DE2019176C3 - Verfahren zur Herstellung von Alkylcoba la minen - Google Patents

Description

Alkylcobalamine sind bislang dadurch hergestellt worden, daß man zunächst Cobalamine, wie Hydroxocobalamin und Cyanocobalamin, in Lösung, z.B. mit Natriumborhydrid, Zinkstaub und verdünter Essigsäure oder Zinkstaub und 10%iger Ammoniumchlorid-Lösung unter anaerobischen Bedingungen reduziert hat. Sodann wurde das reduzierte Cobalamin mit einem Alkylierungsmittel, wie einem Alkylhalogenid oder Alkylsulfat alkyliert. Die Bildung der Cobalamin-Verbindung, die ein einwertiges Kobaltatom enthält, wird durch die visuelle Beobachtung der Farbveränderung der Cobalamin-Lösung von rot zu einem grau-grün bestätigt.

Diese Umsetzungen sind gewöhnlich von der Bildung von Nebenprodukten begleitet. Auf Grund der Ähnlichkeit der Nebenprodukte hinsichtlich der physikalischen und chemischen Eigenschaften ist es schwierig, diese von den Alkylcobalaminen durch die herkömmlichen Abtrcnnungs- und Reinigungsmethoden, wie Extraktion, Kristallisation oder Lyophilisierung vollständig zu entfernen.

Wenn Zink als Reduktionsmittel und Methyljodid als Alkylierungsmittel benutzt werden, ist schon die Abscheidung einer beträchtlichen Menge einer festen Substanz beobachtet worden. Dieser Feststoff ist vermutlich Dimethylzink. Aus diesen Gründen ist die isolierung des erhaltenen Methylcobalamins ziemlich schwierig.

Methylcobalamin, das durch Reduktion von Cobalamin mit Zinkstaub und 10%iger Ammoniumchlorid-Lösung und durch Methylierung mit Dimethylsulfat gebildet wird, enthält eine große Menge, etwa 30 bis 40%, eines Nebenprodukts, das einen gelben Flekken an einer Stelle ergibt, die der ursprünglichen etwas näher liegt als diejenige des Methylcobalamins, wenn man eine absteigende Papierchromatografie durchführt und als Lösungsmittelsystem sekundäres Butanol-Wasser-Eiscssig (100 : 50 : 3) verwendet. Die gelbe Farbe des Fleckens verändert sich allmählich beim Aussetzen an das Licht nach rot. Das Nebenprodukt, das vermutlich eine Verbindung darstellt, die durch übermäßige Methylierung bis zu der N-3-Stelle des 5,6-Dimethylbenzimidazol-Teils des Cobalaminmoleküls gebildeil wird, ist aus dem gewünschten Produkt nur schwierig zu entfernen.

Es wurde nun gefunden, daß die vorherige Reduktion zu einem Cobalamin mit einwertigem Kobalt unterbleiben kann, wenn eine direkte Alkylierung des Hydroxocobalamins in einem alkalischen Medium vorgenommen wird, das eine Hydrazino-Verbindung enthält.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Alkylcobalaminen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen in der an das Kobaltatom gebundenen Alkylgruppe, das dadurch gekennzeichnet ist,

ίο daß man Hydroxocobalamin oder dessen Salze im alkalischen Medium in Gegenwart einer Hydrazino-Gruppen enthaltenden Verbindung mit dem entsprechenden Alkylchlorid, -broimid oder -jodid umsetzt. Durch das Verfahren der Erfindung gelingt es, reine

¹S Alkylcobalamine hoher Ausbeute zu erhalten, ohne daß ungewünschte Nebenprodukte vorliegen.

Als für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Hydrazino-Verbindungen können die folgenden Verbindungen genannt werden:

Hydrazin-Verbindungen, wie Hydrazin per se, Phenylhydrazin und die entsprechenden Salze, z. B. die Hydrochloride; Semicarbazide und deren Salze, wie Hydrochloride; Hydrazide von gesättigten, aliphatischen Monocarbonsäuren, wie Essigsäurehydrazid, Piopionsäurehydrazid, Buttersäurehydrazid und Valeriansäurehydrazid; Hydrazide von gesättigten, aliphatischen Monocarbonsäuren, wie Acrylsäurehydrazid und Crotonsäurehydrazid; Hydrazide vongesättigten Dicarbonsäuren, wie Oxalsäuremiono- und Di-

Jo hydrazide, Bernsteinsäuredihydrazid und Malonsäuredihydrazid. Hydrazide von ungesättigten Dicarbonsäuren, wie Maleinsäuredihydrazid und Fumarsäuredihydrazid; Hydrazide von Hydroxycarbonsäuren, wie Miiehsärehydrazid, ß-Hydroxypropionsäurehy-

drazid, Äpfelsäuredihydrazid, Weinsäuremono- und Dihydrazid. Citronensäureirihydrazid und Gluconsäurchydrazid. Hydrazide von Aminocarbonsäuren, wie Glycinhydra/iti, N-Monomethylglycinhydrazid, N,N-Dimethylglycinhydra/id (Girard's Reagent D),

Trimethylamino-azetohydrazidchlorid (Girard's

Reagent T) und Serinhydrazid; Hydrazide von Aralkylcarbonsäuren, wie Phenylessigsäurehydrazid, Phenylpropionsäurehydrazid und Mandelsäurehydrazid; Hydrazide von aromatischen Carbonsäuren, wie Benzoesäurehydrazid, Salicylsaurehydrazid, o-Aminobenzoesäurehydrazid, Phthalsäuremono- und Di-hydrazid; Hydrazide von heterocyclisch substituierter Essigsäure, wie Morpholinoacetohydrazid, Pyrrolinoacetohvdrazid. Pineridinoaeetohvdrazid. Imidazolinoacetohydrazid, Pyrazolirioacetohydrazid und ihre . quarternären Salze, Pyridinium-acetylhydrazid-chlo-•rid (Girard's. Reagent P) Pyraziniumacetylhydrazidchlorid, Pyrimidiniumacetylhydrazid-chlorid und Pyridazinium-acetylhydrazidcrilorid; sowie Hydrazide von heterocyclischen Carbonsäuren, wie Isonicotinsäure- und Nieotinsäurehydrazid, Picolinsäurehydrazid und ihre quarternären Salze.

Als in das Cobalamin einführbare Alkylreste seien Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl- und Pentyl-Reste genannt. Die entsprechenden Alkalijodide zeigen die höchste Reaktivität gegenüber dem Hydroxycobalamin. Sodann nimmt die Reaktionsfähigkeit über das Bromid nach dem Chlorid hin ab. Somit sind die Alkyljodide am besten geeignet.

Als Hydroxocobalamin, welches als Ausgangsmaterial verwendet wird, ist Hydroxocobalamin per se geeignet sowie seine Salze mit organischen und anorganischen Säuren, z.B. das Acetat und das Hydro-

chlorid.

Das Verfahren der Erfindung kann in der Weise durchgeführt werden, daß man Hydroxocobalamin, eine Hydrazino-Verbindung und das jeweilige Alkylhalogenid in beliebiger Reihenfolge in einem geeigneten Lösungsmittel zur Auflösung bringt und hierzu dann eine Alkali-Lösung fügt. Für diesen Zweck kann jedes beliebige Lösungsmittel eingesetzt werden, vorausgesetzt, daß es dazu imstande ist, mindestens teilweise sowohl das Hydroxocobalamin als auch die Hydrazino-Verbindung aufzulösen. Als geeignete Lösungsmittel können z. B. Wasser und niedrige Alkohole, wie Methanol und Äthanol, sowie deren Gemische in beliebigen Verhältnissen genannt werden. *5

Je nach Lösungsmittel verwendet man als alkalisches Mittel Alkalimetall-Alkoholat, wie Natrium- und Kalium-methoxid bzw. -Äthoxid oder ein Alkalimetallhydroxid, wie Natrium- oder Kalium-hydroxid. Bei Verwendung von Hydrazin als solchem besteht naturgemäß keine Notwendigkeit für die Zufügung einer weiteren alkalischen Substanz in das Reaktionssystem, da das Hydrazin eine mäßige basische Natur besitzt, die ausreicht, um das System zur notwendigen Alkalinität zu bringen. Die Reaktion kann im allge- »5 meinen bei Temperaturen von Raumtemperatur (etwa 25" C) bis etwa 50° C vorgenommen werden. Eine Reaktionstemperatur von etwa 35" C wird bevorzugt.

Die Alkylierungsreaktion, wie sie gemäß der Erfindung erfolgt, nimmt gewöhnlich 1 bis 5 Minuten in Anspruch, wenn die Reaktionstemperatur innerhalb des obengenannten Bereichs gehalten wird.

Es ist besonders beachtenswert, daß die gemäß der Erfindung verlaufende Reaktion nicht unter Luftab-Schluß durchgeführt zu werden braucht.

Das Reaktionsgemisch wird in Wasser gegossen, mit verdünnter Mineralsäure neutralisiert und mit Phenol extrahiert. Der phenolische Extrakt wird heftig mit Äther und einer geringen Wassermenge ge- \o schüttelt, um das erhaltene Alkylcobalamin in die wäßrige Phase zu überführen. Erforderlichenfalls wird die wäßrige Phase durch Behandlung mit Kationen- und Anionen-Austauscherharzen gereinigt. Die als Ausstrom erhaltene wäßrige Phase wird sodann konzentriert, wobei eine Lösung anfällt, die etwa 10 mg/ ml Alkylcobalamin enthält. Zu dieser Lösung wird sodann Aceton gegeben und diese hierauf kalt gestellt, um das Alkylcobalamin auszukristallisieren. Es kann auch eine Lyophilisierung durchgeführt werden. so

Es ist zu beachten, daß die vorstehend genannten Gesamtstufen, die die Alkylierung, die Abtrennung und die Reinigung umfassen, im Dunkeln oder unter einem schwachen Rotlicht durchgeführt werden müssen, wie es in der Chemie des Vitamin B₁₂ vom Coenzym-Typ üblich ist.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Herstellung von Methylcobalamin

a) Umsetzung:

100 mg Hydroxocobalamin und 50 mg Semicarbazid-Hydrochlorid wurden in 10 ml Methanol aufgelöst. Die erhaltene Lösung wurde 25 Minuten bei einer Temperatur von 35 ° C stehen gelassen. Bei dieser Temperatur wurde 1 ml einer Lösung von Methyljodid in Methanol mit einer Konzentration von 500 mg/ml und 3 ml einer Naitriummethoxid-Lösung in Methanol von 16,5 mg/ml zu der Lösung zugefügt, während mäßig gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde zur Vervollständigung der Reaktion 5 Minuten bei 35° C stehen gelassen.

b) Abtrennung und Reinigung des Reaktionsproduktes:

Zu. dem vorstehenden Reaktionsgemisch wurden 100 ml Wasser zugefügt. Es wurde mit verdünnter Salzsäure neutralisiert. Die neutralisierte Lösung wurde 2mal extrahiert, und zwar zunächst mit 30 ml und hierauf mit 5 ml Phenol. Die phenolischen Extrakte wurden vereinigt und 3mal jeweils mit 5 ml Wasser gewaschen.
Zu der Phenolschicht wurde das 8fache Volume*. Äther und 8 ml Wasser gegeben. Das ganze wurde heftig geschüttelt und eine Weile absitzen gelassen, um die wäßrige Schicht zur Abscheidung zu bringen.

Die überstehende ätherische Lösung wurde sodann mit 3 ml Wasser heftig geschüttelt und eine Weile absitzen gelassen, um die zweite wäßrige Schicht zur Abscheidung zu bringen. Die vereinigten wäßrigen Schichten von etwa 10 ml wurden 2mal jeweils mit 5 ml Äther gewaschen, um das Phenol, das in der wäßrigen Lösung zurückgeblieben sein konnte, zu entfernen. Auf diese Weise wurde eine wäßrige Lösung des angestrebten Produkts erhalten.

c) Behandlung mit Ionenaustauschern:

Die vorstehend erhaltene wäßrige Lösung wurde nacheinander durch eine Säule (1 cm x K) cm) aus Carboxymethylcellulose und hierauf durch eine Säule (1 cm X 3 cm) eines Polystyrol-Trirnethylbenzylammonium-Austauschers vom Essigsäuretyp geleitet.

Die Säulen wurden sodann mit destilliertem Wasser eluiert. 30 ml des ersten Ausstroms aus der letzteren Säule wurden gesammelt.
Als durch Papierchromatografie, Elektrophorese und das Absorptionsspektrum das Nichtvorliegen von Verunreinigungen in dem Ausstrom besiätigt wurde, wurde der Ausstrom lyophilisiert, was auf die gewöhnliche Weise geschah. Dabei wurden 88 mg Methylcobalamin in Form eines roten Pulvers mit einer Ausbeute von 88% erhalten.

Das Produkt zeigte in wäßriger Lösung Maxima im Absorptionsspektrum bei 268 ιτιμ, 317 ιημ, 342 ιημ, 374 πιμ und 522 ιπμ. Bei der absteigenden Papierchromatografie mit einem Filterpapier und Verwendung eines Lösungsmittelsystems, das aus sekundärem Butanol/Wasser/ Eisessig im Verhältnis von 100:50:3 bestand, wurde ein einzelner orangeroter Flecken mit einem Rf-Wert von 1,45 bis 1,5 erhalten. Derjenige des Cyanocobalamin betrug 1,0.
Die Elektrophorese des Produkts auf einem Filterpapier mit einer 0,5 m Essigsäure-Lösung unter einem elektrischen Potential von 13 V/cm, die 2,5 Stunden lang durchgeführt wurde, wurde eine relative Beweglichkeit von 1,35 bis 1,4 im Vergleich zu 1,0 und 2,0 für Cyanocobalamin und Hydroxocobalamin festgestellt.
Das durch Behandlung einer Fraktion des Produkts mit einer wäßrigen Lösung von Kaliumcyanid erhaltene Cyanocobalamin zeigte ein scharfes Absorptionsmaximum bei 368 πιμ. Alle oben

angegebenen Werte stehen mit denjenigen für authentische Methylcobalamin-Muster im Einklang.

Beispiel 2

Herstellung von Äthylcobalamin.

100 mg Hydroxocobalamin und 50 mg Semicarbäzid-hydrochlorid wurden in 10 ml Äthanol aufgelöst. Die erhaltene Lösung wurde 20 Minuten bei 35° C stehen gelassen.

Die Lösung wurde mit 1,2 ml einer Lösung von Äthyljodid in Methanol (500 mg/ml) und 3 ml einer Lösung von Natriummethoxid in Methanol (16,5 mg/ml) versetzt. Das ganze wurde 5 Minuten bei 35° C zur Umsetzung gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde gemäß den unter b) beschriebenen Methoden des Beispiels 1 gereinigt, wodurch etwa 10 ml einerwäßrigen Lösung des Produkts erhalten wurden. Zu dieser Lösung wurden 100 ml Aceton gegeben. Das ganze wurde in einem Kühlschrank 3 Stunden stehen gelassen, um das Produkt auszukristallisieren. Auf diese Weise wurden 82 mg Äthylcobalamin in Form von roten Nadeln erhalten.

Die wäßrige Lösung des Produkts zeigte Absorptionsmaxima bei 266 ιτιμ, 345 πιμ und 511 ΐημ Bei einer Papierchromatografie des Produkts, die unter den Bedingungendes Beispiels 1 durchgeführt wurde, wurde ein relativer Rf-Wert von 1,63 bis 1,66 (felb) erhalten. Bei der Papier-Elektrophorese betrug die relative Beweglichkeit oder Migration 1,68 bis 1,72. Beide Werte wurden mit denjenigen des Cyanocobalamin verglichen. Die Werte waren in Übereinstimmung mit denjenigen authentischer Äthylcobalamin-Muster.

Beispiel 3

Herstellung von n-Butylcobalamin.

Die unter a) und b) angegebenen Arbeitsweisen des Beispiels 1 wurden wiederholt, mit der Ausnahme, daß an Stelle der methanolischen Lösung des Methyljodids 1,5 nnl einer Lösung von n-Butyljodid in Methanol (50 mg/ml) verwendet wurde. Dabei wurden ungefähr 10 ml einer wäßrigen Lösung des Reaktionsproduktes erhalten. Zu der Lösung wurden 100 ml Aceton gegeben. Das ganze wurde 3 Tage in einem Kühlschrank gehalten. Auf diese Weise wurden 84 mg rote Nadeln erhalten.

Das erhaltene Produkt zeigte ein Spektrum, das demjenigen des Äthylcobalamins sehr ähnlich war. In wäßriger Lösung wurden Absorptionsmaxima bei 266 τημ, 345 πιμ und 511 ιπμ erhalten. Bei der Papierchromatografie und der Papierelektrophorese, die unter den Bedingungen des Beispiels 1 durchgeführt wurden, betrugen die relativen Rf-Werte 1,80 bis 1,86 und die relative Beweglichkeit oder Migration 1,68 bis 1,72. Diese wurden im Vergleich zu denjenigen des Cyanocobalamin erhalten. Es konnte bewiesen werden, daß diese Werte vollständig mit denjenigen authentischer n-Butylcobalamin-Muster im Einklang stehen.

Beispiel 4

Herstellung von Methylcobalamin

100 mg Hydroxocobalamin und 65 mg Malonsäure-dihydrazid wurden in 10 ml eines Gemisches von destilliertem Wasser mit Methanol (1:1) aufgelöst. Die erhaltene Lösung wurde 15 Minuten bei 35° C stehengelassen.

Sodann wurden zu der Lösung unter Rühren 1 ml einer methanolischen Lösung von Methyljodid (500 mg/ml) und 3 ml einer 3n-w^;ißrigen Natriumhydroxid-Lösung gegeben.

Das ganze wurde 5 Minuten zur Vervollständigung der Reaktion bei 35° C stehen gelassen. Hierzu wurden 20 ml Wasser gegeben -und das Gemisch wurde mit verdünnter Salzsäure neutralisiert. Die Lösung wurde gemäß den unter b) angegebenen Arbeitswei-

sen des Beispiels 1 durch Phenolextraktion gereinigt. Zu 10 ml der wäßrigen Lösung, die das Reaktionsprodukt enthielt, wurden 100 ml Aceton gegeben. Das ganze wurde in einem Kühlschrank stehen gelassen, um die Kristallisation des Produktes zu bewirken. Dabei wurden 80 mg Methylcobalamin in Form von roten Nadeln erhalten.

Beispiel 5

Herstellung von Propylcobalamin

Die Arbeitsweisen des Beispiels 1 wurden wiederholt, mit der Ausnahme, daß 130 mg Malonsäure-dihydrazid und, an Stelle des Methyljodids, 1 ml einer methanolischen Lösung von Propyljodid (500 mg/ml) eingesetz* wurden. Auf diese Weise wurden 80 mg Propylcobalamin in Form von roten Nadeln erhalten.

Beispiel 6

Herstellung von Methylcobalamin

Die Arbeitsweisen von a), b) und c) des Beispiels 1 wurden wiederholt, mit der Ausnahme, daß an Stelle der 50 mg des Semicarbazid-hydrochlorids 120 mg Isonicotinsäure-hydrazid und an Stelle von 100 mg Hydroxocobalamin 80 mg eingesetzt wurden. Dabei wurden 35 ml eines Ausstrqms erhalten. Der Ausstrom wurde sodann durch Phenol gereinigt. Die erhaltene wäßrige Lösung wurde im Vakuum auf 8 ml konzentriert. 90 ml Aceton wurden zu dem wäßrigen Konzentrat gegeben und das ganze wurde in einem Kühlschrank 3 Tage stehen gelassen. Auf diese Weise wurden 6? mg Methylcobalamin in Form von roten Nadeln erhalten.

Beispiel 7

Herstellung von Methylcobalamin

Die Arbeitsweisen des Beispiels 4 wurden wiederholt, mit der Ausnahme, daß an Stelle der 100 mg Hydroxocobalamin 100 mg Hydroxocobalamin-acetat und an Stelle der 65 mg Malonsäure-dihydrazic 72 mg Maleinsäure-dihydrazid verwendet wurden. Auf diese Weise wurden 79 mg Methylcobalamin in Form von roten Nadeln erhalten.

Beispiel 8

Herstellung von Methylcobalamin

Die Arbeitsweisen des Beispiels 4 wurden wiederholt, mit der Ausnahme, daß an Stelle der 100 mg Hydroxocobalamin 100 mg Hydroxocobalamin-acetat und an Stelle der 65 mg Malonsäure-dihydrazid 140 mg Phthalsäuire-dihydrazid verwendet wurden. Auf diese Weise wurden 76 mg Methylcobaiamin in Form von roten Nadeln erhalten.

Beispiel 9

Herstellung von Methylcobalamin

Die unter a), b) und c) des Beispiels 1 beschriebenen Arbeitsweisen wurden wiederholt, mit der Ausnahme, daß an Stelle des Hydroxocobalamins und des

Semicarbazids 100 mg Hydroxocobalamin-hydro- · chlorid und 83 mg Mandelsäure-hydrazid verwendet
wurden. Die weitere Reinigung des Reaktionsproduktes durch Phenol wurde vorgenommen, wobei uii- 5 gefahr 9 ml eines wäßrigen Konzentrats des>Reak- .■ tionsproduktes erhalten wurden. Zu dem Konzentrat '' wurden 90 ml Aceton gegeben. Das ganze wurde in
einem Kühlschrank 3 Tage zur Kristallisation stehen
gelassen. Dadurch wurden 75 mg Methylcobalamin io in Form von roten Nadeln erhalten.

Ii

Beispiel 10

Herstellung von Methylcobalamin ' - ^ *

■ Die Arbeitsweisen des Beispiels,4 wurden wieder-'.' holt, mit der Ausnahme, daß 60 mg Essigsäure-hydrazid an Stelle der 65 mg, Malonsäure-hydrazid verwendet wurden. Dadurch wurden 82 mg Methylcobalamin in Form von roten Nadeln erhalten.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Alkylcobalamin mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen in der an das Kobaltatom gebundenen Alkylgruppe, dadurch gekennzeichnet, daß man Hydroxocobalamin oder dessen Salze im alkalischen Medium in Gegenwart einer Hydrazino-Gruppen enthaltenden Verbindung mit dem entsprechenden Alkylchlorid, -bromid oder -jodid umsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die entsprechenden Alkyljodide umsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Semicarbazid-hydrochlorid verwendet.