DE2019190C3 - Schwangerschafts-Diagnostiziermittel in Form eines Testplättchens - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Schwangerschafts-Diagnostiziermiltel zum Nachweis von Choriongonadotropin im Urin durch immunochemische Agglutinationshemmung der Antigen-Antikörperreaktion von durch Choriongonadotropin sensibilisiertem Polystyrollatcx mit Antiserum. Die kennzeichnende Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mittels ist ein Testplättchen mit benetzbarer, Wasser nicht absorbierender Oberfläche im Testbereich, das an zwei voneinander getrennten Stellen genau eingestellte Mengen des eingetrockneten Latex und des eingetrockneten Antiserums aufweist.

Die Grundlagen für die Immunanalyse wurden von W e i d und G e m ζ e 11 1961 erarbeitet (Hämagglutinationsinhibitionsprinzip). Hierbei agglutinieren mit Human-Chorion-Gonadotropin (HCG) beschichtete Erythrozyten in Gegenwart von HCG-Antiserum und setzen sich als Schicht ab. Kommt HCG in einer bestimmten Konzentration im Urin oder Serum Schwangerer zu diesem System hinzu, wird die Verbindung von beschichteten Zellen bzw. Latex-Partikeln und Antikörpern gehemmt.

Zur Durchführung von auf dieser Erkenntnis berührenden Schwangerschaftsuntersuchungen werden zwei Reagentien benützt: freies Antiserum und HCG (als Antigen), an Latexpartikeln oder an Erythrozyten gebunden. Zuerst werden Urinprobe und Antiserum gemischt, wobei eine Antigen-Antikörperreaktion eintritt, falls die Urinprobe Choriongonadotropin enthält (bis zu diesem Punkt erfolgt keine sichtbare Reaktion, gleichgültig ob HCG in der Urinprobe ist oder nicht, da der Antikörper nicht an einen Träger gebunden ist). Anschließend wird der Mischung Antigen, gebunden an einen Träger, zugesetzt. Falls die Urinprobe HCG enthält (Schwangerschaft), ist der Antikörper in der ersten Reaktion neutralisiert worden, und nach Zusatz des gebundenen Antigens tritt keine sichtbare Agglutination ein (Agglutinationshemmung). Ein positiver Schwangerschaftstest ergibt daher keine sichtbare Agglutination. Enthält die Urinprobe dagegen kein HCG, reagiert der freie Antikörper mit dem an den Träger gebundenen Antigen und es tritt eine sichtbare Agglutination ein.

Man kann die Untersuchung, wie dies beispielsweise in der GB-PS 9 79 759 vorgeschlagen wird, in vitro (im Reagenzglas) durchführen, wobei Reagentien verwendet werden, die zunächst durch Lyophilisieren getrocknet worden waren und sich aufgrund dessen leicht wieder auflösen bzw. resuspendieren lassen. Dl·; Durchführung in vitro hat jedoch gewisse Nachteile·, denn selbst wenn das Testreagens, z. B. die wäßrige Suspension von sensitivierten Erythrocyten, sehr sorgfältig titriert wird, führt die Verwendung von Pipetten und Reagenzgläsern oft zu fraglichen Resultaten, da bei gewöhnlichen Pipetten die Genauigkeit begrenzt ist. Derartige Pipetten oder Tropfröhrchen sind gewöhnlich nicht kalibriert und die Genauigkeit der Tropfengröße, die für den Test von besonderer Wichtigkeit ist, wird kaum je erreicht, sondern die Größe der Tropfen und ihr Gehalt an Reagensmittel ist meist recht

ίο verschieden, so daß der Test unzuverlässig ist.

Im Hinblick auf die Nachteile solcher bekannter Methoden, die mit Reagenzglas und Pipette arbeiten, wurde schon früher vorgeschlagen, gewisse Untersuchungen die auf Agglutination bzw. Agglutinationshem-

mung beruhen, derart durchzuführen, daß man einen Tropfen Testreagens auf die Oberfläche eines Plättchens aus Glas oder Pappe aufbringt, den Tropfen eintrocknen läßt und dann die Testflüssigkeit auftropft und das Resultat beobachtet. So wird in der USA-Patentschrift 27 70 572 eine Karte zur Bestimmung der Blutgruppe beschrieben, die aus einer festen Folie besteht, bei der mindestens ein Bereich den eingetrockneten Rückstand eines Testserunis mit spezifischer Agglutination gegen rote Blutkörperchen trägt. In der

USA-Patentschrift 30 74 853 ist eine Karte für immunochemische Diagnosen (z. B. Syphilis, Typhus etc.) mit einem benetzbaren, jedoch wasserdichten Überzug beschrieben; diese Testkarte tragt einen einzigen trockenen Fleck aus entweder einem Antigen oder einem Antikörper, vermischt mit einer feinverteilten Substanz mit Kontrastfarbe, wie Aktivkohle, gegen welche die Bildung des Agglutinates verfolgt werden kann. Der Antikörper bzw. das Antigen wird als Suspension mit Hilfe einer Pipette aufgebracht und dann eingetrocknet und das /u testende Serum wird, ebenfalls mit der Pipette, auf den getrockneten Testfleck aufgetropft. Auch diese Arbeitsweise hat noch den Nachteil, daß die Testflecke mit Hilfe einer gewöhnlichen Pipette aufgebracht werden, was im Fall von Schwangerschaftstesten unsichere Resultate zur Folge hat; ferner muß eine Kontrastfarbe anwesend sein.

Die USA-Patentschrift 32 72 319 beschreibt eine Packung für immunologische Untersuchungen mit einer Kontrollkarte, die eine praktisch nichtabsorbierende Oberfläche aufweist, an der ein getrocknetes Serum oder Plasma abgelagert wird. Die Packung enthält ferner eine korrespondierende Kontrollkarte mit Ablagerungen von aktivem und inaktivem Serum oder Plasma, um die verwendete Antigensuspension zu !.identifizieren. Eine Blutprobe wird dann gegen einen Flecken getestet, von dem bekannt ist, daß er mit dem Antigen der Krankheit, auf die geprüft wird, reagiert. Bei dieser Ausführung erhalten die Testflecke entweder das Antigen oder den Antikörper, jedoch niemals beide auf dergleichen Karte.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Mittel zur eindeutigen Diagnose von Schwangerschaft in Form eines Plättchens (bzw. einer Karte) bereitzustellen, auf dem sämtliche für einen Agglutinationstest notwendigen Reagentien in trockener Form vorhanden sind und auf das der zu untersuchende Urin aufgetropft wird, so daß das Resultat durch die Person, die den Test durchführt, auch ohne besondere Fachkenntnisse sofort festgestellt werden kann.

Das erfindungsgemäß beanspruchte Testplättchen, das auch die Form einer Karte haben kann, erfüllt diese Forderung, da darauf sämtliche zur Durchführung der

iminunochemischcn Untersuchung des oben beschriebenen Typs notwenigen Reagentien vorhanden sind, und zwar in Form von zwei festen, trocknen und lagestabilen fleckenförmigen Ablagerungen, die hinsichtlich ihres Gehaltes an Einheiten genau eingestellt sind, d. h. eine vorbestimmte Menge an immunochemischem Testreagens enthalten. Die beiden Ablagerungen sind nahe aneinander angeordnet ohne sich m berühren und geben beim Befeuchten wieder die betreffenden Testreagentien frei, die mit der zu untersuchenden Flüssigkeit reagieren, nachdem sie sich mit ihr zu dnem größeren Tropfen Reaktionsgemisch vereinigt haben.

Das Testplättchen besteht aus einem praktisch ebenen Objektträger aus Glas oder einem anderen Substratmateria! mit einer Testfläche, die mit Wasser benetzbar ist, durch die das Wasser jedoch weder hindurchdringt, noch von der es absorbiert wird. An dieser Oberfläche des Plättchens ist der eigentliche Testbereich durch eine Linie umschrieben, innerhalb deren an zwei getrennten Stellen je eine feste Ablagerung angeordnet ist; die eine Ablagerung ist der eingetrocknete Rückstand einer Lösung oder Suspension von HCG-Antiserum, der andere der ebenfalls eingetrocknete Rückstand einer Suspension von durch HCG sensibilisiertem Polystyrollatex. Beim Befeuchten mit wäßrigen Flüssigkeiten (z. B. Urin) geben beide Ablagerungen die Reagentien in gelöster bzw. in resuspendierter Form frei, so daß bei Vereinigung der entstandenen Tropfen die Testreaktion stattfinden kann.

Daß diese Freigabe und Resuspendierung auch bei der Latexablagerung erfolgt, ist höchst überraschend, denn nach allen Erfahrungen, z. B. bei den als »Dispersionsfarben« bekannten Kunstharz-Latices, entsteht beim Eintrocknen eines derartigen wäßrigen Latex ein lackartiger, ausgesprochen wasserbeständiger Überzug, der sich jedem Versuch einer Redispersion in Wasser widersetzt.

Das erfindungsgemäße Testplättchen sei anhand der Zeichnung näher erklärt.

Fig. 1 ist eine Draufsicht auf die Oberfläche eines Testplättchens, auf dem die beiden immunochemischen Reagentien in Form der erwähnten festen, eingetrockneten Ablagerungen angeordnet sind;

F i g. 2 ist eine Draufsicht auf ein Testplättchen nach Fig. 1, das in diesem Fall in eine Schutzhülle eingeschlossen ist;

F i g. 3 ist ein Querschnitt durch das Plättchen und die Hülle von F i g. 2 entlang der Linie 3-3.

Das in Fig. 1 dargestellte Testplättchens 10 zur Durchführung eines Schwangerschaftstestes besteht aus einem im wesentlichen rechteckigen Stück Substratmaterial 11, das für Wasser undurchlässig, jedoch benetzbar ist. Das Substratmaterial kann beispielsweise Glas, Porzellan oder ein vorzugsweise transparenter Kunststoff, z. B. ein Phenol-Formaldehydharz, Nitrocellulose oder Methylmethacrylat mit leicht angerauhter Oberfläche sein.

Bei der in F i g. 1 dargestellten Ausführung ist das Substrat ein dünnes Blatt Pappe, die auf einer oder beiden Seiten überzogen ist mit einem wasserfesten, jedoch benetzbaren Überzug 15 aus weichgestellter Nitrocellulose (Überzugsdicke etwa 0,05 cm).

Auf der überzogenen Oberfläche der Pappunterlage 10 ist mit Kontrastfarbe ein Kreis 12 eingezeichnet, der den Bereich abgrenzt, in dem Testreagentien enthalten sind. 13 ist ein eingetrockneter Tropfen einer wäßrigen Suspension von Polystyrollatex, sensibilisiert mit menschlichem Choriongonadotropin. Das zweite Teslreagens, 14, ist ein eingetrockneter Tropfen einer Lösung von mcnschlischem Gonadotropinantiscrum. Die Ablagerungen haben zweckmäßigerweise einen mittleren Durchmesser von etwa 5 bis 15 mm und sind nahe beieinander aufgebracht. Gegebenenfalls kann der Überzug 15 mit einem dunklen Pigment, wie Ruß, pigmentiert sein, so daß er einen Hintergrund von Kontrastfarbe darstellt, gegen den das Tcstresultat besser beobachtet werden kann.

In F i g. 2 und 3 ist eine Anordnung dargestellt, bei der das Testplättchen nach Fig. 1 in eine Schutzhülle 20 eingeschlossen ist, um die aufgebrachten Reagentien gegen Feuchtigkeit und Beschädigung während des Lagerns und vor Gebrauch zu schützen. Bei der dargestellten Ausführungsform besteht die Umhüllung aus einem Laminat von Aluminiumfolie und Papier 21 und einem Deckblatt 22, das abziehbar längs der Kante 23 mn der Aluminiumfolie verbunden ist. Zur Erleichterung des Ablösens und Abstreifens der Hülle ist ein Vorsprung 24 vorgesehen. Die Hülle 22 weist eine Prägung auf, d. h. sie hat einen Mittelteil 25, welcher der Unterlage entspricht und in eine kreisförmige Wand 26 übergeht, die eine mittlere transparente Kreisscheibe 27 begrenzt, deren Durchmesser im wesentlichen dem Umgrenzungskreis 12 in F i g. 1 entspricht.

Die Herstellung der Testreagentien, die nach dem Trocknen die Ablagerungen auf dem Plättchen bilden, ist im Beispiel näher beschrieben.

Bei der Durchführung eines Schwangerschaftstest mit der Ausführungsform nach Fig. 1 wird eine abgemessene Menge Urin auf die eingetrockneten Reagentien aufgebracht. Die Flecken von getrockneten Reagentien werden dann in dem Urin gelöst bzw. suspendiert und durch Rühren mit einem Glas- oder Kunststoffstäbchen vermischt, so daß sich die Reagentien zu einem einzigen Tropfen Reaktionsgemisch vereinigen, in welchem die immunochemische Reaktion stattfindet.

Die Anwesenheit oder Abwesenheit von menschlichem Choriongonadotropin im Urin läßt sich innerhalb weniger Minuten feststellen anhand der Agglutination der Trägerpartikeln; eine Verhinderung dieser Agglutination bedeutet, daß im untersuchten Urin Gonadotropin vorhanden ist, d. h. daß der Schwangerschaftstest positiv ist. Das bei Schwangeren im Urin vorhandene Choriongonadotropin hat mit den Antikörpern des Antiserums bereits reagiert, so daß diese beim Vermischen nicht mehr durch Reaktion mit den resuspendierten Latexteilchen deren Agglutination bewirken können.

Bei der Herstellung der Testplättchen werden die Reagentien als Lösung bzw. Suspension in einem flüssigen, vorzugsweise einem wäßrigen Medium bereitet, die außerdem Potenzierungs- oder Resuspendierungshilfsmittel enthalten kann, beispielsweise Rinderserumalbumin in einer Konzentration bis zu 5% (Gew./Vol.), Lactalbuminhydrolysat in einer Konzentration bis zu 5% oder Gummiarabicum in einer Konzentration von etwa 0,5%. Bei Zusatz eines Saccharides, ζ. B. von Sucrose oder Mannitol, zu dem Reagens bildet sich nach dem Trocknen ein harter, glasartiger aber wasserlöslicher Überzug über der eingetrockneten Ablagerung, der sie gegen Abrieb und Beschädigung beim Packen und bei der Lagerung schützt.

Es sei ausdrücklich erwähnt, daß das Eintrocknen der auf die Unterlage aufgebrachten Suspension von durch

HCG scnsibilisiertem Polystyrollatex an der Luft bei Normal- oder Unterdruck erfolgt und nicht etwa durch Gefriertrocknen (Lyophilisieren). Während sich die beim Lyophilisieren entstehende lockere Pulverschicht aus protein- und latexhaltigen Trockenteilchen leicht wieder in z. B. Wasser resuspendieren lassen, ist dies bei luftgetrockneten »Krusten« aus proteinhaltigem Material bzw. einem Kunststoff-Latex normalerweise nicht der Fall, weshalb diese für die Verwendung des erfindungsgemäßen Testplättchens ausschlaggebende Tatsache für den Fachmann so überraschend ist.

Ein weiterer, besonders wichtiger Aspekt der Erfindung besteht darin, daß quantitativ genaue Mengen an Reagentien auf das Testplättchen aufgebracht werden können, so daß von vornherein eine optimale Sensibilität des Tests sichergestellt ist. Hiermit ist die Ungenauigkeit der üblichen Testmethoden, bei welchen die Testreagentien mit der Pipette verteilt werden, überwunden und die dabei häufig auftretenden Fehler augeschaltet.

Das Beispiel zeigt die Herstellung des erfindungsgemäßen Teslplättchcns für Schwangerschaftsuntersuchungen.

Beispiel

Polystyiol-Latextcilchcn mit einer Teilchengröße von etwa 0,1 bis 1,5 μ (Durchschnitt 0,5 μ) als Träger werden scnsibilisiert mit je ml 100 I.E. menschlichem Choriongonadotropin (HCG) und in einem Boratpuffer suspendiert, worauf Rinderserumalbumin bis zu einer Konzentration von 1% (Gew./Vol.) zugefügt wird. Der Latex wird mit HCG scnsibilisiert, indem man ihn zunächst mit Rindcrscrumalbumin (etwa 90 μg je ml) behandelt und zentrifugiert, worauf man ihn mit einer Lösung von HCG inkubiert. Das überschüssige HCG wird durch Zentrifugieren und Waschen entfernt und der Latex in dem Puffer suspendiert.

Zur Herstellung von 100 ml Latexsuspension verwendet man 24 ml 10%iger HCG-scnsibilisicrter Latexsuspension in einem Puffer, der je 100 ml Wasser folgende Zusätze enthält: 0,8b7 g Borsäure, 0,2 g NaCI, 0,648 ml 5n-NaOH und 4,0 g Sucrose; der pH-Wert wird mil NaOI I oder HCI auf 8,2 eingestellt.

HCG-Antiserum wird hergestellt durch Auflöser einer entsprechenden Menge (bestimmt durch vorherige Titrierung) von Anti-HCG-Serum (vom Kaninchen] in folgendem Puffergemisch (je 100 ml): 0,4365 g Borsäure, 0,1 g NaCI, 0,234 ml 5n-NaOH, 6 g Sucrose 0,5 g Rinderserumalbumin N-Kaninchenserum 0,5 ml Natriumcitratdihydrat 4 g; der pH-Wert wird mit NaOH oder HCI auf 8,2 eingestellt.
Nun wird eine entsprechende Menge (0.03 ml) der

ίο einzelnen Reagentien genau abgemessen und auf ein Testplättchen innerhalb des umschriebenen Bereiches aufgebracht, wo sie zwei getrennte, jedoch nahe beieinandcrliegende Ablagerungen bilden. Die Reagentien werden dann an der Luft bzw. mit Hilfe eines Luftstromes getrocknet.

Zur Durchführung eines Schwangerschaftstes^es bringt man einen Tropfen (0,03 ml) Urin auf jede der beiden Testablagerungen auf und löst bzw. suspendiert die Reagentien in dieser Flüssigkeit, worauf man das ganze zu einem Tropfen zusammenmischt, in welchem die Reaktion stattfindet; man kann dann visuell feststellen, ob eine Agglutination stattgefunden hat oder ob diese verhindert wurde. Durch Einstellen der Menge an getrockneten Reagentien kann die Sensibilität dieses Testes auf jeden gewünschten Grad eingestellt werden, von etwa 500 I.E. HCG je Liter Urin aufwärts.

Zur genauen Einstellung der Menge an immunochemischen Reagentien, die auf die Testplättchen aufgebracht werden, kann man erfindungsgemäß eine Meßpumpe eines geeigneten Typs verwenden, z. B. eine Kolbenpumpe aus rostfreiem Stahl, die je Hub 0,01 ml bis 0,5 ml, vorzugsweise 0,03 ml, fördert.

Die auf das Plättchen aufzubringenden zwei Reagentien können gleichzeitig nebeneinander als einzelne, genau abgemessene Tropfen aufgetropft werden. Das Ganze wird dann einem Trockner zugeführt, wo die Tropfen bei 20 bis 70⁰C, je nach der Wärmebeständigkeit des betreffenden Reagensmittels, getrocknet werden. Zum Trocknen kann auch Vakuum angewendet

werden. Gefriertrocknung ist unerwünscht, da sonst die Ablagerungen weich und brüchig werden. Nach dem Trocknen kann das Plättchen als solches verwendet oder mit der Schutzhülle versehen und gelagert werden.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Schwangerschafts-Diagnostiziermittel zum Nachweis von Choriongonadotropin im Urin durch immunochemische Agglutinationshetnmung der Antigen-Antikörperreaktion von durch Choriongonadotropin sensibilisiertem Polystyrollatex mit Antiserum, gekennzeichnet durch ein Testplättchen mit benetzbarer, Wasser nicht absorbierender Oberfläche im Testbereich, das an zwei voneinander getrennten Stellen genau eingestellte Mengen des eingetrockneten Latex und des eingetrockneten Antiserums aufweist.