DE202018004857U1 - Mäander-Perfusions-Bioreaktor für die Differenzierung, Aktivierung, Stimulierung und Abtrennung von Zellen - Google Patents

Mäander-Perfusions-Bioreaktor für die Differenzierung, Aktivierung, Stimulierung und Abtrennung von Zellen Download PDF

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Abstract

Mäander- Perfusions- Bioreaktor für die Differenzierung, Aktivierung, Stimulierung und Abtrennung von Zellen bestehend aus einen rechteckigen Bioreaktorgefäß (1) aus vorzugsweise klarem Polymermaterial, das mit einem Deckel (2) steril verschlossen ist, wobei das Bioreaktorgefäß (1) in drei übereinander angeordneten Kammern (3,4,5) unterteilt ist und die unterste Kammer (3) als Unterlay- Kammer, die über der Unterlay-Kammer (3) angeordnete Kammer (4) als Mäander- Perfusions- Kammer und die über der Mäander- Perfusions- Kammer (4) angeordnete Kammer (5) als Overlay-Kammer ausgebildet und die Unterlay- Kammer (3) und die Mäander-Perfusions- Kammer (4) durch eine gelochte Bodenplatte (6) mit einer unten an der gelochten Bodenplatte (6) angeordneten semipermablen Folie (7) voneinander getrennt sind und die Bodenplatte (6) mit auf der Oberseite (8) angeordneten streifenförmigen , die Bodenplatte (6) unterteilenden und eine mäanderförmige Durchströmung der Mäander- Perfusions- Kammer (4) mit Medium erzwingenden Trennwänden (8) versehen ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Bodenfläche (18) der Bodenplatte (6) der Mäander- Perfusions- Kammer (4), die Breite und die Höhe der durch die Trennwände (8) gebildeten Gerinne (19) einen Kontakt zwischen den Aussaatzellen erzwingende, in Abhängigkeit der Menge der zu züchteten Zellen sowie in Abhängigkeit der Menge der Saatzellen der Ausgangsmenge eine frei wählbare Größe aufweisen..

Description

  • Die Erfindung betrifft einen Mäander- Bioreaktor, in dem es gelingt, aus kleingeschnittenen Gewebestücken bestimmte Zellen sowohl in das im Bioreaktor befindliche Medium auswachsen zu lassen, als auch die Zellen gleichzeitig dynamisch und stressfrei zu expandieren, differenzieren, aktivieren, stimulieren und dann von Geweberesten abzutrennen. Insbesondere können auf diese Weise tumorinfiltrierende autologe T- Lymphozyten (TIL) aus Tumorgewebe, Metastasengewebe, deren Umgebungsgewebe und aus Lymphknoten, die von Tumorzellen befallenen sind, aber auch die Gesamtfraktion oder einzelne Zellarten der hämatopoetischen Zellen, hämatopoetischen Stammzellen, hämatopoetischen Progenitorzellen, Immunzellen darin, gewonnen werden, wobei der Bioreaktor im Perfusionsbetrieb arbeitet..
  • Die DE 695 34 132 T2 beschreibt eine Zellkulturvorrichtung , die einen Behälter mit einem Zellkulturabteil umfasst, wobei der Behälter von einer unteren gasdurchlässigen Schicht und einem oberen Blatt, das selektiv für Verbindungen einer vorgegebenen Größe durchlässig und für Zellen undurchlässig ist, begrenzt wird. Der Behälter ist dafür ausgelegt ist, ein Kulturmedium zwischen dem oberen Blatt und der unteren gasdurchlässigen Schicht aufzunehmen.
    Der Behälter besteht aus
    • - einem Basalmediumabteil , von dem sich mindestens ein Teil über dem oberen Blatt befindet, wobei ein Basalmedium auf dem oberen Blatt liegen kann;
    • - nur einer einzigen Zugangsöffnung zu dem Zellkulturabteil ;
    • - einer Zugangsöffnung zu dem Basalmediumabteil; und
    • - einem gasdurchlässigen Schichtträger , der unterhalb der gasdurchlässigen Schicht angeordnet ist und mit dieser teilweise in Kontakt steht, wodurch der größte Teil der gasdurchlässigen Schicht in einer im Wesentlichen horizontalen Lage gehalten wird, so dass sich Zellen einer Suspension entlang des horizontalen Abschnitts der gasdurchlässigen Schicht verteilen können und ein Gasaustausch mit dem Zellkulturabteil nicht wesentlich behindert wird.
  • In der DE 693 32 374 T2 wird einen Bioreaktor zum Kultivieren von Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen beschrieben, der aus einem Gehäuse , das eine Zellkulturkammer definiert, in die Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, eingebracht und worin sie kultiviert werden können, wobei diese Zellkulturkammer so ausgebildet ist, das sie eine Vielzahl von Einlassöffnungen im Wesentlichen äquidistant zu einer Vielzahl von Auslassöffnungen enthält, damit Zellkulturmedium hindurchströmen kann, besteht. Der Bioreaktor beschreibt weiterhin
    • • Mittel zum Perfundieren eines flüssigen Zellkulturmediums durch die Zellkulturkammer;
    • • Mittel zum In-Kontakt-Bringen des flüssigen Zellkulturmediums, das durch die Zellkulturkammer perfundiert wird, mit einer Sauerstoffquelle, so dass das flüssige Zellkulturmedium, das durch die Zellkulturkammer perfundiert wird, mit Sauerstoff angereichert wird, wobei diese Mittel zum In-Kontakt-Bringen eine für Gas permeable und für Flüssigkeit impermeable Membran enthalten;
    und
    • • Mittel zum kontinuierlichen, periodischen oder diskontinuierlichen Ernten nicht adhärenter Zellen aus der Zellkulturkammer durch die Strömung des Kulturmediums.
  • Die für das Gas permeable und für Flüssigkeit impermeable Membran wird so in das Gehäuse eingebaut, dass das Gehäuse in die Zellkulturkammer auf der einen Seite der Membran und in eine Gaskammer auf der anderen Seite der Membran unterteilt wird. Der Bioreaktor umfasst Mittel zum Perfundieren von Atmungsgasen durch diese Zellkultur, die Mittel zum Zuführen der Atmungsgase zu der Gaskammer umfassen, wodurch die Atmungsgase durch die Membran strömen und dabei durch die Zellkulturkammer hindurchtreten, und Mittel zum Abziehen verbrauchter Atmungsgase aus der Gaskammer.
  • Die Erfindung gemäß der DE 69614535 T2 betrifft allgemein eine Vorrichtung zum Aufbewahren und zur Züchtung von biologischen Zellen ex vivo und insbesondere eine Vorrichtung dieser Art, die die Zellen in einer tragbaren Kassette aufbewahrt und züchtet, während ein steriles System aufrechterhalten wird, das von der äußeren Umwelt abgeschlossen ist
  • Die Vorrichtung zur ex vivo Aufbewahrung und Züchtung von biologischen Zellen, umfasst eine tragbare Zellwachstumskassette, die einschließt
    • • ein Gehäuse,
    • • eine Zellwachstumskammer innerhalb des Gehäuses, konfiguriert um eine Menge von biologischen Zellen und ein Wachstumsmedium zu tragen, wobei die Zellwachstumskammer eine Medium-Einlassöffnung und eine Medium-Auslassöffnung aufweist,
    • • einen Mediumbehälter, der mit der Medium-Einlassöffnung der Zellwachstumskammer verbunden und konfiguriert ist, ein Wachstumsmedium zu enthalten,
    und
    • • einen Abfallbehälter, der mit der Medium-Auslassöffnung der
    • • Zellwachstumskammer verbunden und konfiguriert ist, von der
    • • Wachstumskammer abgelassenes Medium
    • • aufzunehmen, wobei die Zellwachstumskammer, der Mediumbehälter und
    • • der Abfallbehälter ein von der äußeren Umwelt abgeschlossenes steriles
    • • System bilden;
    Die Zellwachstumskammer enthält eine Gas-permeable/Flüssigkeits-impermeable Membran, die einen Teil der Zellwachstumskammer definiert und eine Gaskammer, die auf der der Zellwachstumskammer gegenüberliegenden Seite der Membran lokalisiert ist. Die tragbare Zellwachstumskassette schließt weiterhin einen Gaszufuhranschluss ein, der von einer Rückwand des Gehäuses getragen wird, und eine Gaszufuhrleitung, welche den Gaszufuhranschluss mit der Gaskammer verbindet, um so Gas zur Gaskammer zur Permeation durch die Membran zu der Zellwachstumskammer zu liefern.
  • Die Erfindung gemäß der CN1699558 betrifft eine großtechnische Kultivierungstechnologie für Killerzellen zur Induktion von Zellfaktor für hämatopoetische Stammzellen unter Verwendung eines Bioreaktors, umfassend das Erhalten von Nabelschnurblut-hemapoietischen Stammzellen, das Induzieren der hämatopoetischen Stammzellen in DC-Zellen mit Cytokin, das Vervollständigen der die Funktion des Tumorantigens zu präsentieren, die ausgewählte Aktivierung von Killer-T-Lymphozyten mit spezifischer Abtötungswirkung an Tumoren zu vervollständigen, die Herstellung des Gelose-Mikroträgers für den monoklonalen Antikörper (CD3McAb), die Aktivierung der CIK-Zellen und die kontinuierliche Kultivierung von CIK-Zellen im Bioreaktor zu verknüpfen.
  • Die DE 10 2011 106 914 B4 / EP25 43 719 A1 offenbart einen Mänder-Bioreaktor zur dynamischen und stressfreien Expansion, Differenzierung und Ernte der Gesamtfraktion hämatopoetischer Zellen, Stammzellen, Progenitorzellen, aber auch von isolierten, stimulierten, aktivierten Fraktionen dieser Zellen, außer embryonalen Zellen, wobei der Bioreaktor im Perfusionsbetrieb arbeitet. Der Bioreaktor besteht aus einem Bioreaktorgefäß, dessen Bodenfläche mit versetzt angeordneten Trennwänden versehen ist, die eine mäanderartige Führung der Medien mit einer laminaren Strömung bewirken. Der Mäander-Bioreaktor kann über Absperrventile mit anderen Mäander-Bioreaktoren modulartig in Reihe geschaltet werden. Die Zellen bilden nach dem Zuführen in das Bioreaktorgefäß eine zusammenhängende, die Bodenfläche des Mäander-Bioreaktors nahezu bedeckende Zellschicht, wobei die Zellen untereinander vielfach engen Kontakt zueinander haben. Die bei der Expansion entstehenden Zellklumpen werden durch Rütteln aufgelöst und geerntet oder werden einem nachfolgenden modulartigen Bioreaktor mit einer der Expansionsrate des vorherigen Bioreaktors entsprechenden größeren Bodenfläche des Bioreaktorgefäßes zur weiteren Expansion zugeführt.
  • In der DE 10 2018 000 561.6 wird ein Mäander- Bioreaktor und ein zweistufiges Verfahren für die ex- vivo Gewinnung von Zellen beschrieben, die in der ersten Stufe des Verfahrens aus zerkleinerten Gewebeteilen in das im Bioreaktorgefäß (1) befindliche Medium auswachsen, gleichzeitig aktiviert und vermehrt werden und nach Erreichen einer bestimmten Dichte an ausgewachsenen und expandierten Zellen von den Gewebeteilen separiert werden. Die Ausgangs-Gewebe, die von Tumorzellen befallenen sind, stammen bevorzugt aus Anlass von Organtumor- oder Metastasen-Operationen oder Entfernung von deren unmittelbar umgebenden Geweben oder auch aus Lymphknoten. Das Verfahren in der ersten Stufe erfolgt in einem geschlossenen Mäander- Bioreaktorgefäß (1), das mit einem üblichen Medium gerichtet perfundiert und dessen Medium mit einem Gemisch aus AB Humanserum, Cytokinen, Antikörpern und irradiierten humanen Feederzellen zeitweilig supplementiert wird. Die kleingeschnittenen Gewebestücke eignen sich in besonderer Weise für die Gewinnung von tumorinfiltrierten T-Lymphozyten (TIL), aber auch für tumortinfiltrierte natural Killer- Zellen (TINK). Der Mäander- Bioreaktor besteht aus einen rechteckigen Bioreaktorgefäß (1) aus vorzugsweise klarem Polymermaterial, das mit einem Deckel (2) steril verschlossen ist, wobei das Bioreaktorgefäß (1) in drei übereinander angeordneten Kammern (3,4,5) unterteilt ist und die unterste Kammer (3) als Unterlay- Kammer, die über der Unterlay-Kammer (3) angeordnete Kammer (4) als Mäander- Bioreaktor- Kammer und die über der Mäander- Bioreaktor- Kammer (4) angeordnete Kammer (5) als Overlay- Kammer ausgebildet sind und die Unterlay- Kammer(3) und die Mäander- Bioreaktor-Kammer (4) durch eine gelochte Bodenplatte (6) mit einer unten an der gelochten Bodenplatte (6) angeordneten semipermeablen Folie (7) voneinander getrennt sind.
  • Eine gradientenfreie, homogene Versorgung der Zellen ist in diesen Mäander-Bioreaktoren bei dieser Art der Überströmung der Zellen mit Medium aber nicht gegeben. Die Fließgeschwindigkeit des Mediums nimmt vom mittigen Einlass zum Rand hin kontinuierlich zu. Bei zunehmender Expansion der Zellen steigt auch der Mediumbedarf fortlaufend an. Diese Fließeigenschaften lassen homogene Verhältnisse im Medium, zumindest zu Beginn der Kultivierung, nicht zu. Mit zunehmender Zeit der Kultivierung besteht aber die Möglichkeit, dass sich Zellen vom MSC-Typ an der semipermeablen Membran ansiedeln und klumpende Kolonien bilden und so die homogene Versorgung der Zellen verhindern. Außerdem kann keine gleichmäßig auf der Oberfläche verteilte zusammenhängende, für eine hohe Expansionsrate notwendige Zellschicht aufgebaut und kein auf ein optimiertes Zellwachstum ausgerichtetes Verhältnis Zellenzahl zur Fläche eingestellt werden. Zellen müssen von diesen Zellkulturträgern mittels Enzymen oder Zellschaber geerntet werden, was die Zellen beschädigt. Alle bekannten Verfahren für die Vermehrung von hämatopoetischen Zellen/Stammzellen und die in den Verfahren benutzten Bioreaktoren oder Vorrichtungen sind dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierungsbedingungen kompliziert sind, in der Mehrzahl der Verfahren ein erheblicher apparativer Aufwand erforderlich ist und bei häufig verwendeten wichtigen Immun-Zellen (z. B. aktivierten NK-Zellen, spezifisch stimulierten T-Lymphozyten, TIL, mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmark) die Expansion nicht zu therapeutisch erwünschten Mengen führt.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Mäander- Perfusions- Bioreaktor zu entwickeln, der es ermöglicht, ausreichende Mengen an Weise tumorinfiltrierende autologe T- Lymphozyten (TIL) aus Tumorgewebe, Metastasengewebe, deren Umgebungsgewebe und aus Lymphknoten, die von Tumorzellen befallenen sind, aber auch von einzelnen Zellarten der hämatopoetischen Zellen, hämatopoetischen Stammzellen, hämatopoetischen Progenitorzellen, Immunzellen darin für therapeutische Anwendungen und Transplantationszwecke herzustellen. Der Bioreaktor soll einfach aufgebaut und als Disposable-Version herzustellen sein. Die Verfahren für die Zellexpansion, -Differenzierung, -Stimulierung und -Ernte sollen sicher, einfach und transparent durchzuführen sein, um alle Vorgaben für Zellpräparate hinsichtlich GMP-Konformität und Erlangung von Herstellungserlaubnissen für die im Bioreaktor hergestellten hämatopoetische Zellpräparate zu erfüllen. Weiter soll der Bioreaktor im klinischen Alltagsbetrieb ohne großen Aufwand einzusetzen sein.
    Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch einen Mäander-Perfusions- Bioreaktor gelöst, der aus einen rechteckigen Bioreaktorgefäß (1) aus vorzugsweise klarem Polymermaterial, das mit einem Deckel (2) steril verschlossen ist, besteht. Das Bioreaktorgefäß (1) ist in drei übereinander angeordneten Kammern (3,4,5) unterteilt, wobei die unterste Kammer (3) als Unterlay- Kammer, die über der Unterlay-Kammer (3) angeordnete Kammer (4) als Mäander- Perfusions- Kammer und die über der Mäander- Perfusions- Kammer (4) angeordnete Kammer (5) als Overlay-Kammer ausgebildet sind und die Unterlay- Kammer(3) und die Mäander-Perfusions- Kammer (4) durch eine gelochte Bodenplatte (6) mit einer unten an der gelochten Bodenplatte (6) angeordneten semipermeablen Folie (7) voneinander getrennt sind. Auf der Oberseite (8) der Bodenplatte (6) sind streifenförmigen unterteilenden und eine mäanderförmige Durchströmung der Mäander- Perfusions-Kammer (4) mit Gasen und Medium erzwingenden Trennwänden (8) angeordnet. Überraschender Weise wurde gefunden, dass die Bodenfläche (18) der Bodenplatte (6) der Mäander- Perfusions- Kammer (4, die Breite und die Höhe der durch die Trennwände (8) gebildeten Gerinne (19) einen Kontakt zwischen den Aussaatzellen erzwingende, in Abhängigkeit der Menge der zu züchteten Zellen und in Abhängigkeit der Menge der Saatzellen der Ausgangsmenge frei wählbare Größe aufweisen.
  • In einer Ausgestaltung der Erfindung sind die Bodenfläche (18) der Bodenplatte (6) der Mäander- Perfusions- Kammer (4) zwischen 20 bis 1500 cm2, die Höhe der auf der Bodenplatte (6) der Mäander- Perfusions-Kammer (4) angeordneten Gerinne (19) zwischen 1,8 bis 6 cm und der Abstand (A) der Trennwände (8) der Gerinne (19) voneinander sowie von den Seiten- und Stirnwänden der Mäander- Perfusions-Kammer (4) zwischen 2 bis 25 mm frei wählbar angeordnet.
    In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung sind die Bodenfläche (18) der Bodenplatte (6) der Mäander- Perfusions- Kammer (4) zwischen 30 bis 500 cm2 und die Höhe der der durch die Trennwände (8) gebildeten Gerinne (19) zwischen 1, 8 cm und 2,5 cm frei wählbar ausgestaltet.
    In einer noch weiteren Ausgestaltung der Erfindung betragen der Abstand (A) der Trennwände (8) der Gerinne (19) voneinander sowie von den Seiten- und Stirnwänden der Mäander- Perfusions- Kammer (4) zwischen 4 bis 6 mm frei wählbar.
    Durch die Gestaltung der Bodenfläche (18) sowie der Höhe und Breite der Gerinne (19) entsteht in dem Stromfaden der Gerinne eine gemittelte laminare Oberströmung mit einer Froudezahl < 0,005 und eine Bodenströmung mit einer Froudezahl nahe 0 ohne Aufwirbelung der Zellen bildet.
    Durch das Mäander- Prinzip wird erst eine homogene und gradientenfreie Versorgung der Zellen in diesem Perfusions- Bioreaktoren möglich, dies unter wählbaren Strömungsgeschwindigkeiten, variierbarer Zufuhr von Frischmedium zu zirkulierenden Medium, hypoxämischen, normoxämischen oder hyperoxämschen in Unterlay-/Overlay- Kammern und wählbaren Flächen- und Volumenverhältnissen der Perfusionskammer (4).
    An der Unterlay- Kammer (3) ist mit in unterschiedlicher Höhe angebrachte Zu- und Abführungen (9,10) für die Durchströmung mit Gasen, die Mäander- Perfusions-Kammer (4) mit Zu- und Abführungen für Kulturmedien (11, 12) und die Overlay-Kammer (5) mit Zu- und Abführungen (13,14) für Overlay- Gase und mit einem Auslassstutzen (15), an dem im Innern der Overlaykammer (5) vor dem Auslauf ein Siebgewebe (16) angeordnet ist, versehen , wobei an der Zuführung (11) der Mäander- Perfusions- Kammer (4) ein angeordnete Überlauf (17) für die verbrauchte Zellbrühe in seiner Höhe verstellbar angeordnet ist.
  • In einer Auslegung der Erfindung kann der Mäander- Perfusions-Bioreaktor über den Überlauf (17) für die Zellbrühe (mit nicht näher dargestellten Absperrvorrichtungen) mit mehreren Mäander- Perfusions- Bioreaktoren modulartig verbunden sein.
    Die Erfindung wird nun an von Beispielen näher erläutert, wobei die 1 eine schematische Schnittdarstellung des Mäander- Perfusions- Bioreaktors und die 2 eine schematische Draufsicht auf den Mäander- Perfusions- Bioreaktor zeigen und
    • 1
    Bioreaktorgefäß
    2
    Deckel
    3
    Unterlay- Kammer
    4
    Mänder- Perfusions- Kammer
    5
    Overlay- Kammer
    6
    Bodenplatte
    7
    Folie
    8
    Trennwand
    9
    Zuführung Unterlay- Atmosphäre
    10
    Abführung Unterlay- Atmosphäre
    11
    Zuführung Kulturmedium
    12
    Abführung Kulturmedium
    13
    Zuführung Overlay- Atmosphäre
    14
    Abführung Overlay- Atmosphäre
    15
    Auslaufstutzen
    16
    Siebgewebe
    17
    Überlauf für Zellbrühe
    18
    Bodenfläche
    19
    Gerinne
    bedeuten.
  • Beispiel 1
  • Der Mäander-Perfusions- Bioreaktor besteht aus einen rechteckigen Bioreaktorgefäß (1) aus vorzugsweise klarem Polymermaterial, das mit einem Deckel (2) steril verschlossen ist.
  • Das Bioreaktorgefäß (1) ist in drei übereinander angeordneten Kammern (3, 4, 5) unterteilt, wobei die unterste Kammer (3) als Unterlay- Kammer, die über der Unterlay-Kammer (3) angeordnete Kammer (4) als Mäander- Perfusions-Kammer und die über der Mäander- Perfusions- Kammer (4) angeordnete Kammer (5) als Overlay- Kammer ausgebildet sind. Die Unterlay- Kammer(3) und die Mäander- Perfusionsr- Kammer (4) sind durch eine gelochte Bodenplatte (6) mit einer unten an der gelochten Bodenplatte (6) angeordneten semipermeablen Folie (7) voneinander getrennt. Die Grundfläche der Mäander- Perfusions- Kammer (4) beträgt zwischen 20 und 1500 cm2, bevorzugt zwischen 30 und 500 cm2 und die Höhe des Bioreaktors beträgt zwischen 1,8 und 6 cm, bevorzugt 2,5 cm. Auf der Oberseite (8) der Bodenplatte (6) sind streifenförmigen unterteilenden und eine mäanderförmige Durchströmung der Mäander- Perfusions-Kammer (4) mit Gasen und Medium erzwingenden Trennwänden (8) angeordnet, wobei der Abstand (A) der Trennwände (8) voneinander sowie von Seiten- und Stirnwänden der Mäander-Perfusions- Kammer (4) beträgt 2 bis 25 mm, bevorzugt 4 bis 6 mm.
  • An der Unterlay-Kammer (3) sind in unterschiedlicher Höhe Zu- und Abführungen (13,14) für eine geregelte Durchströmung mit Gasen, insbesondere von 02. Der Sauerstoff gelangt dann durch Diffusion durch die semipermeable Folie (7) und durch die gelochte Bodenplatte (6) in die Mäander- Perfusiions- Kammer (4), wo dann das Kulturmedium bei der Durchströmung der Mänder- Perfusions- Kammer (4) durch Perfusion mit O2 versorgt wird. Die Mäander- Perfusions- Kammer (4) ist mit Zu- und Abführungen für Kulturmedien (11, 12) versehen, wobei das Kulturmedium aus einem CellGrow-Medium besteht, das mit einem spezifischen Gemisch aus AB Humanserum, Cytokinen, Antikörpern und irradiierten humanen Feederzellen zeitweilig supplementiert ist. Diesem Kulturmedium werden die während einer Operation vom Patienten entnommenen und zerkleinerten autologen Tumor-Gewebestück in einer Größe von 1 bis 2 mm3 zugegeben und mit dem Kulturmedium in die Mäander-Perfusions-Kammer (4) zugeführt. Die zerkleinerten Gewebestücke werden im Bioreaktor gleichmäßig verteilt und im Perfusionsbetrieb kultiviert, wobei das Kulturmedium über die in die Overlay- Kammer (5) über die Zu- und Abführungen (13,14) mit der entsprechenden Overlay- Atmosphäre geregelt versorgt wird.
  • In einem Kultivierungslauf über 7 bis 14 Tage wachsen normalerweise TIL in größerer Menge aus den Gewebestücken aus. Über den mit Siebgewebe (16) versehenen Auslassstutzen (15) der Overlay-Kammer (5) des Bioreaktorgefäßes (1) werden die TIL als Filtrat von den Geweberesten abgetrennt.
  • Ausführungsbeispiel 2:
  • TIL werden aus zerkleinerten Gewebestücken in einem Mäander- Bioreaktor, wie in Beispiel 1 beschreiben gewonnen. Ausgangsmaterial dafür sind Gewebeteile, die bei operativer Entfernung eines Tumors, von Tumormetastasen oder von Tumorzellen befallenen Lymphknoten anfallen. Die zerkleinerten Gewebestücke werden durch den größer dimensionierten und mit einem steril verschließenden Stopfen eingefüllt und durch Schwenken des mit Medium gefüllten Mäander-Perfusions-Bioreaktors gleichmäßig auf dem Boden verteilt. Nach Verschließen des Einfüllstutzens wird die Kultivierung wie in Beispiel 1 in Gang gesetzt. Nach 3 bis 7 Tagen wachsen die in den tumorösen Gewebestücken enthaltenen Tumor-infiltrierten T-Lymphozyten (TIL) in Mengen aus. Je nach gewähltem Medium und zugesetzten Supplementen werden die TIL in dieser Prozess-Phase aktiviert, durch weiteren Kontakt mit den anfangs noch vorhandenen mutierten Tumorzellen spezifisch geprimt. Sie vermehren sich in der Regel auf 0,5 bis 1,5 × 109 TIL. Nach Aufschütteln des Mäander- Perfusions-Bioreaktors werden die TIL durch den seitlichen Auslass-Stutzen (15), der mit einem Siebgewebe versehen ist, in ein steriles Gefäß oder in einen größer dimensionierten Mäander-Bioreaktor für die weitere Expansion. Die Gewebestücke, aus denen die TIL ausgewachsen sind, werden vollständig vom Siebgewebe des ersten Mäander-Bioreaktors zurückgehalten.Eine gradientenfreie, homogene Versorgung der Zellen ist mit diesen Mäander- Perfusions Bioreaktoren möglich, da bei dieser Art der Überströmung der Zellen mit Medium aber nicht gegeben.
  • Der Mäander- Perfusions- Bioreaktor vereint in diesem einfachen und geschlossenem ersten Verfahrens-Schritt ein längeres spezifisches Primen durch die jeweiligen individuellen Tumor-Zellen, die Aktivierung zu schnellerem Wachstum der TIL sowie die Isolierung einer großen Menge an sehr reinen TIL.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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    • DE 102018000561 [0009]

Claims (6)

  1. Mäander- Perfusions- Bioreaktor für die Differenzierung, Aktivierung, Stimulierung und Abtrennung von Zellen bestehend aus einen rechteckigen Bioreaktorgefäß (1) aus vorzugsweise klarem Polymermaterial, das mit einem Deckel (2) steril verschlossen ist, wobei das Bioreaktorgefäß (1) in drei übereinander angeordneten Kammern (3,4,5) unterteilt ist und die unterste Kammer (3) als Unterlay- Kammer, die über der Unterlay-Kammer (3) angeordnete Kammer (4) als Mäander- Perfusions- Kammer und die über der Mäander- Perfusions- Kammer (4) angeordnete Kammer (5) als Overlay-Kammer ausgebildet und die Unterlay- Kammer (3) und die Mäander-Perfusions- Kammer (4) durch eine gelochte Bodenplatte (6) mit einer unten an der gelochten Bodenplatte (6) angeordneten semipermablen Folie (7) voneinander getrennt sind und die Bodenplatte (6) mit auf der Oberseite (8) angeordneten streifenförmigen , die Bodenplatte (6) unterteilenden und eine mäanderförmige Durchströmung der Mäander- Perfusions- Kammer (4) mit Medium erzwingenden Trennwänden (8) versehen ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Bodenfläche (18) der Bodenplatte (6) der Mäander- Perfusions- Kammer (4), die Breite und die Höhe der durch die Trennwände (8) gebildeten Gerinne (19) einen Kontakt zwischen den Aussaatzellen erzwingende, in Abhängigkeit der Menge der zu züchteten Zellen sowie in Abhängigkeit der Menge der Saatzellen der Ausgangsmenge eine frei wählbare Größe aufweisen..
  2. Mäander- Perfusions- Bioreaktor, dadurch gekennzeichnet, dass die Bodenfläche (18) der Bodenplatte (6) der Mäander- Perfusions- Kammer (4) zwischen 20 bis 1500 cm2 und die Höhe der auf der Bodenplatte (6) der Mäander- Perfusions-Kammer (4) angeordneten Gerinne (19) zwischen 1,8 bis 6 cm und der Abstand (A) der Trennwände (8) der Gerinne (19) voneinander sowie von den Seiten- und Stirnwänden der Mäander-Perfusions- Kammer (4) zwischen 2 bis 25 mm frei wählbar aufweisen..
  3. Mäander- Perfusions- Bioreaktor nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bodenfläche (18) der Bodenplatte (6) der Mäander-Perfusions- Kammer (4) zwischen 30 bis 500 cm2 und die Höhe der durch die Trennwände (8) gebildeten Gerinne (19) zwischen 1, 8 cm und 2,5 cm frei wählbar betragen.
  4. Mäander- Perfusions- Bioreaktor nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand (A) der Trennwände (8) der Gerinne (19) voneinander sowie von den Seiten- und Stirnwänden der Mäander-Perfusions- Kammer (4) zwischen 4 bis 6 mm frei wählbar betragen.
  5. Mäander-Perfusions- Bioreaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterlay- Kammer (3) mit in unterschiedlicher Höhe angebrachte Zu- und Abführungen (9,10) für die Durchströmung mit Gasen, die Mäander-Perfusions- Kammer (4) mit Zu- und Abführungen für Kulturmedien (11, 12) und die Overlay- Kammer (5) mit Zu- und Abführungen (13,14) für Overlay-Gase und mit einem Auslassstutzen (15), an dem im Innern der Overlaykammer (5) vor dem Auslauf ein Siebgewebe (16) angeordnet ist, versehen ist, , wobei an der Zuführung (11) der Mäander- Perfuions- Kammer (4) ein angeordnete Überlauf (17) für die verbrauchte Zellbrühe in seiner Höhe verstellbar angeordnet ist.
  6. Mäander- Perfusions-Bioreaktor nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass über den Überlauf (17) für die Zellbrühe (mit nicht näher dargestellten Absperrvorrichtungen) mehrere Mäander- Bioreaktoren modulartig miteinander verbunden sind
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