DE19963857A1

DE19963857A1 - Primers, in particular for primer-dependent nucleic acid synthesis processes and nucleic acid amplification processes

Info

Publication number: DE19963857A1
Application number: DE19963857A
Authority: DE
Inventors: Christian Korfhage; Uwe Oelmueller
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 1999-12-30
Filing date: 1999-12-30
Publication date: 2001-07-26
Also published as: WO2001049880A3; WO2001049880A2; EP1242621A2

Abstract

The invention relates to primers which exhibit a high specificity and efficiency during hybridization with a target nucleic acid. To this end, the invention provides that a high proportion of bases, which can form two hydrogen bridge-type bonds with the corresponding bases in a target molecule, are predominant on the 3'-end of the hybridizing part of the primer. The 5'-end of the hybridizing part advantageously comprises a high proportion of bases which can form three hydrogen bridge-type bonds with the corresponding bases in the target molecule. The inventive primers are suited for use in primer-dependent nucleic acid synthesis processes, such as DNA syntheses and nucleic acid amplification methods, in particular, isothermal amplification methods. The inventive primers make it possible to significantly increase the yield of a specific amplification product and to reduce the production of undesired byproducts.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Primer, insbesondere für Primer-abhängige Nukleinsäure- Syntheseprozesse und Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, Primergemische, ein Verfahren zur Herstellung von Primern, die Verwendung der Primer in Nukleinsäure-Syntheseprozessen und Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren sowie Kits enthaltend entsprechende Primer.The present invention relates to primers, in particular for primer-dependent nucleic acid Synthesis processes and nucleic acid amplification processes, primer mixtures, one process for the production of primers, the use of the primers in nucleic acid synthesis processes and nucleic acid amplification methods and kits containing corresponding primers.

Zunächst werden nachfolgend einige Begriffsdefinitionen angegeben.First, some definitions of terms are given below.

Unter einem Enzym für die Nukleinsäure-Polymerisation ist eine Klasse von Enzymen zu verstehen, welche Phosphdiester-Bindungen zwischen einzelnen Nukleotiden innerhalb eines Nukleinsäure-Stranges katalysieren.Under an enzyme for nucleic acid polymerization is a class of enzymes too understand which phosphdiester bonds between individual nucleotides within a Catalyze nucleic acid strands.

Häufig verwendete Enzyme zum Zwecke der Nukleinsäure-Polymerisation sind DNA- oder RNA-Polymerasen. Darunter sind unabhängig von ihrer stofflichen Natur Enzyme zu verstehen, welche eine Kondensationsreaktion zwischen dem 3'-Ende (OH-Ende) der Desoxyribose der DNA und einem Säurerest, der mit der Desoxyribose des eintretenden Nukleotids verknüpft ist, katalysieren. Als Matritze dient dabei eine Nukleinsäure, und zwar eine RNA (Ribonukleinsäure) bei RNA-abhängigen DNA-Polymerasen und eine DNA (Desoxyribonukleinsäure) bei DNA-abhängigen DNA-Polymerasen.Frequently used enzymes for the purpose of nucleic acid polymerization are DNA or RNA polymerases. These include enzymes regardless of their material nature understand which is a condensation reaction between the 3 'end (OH end) of the Deoxyribose of DNA and an acid residue that coincides with the deoxyribose of the entering Is linked, catalyze. A nucleic acid serves as the matrix, namely an RNA (ribonucleic acid) in RNA-dependent DNA polymerases and a DNA (Deoxyribonucleic acid) in DNA-dependent DNA polymerases.

Nukleinsäure-Synthesen sind beispielsweise Schlüsselreaktionen bei der Amplifikation und Klonierung von Nukleinsäuren. Des weiteren werden sie beispielsweise bei diagnostischen Verfahren eingesetzt. For example, nucleic acid syntheses are key reactions in amplification and Cloning of nucleic acids. They are also used, for example, in diagnostic Process used.

Unter den Begriff Nukleinsäure fallen insbesondere RNA und DNA in allen Längen und Konfigurationen, wie Doppelstrang, Einzelstrang, zirkulär, linear, verzweigt etc. Des weiteren fallen darunter Oligomere, Plasmide, Viroide, virale, bakterielle und archaebakterielle DNA und RNA, genomische und nicht-genomische DNA und RNA aus Tier-, Pilz- und Pflanzenzellen oder anderen Eukaryonten, tRNA, mRNA in prozessierter und unprozessierter Form, hnRNA, rmA, cDNA und alle anderen denkbaren Nukleinsäuren.The term nucleic acid includes in particular RNA and DNA in all lengths and Configurations such as double strand, single strand, circular, linear, branched etc. Furthermore these include oligomers, plasmids, viroids, viral, bacterial and archaebacterial DNA and RNA, genomic and non-genomic DNA and RNA from animal, fungal and Plant cells or other eukaryotes, tRNA, mRNA in processed and unprocessed Form, hnRNA, rmA, cDNA and all other conceivable nucleic acids.

Der Nukleinsäure-Erststrang ist der Nukleinsäurestrang, welcher während der Primer abhängigen Nukleinsäure-Synthese durch ein Enzym, wie z. B. DNA oder RNA-Polymerase, Ligase etc.; gebildet wird und komplementär zur Sequenz einer Zielnukleinsäure ist. Der Nukleinsäure-Zweitstrang ist der Nukleinsäurestrang, welcher während der Primer abhängigen Nukleinsäure-Synthese durch ein Enzym gebildet wird und komplementär zur Sequenz des Erststrangs ist.The first strand of nucleic acid is the strand of nucleic acid that is present during the primer dependent nucleic acid synthesis by an enzyme, such as. B. DNA or RNA polymerase, Ligase etc .; is formed and is complementary to the sequence of a target nucleic acid. The nucleic acid second strand is the nucleic acid strand that is used during the primer dependent nucleic acid synthesis is formed by an enzyme and complementary to Sequence of the first strand is.

Als eine Zielnukleinsäure wird eine Nukleinsäure definiert, die spezifisch einen definierten Primer binden, d. h. mit diesem hybridisieren, kann. Die Zielnukleinsäure dient nach der Primer-Bindung bei der primer-abhängigen Nukleinsäure-Synthese durch ein Enzym, z. B. DNA- oder RNA-abhängige DNA-Polymerasen, als Matrize des zu synthetisierenden Nukleinsäure-Strangs, wobei die Sequenz des zu synthetisierenden Nukleinsäure-Strangs komplementär zur Sequenz der Zielnukleinsäure ist. Spezifische Bindung bedeutet dabei nicht, daß 100% Komplementarität zwischen Zielnukleinsäure und hybridisierendem Teil des Primers vorliegen muß. Bis zu maximal 50% der Basen im hybridisierenden Bereich zwischen Primer und Zielnukleinsäure dürfen nicht-komplementär sein, um noch brauchbare Ergebnisse zu erzielen. Gute bis sehr gute Ergebnisse können erreicht werden, wenn nicht mehr als 30% der Basen des hybridisierenden Teils des Primers und der Zielnukleinsäure nicht komplementär sind. Je höher der Grad an Komplementarität zwischen dem hybridisierenden Teil des Primers und der Zielnukleinsäure ist, desto spezifischer und effektiver ist der Primer.A nucleic acid is defined as a target nucleic acid that specifically defines a defined one Bind primer, d. H. can hybridize with this. The target nucleic acid serves after the Primer binding in the primer-dependent nucleic acid synthesis by an enzyme, e.g. B. DNA or RNA-dependent DNA polymerases, as a template for the one to be synthesized Nucleic acid strand, the sequence of the nucleic acid strand to be synthesized is complementary to the sequence of the target nucleic acid. Specific binding means not that 100% complementarity between target nucleic acid and hybridizing part of the Primers must be present. Up to a maximum of 50% of the bases in the hybridizing area between primer and target nucleic acid must be non-complementary to still be usable Get results. Good to very good results can be achieved if not more than 30% of the bases of the hybridizing part of the primer and the target nucleic acid are not complementary. The higher the degree of complementarity between the hybridizing part of the primer and the target nucleic acid, the more specific and the primer is more effective.

Die Zielsequenz ist zum einen die Sequenz, welche die Primer-Bindestelle enthält, und zum anderen die Sequenz, die in 3'-Richtung (stromabwärts) von der Primer-Bindestelle liegt. Bei der Primer-abhängigen Nukleinsäure-Synthese wird eine Nukleinsäuresequenz gebildet, die komplementär zur Zielsequenz ist. The target sequence is on the one hand the sequence which contains the primer binding site and on the other others the sequence located in the 3 'direction (downstream) from the primer binding site. At a nucleic acid sequence is formed in the primer-dependent nucleic acid synthesis is complementary to the target sequence.

Primer sind Starter für die Nukleinsäure-Synthese. Es handelt sich meist um kurzkettige, einzelsträngige Oligoribo- oder Desoxyribonukleotide, die zu einem Bereich auf einem einzelsträngigen Nukleinsäuremolekül zu mindestens 50% komplementär sind (siehe oben) und mit diesem zu einem Doppelstrang reagieren können. Das freie 3'-Hydroxy-Ende in diesem Doppelstrang dient als Substrat für Nukleinsäure-Polymerasen, wie beispielsweise DNA-Polymerasen, und als Startstelle für die Aufpolymerisierung des gesamten Einzelstrangs zum Doppelstrang. Primer sind allgemein definiert als ein oligomeres Startermolekül, das sequenzspezifisch an die Zielnukleinsäure binden kann. Die Sequenz der Zielnukleinsäure, die den Primer bindet, wird als Primer-Bindestelle bezeichnet. Dabei kann ein Primer durchaus auch verschiedene Zielnukleinsäuren binden, wenn diese alle die gleiche oder eine ähnliche Sequenz als Primer-Bindestelle enthalten. Ein erster oder primärer Primer P1 wird als "anti-sense Primer" und ein zweiter oder sekundärer Primer P2 wird als "sense Primer" definiert.Primers are starters for nucleic acid synthesis. It is mostly short-chain, single-stranded oligoribo- or deoxyribonucleotides that belong to an area on one single-stranded nucleic acid molecules are at least 50% complementary (see above) and can react with it to a double strand. The free 3'-hydroxy end in this double strand serves as a substrate for nucleic acid polymerases, such as DNA polymerases, and as a starting point for the polymerization of the entire single strand to the double strand. Primers are generally defined as an oligomeric starter molecule that can bind to the target nucleic acid in a sequence-specific manner. The sequence of the target nucleic acid, that binds the primer is called the primer binding site. It can be a primer bind different target nucleic acids if they are all the same or one contain similar sequence as primer binding site. A first or primary primer P1 will as "anti-sense primer" and a second or secondary primer P2 is called "sense primer" Are defined.

Als Zweitsrangsynthese-Primer wird ein "sense Primer" definiert, der entweder ein sekundärer, der Reaktion von außen zugeführter Primer P2 oder ein durch die Rückfaltung des Nukleinsäure-Erststrangs gebildeter Primer (sog. "Hairpin Loop") ist.A "sense primer" is defined as a second-rank synthesis primer, which is either a secondary primer P2 supplied to the reaction from the outside or one by refolding of the nucleic acid first strand is a primer (so-called "hairpin loop").

Eine Primer-Bindestelle ist die Sequenz der Zielnukleinsäure, die den Primer durch Hybridisierung binden kann. Die Sequenz der Primer-Bindestelle ist zu mindestens 30%, bevorzugt mindestens 50%, besonders bevorzugt 100%, komplementär zur Sequenz des Primers.A primer binding site is the sequence of the target nucleic acid that passes through the primer Hybridization can bind. The sequence of the primer binding site is at least 30%, preferably at least 50%, particularly preferably 100%, complementary to the sequence of the Primers.

Der hybridisierende Anteil des Primers ist der Sequenzteil des Primers, der an das primäre Zielmolekül hybridisiert und zu der Sequenz der Primerbindestelle des primären Zielmoleküls in mindestens 50% der Basen komplementär ist. Das primäre Zielmolekül ist das Nukleinsäuremolekül, das in die enzymatische Reaktion eingesetzt wird. Es ist nicht Produkt dieser Reaktion.The hybridizing portion of the primer is the sequence portion of the primer that is attached to the primary Target molecule hybridizes and to the sequence of the primer binding site of the primary target molecule is complementary in at least 50% of the bases. The primary target is that Nucleic acid molecule that is used in the enzymatic reaction. It is not a product this reaction.

Die durch Enzyme, wie insbesondere DNA- und RNA-abhängige DNA-Polymerasen katalysierte, Primer-abhängige Nukleinsäure-Synthese ist eine Schlüsselreaktion bei der cDNA-Synthese, DNA-Sequenzierung und bei Amplifikationsverfahren wie z. B. der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)/RT-PCR oder den isothermalen Amplifikationsverfahren NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplifleation), 3SR (Self-Sustained Sequence Replication; beinhaltet die Verwendung von RNase H), 2SR (Self-Sustained Sequence Replication; ähnlich wie 3SR, aber ohne Verwendung von RNase H), TMA (Transcription Mediated Amplification), SDA (Strand Displacement Amplification), LCR (Ligase Chain Reaction) und verwandte Methoden. Die Effizienz der Primer-abhängigen Nukleinsäure- Synthese wird beeinflußt durch die Aktivität des Enzyms für die Nukleinsäure-Polymerisation (z. B. einer DNA-Polymerase), durch die Zielnukleinsäure und durch Effizienz und Spezifität der Primer-Hybridisierung. Die Effizienz und Spezifität der Primer-Hybridisierung hängt wiederum entscheidend von den verwendeten Salzen und Salzkonzentrationen in der Syntheselösung, von der Sequenz der Zielnukleinsäure und von der Sequenz der Primer ab. Nachfolgend werden einige Anwendungsbeispiele für Primer-abhängige Nukleinsäure- Syntheseprozesse näher beschrieben.The by DNA enzymes, such as DNA and RNA-dependent DNA polymerases Catalyzed, primer-dependent nucleic acid synthesis is a key reaction in the cDNA synthesis, DNA sequencing and in amplification methods such as. B. the Polymerase chain reaction (PCR) / RT-PCR or the isothermal amplification method NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplifleation), 3SR (Self-Sustained Sequence Replication; involves the use of RNase H), 2SR (Self-Sustained Sequence Replication; Similar to 3SR, but without the use of RNase H), TMA (Transcription Mediated Amplification), SDA (Strand Displacement Amplification), LCR (Ligase Chain Reaction) and related methods. The efficiency of the primer-dependent nucleic acid Synthesis is affected by the activity of the enzyme for nucleic acid polymerization (e.g. a DNA polymerase), by the target nucleic acid and by efficiency and specificity primer hybridization. The efficiency and specificity of primer hybridization depends again crucial from the salts and salt concentrations used in the Synthesis solution, on the sequence of the target nucleic acid and on the sequence of the primers. Below are some application examples for primer-dependent nucleic acid Synthesis processes described in more detail.

Primer-abhängige Nukleinsäure-Synthese-Reaktionen findet man z. B. bei Erst- und Zweitstrang-cDNA-Synthesen, bei der DNA-Sequenzierung, bei auf Primer-Bindung basierenden Mutageneseprozessen und anderen Verfahren. Dabei werden sequenzspezifisch gestartete Nukleinsäure-Synthesereaktionen durchgeführt unter Einsatz von Enzymen, wie z. B. RNA- oder DNA-abhängigen DNA-Polymerasen, wobei die sequenzspezifisch gestarteten DNA-Synthesereaktionen folgende Schritte enthalten:
Primer-dependent nucleic acid synthesis reactions can be found e.g. B. in first and second strand cDNA syntheses, in DNA sequencing, in mutagenesis processes based on primer binding and other methods. Sequence-specifically started nucleic acid synthesis reactions are carried out using enzymes, such as. B. RNA- or DNA-dependent DNA polymerases, the sequence-specifically started DNA synthesis reactions containing the following steps:

1. Sequenzspezifische Hybridisierung eines ersten Primers P1 an eine zu diesem komplementäre Sequenz der Zielnukleinsäure (RNA oder DNA); und1. Sequence-specific hybridization of a first primer P1 to one of these complementary sequence of the target nucleic acid (RNA or DNA); and
2. Verlängerung des Primers P1 durch den katalysierten Einbau von Desoxyribonukleotiden an das freie 3'-OH Ende des zu verlängernden Primers P1 mittels eines Enzyms, wie z. B. einer RNA-abhängigen oder DNA-abhängigen DNA-Polymerase, wobei die Zielnukleinsäure als Matrize dient, und der Primer P1 insgesamt oder zumindest im 3'- Bereich eine Sequenz enthält, die komplementär zur einer bestimmten Sequenz der Zielnukleinsäure ist und sequenzspezifisch an diese Zielsequenz hybridisieren kann und wobei der Primer P1 im 5'-Bereich eine Sequenz enthalten kann, die nicht komplementär zur Zielnukleinsäure ist und nicht an der Zielnukleinsäure hybridisieren kann und zusätzliche Funktionen enthalten kann. Die Synthese läuft bis zum Ende der Zielnukleinsäure (Matritze) oder kann vor dem Ende unterbrochen werden, womit die Erststrang-Nukleinsäure-Synthese beendet ist.2. Extension of the primer P1 by the catalyzed incorporation of deoxyribonucleotides to the free 3'-OH end of the primer P1 to be extended by means of an enzyme, such as. B. an RNA-dependent or DNA-dependent DNA polymerase, the Target nucleic acid serves as a template, and the primer P1 as a whole or at least in the 3'- Area contains a sequence that is complementary to a specific sequence of Is target nucleic acid and can hybridize specifically to this target sequence and wherein the primer P1 in the 5 'region can contain a sequence that is not complementary to the target nucleic acid and cannot hybridize to the target nucleic acid and may contain additional functions. The synthesis runs until the end of Target nucleic acid (template) or can be interrupted before the end, with which the First strand nucleic acid synthesis is complete.
3. Die Nukleinsäure-Zweitstrangsynthese beginnt durch die sequenzspezifische Hybridisierung eines Zweitsrangsynthese-Primers (ZP). Der Zweitstrangsynthese-Primer kann sein ein separater, der Reaktion zugeführter Primer P2, ein Degradierungsprodukt der Zielnukleinsäure oder ein durch die Rückfaltung des Nukleinsäure-Erststrangs gebildeter Primer (Hairpin Loop).3. Second-strand nucleic acid synthesis begins with the sequence-specific one Hybridization of a second-tier synthesis primer (ZP). The second strand synthesis primer can be a separate reaction primer P2, a degradation product of Target nucleic acid or one formed by refolding the first strand of nucleic acid Primer (hairpin loop).
4. Verlängerung des ZP durch den katalysierten Einbau von Nukleotiden an das freie 3'-OH Ende des zu verlängernden ZP mittels eines Enzyms, wobei der Nukleinsäure-Erststrang der Zielnukleinsäure als Matrize dient; der ZP enthält insgesamt oder zumindest im 3'- Bereich eine Sequenz, die komplementär zu einer bestimmten Sequenz der Zielnukleinsäure ist und sequenzspezifisch an diese Zielsequenz hybridisieren kann und der ZP kann im 5'-Bereich eine Sequenz enthalten, die nicht komplementär zur Zielnukleinsäure ist, als Folge davon nicht an der Zielnukleinsäure hybridisieren kann, zusätzliche Funktionen enthalten kann und wobei der ZP die gleiche oder eine zu dem Primer P1 unterschiedliche Sequenz aufweisen kann.4. Extension of the ZP by the catalyzed incorporation of nucleotides into the free 3'-OH End of the ZP to be extended using an enzyme, the nucleic acid first strand the target nucleic acid serves as a template; the ZP contains in total or at least in 3'- Range a sequence that is complementary to a particular sequence of Is target nucleic acid and can hybridize specifically to this target sequence and the ZP can contain a sequence in the 5 'region that is not complementary to Target nucleic acid, as a result of which it cannot hybridize to the target nucleic acid, may contain additional functions and where the ZP is the same or one to the Primer P1 can have a different sequence.

Die Primer-abhängige Synthese Reaktion ist auch bei der Sequenzierung eine Schlüsselreaktion. Das Verfahren der Nukleinsäure-Sequenzierung folgt im wesentlichen dem schon vorstehend unter Primer-abhängige Nukleinsäure-Synthese Reaktion beschriebenen Verfahren und beschränkt sich auf die Schritte (1) und (2), wobei im Falle einer DNA- Synthese anstelle der Desoxyribonukleotide eine Mischung aus Desoxyribonukleotiden und Didesoxyribonukleotiden zum katalysierten Einbau durch Enzyme, wie z. B. RNA- oder DNA-abhängige DNA-Polymerasen, verwendet wird.The primer-dependent synthesis reaction is also a factor in sequencing Key reaction. The nucleic acid sequencing procedure essentially follows this already described above under primer-dependent nucleic acid synthesis reaction Method and is limited to steps (1) and (2), where in the case of a DNA Synthesis instead of the deoxyribonucleotides a mixture of deoxyribonucleotides and Dideoxyribonucleotides for catalyzed incorporation by enzymes, such as. B. RNA or DNA-dependent DNA polymerases is used.

Dabei werden die sequenzspezifisch gestarteten Nukleinsäure-Synthesereaktionen zur Sequenzierung durchgeführt durch Enzyme, wie beispielsweise RNA- oder DNA-abhängige DNA-Polymerasen, wobei die sequenzspezifisch gestarteten DNA-Sequenzreaktionen folgende Schritte enthalten:
The sequence-specifically started nucleic acid synthesis reactions for sequencing are carried out by enzymes, such as RNA or DNA-dependent DNA polymerases, the sequence-specifically started DNA sequence reactions containing the following steps:

1. Sequenzspezifische Hybridisierung eines Primers P1 an eine zu diesem komplementäre Sequenz der Ziel-Nukleinsäure (RNA oder DNA).1. Sequence-specific hybridization of a primer P1 to a complementary one Sequence of the target nucleic acid (RNA or DNA).
2. Verlängerung des Primers P1 durch den katalysierten Einbau von Desoxyribonukleotiden und Didesoxyribonucleotiden an das freie 3'-OH Ende des zu verlängernden Primers P1 durch ein Enzym, z. B. eine RNA-abhängige oder DNA-abhängige DNA-Polymerase, wobei die Zielnukleinsäure als Matrize dient, der Primer P1 insgesamt oder zumindest im 3'-Bereich eine Sequenz enthält, die komplementär zur einer bestimmten Sequenz der Zielnukleinsäure ist und sequenzspezifisch an diese Zielsequenz hybridisieren kann und der Primer P1 im 5'-Bereich eine Sequenz enhalten kann, die nicht komplementär zur Zielnukleinsäure ist, nicht an der Zielnukleinsäure hybridisieren kann und zusätzliche Funktionen enthalten kann.2. Extension of the primer P1 by the catalyzed incorporation of deoxyribonucleotides and dideoxyribonucleotides at the free 3'-OH end of the primer P1 to be extended by an enzyme, e.g. B. an RNA-dependent or DNA-dependent DNA polymerase, where the target nucleic acid serves as a template, the primer P1 as a whole or at least in 3 'area contains a sequence that is complementary to a specific sequence of Is target nucleic acid and can hybridize specifically to this target sequence and the primer P1 in the 5 'region can contain a sequence that is not complementary to Target nucleic acid is, can not hybridize to the target nucleic acid and additional Can contain functions.

Primer-abhängige Nukleinsäure-Synthese-Reaktionen findet man auch bei auf Primer- Bindung basierenden Mutageneseprozessen. Dabei beruhen diese Mutagenesemethoden auf der sequenzspezifischen Bindung eines Primers oder mehrerer Primer, der/die mindestens eine Mutation aufweist/aufweisen. Im einzelnen umfassen die auf Primer-Bindung basierenden Mutageneseprozesse folgende Schritte:
Primer-dependent nucleic acid synthesis reactions can also be found in mutagenesis processes based on primer binding. These mutagenesis methods are based on the sequence-specific binding of one or more primers which has / have at least one mutation. In detail, the mutagenesis processes based on primer binding comprise the following steps:

1. Sequenzspezifische Hybridisierung eines (oder meherer) Primer(s) P1 (P1_n) an eine zu diesem/diesen komplementäre Sequenz der Zielnukleinsäure (RNA oder DNA).1. Sequence-specific hybridization of one (or more) primer (s) P1 (P1 _n ) to a sequence of the target nucleic acid (RNA or DNA) that is complementary to this.
2. Verlängerung des (oder der) Primer(s) P1 (P1_n) durch den katalysierten Einbau von Nukleotiden an das freie 3'-OH Ende des (oder der) zu verlängernden Primer(s) durch ein Enzym, z. B. eine RNA-abhängige oder DNA-abhängige DNA-Polymerase, wobei die Zielnukleinsäure als Matrize dient, wobei der oder die Primer P1 (P1_n) insgesamt oder zumindest im 3'-Bereich eine Sequenz enthält/enthalten, die komplementär zur einer bestimmten Sequenz der Zielnukleinsäure ist und sequenzspezifisch an diese Zielsequenz hybridisieren kann, der oder die Primer P1 (P1_n) innerhalb der zur Zielsequenz komplementären Sequenz mindestens eine Mutation aufweist/aufweisen, d. h. eine im Vergleich zur Nukleotidabfolge der Zielsequenz nicht komplementäre Base und der/die Primer P1 (P1_n) im 5'-Bereich eine Sequenz enthalten kann/können, die nicht komplementär zur Zielnukleinsäure ist, nicht an der Zielnukleinsäure hybridisieren kann und zusätzliche Funktionen enthalten kann.2. Extension of the primer (s) P1 (P1 _n ) by the catalyzed incorporation of nucleotides at the free 3'-OH end of the primer (s) to be extended by an enzyme, e.g. B. an RNA-dependent or DNA-dependent DNA polymerase, wherein the target nucleic acid serves as a template, the primer ( _s ) P1 (P1 _n ) in total or at least in the 3 'region contains a sequence which is complementary to a specific one Sequence of the target nucleic acid and can hybridize to this target sequence in a sequence-specific manner, the primer P1 (P1 _n ) has / have at least one mutation within the sequence complementary to the target sequence, ie a base that is not complementary to the nucleotide sequence of the target sequence and the primer ( _s ) P1 (P1 _n ) in the 5 'region can contain a sequence which is not complementary to the target nucleic acid, cannot hybridize to the target nucleic acid and can contain additional functions.
3. Die Nukleinsäure-Zweitstrangsynthese wird dann begonnen durch eine sequenzspezifische Hybridisierung eines ZP, eines Degradationsprodukts der Zielnukleinsäure oder durch die Rückfaltung des Nukleinsäure-Erststrangs an die zu diesem komplementäre Sequenz des DNA-Erststranges der Zielnukleinsäure.3. The second strand nucleic acid synthesis is then started by a sequence specific Hybridization of a ZP, a degradation product of the target nucleic acid or by the Refolding of the nucleic acid first strand to the sequence of the complementary to this DNA first strand of target nucleic acid.
4. Verlängerung des ZP durch den katalysierten Einbau von Desoxyribonukleotiden an das freie 3'-OH Ende des zu verlängernden ZP mittels einer DNA-abhängigen DNA- Polymerase, wobei der DNA-Erststrang der Zielnukleinsäure als Matrize dient, und der ZP insgesamt oder zumindest im 3'-Bereich eine Sequenz enthält, die komplementär zur einer bestimmten Sequenz der Zielnukleinsäure ist und sequenzspezifisch an diese Zielsequenz hybridisieren kann, und wobei der ZP im 5'-Bereich eine Sequenz enthalten kann, die nicht komplementär zur Zielnukleinsäure ist, als Folge davon nicht an der Zielnukleinsäure hybridisieren kann und zusätzliche Funktionen enthalten kann und wobei der ZP die gleiche oder eine zu Primer P1 unterschiedliche Sequenz aufweisen kann.4. Extension of the ZP by the catalyzed incorporation of deoxyribonucleotides into the free 3'-OH end of the ZP to be extended by means of a DNA-dependent DNA Polymerase, where the DNA first strand of the target nucleic acid serves as a template, and the ZP contains a sequence as a whole or at least in the 3 'region which is complementary to one specific sequence of the target nucleic acid and sequence specific to this target sequence can hybridize, and the ZP in the 5 'region can contain a sequence that does not is complementary to the target nucleic acid, consequently not to the target nucleic acid can hybridize and can contain additional functions and the ZP the may have the same or a different sequence to primer P1.

Primer-abhängige Nukleinsäure-Synthese-Reaktionen findet man ebenfalls bei Erst- und Zweitstrang-DNA-Synthesen der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Dabei werden die sequenzspezifisch gestarteten DNA-Synthesereaktionen durchgeführt durch hitzestabile RNA- und/oder DNA-abhängige DNA-Polymerasen, wobei die sequenzspezifisch gestarteten DNA-Synthesereaktionen folgende Schritte enthalten:
Primer-dependent nucleic acid synthesis reactions can also be found in first- and second-strand DNA syntheses of the polymerase chain reaction (PCR). The sequence-specifically started DNA synthesis reactions are carried out by heat-stable RNA and / or DNA-dependent DNA polymerases, the sequence-specifically started DNA synthesis reactions containing the following steps:

1. Initiale thermische Denaturierung der Zielnukleinsäure;1. Initial thermal denaturation of the target nucleic acid;
2. Sequenzspezifische Hybridisierung zweier Primer P1 und P2 an eine zu diesen komplementäre Sequenz der Zielnukleinsäure;2. Sequence-specific hybridization of two primers P1 and P2 to one of these complementary sequence of the target nucleic acid;
3. Verlängerung der Primer P1 und P2 durch den katalysierten Einbau von Desoxyribonukleotiden an das freie 3'-OH Ende der zu verlängernden Primer P1 und P2 durch eine hitzestabile RNA-abhängige oder DNA-abhängige DNA-Polymerase, wobei die Zielnukleinsäure als Matrize dient;3. Extension of the primers P1 and P2 by the catalyzed incorporation of Deoxyribonucleotides at the free 3'-OH end of the primers P1 and P2 to be extended by a heat-stable RNA-dependent or DNA-dependent DNA polymerase, the Target nucleic acid serves as a template;
4. die Primer-Verlängerungsprodukte ihrerseits nach Eingang in Schritt (1) wieder als Matrize zur Primer-Hybridisierung der Primer P1 und P2 dienen; und4. the primer extension products in turn after receipt in step (1) as Serve template for primer hybridization of primers P1 and P2; and
5. die Schritte (1) bis (4) beliebig häufig wiederholt werden können und so die Nukleinsäure mit den gewünschten Eigenschaften synthetisiert werden kann, wobei die Primer P1 und P2 insgesamt oder zumindest im 3'-Bereich eine Sequenz enthalten, die komplementär zu einer bestimmten Sequenz der Zielnukleinsäure ist und sequenzspezifisch an diese Zielsequenz hybridisieren kann und wobei die Primer P1 und P2 im 5'-Bereich eine Sequenz enthalten können, die nicht komplementär zur Zielnukleinsäure ist und nicht an der Zielnukleinsäure hybridisieren kann und zusätzliche Funktionen enthalten kann.5. steps (1) to (4) can be repeated any number of times and so can the nucleic acid can be synthesized with the desired properties, the primers P1 and P2 as a whole or at least in the 3 'region contain a sequence that is complementary to a specific sequence of the target nucleic acid and sequence-specific to it Target sequence can hybridize and where the primers P1 and P2 in the 5 'region May contain sequence that is not complementary to the target nucleic acid and not the target nucleic acid can hybridize and can contain additional functions.

Sequenzspezifisch gestartete Nukleinsäure-Synthesereaktionen sind des weiteren Bestandteil von auf in-vitro Transkription basierenden, isothermalen, exponentiellen Nukleinsäure- Amplifikationsverfahren wie z. B. NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), 3SR (Self-Sustained Sequence Replication), 2SR (Self-Sustained Sequence Replication ähnlich 3SR, jedoch ohne Verwendung von RNase H), TMA (Transcription-Mediated Amplification), und ähnlichen Verfahren. Bei diesen Methoden verwendet man sequenzspezifisch bindende Primer, RNA- und DNA-abhängige DNA-Polymerasen, RNA- Polymerasen und geeignete Reaktionsbedingungen, wobei die exponentiellen Nukleinsäure- Amplifikationsverfahren folgende Schritte umfassen:
Sequence-specifically started nucleic acid synthesis reactions are also part of isothermal, exponential nucleic acid amplification methods based on in vitro transcription, such as. B. NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), 3SR (Self-Sustained Sequence Replication), 2SR (Self-Sustained Sequence Replication similar to 3SR but without the use of RNase H), TMA (Transcription-Mediated Amplification), and similar methods. These methods use sequence-specific binding primers, RNA- and DNA-dependent DNA polymerases, RNA polymerases and suitable reaction conditions, the exponential nucleic acid amplification methods comprising the following steps:

1. Herstellung eines einzigen Reaktionsmediums, welches eine Zielnukleinsäure, einen ersten Primer P1, einen zweiten ZP, eine RNA-abhängige DNA Polymerase, eine DNA abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, Ribonukleotide und Desoxyribonukleotide enthält;1. Preparation of a single reaction medium which is a target nucleic acid, a first primer P1, a second ZP, an RNA-dependent DNA polymerase, a DNA dependent DNA polymerase, a DNA dependent RNA polymerase, ribonucleotides and Contains deoxyribonucleotides;
2. Einstellung von Reaktionsbedingungen, so daß Amplifikationszyklen aufrecht erhalten werden können, wobei2. Setting reaction conditions so that amplification cycles are maintained can be where
3. die Erststrang-DNA-Synthese komplementär zur Zielnukleinsäure durchgeführt wird durch die Hybridisierung eines Primers P1 an eine komplementäre Zielsequenz, gefolgt von einer Verlängerung des Primers P1 durch Desoxyribonukleotide unter Verwendung einer RNA- oder DNA-abhängigen DNA-Polymerase, wobei die Zielnukleinsäure entweder eine DNA oder eine RNA sein kann, und3. the first strand DNA synthesis is carried out complementarily to the target nucleic acid followed by hybridization of a primer P1 to a complementary target sequence from an extension of primer P1 by using deoxyribonucleotides an RNA or DNA-dependent DNA polymerase, the target nucleic acid can be either a DNA or an RNA, and
4. die Synthese der Zweitstrang-DNA komplementär zur Erststrang-DNA durchgeführt wird durch die enzymatische, thermische oder chemische Denaturierung oder Degradation der Zielnukleinsäure von der Erststrang-DNA und die Hybridisierung eines ZP an die komplementäre Erststrang-DNA gefolgt von einer Verlängerung des ZP durch Desoxyribonukleotide unter Verwendung einer RNA- oder DNA-abhängigen DNA- Polymerase, wobei die Primer P1 und ZP im 3'-Bereich eine Sequenz enthalten, die komplementär zur einer bestimmten Sequenz der Zielnukleinsäure ist und sequenzspezifisch an diese Zielsequenz hybridisieren kann und wobei mindestens einer der Primer P1 oder ZP oder beide Primer im 5'-Bereich eine Sequenz enthalten, die nicht komplementär zur Zielnukleinsäure ist und nicht an der Zielnukleinsäure hybridisieren kann und eine DNA-abhängige RNA-Polymerase Promotorsequenz enthält,4. the synthesis of the second strand DNA is carried out complementarily to the first strand DNA through the enzymatic, thermal or chemical denaturation or degradation of the Target nucleic acid from the first strand DNA and the hybridization of a ZP to the complementary first strand DNA followed by an extension of the ZP Deoxyribonucleotides using an RNA- or DNA-dependent DNA- Polymerase, wherein the primers P1 and ZP in the 3 'region contain a sequence which is complementary to a specific sequence of the target nucleic acid and can hybridize specifically to this target sequence and wherein at least one of the Primer P1 or ZP or both primers in the 5 'region contain a sequence that does not is complementary to the target nucleic acid and does not hybridize to the target nucleic acid can and contains a DNA-dependent RNA polymerase promoter sequence,
5. von dem aus eine in-vitro Transkription des in den Schritten (1) bis (4) synthetisierten DNA-Moleküls durch die Verwendung von DNA-abhängiger RNA-Polymerase und Ribonukleotiden durchgeführt werden kann, wobei die entstehenden in-vitro Transkripte wiederum als Matrize dienen und unter sequenzspezifischer Hybridisierung von Primer P1 und ZP erneut Eingang in DNA-Erst- und Zweitstrang-Synthese finden, gefolgt von in vitro Transkription. Auf diese Weise wird eine exponentielle Amplifikation der Nukleinsäure erreicht.5. from which an in vitro transcription of that synthesized in steps (1) to (4) DNA molecule through the use of DNA-dependent RNA polymerase and Ribonucleotides can be carried out, with the resulting in vitro transcripts again serve as a template and with sequence-specific hybridization of primer P1 and ZP again find their way into DNA first and second strand synthesis, followed by in vitro transcription. In this way an exponential amplification of the Nucleic acid reached.

Sequenzspezifisch gestartete Nukleinsäure-Synthesereaktionen sind außerdem Bestandteil von auf in-vitro Transkription basierenden, linearen, isothermalen Nukleinsäure- Amplifikationsverfahren. Diese Methoden werden unter Verwendung sequenzspezifisch bindender Primer, von RNA- und DNA-abhängigen DNA-Polymerasen, und RNA- Polymerasen bei geeigneten Reaktionsbedingungen durchgeführt, wobei isothermale, lineare Nukleinsäure-Amplifikationen folgende Schritte umfassen:
Sequence-specifically started nucleic acid synthesis reactions are also part of linear, isothermal nucleic acid amplification methods based on in vitro transcription. These methods are carried out using sequence-specific binding primers, RNA- and DNA-dependent DNA polymerases, and RNA polymerases under suitable reaction conditions, with isothermal, linear nucleic acid amplifications comprising the following steps:

1. Herstellung eines einzigen Reaktionsmediums, welches eine Zielnukleinsäure, einen ersten Primer P1, einen zweiten ZP, eine RNA-abhängige DNA Polymerase, eine DNA abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, Ribonukleotide und Desoxyribonukleotide enthält,1. Preparation of a single reaction medium which is a target nucleic acid, a first primer P1, a second ZP, an RNA-dependent DNA polymerase, a DNA dependent DNA polymerase, a DNA dependent RNA polymerase, ribonucleotides and Contains deoxyribonucleotides,
2. Durchführung der Erststrang-DNA-Synthese komplementär zur Zielnukleinsäure durch die Hybridisierung eines Primers P1 an eine komplementäre Zielsequenz gefolgt von einer Verlängerung des Primers P1 durch Desoxyribonukleotide unter Verwendung einer RNA- oder DNA-abhängigen DNA-Polymerase, wobei die Zielnukleinsäure entweder eine DNA oder eine RNA sein kann;2. Carrying out the first-strand DNA synthesis complementary to the target nucleic acid hybridization of a primer P1 to a complementary target sequence followed by one Extension of the primer P1 by deoxyribonucleotides using an RNA or DNA-dependent DNA polymerase, wherein the target nucleic acid is either a DNA or can be an RNA;
3. die Synthese der Zweitstrang-DNA wird komplementär zur Erststrang-DNA durchgeführt durch die enzymatische, thermische oder chemische Wegnahme der Zielnukleinsäure von der Erststrang-DNA und die Hybridisierung eines ZP an die komplementäre DNA des Erststrangs. Die Nukleinsäure-Zweitstrang-Synthese beginnt durch die sequenzspezifische Hybridisierung eines zweiten ZP, eines Degradierungsprodukts der Zielnukleinsäure oder durch die Rückfaltung des Nukleinsäure-Erststrangs an die zu diesem komplementäre Sequenz des Nukleinsäure-Erststrangs der Zielnukleinsäure. Darauf folgt eine Verlängerung des ZP durch Desoxyribonukleotide unter Verwendung einer RNA- oder DNA-abhängigen DNA-Polymerase, wobei die Primer P1 und ZP im 3'-Bereich eine Sequenz enthalten, die komplementär zu einer bestimmten Sequenz der Zielnukleinsäure ist und sequenzspezifisch an diese Zielsequenz hybridisieren kann und wobei mindestens einer der Primer P1 oder ZP oder die Primer P1 und ZP im 5'-Bereich eine Sequenz enthalten, die nicht komplementär zur Zielnukleinsäure ist und nicht an der Zielnukleinsäure hybridisieren kann, und eine DNA-abhängige RNA-Polymerase eine Promotorsequenz enthält, von der aus eine in-vitro Transkription des in den Schritten (1) bis (3) synthetisierten DNA-Moleküls durch die Verwendung von DNA-abhängiger RNA- Polymerase und Ribonukleotiden durchgeführt werden kann. Auf diese Weise wird eine lineare Amplifikation der Nukleinsäure erreicht.3. The synthesis of the second strand DNA is carried out complementarily to the first strand DNA by enzymatic, thermal or chemical removal of the target nucleic acid from the first strand DNA and the hybridization of a ZP to the complementary DNA of the First strand. Second strand nucleic acid synthesis begins with sequence specific Hybridization of a second ZP, a degradation product of the target nucleic acid or by refolding the nucleic acid first strand to the complementary one Sequence of the nucleic acid first strand of the target nucleic acid. This is followed by one Extension of the ZP by deoxyribonucleotides using an RNA or DNA-dependent DNA polymerase, the primers P1 and ZP in the 3 'range Contain sequence that are complementary to a specific sequence of the target nucleic acid is and can hybridize specifically to this target sequence and at least one of the primers P1 or ZP or the primers P1 and ZP in the 5 'region has a sequence contain, which is not complementary to the target nucleic acid and not on the Target nucleic acid can hybridize, and a DNA-dependent RNA polymerase Contains promoter sequence from which an in vitro transcription of the in steps (1) to (3) synthesized DNA molecule through the use of DNA-dependent RNA Polymerase and ribonucleotides can be carried out. In this way, one linear amplification of the nucleic acid achieved.

Bisher sind nur wenige Regeln zum Aufbau des hybridisierenden Anteils von Primern bekannt, die für sequenzspezifisch gestartete Nukleinsäure-Synthesereaktion unter Verwendung von Enzymen, z. B. DNA-Polymerasen, oder zum Zwecke von enzymatischen Reaktionen, die sequenzspezifisch gestartete Nukleinsäure-Synthesereaktionen unter Verwendung von Enzymen, z. B. DNA-Polymerasen, als Schlüsselreaktion enthalten, eingesetzt werden. Bisher aufgestellte Primerregeln besagen, daß
So far, only a few rules for the construction of the hybridizing portion of primers are known, which are used for sequence-specific nucleic acid synthesis reactions using enzymes, e.g. B. DNA polymerases, or for the purpose of enzymatic reactions, the sequence-specifically started nucleic acid synthesis reactions using enzymes, for. B. DNA polymerases, used as a key reaction. Previously established primer rules state that

1. der hybridisierende Sequenzanteil der Primer einen GC-Gehalt von 40-60% aufweisen sollte;1. the hybridizing sequence portion of the primers have a GC content of 40-60% should;
2. der hybridisierende Sequenzanteil der Primer eine Länge von 20-25 Nukleotiden (nt) aufweisen sollte;2. the hybridizing sequence portion of the primers has a length of 20-25 nucleotides (nt) should have;
3. Primer keine intramolekularen Sekundärstrukturen aufweisen sollten;3. Primers should not have any intramolecular secondary structures;
4. intermolekulare Dimerisierung von Primern vermieden werden sollte; und4. intermolecular dimerization of primers should be avoided; and
5. Primer einstückig sein und keine Abbruchprodukte enthalten sollten.5. The primer should be in one piece and should not contain any demolition products.

Zusätzlich zu den vorstehend genannten Punkten (1) bis (5) gilt für Primer, die bei der Polymerase Chain Reaction (PCR) eingesetzt werden, daß
In addition to the above-mentioned points (1) to (5) applies to primers which are used in the polymerase chain reaction (PCR) that

1. falls der Primer eine überwiegend GC-reiche Sequenz enthalten sollte, eine AT-reiche Sequenz an sein 5'-Ende angehängt werden sollte, und, falls umgekehrt, der Primer eine überwiegend AT-reiche Sequenz enthalten sollte, an sein 5'-Ende eine GC-reiche Sequenz angehängt werden sollte.1. If the primer should contain a predominantly GC-rich sequence, an AT-rich one Sequence should be appended to its 5 'end, and, conversely, the primer one should contain predominantly AT-rich sequence, at its 5 'end a GC-rich sequence should be appended.

Zusätzlich zu den vorstehend genannten Punkten (1) bis (5) gilt für den hybridisierenden Anteil von Primern für die NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), daß
In addition to items (1) to (5) above, the following applies to the hybridizing portion of primers for NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification)

1. (6*) die Base am 3'-Ende ein Adenin sein sollte und1. (6 *) the base at the 3 'end should be an adenine and
2. die ersten 10 bis 12 Basen, die dem T7 RNA-Polymerase-Promotor folgen, keine Sequenzfolgen enthalten sollen, die aus mehr als zwei direkt aufeinanderfolgenden Pyrimidinen bestehen.2. The first 10 to 12 bases that follow the T7 RNA polymerase promoter, none Sequences of sequences should consist of more than two directly consecutive Pyrimidines exist.

Die vorgenannten Aussagen gelten sowohl für primäre Primer P1 als auch für ZP.The above statements apply to both primary primer P1 and ZP.

Ein Nachteil von sequenzspezifisch gestarteten Nukleinsäure-Synthesereaktionen, welche DNA-Polymerasen oder enzymatischen Reaktionen verwenden, die sequenzspezifisch gestartete Nukleinsäure-Synthesereaktionen unter Verwendung von Enzymen, wie z. B. DNA- Polymerasen, als Schlüsselreaktion enthalten, ist die Primer-abhängige Spezifität, die Primer abhängige Sensitivität, und der Primer-abhängige Anteil an Sekundär- und Hintergrundsignalen. So kann z. B. beobachtet werden, daß bei einigen isothermalen Nukleinsäure-Amplifikations-Reaktionen der Anteil an Sekundärprodukten deutlich überwiegt bis hin zum totalen Verlust des spezifischen Signals. In den meisten Fällen hängt bei optimierten Reaktionsbedingungen eine niedrige Sensitivität von einer nicht effizienten oder unspezifischen Primer-Hybridisierung an die Zielsequenz ab. Reduzierte Sequenzspezifität der Primer-Hybridisierung erhöht die Bildung von amplifizierbaren unspezifischen Produkten, die wiederum die Amplifikation der spezifischen Zielsequenz reduziert oder ganz verhindert (kompetetive Reaktion). Aufgrund des isothermalen Charakters einer Primer-abhängigen Nukleinsäure-Synthese kann die Spezifität und Effizienz der Primer- Hybridisierung praktisch nicht durch Temperaturänderung beeinflußt werden. Aus diesem Grund ist eine Selektion für bestimmte Primer-Sequenzen zum Zwecke von sequenzspezifisch gestarteten Primer-abhängigen Nukleinsäure-Synthesereaktion unter Verwendung von Enzymen, wie beispielsweise DNA-Polymerasen, oder zum Zwecke von enzymatischen Reaktion, die sequenzspezifisch gestartete Primer-abhängige Nukleinsäure- Synthesereaktionen unter Verwendung von Enzymen, z. B. DNA-Polymerasen, als Schlüsselreaktion enthalten, essentiell für sensitive und spezifische Reaktionen.A disadvantage of sequence-specific nucleic acid synthesis reactions which Use DNA polymerases or enzymatic reactions that are sequence specific started nucleic acid synthesis reactions using enzymes, such as. B. DNA Polymerases, as a key reaction, is the primer-dependent specificity, the primer dependent sensitivity, and the primer-dependent share of secondary and Background signals. So z. B. can be observed that in some isothermal Nucleic acid amplification reactions clearly indicate the proportion of secondary products predominates up to the total loss of the specific signal. Hangs in most cases with optimized reaction conditions a low sensitivity of an inefficient one or unspecific primer hybridization to the target sequence. Reduced Sequence specificity of primer hybridization increases the formation of amplifiable ones non-specific products, which in turn amplify the specific target sequence reduced or completely prevented (competitive reaction). Due to the isothermal nature of a primer-dependent nucleic acid synthesis, the specificity and efficiency of the primer Hybridization are practically not affected by temperature changes. For this The reason is a selection for certain primer sequences for the purpose of sequence-specific started using a primer-dependent nucleic acid synthesis reaction Enzymes, such as DNA polymerases, or for the purpose of enzymatic Reaction involving sequence-specific primer-dependent nucleic acid Synthesis reactions using enzymes, e.g. B. DNA polymerases as Key reaction included, essential for sensitive and specific reactions.

Aus der US-A-5 409 818 ist ein Verfahren zur Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäuresequenz bekannt. Das Verfahren umfaßt die Synthese einzelsträngiger RNA, einzelsträngiger DNA und doppelsträngiger DNA. Die einzelsträngige RNA dient als Matritze für einen ersten Primer, die einzelsträngige DNA ist eine zweite Matritze für einen zweiten Primer und die doppelsträngige DNA ist eine dritte Matritze für die Synthese einer Vielzahl von Kopien der ersten Matritze. Eine Sequenz des ersten oder zweiten Primers ist komplementär zu einer Sequenz der spezifischen Nukleinsäure und eine Sequenz des ersten oder zweiten Primers ist homolog zu einer Sequenz der spezifischen Nukleinsäure. Das in der US-A 5 409 818 beschriebene Amplifikationsverfahren kann dazu verwendet werden, um die Menge der spezifischen Nukleinsäuresequenz zu vermehren um dadurch den Nachweis der spezifischen Nukleinsäuresequenz zu ermöglichen, oder als Alternative zu herkömmlichen Klonierungsmethoden, um die Reinheit der spezifischen Nukleinsäuresequenz zu erhöhen.From US-A-5 409 818 is a method for the amplification of a specific Nucleic acid sequence known. The method involves the synthesis of single-stranded RNA, single-stranded DNA and double-stranded DNA. The single-stranded RNA serves as Template for a first primer, the single-stranded DNA is a second template for one second primer and the double-stranded DNA is a third template for the synthesis of a Variety of copies of the first die. Is a sequence of the first or second primer complementary to a sequence of the specific nucleic acid and a sequence of the first or second primer is homologous to a sequence of the specific nucleic acid. That in the US-A 5 409 818 amplification method described can be used to the To increase the amount of the specific nucleic acid sequence to thereby detect the to enable specific nucleic acid sequence, or as an alternative to conventional Cloning methods to increase the purity of the specific nucleic acid sequence.

Ein ähnliches Verfahren beschreibt auch die US-A-5 554 517. A similar process is also described in US-A-5 554 517.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Primer anzugeben, deren hybridisierender Anteil derart aufgebaut ist, daß er mit sehr großer Spezifität und Effizienz an die Zielnukleinsäure bindet sowie die Verwendung derartiger Primer in sequenzspezifisch gestarteten, Primer-abhängigen Nukleinsäure-Synthesereaktionen und Nukleinsäure- Amplifikationsverfahren, insbesondere isothermale Amplifikationsverfahren.The present invention has for its object to provide new primers whose hybridizing portion is constructed such that it with very great specificity and efficiency binds the target nucleic acid and the use of such primers in sequence-specific started, primer-dependent nucleic acid synthesis reactions and nucleic acid Amplification processes, in particular isothermal amplification processes.

Diese Aufgabe löst die Erfindung durch den im unabhängigen Patentanspruch 1 angegebenen Primer, das im unabhängigen Anspruch 9 beschriebene Primergemisch, das im unabhängigen Patentanspruch 10 angegebene Verfahren, die Verwendung gemäß der unabhängigen Patentansprüche 11 und 12 und des Kits gemäß des unabhängigen Patentanspruchs 17. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen, Aspekte und Details der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Beispielen und der Zeichnung angegeben.This object is achieved by the invention as specified in independent claim 1 Primer, the primer mixture described in independent claim 9, which in independent Claim 10 specified method, the use according to the independent Claims 11 and 12 and the kit according to independent claim 17. Further advantageous refinements, aspects and details of the invention are in the dependent claims, the description, the examples and the drawing.

Die vorliegende Erfindung hat Primer zum Gegenstand, die insbesondere bei isothermalen, Primer-abhängigen Nukleinsäure-Syntheseprozessen oder isothermalen Nukleinsäure- Amplifikationsverfahren einsetzbar sind.The present invention relates to primers which are particularly useful in isothermal, Primer-dependent nucleic acid synthesis processes or isothermal nucleic acid Amplification methods can be used.

Die erfindungsgemäßen Primer zeichnen sich dadurch aus, daß der Anteil an Basen, die zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, in den letzten sechs Basen vor dem 3'-Ende im hybridisierenden Teil des Primers mindestens 50% ausmacht und der Anteil an Basen, die drei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, im letzten Viertel vor dem 5'-Ende im hybridisierenden Teil des Primers mindestens 60% ausmacht.The primers according to the invention are characterized in that the proportion of bases, the two Form hydrogen bonds to the corresponding bases in the target molecule can, in the last six bases before the 3 'end in the hybridizing part of the primer accounts for at least 50% and the proportion of bases that have three hydrogen bonds can form the corresponding bases in the target molecule in the last quarter before 5'-end makes up at least 60% in the hybridizing part of the primer.

Dabei umfaßt der hybridisierende Teil der erfindungsgemäßen Primer 12 bis 40 Basen, vorzugsweise 15 bis 30 Basen, insbesondere 15 bis 20 Basen; ganz besonders bevorzugt sind Primer, bei denen der hybridisierende Teil aus 20 Basen aufgebaut ist.The hybridizing part of the primers according to the invention comprises 12 to 40 bases, preferably 15 to 30 bases, in particular 15 to 20 bases; are particularly preferred Primers in which the hybridizing part is composed of 20 bases.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Primer angegeben, die sich dadurch auszeichnen, daß der Anteil an Basen, die zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, unter den letzten sechs Basen vor dem 3'-Ende im hybridisierenden Teil mindestens 50% ausmacht und der Anteil an Basen, die drei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, im letzten Viertel vor dem 5'-Ende im hybridisierenden Teil mindestens 70% ausmacht.In a preferred embodiment of the invention, primers are specified that are characterized in that the proportion of bases that have two hydrogen bonds to the can form corresponding bases in the target molecule, under the last six bases before the 3 'end in the hybridizing part is at least 50% and the proportion of bases, the three hydrogen bonds to the corresponding bases in the target molecule can train, in the last quarter before the 5 'end in the hybridizing part at least 70% matters.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Primer angegeben, die sich dadurch auszeichnen, daß der Anteil an Basen, die zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, unter den letzten sechs Basen vor dem 3'-Ende im hybridisierenden Teil mindestens 50% ausmacht und daß der Anteil an Basen, die drei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, im letzten Viertel vor dem 5'- Ende des hybridisierenden Teils des Primers mindestens 80% ausmacht.In a particularly preferred embodiment of the invention, primers are specified which are characterized in that the proportion of bases, the two Form hydrogen bonds to the corresponding bases in the target molecule can, at least among the last six bases before the 3 'end in the hybridizing part Accounts for 50% and that the proportion of bases, the three hydrogen bonds to the can form corresponding bases in the target molecule, in the last quarter before the 5'- End of the hybridizing part of the primer makes up at least 80%.

Vorzugsweise zeichnen sich die erfindungsgemäßen Primer dadurch aus, daß der Anteil an Basen, die zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, unter den letzten fünf Basen vor dem 3'-Ende im hybridisierenden Teil mindestens 60% ausmacht, und daß der Anteil an Basen, die drei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, im letzten Viertel vor dem 5'-Ende des hybridisierenden Teils des Primers mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70% und insbesondere mindestens 80% ausmacht.The primers according to the invention are preferably distinguished in that the proportion of Bases that have two hydrogen bonds to the corresponding bases in the Can form target molecule, under the last five bases before the 3 'end in hybridizing part makes up at least 60%, and that the proportion of bases, the three Form hydrogen bonds to the corresponding bases in the target molecule can, in the last quarter before the 5 'end of the hybridizing part of the primer accounts for at least 60%, preferably at least 70% and in particular at least 80%.

Daneben betrifft die vorliegende Erfindung weitere bevorzugte Primer, die sich dadurch auszeichnen, daß der Anteil an Basen, die zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, unter den letzten fünf Basen vor dem 3'-Ende im hybridisierenden Teil mindestens 80% ausmacht, und daß der Anteil an Basen, die drei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, im letzten Viertel vor dem 5'-Ende des hybridisierenden Teils des Primers mindestens 60%, vorzugsweise 70% und insbesondere mindestens 80% ausmacht.In addition, the present invention relates to further preferred primers, which are characterized by distinguish that the proportion of bases that have two hydrogen bonds to the can form corresponding bases in the target molecule, under the last five bases before accounts for at least 80% of the 3 'end in the hybridizing part, and that the proportion of Bases, the three hydrogen bonds to the corresponding bases in the Can form target molecule in the last quarter before the 5 'end of the hybridizing part of the primer at least 60%, preferably 70% and in particular at least 80% matters.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Primer, die sich dadurch auszeichnen, daß der Anteil an Basen, die zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, unter den letzten vier Basen vor dem 3'-Ende des hybridisierenden Teils mindestens 75% ausmacht, und daß der Anteil an Basen, die drei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespodierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, im letzten Viertel vor dem 5'- Ende des hybridisierenden Teils des Primers mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70% und insbesondere mindestens 80% ausmacht.In a very particularly preferred embodiment, the present invention relates Primers, which are characterized in that the proportion of bases, the two Form hydrogen bonds to the corresponding bases in the target molecule can, at least among the last four bases before the 3 'end of the hybridizing part Makes up 75%, and that the proportion of bases that three hydrogen bonds to the can form corresponding bases in the target molecule in the last quarter before the 5'- End of the hybridizing part of the primer at least 60%, preferably at least 70% and in particular makes up at least 80%.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere die zuvor beschriebenen Primer, die sich dadurch auszeichnen, daß der Anteil an Basen, die zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können unter den letzten fünf Basen vor dem 3'-Ende im hybridisierenden Teil mindestens 80% ausmacht und daß der Anteil an Basen, die drei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, im letzten Viertel vor dem 5'- Ende im hybridisierenden Teil mindestens 70% ausmacht.Furthermore, the present invention relates in particular to the primers described above, which are characterized in that the proportion of bases, the two Form hydrogen bonds to the corresponding bases in the target molecule can at least under the last five bases before the 3 'end in the hybridizing part 80% and that the proportion of bases, the three hydrogen bonds to the can form corresponding bases in the target molecule, in the last quarter before the 5'- End at least 70% in the hybridizing part.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Primer, die dadurch ausgezeichnet sind, daß der Anteil an Basen, die zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, unter den letzten vier Basen vor dem 3'-Ende im hybridisierenden Teil mindestens 75%, besser 100%, ausmacht und daß der Anteil an Basen, die drei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, im letzten Viertel vor dem 5'-Ende im hybridisierenden Teil mindestens 80%, besser 100%, ausmacht.In a particularly preferred embodiment, the present invention relates to primers which are characterized in that the proportion of bases, the two Form hydrogen bonds to the corresponding bases in the target molecule can, at least among the last four bases before the 3 'end in the hybridizing part 75%, better 100%, and that the proportion of bases, the three Form hydrogen bonds to the corresponding bases in the target molecule can, in the last quarter before the 5 'end in the hybridizing part at least 80%, better 100%.

Vorzugsweise handelt es sich bei den Basen, die zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen in einem Zielmolekül ausbilden können, um Adenin und/oder Thymin.The bases are preferably the two hydrogen bonds to the corresponding bases in a target molecule to form adenine and / or Thymine.

Die Basen, die drei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen in einem Zielmolekül ausbilden können, sind vorzugsweise Guanin und/oder Cytosin.The bases, the three hydrogen bonds to the corresponding bases in one Guanine and / or cytosine are preferably able to form the target molecule.

Daneben betrifft die Erfindung ein Gemisch aus den erfindungsgemäßen Primern, ein Verfahren zur Herstellung der Primer, und die Verwendung der Primer für Primer-abhängige Nukleinsäure-Syntheseprozesse oder für Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, insbesondere isothermale Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren.In addition, the invention relates to a mixture of the primers according to the invention Process for the preparation of the primers, and the use of the primers for primer-dependent Nucleic acid synthesis processes or for nucleic acid amplification processes, in particular isothermal nucleic acid amplification method.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch noch einen Kit für die Durchführung von Primer-abhängigen Nukleinsäure-Syntheseprozessen oder Nukleinsäure- Amplifikationsverfahren, insbesondere isothermale Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, wobei der Kit die vorstehend beschriebenen Primer in einem geeigneten Behälter enthält. Daneben kann der Kit noch geeignete Puffersysteme, Enzyme, Nukleotide etc. enthalten.Finally, the present invention also relates to a kit for carrying out Primer-dependent nucleic acid synthesis processes or nucleic acid Amplification methods, in particular isothermal nucleic acid amplification methods, the kit containing the primers described above in a suitable container. The kit can also contain suitable buffer systems, enzymes, nucleotides etc.

Die erfindungsgemäßen Primer können mit herkömmlichen Nukleinsäure-Syntheseverfahren hergestellt und anschließend aus dem Syntheseansatz isoliert werden. Beschrieben sind diese herkömmlichen Verfahren beispielsweise in dem Buch von de la Vega und Guamos, Synthetic oligonucleotides, preparation, analysis and applications, Springer, Berlin 1996.The primers according to the invention can be prepared using conventional nucleic acid synthesis methods prepared and then isolated from the synthesis. These are described conventional processes, for example in the book by de la Vega and Guamos, Synthetic oligonucleotides, preparation, analysis and applications, Springer, Berlin 1996.

Intramolekulare Hybridisierung des Primers oder intermolekulare Hybridisierung zwischen verschiedenen Primern tritt nicht auf.Intramolecular hybridization of the primer or intermolecular hybridization between different primers does not occur.

Nachteilig an isothermalen, Primer-abhängigen Nukleinsäure-Syntheseprozessen und isothermalen Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren ist die von den Primern einer bestimmten Zielsequenz abhängige, starke Variabilität in Bezug auf Sensitivität, Spezifität und Menge an Hintergrund- und Sekundärprodukten. Der Anteil an unerwünschten Sekundärprodukten manifestiert sich häufig schon in Ansätzen, die keine Matritzen-Nukleinsäure enthalten, sondern nur das Reaktionsgemisch inklusive Primer (sog. Negativkontrolle).Disadvantages of isothermal, primer-dependent nucleic acid synthesis processes and Isothermal nucleic acid amplification method is that of the primers of a particular one Target sequence dependent, strong variability in terms of sensitivity, specificity and amount of Background and secondary products. The proportion of unwanted secondary products often manifests itself in approaches that do not contain matrix nucleic acid, but only the reaction mixture including primer (so-called negative control).

Bei isothermalen, Primer-abhängigen Nukleinsäure-Syntheseprozessen und isothermalen Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren kann eine schlechte Hybridisierungsspezifität oder Hybridisierungseffizienz von Primern wegen der limitierten Hitzestabilität der beteiligten Enzyme nicht durch eine Veränderung (Erhöhung) der Primer-Hybridisierungstemperatur verbessert werden. Es muß daher bei diesen Verfahren ein besonderes Augenmerk auf die verwendeten Primer gelegt werden. Hier setzt die vorliegende Erfindung an. Die erfindungsgemäßen Primer weisen eine hohe Sensitivität und Spezifität im Hinblick auf die Primer-Bindung an eine bestimmte Zielsequenz auf. Darüberhinaus ist die Produktion unerwünschter Hintergrund- und Sekundärprodukte gegenüber bekannten Primern deutlich erniedrigt.For isothermal, primer-dependent nucleic acid synthesis processes and isothermal Nucleic acid amplification methods can have poor hybridization specificity or Hybridization efficiency of primers due to the limited heat stability of those involved Enzymes do not change (increase) the primer hybridization temperature be improved. Therefore, special attention must be paid to these processes used primer. This is where the present invention comes in. The Primers according to the invention have a high sensitivity and specificity with regard to the Primer binding to a specific target sequence. Furthermore, the production undesirable background and secondary products compared to known primers degraded.

Die Primer-Sequenz beeinflußt Spezifität und Effizienz der Primer-Hybridisierung mit der Zielnukleinsäure. Dies wiederum beeinflußt die Spezifität der sequenzspezifisch gestarteten Primer-abhängigen Nukleinsäure-Synthesereaktion unter Verwendung von Enzymen, wie z. B. DNA-Polymerasen, oder von enzymatischen Reaktionen, die sequenzspezifisch gestartete Primer-abhängige Nukleinsäure-Synthesereaktionen unter Verwendung von Enzymen, wie z. B. DNA-Polymerasen, als Schlüsselreaktion enthalten. Eine Erhöhung der Schmelztemperatur (Tm) zwischen Zielnukleinsäure und Primer durch die Erhöhung des GC- Gehaltes bzw. Verringerung des AT-Gehaltes der Primer-Sequenz führt zu einer Erhöhung der Primer-Hybridisierungseffizienz und zu einer Verringerung der Primer- Hybridisierungsspezifität. Eine Verringerung des GC-Gehaltes bzw. eine Erhöhung des AT- Gehaltes der Primer-Sequenz führt dagegen zu geringerer Hybridisierungseffizienz, aber höherer Hybridisierungsspezifität zwischen Primer und Zielnukleinsäure.The primer sequence affects the specificity and efficiency of the primer hybridization with the Target nucleic acid. This in turn influences the specificity of the sequence-specifically started Primer dependent nucleic acid synthesis reaction using enzymes such as. B. DNA polymerases, or of enzymatic reactions that started sequence-specifically Primer dependent nucleic acid synthesis reactions using enzymes such as e.g. B. DNA polymerases, as a key reaction. An increase in Melting temperature (Tm) between target nucleic acid and primer by increasing the GC Content or decrease in the AT content of the primer sequence leads to an increase primer hybridization efficiency and a reduction in primer Hybridization specificity. A reduction in the GC content or an increase in the AT However, the content of the primer sequence leads to lower hybridization efficiency, however higher hybridization specificity between primer and target nucleic acid.

Die Primer-abhängige Nukleinsäure-Synthese durch Enzyme, wie beispielsweise RNA- oder DNA-abhängige DNA-Polymerasen, ist eine Schlüsselreaktion bei vielen DNA- Synthesereaktionen, wie z. B. cDNA-Synthese, PCR, RT/PCR und DNA-Sequenzierung, sowie isothermalen Amplifikationsreaktionen, wie z. B. NASBA, 3SR, TMA; SDA, LCR und anderen Methoden. Die Effizienz der Primer-abhängigen DNA-Synthese hängt neben vielen anderen Bedingungen von der Effizienz und Spezifität der Primer-Hybridisierung ab. Die hier aufgeführte Erfindung betrifft verbesserte Primer, welche eine erhöhte Primer- Bindungseffizienz und -Spezifität aufweisen, zum Zwecke einer verbesserten Primer- abhängigen Nukleinsäure-Synthese oder einer Verbesserung von Reaktionen, die eine Primer- abhängige DNA-Synthese enthalten.The primer-dependent nucleic acid synthesis by enzymes, such as RNA or DNA-dependent DNA polymerases, is a key reaction in many DNA Synthesis reactions, such as. B. cDNA synthesis, PCR, RT / PCR and DNA sequencing, and isothermal amplification reactions, such as. B. NASBA, 3SR, TMA; SDA, LCR and other methods. The efficiency of primer-dependent DNA synthesis depends on many other conditions depend on the efficiency and specificity of the primer hybridization. This one The invention listed relates to improved primers which have an increased primer Have binding efficiency and specificity for the purpose of improved primer dependent nucleic acid synthesis or an improvement in reactions that require a primer dependent DNA synthesis included.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf den hybridisierenden Anteil der Sequenz des Primers P1 oder des ZP oder beider Primer P1 und ZP für sequenzspezifisch gestartete Primer-abhängige Nukleinsäure-Synthesereaktionen unter Verwendung von Enzymen für die Nukleinsäure-Polymerisation, wie beispielsweise DNA-Polymerasen, oder enzymatische Reaktionen, die sequenzspezifisch gestartete Primer-abhängige Nukleinsäure- Synthesereaktionen unter Verwendung von Nukleinsäure-Polymerasen, wie DNA- Polymerasen, als Schlüsselreaktion enthalten.The present invention relates in particular to the hybridizing portion of the Sequence of the primer P1 or the ZP or both primers P1 and ZP for sequence-specific started primer dependent nucleic acid synthesis reactions using Enzymes for nucleic acid polymerization, such as DNA polymerases, or enzymatic reactions, the sequence-specifically started primer-dependent nucleic acid Synthesis reactions using nucleic acid polymerases, such as DNA Polymerases, included as a key reaction.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichung und der Beispiele näher erläutert. Es zeigen:The invention is explained in more detail below with the aid of the drawing and the examples. It demonstrate:

Fig. 1 bis 5 Agarosegele, welche die Auftrennung von mit bekannten und erfindungsgemäßen Primern hergestellten Amplifikationsprodukten zeigen. Fig. 1 to 5 agarose gels showing the separation of manufactured with known and inventive primers amplification products.

Die erfindungsgemäßen Primer sind besonders wirksam, wenn sie weder mit sich selbst hybridisieren (intramolekulare Hybridisierung) noch bei Einsatz mehrerer Primer untereinander hybridisieren (intermolekulare Hybridisierung).The primers according to the invention are particularly effective if they are neither with themselves hybridize (intramolecular hybridization) even when using multiple primers hybridize with each other (intermolecular hybridization).

Wie bereits mehrfach erwähnt eignen sich die erfindungsgemäßen Primer insbesondere für den Einsatz bei isothermalen, Primer-abhängigen Nukleinsäure-Syntheseprozessen, wie DNA-Syntheseprozessen, sowie bei isothermalen Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren.As already mentioned several times, the primers according to the invention are particularly suitable for use in isothermal, primer-dependent nucleic acid synthesis processes, such as DNA synthesis processes and isothermal nucleic acid amplification processes.

Um die Überlegenheit der neuen, erfindungsgemäßen Primer gegenüber herkömmlichen Primern zu demonstrieren wurden diese unter ansonsten vergleichbaren Bedingungen in einem isothermalen Amplifikationsverfahren (NASBA, Nucleic Acid Sequence Based Amplification) getestet. Die Ergebnisse dieser Tests sind in den nachfolgenden Beispielen dargelegt sowie in den Fig. 1 bis 5 dargestellt.In order to demonstrate the superiority of the new primers according to the invention over conventional primers, they were tested under otherwise comparable conditions in an isothermal amplification method (NASBA, Nucleic Acid Sequence Based Amplification). The results of these tests are set out in the examples below and in FIGS. 1 to 5.

Es wurde eine Reihe von Primer-Paaren (Primer P1 und Primer P2) und Zielnukleinsäuren getestet, wobei hauptsächlich nur ein Primer, nämlich Primer P1, in seinem Primer Design vergleichend zwischen bekannten und erfindungsgemäßen Primer Design Regeln getestet wurde.There were a number of primer pairs (primer P1 and primer P2) and target nucleic acids tested, mainly only one primer, namely primer P1, in its primer design tested comparably between known and inventive primer design rules has been.

Der NASBA-Ansatz in den Beispielen wurde folgendermaßen durchgeführt. Die Reagentien (Puffer, Nukleotide, Salze) wurden zusammen mit Wasser, Primer P1, Primer P2 und RNA bei 65°C für 5 min inkubiert und dann für 5 min auf 41°C abgekühlt. Anschließend wurde ein Gemisch aus den Enyzmen T7-RNA-Polymerase, RNase H und Reverse Transkriptase hinzugegeben. Die Reaktion erfolgte dann für 90 min bei 41°C. Die entstandenen Reaktionsprodukte wurden anschließend auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt, wobei die Konzentration der Gele 1- bis 1,2%-ig war. Die Spezifität der Produkte wurde durch Standardverfahren verifiziert. Unter Standardverfahren sind insbesondere die Größenbestimmung der entstehenden Fragmente im Agarosegel sowie die Hybridisierung mit einer radioaktiven Sonde, Blotting-Verfahren und Hybridisierungsbedingungen nach Sambrook, J., Fritsch E. F., Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2^nd Edition; Cold Spring Harbour Laboratory; Cold Spring Harbour; NY, 1989; zu verstehen. Sowohl der Laufpuffer als auch der Gelpuffer waren 1x Tris-Borat-EDTA-Puffer (TBE- Puffer). Die angelegte Spannung betrug 4 V/cm, und die Elektrophoresen dauerten 30 bis 45 min. The NASBA approach in the examples was carried out as follows. The reagents (buffers, nucleotides, salts) were incubated together with water, primer P1, primer P2 and RNA at 65 ° C. for 5 min and then cooled to 41 ° C. for 5 min. A mixture of the enzymes T7 RNA polymerase, RNase H and reverse transcriptase was then added. The reaction then took place at 41 ° C. for 90 min. The reaction products formed were then electrophoresed on an agarose gel, the concentration of the gels being 1 to 1.2%. The specificity of the products was verified by standard procedures. Standard methods include, in particular, determining the size of the fragments formed in the agarose gel and hybridization with a radioactive probe, blotting method and hybridization conditions according to Sambrook, J., Fritsch EF, Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2 ^nd Edition; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor; NY, 1989; to understand. Both the running buffer and the gel buffer were 1x Tris borate EDTA buffer (TBE buffer). The applied voltage was 4 V / cm and the electrophoresis took 30 to 45 minutes.

Die zu vergleichenden bekannten und erfindungsgemäßen Primer wurden häufig aus derselben Primer-Bindungsregion hergestellt, wobei sich beide Primerbindestellen der Primer (bekannte und erfindungsgemäße Primer) in der Regel überlappten. Dabei zeigte sich, daß bei Verwendung der erfindungsgemäßen Primer im Vergleich zu herkömmlichen Primern der Anteil an Hintergrundsignal reduziert ist, das Signal/Rausch-Verhältnis und die Sensitivität erhöht sind und stärkere Signale beobachtet werden.The known and inventive primers to be compared were frequently made from the same primer binding region, with both primer binding sites of the primers (known and inventive primers) usually overlapped. It was found that at Use of the primers according to the invention in comparison to conventional primers The proportion of background signal is reduced, the signal / noise ratio and the sensitivity are increased and stronger signals are observed.

Beispiel 1example 1

Dieses Beispiel betrifft die NASBA-Amplifikation eines Amplikons aus der NF-kBmRNA. Verglichen wurden die vier Primer A, B, C und D (siehe Tabelle 1), wobei die Primer A und B herkömmlicher Art waren und die Primer C und D erfindungsgemäße Ausführungsformen darstellen.This example concerns the NASBA amplification of an amplicon from the NF-kBmRNA. The four primers A, B, C and D were compared (see Table 1), the primers A and B were of a conventional type and the primers C and D embodiments according to the invention represent.

Primer A hat AT-reiche 3'- und 5'-Enden und T als terminale Base am 3'-Ende.Primer A has AT-rich 3 'and 5' ends and T as the terminal base at the 3 'end.

Primer B hat ebenfalls AT-reiche 3'- und 5'-Enden, allerdings ein C als terminale Base am 3'- Ende.Primer B also has AT-rich 3 'and 5' ends, but a C as the terminal base at the 3'- The End.

Die beiden erfindungsgemäßen Primer C und D zeigen ein GC-reiches 5'-Ende und ein AT- reiches 3'-Ende. Primer C enthält ein A als terminale Base am 3'-Ende, während Primer D ein T als terminale 3'-Base aufweist.The two primers C and D according to the invention have a GC-rich 5 'end and an AT rich 3 'end. Primer C contains an A as the terminal base at the 3 'end, while primer D contains one T has as the terminal 3'-base.

Die genauen Primersequenzen sind in Tabelle 1 angegeben.The exact primer sequences are given in Table 1.

Fig. 1 zeigt Agarosegele, auf denen die Amplifikationsprodukte der mit den herkömmlichen und den erfindungsgemäßen Primern behandelten Ansätze aufgetrennt sind. Fig. 1 shows agarose gels on which the amplification products treated with the traditional and the inventive primers approaches are separated.

Die Spuren 1 bis 5 für die einzelnen Primer A bis D repräsentieren jeweils unterschiedliche Mengen an RNA, die zur NASBA-Reaktion eingestzt wurden. Spur 1 betrifft den Ansatz mit 330 ng, Spur 2 den mit 20 ng, Spur 3 den mit 1,3 ng, Spur 4 den mit 0,08 ng und Spur 5 den mit 0 ng. M bezeichnet die Größenmarkerspur.Lanes 1 to 5 for the individual primers A to D each represent different ones Amounts of RNA used for the NASBA reaction. Track 1 affects the approach with 330 ng, lane 2 with 20 ng, lane 3 with 1.3 ng, lane 4 with 0.08 ng and lane 5 with with 0 ng. M denotes the size marker track.

Das gewünschte (spezifische) Produkt ist in Fig. 1 mit einem Pfeil markiert. Man erkennt deutlich, daß mit den Primern A und B neben den spezifischen in erheblichem Ausmaß unspezifische Amplifikationsprodukte gebildet wurden, während mit den erfindungsgemäßen Primern C und D die Ausbeute an spezifischen Produkten deutlich höher war und die Bildung unerwünschter Nebenprodukte weitestgehend unterblieb. Somit ist mit den erfindungsgemäßen Primern sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität im Vergleich zu herkömmlichen Primern signifikant verbessert.The desired (specific) product is marked with an arrow in FIG. 1. It can clearly be seen that, with the primers A and B, in addition to the specific, non-specific amplification products were formed to a considerable extent, while with the primers C and D according to the invention, the yield of specific products was significantly higher and the formation of undesired by-products was largely avoided. Thus, with the primers according to the invention, both the sensitivity and the specificity are significantly improved in comparison to conventional primers.

TABELLE 1 TABLE 1

VergleichsbeispielComparative example

Auch dieses Beispiel betrifft die NASBA-Amplifikation eines Amplikons aus der NF-kB- mRNA. Verglichen wurden ausschließlich Primer, die nicht nach den erfindungsgemäßen Vorgaben zusammengestellt wurden.This example also relates to the NASBA amplification of an amplicon from the NF-kB mRNA. Only primers that were not compared to those according to the invention were compared Specifications were put together.

Die Primer A, B, C und D (siehe Tabelle 2) weisen in Umkehrung der Merkmale der neuen, erfindungsgemäßen Primer anstelle eines AT-reichen 3'-Endes und eines GC-reichen 5'- Endes ein GC-reiches 3'-Endes und ein AT-reiches 5'-Ende auf. Primer E und F dagegen zeigen zwar ein AT-reiches 3'-Ende, aber auch ein AT-reiches 5'-Ende. Die Primer A und B zeigen ein G als 3'-terminale Base, die Primer C, D und E weisen ein A als 3'-terminale Base auf und Primer F trägt ein C als 3'-terminale Base. Der GC-Gehalt des hybridisierenden Teils aller Primer ist größer oder gleich 50%.The primers A, B, C and D (see Table 2) reverse the characteristics of the new, primers according to the invention instead of an AT-rich 3 'end and a GC-rich 5'- End a GC-rich 3 'end and an AT-rich 5' end. Primers E and F against it show an AT-rich 3 'end, but also an AT-rich 5' end. The primers A and B show a G as a 3'-terminal base, the primers C, D and E have an A as a 3'-terminal base and primer F carries a C as the 3'-terminal base. The GC content of the hybridizing part all primers are greater than or equal to 50%.

Die genauen Primersequenzen sind in Tabelle 2 gezeigt.The exact primer sequences are shown in Table 2.

In den Spuren 1 bis 5 des in Fig. 2 gezeigten Agarosegels sind unterschiedliche Mengen an Gesamt-RNA (1 = 330 ng; 2 = 20 ng; 3 = 1,3 ng; 4 = 0,08 ng und 5 = 0 ng) zur NASBA- Reaktion eingesetzt worden. M ist die Größenmarkerspur. Die spezifische Produktgröße ist mit einem Pfeil markiert.Lanes 1 to 5 of the agarose gel shown in FIG. 2 contain different amounts of total RNA (1 = 330 ng; 2 = 20 ng; 3 = 1.3 ng; 4 = 0.08 ng and 5 = 0 ng) used for the NASBA reaction. M is the size marker track. The specific product size is marked with an arrow.

Man erkennt deutlich, daß mit bisher verwendeten Primern oder bei Umkehrung der erfindungsgemäß angegebenen Primer Design Regel Sensitivität und Spezifität signifikant herabgesetzt sind. One can clearly see that with previously used primers or with reversal of the Primer design rule according to the invention sensitivity and specificity significant are reduced.

TABELLE 2 TABLE 2

Beispiel 2Example 2

Dieses Beispiel betrifft die NASBA-Amplifikation eines Amplikons aus der IL1 alpha- mRNA. Verglichen wurden, wie in Fig. 3 gezeigt, Amplifikationsprodukte, die mit herkömmlichen Primern hergestellt wurden (die unter Ziffer 1 angegebenen Spuren) mit entsprechenden Produkten, bei deren Herstellung auf die neuen, erfindungsgemäßen Primer zurückgegriffen wurde (Spuren, die unter den Ziffern 2 und 3 zu sehen sind). Die unter Ziffer 4 angegebenen Spuren sind Negativkontrollen; M ist die Größenmarkerspur.This example concerns the NASBA amplification of an amplicon from the IL1 alphamRNA. As shown in FIG. 3, amplification products which were produced using conventional primers (the traces specified under number 1) were compared with corresponding products which were produced using the new primers according to the invention (traces specified under numbers 2 and 3 can be seen). The traces specified in section 4 are negative controls; M is the size marker track.

Tabelle 3 gibt die genauen Primersequenzen wieder.Table 3 shows the exact primer sequences.

Die spezifische Produktgröße ist in dem in Fig. 3 gezeigten Agarosegel mit einem Pfeil markiert. Man erkennt deutlich, daß mit herkömmlichen Primern neben spezifischen Produkten in erheblichem Ausmaß auch unerwünschte, unspezifische Amplifikationsprodukte gebildet werden. Nur beim Einsatz von erfindungsgemäßen Primern findet man praktisch ohne störenden Hintergrund das spezifische, gewünschte Amplifikationsprodukt.The specific product size is marked with an arrow in the agarose gel shown in FIG. 3. It can clearly be seen that conventional primers, in addition to specific products, also form undesirable, non-specific amplification products to a considerable extent. Only when primers according to the invention are used can the specific, desired amplification product be found practically without a disturbing background.

TABELLE 3 TABLE 3

Beispiel 3Example 3

In diesem Beispiel wird die NASBA-Amplifikation eines Amplikons aus der IL10-mRNA beschrieben. Bei dem in Fig. 4 gezeigten Agarosegel sind die mit herkömmlichen Primern erhaltenen Amplifikationsprodukte auf den Spuren 1 und 2 gezeigt, während die mit dem neuen, erfindungsgemäßen Primer gewonnenen Produkte auf die unter Ziffer 3 dargestellten Spuren aufgetragen wurden. Die Spuren unter Ziffer 4 sind Negativkontrollen, und M ist wieder die Größenmarkerspur. Die spezifische Produktgröße ist in Fig. 4 mit einem Pfeil markiert.This example describes the NASBA amplification of an amplicon from the IL10 mRNA. In the agarose gel shown in FIG. 4, the amplification products obtained with conventional primers are shown on lanes 1 and 2, while the products obtained with the new primer according to the invention were applied to the lanes shown under number 3. The tracks under number 4 are negative controls and M is again the size marker track. The specific product size is marked with an arrow in FIG. 4.

Die exakten Primersequenzen sind in Tabelle 4 angegeben.The exact primer sequences are given in Table 4.

Man kann deutlich erkennen, daß mit den herkömmlichen Primern praktisch nur unspezifische Amplifikationsprodukte gebildet wurden, während mit dem erfindungsgemäßen Primer größtenteils das spezifische Amplifikationsprodukt erhalten wird.One can clearly see that with the conventional primers practically only non-specific amplification products were formed while using the invention Primer for the most part the specific amplification product is obtained.

TABELLE 4 TABLE 4

Beispiel 4Example 4

In diesem Beispiel wird die NASBA-Amplifikation eines Amplikons aus der c-fos-mRNA gezeigt. Das Ergebnis ist in Fig. 5 dargestellt. Aufgetragen wurden dort mit herkömmlichen Primern gewonnene Amplifikationsprodukte (Spuren A1 und A2 sowie B1 und B2) mit den Produkten, bei denen die neuen, erfindungsgemäßen Primer (Spuren C1 und C2) eingesetzt wurden. Die drei Spuren N sind Negativkontrollen; M ist wieder die Größenmarkerspur. Die spezifische Produktgröße ist mit einem Pfeil markiert.This example shows the NASBA amplification of an amplicon from the c-fos mRNA. The result is shown in FIG. 5. Amplification products obtained with conventional primers (lanes A1 and A2 and B1 and B2) were applied there with the products in which the new primers according to the invention (lanes C1 and C2) were used. The three lanes N are negative controls; M is the size marker track again. The specific product size is marked with an arrow.

Die Sequenzen der in diesem Beispiel eingesetzten Primer sind in Tabelle 5 aufgeführt.The sequences of the primers used in this example are listed in Table 5.

Man erkennt deutlich, daß bei einem schwach exprimierten Gen mit herkömmlichen Primern nur unspezifische Amplifikationsprodukte gebildet werden. Nur mit erfindungsgemäßen Primern erhält man das spezifische Amplifikationsprodukt in erheblicher Ausbeute (siehe insbesondere Spur C2).One can clearly see that with a poorly expressed gene with conventional primers only non-specific amplification products are formed. Only with the invention The specific amplification product is obtained in primers in considerable yield (see especially track C2).

TABELLE 5 TABLE 5

Die Ergebnisse der vorstehenden Beispiele zusammenfassend kann festgestellt werden, daß eine Vielzahl von herkömmlichen und erfindungsgemäßen Primern auf ihre Fähigkeit hin untersucht wurde, spezifische Amplifikationsprodukte zu bilden bzw. die Bildung unerwünschter Nebenprodukte möglichst weitgehend zu unterdrücken. Dabei fiel auf, daß herkömmliche Primer in sehr viel größerem Ausmaß dazu neigen, unspezifische Nebenprodukte, unscharfe Banden oder falsch positive Ergebnisse, d. h. Produkte mit falscher Größe, zu bilden, während bei Verwendung von erfindungsgemäßen Primern praktisch immer eine erhebliche Ausbeute an spezifischem Amplifikationsprodukt erhalten werden konnte.Summarizing the results of the above examples, it can be said that a variety of conventional and inventive primers for their ability was investigated to form specific amplification products or the formation to suppress undesirable by-products as much as possible. It was noticed that conventional primers to a much greater extent tend to be non-specific By-products, fuzzy bands or false positive results, i. H. Products with wrong Size to form, while practically always when using primers according to the invention a significant yield of specific amplification product could be obtained.

Setzt man die Anzahl von Reaktionen B, die zu Hintergrund-Signalen führen, ins Verhältnis zu der Anzahl an Reaktionen O, die zu keinem Hintergrund-Signal führen, erhält man folgendes Ergebnis: Relating the number of reactions B that lead to background signals the number of reactions O that do not lead to a background signal is obtained the following result:

Verhältnis B/OB / O ratio

Herkömmliche PrimerConventional primers 1,251.25 Erfindungsgemäße PrimerPrimers according to the invention 0,860.86

Dies bedeutet, daß bei Verwendung herkömmlicher Primer mehr als 45% mehr Hintergrund- Signale und damit unspezifische Produkte auftreten als bei Einsatz der neuen, erfindungsgemäßen Primer. Die vorstehend angegebene Berechnung bezieht sich auf alle in der vorliegenden Anmeldung angegebenen Beispiele sowie auf weitere untersuchte, nicht näher aufgeführte Primer.This means that when using conventional primers, more than 45% more background Signals and thus unspecific products occur than when using the new, primer according to the invention. The above calculation applies to all in examples given in the present application and on other examined, not more detailed primers.

Die neuen, erfindungsgemäßen Primer ermöglichen somit eine höhere Ausbeute an spezifischem Produkt bei reduziertem Hintergrundsignal (reduzierte Menge an Hintergrund- und Sekundärprodukten). Dies geht zurück auf eine hohe Spezifität und Sensitivität der erfindungsgemäßen Primer in Bezug auf die verwendeten Matrizen, was diese Primer besonders geeignet macht zum Einsatz bei isothermalen, Primer-abhängigen Nukleinsäure- Syntheseprozessen und isothermalen Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, bei denen die Bindung des Primers an die Matrize nicht durch eine Temperaturänderung beeinflußt werden kann. The new primers according to the invention thus enable a higher yield specific product with reduced background signal (reduced amount of background and secondary products). This is due to the high specificity and sensitivity of the primers according to the invention in relation to the matrices used, what these primers particularly suitable for use with isothermal, primer-dependent nucleic acid Synthesis processes and isothermal nucleic acid amplification processes in which the Binding of the primer to the template cannot be influenced by a change in temperature can.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims

1. Primer, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil an Basen, die zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen in einem Zielmolekül ausbilden können, unter den letzten sechs Basen vor dem 3'-Ende des hybridisierenden Teils des Primers mindestens 50% beträgt und der Anteil an Basen, die drei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen in dem Zielmolekül ausbilden können, im letzten Viertel vor dem 5'-Ende des hybridisierenden Teils des Primers mindestens 60% beträgt.1. Primer, characterized in that the proportion of bases which can form two hydrogen bonds to the corresponding bases in a target molecule, is at least 50% among the last six bases before the 3 'end of the hybridizing part of the primer and the proportion Bases that can form three hydrogen bonds to the corresponding bases in the target molecule are at least 60% in the last quarter before the 5 'end of the hybridizing part of the primer.

2. Primer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil an Basen, die drei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen in dem Zielmolekül ausbilden können, im letzten Viertel vor dem 5'-Ende des hybridisierenden Teils des Primers mindestens 70% beträgt.2. Primer according to claim 1, characterized in that the proportion of bases, the three Hydrogen bonds to the corresponding bases in the target molecule can train in the last quarter before the 5 'end of the hybridizing part of the Primers is at least 70%.

3. Primer nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil an Basen, die drei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen in dem Zielmolekül ausbilden können, im letzten Viertel vor dem 5'-Ende des hybridisierenden Teils des Primers mindestens 80% beträgt.3. Primer according to claim 2, characterized in that the proportion of bases, the three Hydrogen bonds to the corresponding bases in the target molecule can train in the last quarter before the 5 'end of the hybridizing part of the Primers is at least 80%.

4. Primer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil an Basen, die zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen in dem Zielmolekül ausbilden können, unter den letzten fünf Basen vor dem 3'- Ende des hybridisierenden Teils des Primers mindestens 60% beträgt.4. Primer according to one of the preceding claims, characterized in that the Proportion of bases that have two hydrogen bonds to the corresponding ones Can form bases in the target molecule, under the last five bases before the 3'- End of the hybridizing part of the primer is at least 60%.

5. Primer nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil an Basen, die zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen in dem Zielmolekül ausbilden können, unter den letzten fünf Basen vor dem 3'-Ende des hybridisierenden Teils des Primers mindestens 80% beträgt. 5. Primer according to claim 4, characterized in that the proportion of bases, the two Hydrogen bonds to the corresponding bases in the target molecule can form under the last five bases before the 3 'end of the hybridizing Part of the primer is at least 80%.

6. Primer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil an Basen, die zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, unter den letzten vier Basen vor dem 3'-Ende des hybridisierenden Teils des Primers mindestens 75%, vorzugsweise 100%, ausmacht, und daß der Anteil an Basen, die drei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen im Zielmolekül ausbilden können, im letzten Viertel vor dem 5'-Ende im hybridisierenden Teil mindestens 80%, vorzugsweise 100%, ausmacht.6. Primer according to one of the preceding claims, characterized in that the Proportion of bases that have two hydrogen bonds to the corresponding ones Can form bases in the target molecule, under the last four bases before the 3 'end of the hybridizing part of the primer is at least 75%, preferably 100%, and that the proportion of bases that have three hydrogen bonds to the can form corresponding bases in the target molecule, in the last quarter before 5'-end in the hybridizing part makes up at least 80%, preferably 100%.

7. Primer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Basen, die zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen in dem Zielmolekül ausbilden können, Adenin und/oder Thymin sind.7. Primer according to one of the preceding claims, characterized in that the Bases that have two hydrogen bonds to the corresponding bases in the Can form target molecule, are adenine and / or thymine.

8. Primer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Basen, die drei Wasserstoffbrückenbindungen zu den korrespondierenden Basen in dem Zielmolekül ausbilden können, Guanin und/oder Cytosin sind.8. Primer according to one of the preceding claims, characterized in that the Bases, the three hydrogen bonds to the corresponding bases in the Can form target molecule, are guanine and / or cytosine.

9. Gemisch aus mindestens zwei Primern gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Primer derart aufgebaut sind, daß keine intermolekulare und/oder intramolekulare Wechselwirkung auftritt.9. Mixture of at least two primers according to one of claims 1 to 7, characterized characterized in that the primers are designed such that no intermolecular and / or intramolecular interaction occurs.

10. Verfahren zur Herstellung eines Primers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Primer nach an sich bekannten Verfahren herstellt und isoliert.10. A method for producing a primer according to any one of claims 1 to 7, characterized characterized in that the primers are prepared by processes known per se and isolated.

11. Verwendung eines Primers oder mehrerer Primer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder des Gemischs aus Primern gemäß Anspruch 8 für Primer-abhängige Nukleinsäure- Syntheseprozesse.11. Use of one or more primers according to one of claims 1 to 7 or the mixture of primers according to claim 8 for primer-dependent nucleic acid Synthesis processes.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Primer-abhängigen Nukleinsäure-Syntheseprozesse isothermale Prozesse sind.12. Use according to claim 11, characterized in that the primer-dependent Nucleic acid synthesis processes are isothermal processes.

13. Verwendung eines Primers oder mehrerer Primer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder des Gemischs aus Primern gemäß Anspruch 8 für Nukleinsäure- Amplifikationsverfahren. 13. Use of one or more primers according to one of claims 1 to 7 or the mixture of primers according to claim 8 for nucleic acid Amplification method.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure- Amplifikationsverfahren isothermale Verfahren sind.14. Use according to claim 13, characterized in that the nucleic acid Amplification methods are isothermal methods.

15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das isothermale Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren eine Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) ist.15. Use according to claim 14, characterized in that the isothermal Nucleic acid amplification method a nucleic acid sequence based amplification (NASBA) is.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure DNA oder RNA ist.16. Use according to one of claims 11 to 15, characterized in that the Is nucleic acid DNA or RNA.

17. Kit für Primer-abhängige Nukleinsäure-Syntheseprozesse oder Nukleinsäure- Amplifikationsverfahren, wobei der Kit mindestens einen Primer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 oder ein Gemisch aus Primern gemäß Anspruch 9 in einem geeigneten Behälter enthält.17. Kit for primer-dependent nucleic acid synthesis processes or nucleic acid Amplification method, wherein the kit at least one primer according to one of the Claims 1 to 8 or a mixture of primers according to claim 9 in a suitable Containers.

18. Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure DNA oder RNA ist.18. Kit according to claim 13, characterized in that the nucleic acid DNA or RNA is.

19. Kit gemäß einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Kit neben dem Primer oder den Primern weiterhin Puffer, Enzyme und/oder Nukleotide enthält.19. Kit according to one of claims 17 or 18, characterized in that the kit in addition the primer or primers further contains buffers, enzymes and / or nucleotides.