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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur bildgebenden Erfassung
einer Probe, mit einem Beleuchtungsstrahlengang, über den
der Probe ein Beleuchtungslicht zuführbar ist, und mit einem Detektionsstrahlengang, über den
von der Probe emittiertes Emissionslicht einem bildgebenden Detektor
zuführbar
ist, wobei der Beleuchtungsstrahlengang, in den das von einer Lichtquelle
erzeugte Beleuchtungslicht über
einen Einkoppelport einkoppelbar ist, eine Strahlformungsoptik zur
Formung eines zur Beleuchtung der Probe geeigneten Beleuchtungsstrahls
aufweist und der Detektionsstrahlengang eine Bildgebungsoptik zur
Abbildung der Probe auf den Detektor aufweist.
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Stand der
Technik
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Derartige
Vorrichtungen sind beispielsweise als sogenannte Fluoreszenz-Reader
hinlänglich
bekannt. Der typische Einsatzbereich derartiger Systeme ist die
bildgebende Erfassung von Mikrotiterplatten, d.h. in der Regel rechteckiger
Platten standardisierter Größe mit einer Vielzahl
von Vertiefungen oder Wells, in denen fluoreszenzmarkierte Proben vorliegen.
In der Regel unterscheiden sich die Proben in einem oder mehreren
fluoreszenzrelevanten Parametern, sodass eine vergleichende Bildauswertung
Rückschlüsse auf
Eigenschaften der unterschiedlichen Well-Inhalte erlaubt. Insbesondere
bei Fluoreszenz-Anwendungen sind zusätzlich zu den oben genannten
Elementen Filtereinheiten vorgesehen, die das Licht im Beleuchtungsstrahlengang
und im Detektionsstrahlengang jeweils auf nicht-überlappende Spektralbereiche
einschränken.
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In
jüngerer
Zeit ist ein erheblicher Trend zur Verwendung sogenannten Biochips
zu erkennen. Ähnlich
wie bei der Mikrotiterplatte stellt der Biochip auf einer Probenfläche standardisierter
Größe ein standardisiertes
Muster von Probenelementen mit unterschiedlichen Parametern zur
Verfügung.
Die typische Größe, in der
Mikrochips angeboten werden, entspricht denjenigen bekannter Mikroskop-Objektträger. Wie
oben im Zusammenhang mit Mikrotiterplatten erläutert ist es auch bei Verwendung
von Biochips das Ziel, durch vergleichende Bildauswertung Rückschlüsse auf
Eigenschaften einzelner Probenelemente zu ziehen.
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Die
US 6,853,454 B1 offenbart
einen gattungsgemäßen Fluoreszenz-Reader
zur bildgebenden Erfassung von Biochips.
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Aufgrund
der stark unterschiedlichen Standardmaße von Mikrotiterplatten und
Biochips sowie weiteren gebräuchlichen
Probenformen, wie etwa Nanotiterplatten, die in ihrer Größe zwischen
den Biochips und den Mikrotiterplatten liegen, werden in der Regel
unterschiedliche Vorrichtungen für
jede dieser Probenarten verwendet. Dies ist zum einen teuer, weiter
hinsichtlich des Platzbedarfs mehrerer Instrumente nachteilig und
schließlich
auch unter dem Aspekt der Vergleichbarkeit von Ergebnissen nicht
wünschenswert.
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Ansätze zur
Bereitstellung von Kombinationsgeräten, mit denen sowohl Mikrotiterplatten
als auch Biochips bildgebend erfasst werden können, begegnen vor allem der
Problematik der geeigneten Probenbeleuchtung, sofern keine teuren,
anfälligen und
messzeitintensiven Scannervorrichtungen realisiert werden. Im Detektionsbereich,
d.h. im Hinblick auf die Bildgebungsoptik, sind sehr leistungsstarke Zoom-Objektive
oder, wie z.B. in der oben genannten
US 6,853,454 B1 offenbart, austauschbare
Einzelbereichsobjektive bekannt.
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Im
Hinblick auf die Beleuchtung der Probe sind der Übernahme dieser Technologie
jedoch enge Grenzen gesetzt. Wenig kritisch ist das Problem in Fällen, in
denen als Lichtquelle stark divergente Elemente, wie beispielsweise
Lampen oder LEDs verwendet werden. Diese Arten von Lichtquellen
weisen jedoch ein breites bis sehr breites Emissionsspektrum auf,
das zudem eine geringe spektrale Leistungsdichte zeigt. Entsprechend
müssen
gerade im Bereich der Fluoreszenzmessungen sehr leistungsstarke
Filtersysteme eingesetzt werden, durch die ein großer Teil
der erzeugten optischen Leistung verloren geht. Entsprechend schwach
fällt die
Beleuchtungsintensität
und damit die Fluoreszenzanregung aus. Dies führt im besten Fall zu langen
Messdauern, kann jedoch in ungünstigeren
Fällen
eine Messung unmöglich
machen.
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Daher
wird zur Beleuchtung die Verwendung von Lasern mit schmalbandiger
Emission und hoher spektraler Leistungsdichte häufig bevorzugt. Einige der
früheren
Vorbehalte gegen die Verwendung von Laserstrahlung als Beleuchtungslicht,
nämlich
die hohen Kosten und geringe Flexibilität aufgrund des schmalen Emissionsspektrums
sind heute weitgehend obsolet, da durch die Verwendung einer Mehrzahl
von Lasern ein hinreichend großes
Spektrum abgedeckt werden kann und die Kosten und der Platzbedarf
einer Mehrzahl von Lasern insbesondere bei Verwendung kleiner Festkörperlaser
gegenüber früheren Zeiten
wesentlich reduziert werden konnten. Allerdings neigt der Laserstrahl,
der in der Regel ein gaußförmiges Intensitätsprofil
aufweist, dazu, diese räumliche
Intensitätsverteilung
auch bei den zur Beleuchtung ausgedehnter Proben erforderlichen
Aufweitung beizubehalten. Dies führt
zu einer ungleichmäßigen Probenbeleuchtung,
die die vergleichende Bildauswertung wesentlich erschwert.
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Aufgabenstellung
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Es
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Vorrichtungen zur bildgebenden
Probenerfassung, insbesondere bildgebende Fluorimeter, derart weiterzubilden,
dass die laserbasierte, gleichförmige Beleuchtung
großer
Probenflächen
erleichtert wird. Eine derartige Erleichterung würde zur vereinfachten Konstruktion
von Kombinationsgeräten
zur Vermessung von Proben unterschiedlicher Größen führen.
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Darlegung
der Erfindung
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Diese
Aufgabe wird in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs von
Anspruch 1 dadurch gelöst,
dass in dem Beleuchtungsstrahlengang angeordnete Homogenisierungsmittel
zur Homogenisierung des Beleuchtungslichtes einen Diffuser mit einer
aktiven Diffuseroberfläche
umfassen, die eine Vielzahl deterministisch verteilter Mikrolinsen
aufweist.
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Durch
die erfindungsgemäße Verwendung eines
Mikrolinsendiffusers wird vor der Strahlformungsoptik ein divergentes
Lichtbündel
definierter Divergenz mit gleichförmiger räumlicher Intensitätsverteilung
bereitgestellt. Der Divergenzwinkel ist dabei im Wesentlichen unabhängig von
der Art und Strahlform des eingestrahlten Lichtes. Dies bedeutet insbesondere,
dass auch die, wie oben erläutert,
bevorzugten Laser eingesetzt werden können.
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Die
erfindungsgemäß eingesetzten
Mikrolinsendiffuser werden beispielsweise unter der Handelsmarke "Engineered Diffuser" von der Firma RPC Photonics,
Inc., 330 Clay Road, Rochester, NY 14623, vertrieben. Die bekannten
Diffuser sind für verschieden
Strahlumrisse und Divergenzwinkel erhältlich. Die weitere Größenanpassung
zur möglichst effizienten,
d.h. vollständigen
Beleuchtung ohne randständigen
Beleuchtungsüberschuss,
mittels einer Strahlformungsoptik ist für den Fachmann leicht zu realisieren.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
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Die
Mikrolinsen des Diffusers haben vorzugsweise eine vorbestimmte Verteilung
von Krümmungsradien
zwischen 50 Mikrometern und 250 Mikrometern und bevorzugt eine vorbestimmte
Verteilung von Linsendurchmessern zwischen 20 Mikrometern und 80
Mikrometern. Die konkrete Verteilung, d.h. sowohl räumliche
Verteilung als auch Mengenverteilung der einzelnen Arten von Mikrolinsen,
ist abhängig
von dem gewünschten
Streubild.
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Die
erfindungsgemäß eingesetzten
Mikrolinsen-Diffuser sind grundsätzlich
sowohl für
den reflektiven wie auch für
den transmissiven Einsatz geeignet. Aus Bauraumgründen wird
im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedoch bevorzugt, den Diffuser so
im Beleuchtungsstrahlengang anzuordnen, dass das Beleuchtungslicht
durch ihn hindurchtritt, d.h. im transmissiven Modus.
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Bekanntermaßen weisen
Laserstrahlen eine hohe Kohärenz
auf. Dies kann im gestreuten und aufgeweiteten Strahl zur Bildung
eines sogenannten Speckle-Musters führen, das zu einer inhomogenen Beleuchtung
der Probe führt.
Um dem entgegen zu wirken, ist bei einer vorteilhaften Weiterbildung
der Erfindung vorgesehen, dass die Homogenisierungsmittel weiter
einen dem Diffuser vorgeschalteten Kohärenzreduzierer aufweisen. Dieser
kann bei einer günstigen
Ausführungsform
z.B. eine rotierende Keilscheibe umfassen. Es ist darauf zu achten,
dass die Rotationsgeschwindigkeit so an die typischen Belichtungszeiten
des Detektors angepasst ist, dass während der Belichtungszeit eine
hinreichend gute zeitliche Mittelung des Speckle-Musters zustande
kommt, sodass tatsächlich
eine im Mittel homogene Probenbeleuchtung realisiert ist.
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Um
mit derselben Vorrichtung Proben, die in ihrer Größe stark
differieren, wie insbesondere Mikrotiterplatten und Biochips, beleuchten
zu können,
ist bei einer günstigen
Weiterbildung der Erfindung vorgesehen, dass die Strahlformungsoptik
eine Mehrzahl motorisch auswechselbarer Beleuchtungsobjektive, die
Beleuchtungsstrahlen unterschiedlicher Divergenz erzeugen, aufweist.
Diese sind vorzugsweise auf einem motorisch verfahrbaren Trägerelement angeordnet.
Aufgrund des durch den erfindungsgemäß eingesetzten Mikrolinsen-Diffuser
einheitlich gestalteten Eingangslichtbündels der Strahlformungsoptik
können
die auswechselbaren Objektive vergleichsweise einfach und leicht
ausgestaltet sein. Dies ermöglich
auch bei kleinem Bauraum die Anordnung mehrerer Objekte auf einem
verfahrbaren Trägerelement,
wie beispielsweise einem verschiebbaren Schlitten oder einer drehbaren
Trommel, das zur Durchführung
automatisierter Messungen motorisch antreibbar ist.
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Insbesondere
in der Fluorimetrie findet man häufig
Anordnungen, bei denen der Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang
bereichsweise, insbesondere im Bereich der Probe, colinear und antiparallel
verlaufen. Hiervon rückt
die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform
ab. Danach ist vorgesehen, dass der Beleuchtungsstrahlengang in
einem spitzen Winkel gegenüber
dem Detektionsstrahlengang und der Probennormalen angeordnet ist.
D.h., die Probe wird unter einem schrägen Einfallswinkel beleuchtet.
Wie sich herausgestellt hat, hat dies keine Nachteile im Hinblick
auf die Zuverlässigkeit
der Messung.
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Wie
bereits erwähnt,
wird die Verwendung von Lasern als Lichtquelle bevorzugt. Günstigerweise
ist vorgesehen, dass als Lichtquelle eine Mehrzahl von Lasern unterschiedlicher
Wellenlängen
dient, deren Licht separat oder kombiniert dem Einkoppelport zuführbar ist.
Die Zuführung
kann dabei über
eine vorzugsweise schaltbare Spiegelanordnung zur Auswahl und/oder
Kombination von Komponenten des Lichtes der Lichtquelle, d.h. insbesondere
der einzelnen Laserstrahlen erfolgen. Bei einer anderen Ausführungsform
können
ein oder mehrere Farbteilerspiegel untereinander angeordnet werden.
Alternativ oder zusätzlich
ist auch die Zuführung über Lichtleiter denkbar.
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Um
ein kompaktes Gerät
zur Verfügung
zu stellen, ist bevorzugt vorgesehen, dass wenigstens der Beleuchtungsstrahlengang,
eine Probenhalterung, der Detektionsstrahlengang und der Detektor
in einem gemeinsamen Gehäuse
angeordnet sind und die Probenhaltung als ein aus dem Gehäuse ausfahrbares
Element gestaltet ist. Dies kann beispielsweise in Form einer ausfahrbaren
Schublade oder einer Klappe sein. Vorteilhafterweise sind in der
Probenhalterung Ausnehmungen zur Aufnahme von Proben standardisierter
Größe vorgesehen.
Hierdurch wird erreicht, dass die Proben, sofern sie den Standardmaßen entsprechen,
reproduzierbar bei jeder Messung demselben Messort zugeführt werden.
Dies steigert die Vergleichbarkeit der Ergebnisse.
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Bei
einer Weiterbildung der Erfindung ist auch die Lichtquelle, insbesondere
eine Mehrzahl von Lasern, vorzugsweise Festkörperlaser, in dem gemeinsamen
Gehäuse
integriert.
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Zur
Erreichung einer weitgehend automatisierten Messung kann günstigerweise
wenigstens ein Sensorelement zur Erkennung der Probengröße sowie
eine Steuereinrichtung vorgesehen sein, wobei die Steuereinrichtung
ausgelegt ist, in Abhängigkeit
von der erkannten Probengröße die motorische Auswechslung
der Beleuchtungsobjektive derart anzusteuern, dass die Probe vollständig ausleuchtbar ist.
Als Sensoren kommen beispielsweise Mikroschalter in der Probenhalterung
oder optische Sensoren im Bereich der Probenhalterung in Frage.
Da die auswechselbaren Beleuchtungsobjektive in ihren optischen
Eigenschaften vorzugsweise an die standardisierten Probengrößen angepasst
sind, kann auf diese Weise ohne Zutun des Benutzers stets die optimale
Probenausleuchtung realisiert werden. Bei einer Ausführungsform
erfolgt eine Anpassung der Detektionsoptik in analoger Weise.
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Ausführungsbeispiele
der Erfindung
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Weitere
Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden, speziellen
Beschreibung und den Zeichnungen.
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Es
zeigen:
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1:
eine schematische Seitenansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
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2:
eine gegenüber 1 um
90° versetzte
Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
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3:
eine schematische Darstellung eines "Engineered Diffuser".
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4:
eine schematische Darstellung eines bevorzugten Beleuchtungsfeldes
und
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5:
ein schematisches Intensitätsprofil
eines bevorzugten Beleuchtungsstrahls.
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1 zeigt
eine schematische Seitenansicht einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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Die
Darstellung von 1 gibt insbesondere den zur
Beleuchtung und Detektion einer als Probe dienenden Mikrotiterplatte 10 realisierten
Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang wieder. Die Mikrotiterplatte 10 weist
eine Vielzahl von Ausnehmungen ("Wells") 11 auf,
in denen zu untersuchende Substanzen enthalten sind. Die Substanzen
sind vorzugsweise mit einem Fluorophor markiert oder selbst fluoreszierend.
Das Ausmaß der
Fluoreszenz ist dabei vorzugsweise von bestimmten chemischen Bedingungen
in den einzelnen Wells abhängig,
wobei der Experimentator vorzugsweise den Zusammenhang zwischen
den chemischen Bedingungen und der räumlichen Position der einzelnen
Wells auf der Mikrotiterplatte 10 kennt. Zur Erzeugung
eines Beleuchtungslichtes dienen bei der dargestellten Ausführungsform
drei Laser 12, 14, 16, die Laserlicht
unterschiedlicher Wellenlängen
aussenden. Mit Hilfe von Farbteilerspiegeln 18, 20 kann
das Licht der Laser 12, 14, 16 einzeln
oder in irgendeiner Kombination auf einen als Einkoppelport dienenden
Einkoppelspiegel 22 gelenkt werden. Alternativ zu der Spiegelanordnung
von 1 ist auch eine Einkopplung des Beleuchtungslichtes
mittels eines Lichtleiters, z.B. einer Glasfaser, möglich. Der eingekoppelte Lichtstrahl 24 zeigt
aufgrund seiner Herkunft aus einer bzw. mehreren Laserquellen eine
starke Kohärenz.
Diese ist aufgrund des entstehenden Speckle-Musters bei der nachfolgenden
Aufweitung zur Beleuchtung der Mikrotiterplatte 10 nachteilig.
Bei der Ausführungsform
von 1 ist daher eine rotierende Keilscheibe 26 im
Strahlengang des Einkoppelstrahls 24 angeordnet. Die rotierende
Keilscheibe verhindert die Ausbildung eines Speckle-Musters über längere Zeiträume, sodass
im zeitlichen Mittel eine homogene Beleuchtung möglich wird. Der als Kohärenzreduzierer
wirkenden Keilscheibe 26 ist ein Mikrolinsendiffuser 28 nachgeschaltet.
Details des Mikrolinsendiffusers 28 werden weiter unten
im Zusammenhang mit den 3 bis 5 beschrieben.
Der Diffuser 28 bewirkt, dass der Einkoppelstrahl 24 zu
einem divergenten Strahlbündel
mit definiertem Divergenzwinkel 30 und im Wesentlichen
gleichförmiger
Intensitätsverteilung
aufgeweitet wird.
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Ein
Beleuchtungsobjektiv 32 formt einen Beleuchtungsstrahl,
der eine möglichst
exakte Abdeckung des interessierenden Zielbereichs der Mikrotiterplatte
bietet.
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In
jedem der mit einer fluoreszenzfähigen Substanz
befüllen
Wells 11 der Mikrotiterplatte 10 wird durch den
Beleuchtungsstrahl 34 eine Fluoreszenzemission ausgelöst. Diese
wird von einem Detektionsobjektiv 36 erfasst, welches die
Mikrotiterplatte 10 auf einen bildgebenden Detektor 38 abbildet.
Der Detektor 38 ist vorzugsweise eine CCD-Kamera.
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Der Übersichtlichkeit
der Zeichnung halber ist nur der Strahlengang für einen der Wells 11 gezeigt.
Außerdem
sind Details des Beleuchtungsobjektivs 32 und des Detektionsobjektivs 38 nicht
dargestellt. Auch zusätzliche,
in der Fluorimetrie bekannte, notwendige und selbstverständliche
Elemente, wie beispielsweise Filter sind in 1 nicht
dargestellt. Bei der in 1 gezeigten Ausführungsform
ist mindestens ein Emissionsfilter im Detektionsstrahlengang erforderlich,
der das aufgrund der Stokes-Verschiebung längerwellige Fluoreszenz-Emissionslicht
zum Detektor 38 passieren lässt und kürzerwelliges, reflektiertes
Beleuchtungslicht abblockt. Derartige Filter sind vorzugsweise in
einem Bereich der Detektionsoptik 36 mit im Wesentlichen parallelem
Strahlengang angeordnet. Auf ähnliche Weise
können
auch im Beleuchtungsstrahlengang, insbesondere im Bereich der Beleuchtungsoptik 32, Filter
angeordnet sein.
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2 zeigt
die gleiche Vorrichtung wie 1, jedoch
in einer um 90° versetzten
Seitenansicht. Bei der dargestellten Ausführungsform liegt das Beleuchtungsobjektiv 32 in
zweifacher Ausführung 32, 32' vor, wobei
jedes der Objektive 32, 32' andere optische Strahlformungseigenschaften
hat. So wird, ausgehend von dem um den Divergenzwinkel 32 aufgeweiteten
Ausgangsstrahl des Mikrolinsendiffusers 28 von dem Objektiv 32 der
bereits beschriebene Beleuchtungsstrahl 34 geformt. Das
Objektiv 32' ist
hingegen in der Lage, einen Beleuchtungsstrahl 34' zu formen,
der gegenüber
dem Beleuchtungsstrahl 34 einen anderen Divergenzwinkel
aufweist (gestrichelt dargestellt in 2). Die
Objektive 32 und 32' sind
auf einem verfahrbaren Schlitten 40 angeordnet und können so
wahlweise in den Beleuchtungsstrahlengang integriert oder aus ihm
herausgenommen werden. Beispielsweise kann das Objektiv 32 ausgelegt
sein, mit dem Beleuchtungsstrahl 34 eine Mikrotiterplatte 10 vollständig auszuleuchten, während das
Objektiv 32' ausgelegt
sein kann, mit seinem Beleuchtungsstrahl 34' eine kleinere Fläche, beispielsweise
die Fläche
eines Biochips, vollständig auszuleuchten.
Selbstverständlich
ist auch die Anordnung von mehr als zwei Beleuchtungsobjektiven auf
einem Schlitten oder alternativ auf einer Trommel möglich.
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3 zeigt
stark vereinfacht eine schematische Darstellung eines Mikrolinsendiffusers.
Der Diffuser 28 besteht aus einem transparenten Substrat 281,
das einseitig mit Mikrolinsen 282 unterschiedlicher Größen und
Krümmungen
besetzt ist. Die optische Wirkung einzelner Mikrolinsen 282 ist
in 3 schematisch dargestellt. Gleichwohl kann die
Gesamtwirkung des Mikrolinsendiffusers 28 in dieser schematischen
Darstellung nicht wiedergegeben werden. Wie bereits erwähnt, ist
es die Wirkung des Mikrolinsendiffusers einen einfallenden Lichtstrahl
in ein Lichtbündel
mit definiertem Divergenzwinkel und definiertem Strahlumfang zu
verwandeln, das wenigstens in seinem Zentralbereich eine gleichmäßige Intensitätsverteilung
aufweist. Dies wird durch eine geeignete räumliche und anteilmäßige Verteilung
der Mikrolinsen mit verschiedenen Krümmungen und Radien auf dem
Substrat 281 erreicht.
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4 gibt
einen bevorzugten Strahlumriss eines Beleuchtungsstrahls 34 wieder,
wie er mithilfe eines Mikrolinsendiffusers 28 und einem
nachgeschalteten Beleuchtungsobjektiv erzeugt werden kann.
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5 zeigt
schematisch ein Intensitätsprofil des
Beleuchtungsstrahls 34 von 4. Wie man
erkennen kann, ist die Intensität
in einem Zentralbereich des Beleuchtungsstrahls 34 im Wesentlichen konstant.
Lediglich an den Strahlrändern
ergibt sich ein steiler Intensitätsabfall.
Bei der Auslegung des Beleuchtungsobjektivs ist im Hinblick auf
die Form und Größe der zu
beleuchtenden Probe vorzugsweise darauf zu achten, dass der Zentralbereich
konstanter Intensität
möglichst
gut mit der zu beleuchtenden Fläche übereinstimmt.
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Natürlich stellen
die in der speziellen Beschreibung erläuterten und in den Zeichnungen
dargestellten Ausführungsformen
nur illustrative Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung dar. Im Lichte der hier offenbarten Lehre
ist dem Fachmann ein breites Spektrum an Variationsmöglichkeiten
anhand gegeben. Insbesondere sind Mikrolinsendiffusoren bekannt,
die andere Strahlcharakteristiken als die gezeigten liefern.
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- 10
- Mikrotiterplatte
- 11
- Well
- 12
- Laser
- 14
- Laser
- 16
- Laser
- 18
- Farbteilerspiegel
- 20
- Farbteilerspiegel
- 22
- Einkoppelspiegel
- 24
- Einkoppelstrahl
- 26
- rotierbare
Keilscheibe
- 28
- Mikrolinsendiffuser
- 281
- Substrat
von 28
- 282
- Mikrolinse
von 28
- 30
- Divergenzwinkel
- 32
- Beleuchtungsobjektiv
- 32'
- Beleuchtungsobjektiv
- 34
- Beleuchtungsstrahl
- 34'
- Beleuchtungsstrahl
- 36
- Detektionsobjektiv
- 38
- CCD-Detektor
- 40
- Objektivschlitten