, ethanol).
In einen Kolben wurden 100 ml eines Kulturmediums •lit der gleichen Zusammensetzung, wie im Beispiel 1, eingebracht und sterilisiert. Es wurde mit Flavobactcrium esteroaromalicum IFO 3751 beimpft und durch Schütteln bei 37°C innerhalb von 36 Stunden bebrütet. Anschließend wurden 2 g der Palmitinsäureester von dl-Menthol zugesetzt und die Gesamtmasse weitere 72 Stunden geschüttelt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit Äther extrahiert und 1,91 g des Extraktes erhalten. Die gaschromatographische Analyse zeigte einen Gehalt von 13,2°/O 1-Menthol des Extraktes. Dieser Extrakt wurde mit Wasserdampf destilliert und das 1-Menthol als Destillat gewonnen. Das erhaltene rohe I-Menthol wurde aus Nitromethan umkristallisiert und ergab 0,14 g I-Menthol, [«]? = -49,7° (c = 1, Äthanol), Schmelzpunkt 41,2"C.100 ml of a culture medium with the same composition as in Example 1 were placed in a flask and sterilized. It was inoculated with Flavobactcrium esteroaromalicum IFO 3751 and incubated by shaking at 37 ° C. within 36 hours. Then 2 g of the palmitic acid ester of dl-menthol were added and the total mass was shaken for a further 72 hours. Then the reaction mixture was extracted with ether and 1.91 g of the extract was obtained. The gas chromatographic analysis showed a content of 13.2 ° / O 1-menthol of the extract. This extract was distilled with steam and the 1-menthol was obtained as a distillate. The crude I-menthol obtained was recrystallized from nitromethane and gave 0.14 g of I-menthol, [«]? = -49.7 ° (c = 1, ethanol), melting point 41.2 "C.
In einen Kolben wurden 100 ml eines Kulturmediums mit der gleichen Zusammensetzung, wie im Beispiel 3, eingebracht, sterilisiert und mit Mycobacterium phlei IFO 3158 beimpft. Nach dem Bebrüten durch Schütteln bei 37°C innerhalb von 36 Stunden wurden 2 g eines Gemisches der Laurinsäureester der im Beispiel 1 beschriebenen dl-Mentholisomeren zugegeben und die Gesamtmenge weitere 96 Stunden geschüttelt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit Äther extrahiert. Es wurden 1,92 g Extrakt erhalten. Die gaschromatographische Analyse zeigte einen Gehalt des Extraktes an 7,1 °/0 1-Menthol und 0,0°/0 I-Isomenthol. Der Extrakt wurde in der gleichen Weise, wie im Beispiel 10, behandelt und 0,23 g 1-Menthol erhalten, [α]?' = -49,0° (c = 1, Äthanol), Schmelzpunkt = 41,4°C.In a flask, 100 ml of a culture medium having the same composition as in Example 3 was placed, sterilized and inoculated with Mycobacterium phlei IFO 3158. After incubation by shaking at 37 ° C. within 36 hours, 2 g of a mixture of the lauric acid esters of the dl-menthol isomers described in Example 1 were added and the total amount was shaken for a further 96 hours. Then the reaction mixture was extracted with ether. 1.92 g of extract were obtained. The gas chromatographic analysis showed a content of 7.1 ° / 0 1-menthol and 0.0 ° / 0 I-isomenthol in the extract. The extract was treated in the same manner as in Example 10, and 0.23 g of 1-menthol was obtained, [α]? ' = -49.0 ° (c = 1, ethanol), melting point = 41.4 ° C.
Ein Kulturmedium mit der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 1 wurde mit Arthrobacter simplex IAM 1660 beimpft und durch Schütteln bei 37°C innerhalb von 48 Stunden bebrütet. 4 g dl-Menthylmyristinat wurden zugegeben und nach weiterem Schütteln 96 Stunden stehengelassen. Das oben S schwimmende Reaktionsprodukt wurde gesammelt. Ausbeute 3,4 g. Das Reaktionsprodukt wurde mit Wasserdampf destilliert. Es wurden 0,94 g I-Mcntholkristalle erhalten, [«]? = —50,0° (c 5, Äthanol).A culture medium with the same composition as in Example 1 was inoculated with Arthrobacter simplex IAM 1660 and incubated by shaking at 37 ° C. within 48 hours. 4 g of dl-menthyl myristinate were added and, after further shaking, left to stand for 96 hours. The reaction product floating above S was collected. Yield 3.4g. The reaction product was distilled with steam. 0.94 g of 1-methylol crystals were obtained, [«]? = -50.0 ° (c 5, ethanol).
■ o Be i s ρ i e 1 13■ o Be i s ρ i e 1 13
Entsprechend der Arbeitsweise von Beispiel 7, jedoch unter Verwendung von Nocardia gardinen IAM 0105 an Stelle von Lactobacillus casei IFO 3425, betrug die Ausbeute des Reaktionsproduktes 1,80 g, und die gaschromatographische Analyse zeigte 6,5% 1-Menthol und 0,0% 1-Isomentho! an. Das Reaktionsprodukt wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 3 behandelt. Es wurden 0,08 g 1-Menlhol erhalten, [α]?Corresponding to the procedure of Example 7, but using Nocardia curtains IAM 0105 instead of Lactobacillus casei IFO 3425, the yield of the reaction product was 1.80 g, and gas chromatographic analysis showed 6.5% 1-menthol and 0.0% 1-isomentho! at. The reaction product was prepared in the same manner as in Example 3 treated. 0.08 g of 1-Menlhol were obtained, [α]?
ao = -48,8" (c = 1, Äthanol), Schmelzpunkt = 41,5°C.ao = -48.8 "(c = 1, ethanol), melting point = 41.5 ° C.
Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 2, jedochFollowing the procedure of Example 2, however
a5 unter Verwendung von Aerobacter cloacao IAM 1134 an Stelle von Micrococcus variants IAM 1314, betrug die Ausbeute des Reaktionsproduktes 1,76 g, und die gaschromatographische Analyse zeigte 13,8% i-Menthol und 0,0% 1-lsomenthol an. Das Reaktionsprodukt wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 behan-• delt. Es wurden 0,3 g I-Menthol erhalten, [·*]?a5 using Aerobacter cloacao IAM 1134 instead of Micrococcus variants IAM 1314, the yield of the reaction product was 1.76 g, and the Gas chromatographic analysis showed 13.8% i-menthol and 0.0% 1-isomenthol. The reaction product was treated in the same way as in Example 1 delt. 0.3 g of I-menthol were obtained, [· *]?
= _49,9° (c = 5, Äthanol).= _49.9 ° (c = 5, ethanol).
Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 12, jedoch unter Verwendung von AgrobacUrium tumefaciens IAM 1525 an Stelle von Arthrobacter simplex IAM1660, wurden 3,2 g des Reaktionsproduktes erhalten. Das Reaktionsprodukt wurde mit Wasserdampf destilliert. Es wurden 0,87 g 1-Mentholkristalle erhalten, [<x]f = -48,8° (c = 5, Äthanol).Following the procedure of Example 12, but using AgrobacUrium tumefaciens IAM 1525 instead of Arthrobacter simplex IAM1660, 3.2 g of the reaction product were obtained. The reaction product was distilled with steam. 0.87 g of 1-menthol crystals were obtained, [<x] f = -48.8 ° (c = 5, ethanol).
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