DE19959045A1

DE19959045A1 - Adeno-associated virus vectors that express monocyte chemotactic protein-1, useful for gene therapy of cancers, promotion of angiogenesis and treatment of inflammation

Info

Publication number: DE19959045A1
Application number: DE19959045A
Authority: DE
Inventors: Juergen Kleinschmidt; David Kunke; Hausen Harald Zur
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1999-12-07
Filing date: 1999-12-07
Publication date: 2001-06-28

Abstract

Adeno-associated virus (AAV) vector (A) containing cDNA that encodes monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) is new. Independent claims are also included for the following: (a) AAV particles (B) that contain (A); (b) pharmaceutical composition containing (A) or (B) and a carrier; and (c) cells containing (A) or (B).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen adenoassoziierten Virus-Expressionsvektor (AAV-Expressionsvektor), der das Monocyten-chemotaktische Protein 1 (MCP-1) exprimiert, vorzugsweise unter Kontrolle des CMV- oder Cytokeratin K14- Promotors. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung dieser AAV-Expressionsvektoren bzw. diese Vektoren enthaltender AAV- Partikel zur Therapie von HPV-induzierten Tumoren, zur Förderung oder Induktion der Angiogenese oder zur Behandlung von Entzündungsprozessen.The present invention relates to an adeno-associated Virus expression vector (AAV expression vector), which the Monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) expressed, preferably under control of the CMV or cytokeratin K14 Promoter. The invention further relates to the use of these AAV expression vectors or AAV- containing these vectors Particles for the therapy of HPV-induced tumors, for Promote or induce angiogenesis or for treatment of inflammatory processes.

Lange bestehende Infektionen mit den menschlichen "Hoch- Risiko"-Papillomavirus-Typen (HPV), beispielsweise HPV-Typ 16 oder 18, werden als der wichtigste Risikofaktor bei der Entwicklung des Zervixkarzinoms angesehen. Dabei sind annähernd 100% der Zervixkarzinome mit einer HPV16- oder HPV18-Infektion assoziiert. Die onkogene Funktion dieser beiden HPV-Typen wurde hauptsächlich mit der Expression der zwei frühen Gene E6 und E7 in Zusammenhang gebracht. Diese induzieren durch das Herbeiführen einer Labilität von p53 und Sequestrieren von Retinoblastom-Protein eine verminderte Kontrolle des Zellzyclus, zelluläre Immortalität und Chromosomen-Abberationen. Es gibt inzwischen einige Beweise dafür, daß die Expression dieser transformierenden Gene zur Aufrechterhaltung des Tumor-erzeugenden Phänotyps bei verschiedenen Zervixkarzinom-Zellen, die mit "Hoch-Risiko"- HPV-Typen infiziert sind, kontinuierlich erfolgen muß. Die Hemmung der E6 und E7 codierenden Gene durch komplementäre antisense-Transkripte führte bei Zervixkarzinom- und Mundkarzinom-Zellinien zu reduzierten Wachstumsraten und zum Verlust des transformierten Phänotyps und zu einer Hemmung der Tumorbildung im Tiermodell. Darüber hinaus gibt es gute Hinweise darauf, daß an der Kontrolle der Papillomavirus- Infektion sowohl bei der primären Manifestation als auch bei dem Fortschreiten zur Bösartigkeit das Immunsystem beteiligt ist. Somit ergaben sich verschiedene Ansatzpunkte für eine Therapie.Long-standing infections with the human "high Risk "papillomavirus types (HPV), for example HPV type 16 or 18, are considered the main risk factor in the Development of cervical cancer considered. Are there approximately 100% of cervical cancers with HPV16 or HPV18 infection associated. The oncogenic function of this two HPV types was mainly associated with the expression of two early genes E6 and E7 have been linked. This induce instability of p53 and Sequestration of retinoblastoma protein decreased Control of cell cycle, cellular immortality and Chromosome aberrations. There is some evidence now for the expression of these transforming genes to Maintenance of the tumorigenic phenotype various cervical cancer cells that are "high-risk" HPV types are infected, must be done continuously. The Inhibition of the E6 and E7 coding genes by complementary antisense transcripts resulted in cervical cancer and Oral carcinoma cell lines at reduced growth rates and Loss of the transformed phenotype and inhibition of Tumor formation in the animal model. There are also good ones Evidence that control of papilloma virus Infection both at the primary manifestation and at the immune system involved in the progression to malignancy is. This resulted in different starting points for one Therapy.

Allerdings konnten mit den bisherigen Therapieansätzen, die auf den vorstehend diskutierten Strategien basieren, noch keine befriedigenden therapeutischen Erfolge erzielt werden. Dies liegt bezüglich der Unterdrückung der Expression von E6 und/oder E7 mittels antisense- bzw. Ribozym-Strategien daran, daß bei dieser Vorgehensweise ein hoher Prozentsatz der Zielzellen transduziert werden muß, da es hier keinen "Bystander"-Effekt gibt, der dazu führt, daß letztendlich das therapeutische Ziel in allen Zellen verwirklicht wird. Eine solch hohe Transduktionseffizienz ist jedoch in der Praxis nicht erreichbar. Außerdem stellt sich noch das kaum lösbare Problem, daß die Expression der antisense-RNA bzw. der Ribozyme stabil sein muß, da die Tumorzellen durch eine Behandlung mit einem proliferationshemmenden antisense- Konstrukt nicht eliminiert werden.However, with the previous therapeutic approaches, the based on the strategies discussed above, yet no satisfactory therapeutic success can be achieved. This is due to the suppression of the expression of E6 and / or E7 using antisense or ribozyme strategies, that with this approach a high percentage of Target cells must be transduced because there is none "Bystander" effect, which ultimately leads to the therapeutic goal is achieved in all cells. A however, such high transduction efficiency is in practice not reachable. In addition, there is the hardly solvable Problem that the expression of the antisense RNA or Ribozymes must be stable since the tumor cells are Treatment with an anti-proliferation antisense Construct cannot be eliminated.

Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem war somit die Bereitstellung von Mitteln, die eine wirksame Therapie von HPV-induzierten Tumoren, vorzugsweise die Therapie des Zervixkarzinoms, erlauben.The technical on which the present invention is based The problem was therefore the provision of funds that a effective therapy for HPV-induced tumors, preferably allow therapy for cervical cancer.

Die Lösung dieses technischen Problems erfolgt durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen.This technical problem is solved by Provision of those characterized in the claims Embodiments.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß durch die Verabreichung von AAV-Expressionsvektoren, die MCP-1 exprimieren, das HPV-induzierte Tumorwachstum gehemmt werden kann, diese somit ein wirksames Mittel zur Behandlung von solchen Tumoren, vorzugsweise des Zervixkarzinoms, darstellen. It was surprisingly found that the Administration of AAV expression vectors, the MCP-1 express that HPV-induced tumor growth are inhibited can, therefore, an effective means of treating such tumors, preferably cervical cancer.

In der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß zwar die Expression von antisense-E6 bzw. E7 oder entsprechender Ribozyme mittels AAV-Expressionsvektoren keinen Antitumor- Effekt aufweist, jedoch die von AAV-Expressionsvektoren vermittelte Expression von MCP-1. Dazu wurde deshalb das AAV- 2-Vektorsystem gewählt, da davon ausgegangen wurde, daß mit diesem System Zellen, beispielsweise HeLa-Zellen sehr effizient transduziert werden können und dieser Vektor nicht nur in das Genom integrieren sondern auch eine langandauernde Expression des gewünschten Gens gewährleisten kann. Anzumerken ist auch noch, daß von AAV, beispielsweise AAV-2, stammende Vektoren eine immer größerer Akzeptanz für die Gentherapie gewinnen, beispielsweise zur Behandlung von Erbkrankheiten, da sie eine geringe Immunogenität aufweisen, zu einer langdauernden Expression des gewünschten Gens führen und gemäß derzeitigem Wissensstand für den Empfänger nicht pathogen sind. Das MCP-1 codierende JE-Gen wurde deshalb gewählt, weil es Befunde dafür gibt, daß das MCP-1 Protein in tumorigenen HPV-positiven Zervixkarzinomzellinien grundsätzlich fehlt, obwohl das endogene Gen vorhanden und nicht strukturell rearrangiert ist. MCP-1 wurde unter der Kontrolle zweier verschiedener Promotoren, dem CMV-Promotor und dem Cytokeratin K14-Promotor exprimiert. Die Transduktion des MCP-1 codierenden JE-Gens unter der Kontrolle dieser Promotoren mittels AAV-Vektoren in SiHa-Zellen bzw. HeLa-Zellen erlaubte eine signifikante Reduktion des Tumorwachstums. Diese Reduktion war für die MCP-1-Expression spezifisch, da die Transduktion des lacZ-Gens oder von antisense-MCP-1 keinen signifikanten Effekt hinsichtlich des Tumorwachstums hatte. Die Analyse des zeitlichen Verlaufs des Tumorwachstums bei Tumoren, die von implantierten SiHa-Zellen stammten, zeigt, daß das Tumorwachstum etwa 40 bis 45 Tage nach Implantation des Tumors praktisch vollständig gehemmt wird. Es konnte somit in der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, daß die Transduktion des JE-Gens mit rAAV-Vektoren in eine begrenzte Anzahl von Zellen bereits zu therapeutisch ausreichenden Konzentrationen des MCP-1-Gens führt, was in Nacktmäusen zu einem signifikant reduzierten Wachstum von Tumoren führt, die von HeLa- oder SiHa-Zellen stammen - vermutlich durch die MCP- 1-vermittelte indirekte Hemmung der E6/E7-Expression. Somit bietet der AAV-Vektor-vermittelte Transfer des JE-Gens in Zielzellen, der einen systemischen Effekt vermittelt, eine erfolgversprechende Basis für die Therapie von HPV-induzierten Tumoren, insbesondere des Zervixkarzinoms.In the present invention it could be shown that although the expression of antisense-E6 or E7 or equivalent Ribozymes using AAV expression vectors have no anti-tumor Has effect, but that of AAV expression vectors mediated expression of MCP-1. For this reason, the AAV 2-vector system chosen because it was assumed that with cells, for example HeLa cells very much can be transduced efficiently and this vector cannot only integrate into the genome but also a long-lasting one Can ensure expression of the desired gene. Noteworthy is also that of AAV, for example AAV-2 Vectors an increasing acceptance for gene therapy win, for example for the treatment of hereditary diseases, because they have low immunogenicity to one cause long-term expression of the desired gene and according current state of knowledge is not pathogenic for the recipient are. The MCP-1 coding JE gene was chosen because there are findings that the MCP-1 protein in tumorigenic HPV-positive cervical carcinoma cell lines are basically missing, although the endogenous gene is present and not structural rearranged. MCP-1 was under the control of two various promoters, the CMV promoter and the cytokeratin K14 promoter expressed. The transduction of the MCP-1 coding JE gene under the control of these promoters allowed by means of AAV vectors in SiHa cells or HeLa cells a significant reduction in tumor growth. This Reduction was specific for MCP-1 expression because the Transduction of the lacZ gene or of antisense MCP-1 none had a significant effect on tumor growth. Analysis of the temporal course of tumor growth Tumors derived from implanted SiHa cells shows that tumor growth is about 40 to 45 days after implantation of the tumor is almost completely inhibited. So it could shown in the present invention that the Transduction of the JE gene with rAAV vectors into a limited Number of cells already too therapeutically sufficient Concentrations of the MCP-1 gene result in what in nude mice leads to a significantly reduced growth of tumors that from HeLa or SiHa cells - presumably through the MCP 1-mediated indirect inhibition of E6 / E7 expression. Consequently offers the AAV vector-mediated transfer of the JE gene in Target cells that mediate a systemic effect, a promising basis for the therapy of HPV-induced Tumors, especially cervical cancer.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein adenoassozierter Virus-Expressionsvektor (AAV- Expressionsvektor), der eine das Monocyten-chemotaktische Protein 1 (MCP-1) codierende DNA-Sequenz enthält.The present invention thus relates to adeno-associated virus expression vector (AAV Expression vector), which is a the monocyte chemotactic Contains protein 1 (MCP-1) coding DNA sequence.

Der hier verwendete Ausdruck "AAV-Expressionsvektor" betrifft jegliches AAV, d. h. Virus-Partikel, und dessen DNA. Der AAV-Expressionsvektor kann in Wildtyp- oder veränderter Form vorliegen. Ferner kann er ein System aus mehreren Komponenten sein, die einzelne oder alle Funktionen von AAV und/oder seiner DNA bereitstellen. Ein solches System umfaßt z. B. einen rep-negativen AAV-Expressionsvektor und ein ein AAV-Rep-Protein bereitstellendes Mittel. Der AAV-Expressionsvektor kann in Zellen eingebracht werden und dort in das Genom integrieren oder in episomaler Form verbleiben.The term "AAV expression vector" as used herein refers to any AAV, d. H. Virus particles and their DNA. The AAV expression vector can be in wild-type or altered form available. It can also be a system made up of several components be the single or all functions of AAV and / or provide his DNA. Such a system includes e.g. B. one rep-negative AAV expression vector and a AAV Rep protein providing agent. The AAV expression vector can be introduced into cells and integrate there into the genome or in episomal form remain.

AAVs sind einzelsträngige, zur Familie der Parvoviren gehörende DNA-Viren. Für ihre Replikation benötigen AAVs Helferviren, insbesondere Herpesviren oder Adenoviren. In Abwesenheit von Helferviren integrieren AAVs in das Wirtszellgenom, insbesondere an einer spezifischen Stelle von Chromosom 19. Das Genom von AAVs ist linear und weist eine Länge von ca. 4680 Nukleotiden auf. Dieses umfaßt zwei Leserahmen, die für ein strukturelles und ein nichtstrukturelles Gen codieren. Das strukturelle Gen wird als cap-Gen bezeichnet. Dieses steht unter der Kontrolle des P40-Promotors und kodiert für drei Capsid-Proteine. Das nicht strukturelle Gen wird mit rep-Gen bezeichnet und kodiert für die Rep-Proteine Rep 78, Rep 68, Rep 52 und Rep 40. Die beiden ersteren werden unter der Kontrolle des P5 Promotors exprimiert, während die Expression von Rep 52 und Rep 40 unter der Kontrolle des P19-Promotors steht. Die Funktionen der Rep-Proteine liegen u. a. in der Regulation der Replikation und Transkription des AAV-Genoms.AAVs are single-stranded, to the parvovirus family belonging DNA viruses. AAVs need for their replication Helper viruses, especially herpes viruses or adenoviruses. In Absence of helper viruses integrate AAVs into that Host cell genome, particularly at a specific site of Chromosome 19. The genome of AAVs is linear and has one Length of approximately 4680 nucleotides. This includes two Reading frames for a structural and a encode non-structural gene. The structural gene is called called cap gene. This is under the control of the P40 promoter and encodes three capsid proteins. Not that structural gene is called rep gene and codes for the Rep proteins Rep 78, Rep 68, Rep 52 and Rep 40. The two the former are under the control of the P5 promoter expressed while the expression of Rep 52 and Rep 40 under is under the control of the P19 promoter. The functions of Rep proteins are u. a. in the regulation of replication and AAV genome transcription.

Zur Herstellung eines vorstehenden AAV-Expressionsvektors können übliche Verfahren durchgeführt werden. Soll z. B. der AAV-Expressionsvektor in Form eines Virus-Partikels erhalten werden, bietet sich ein Verfahren an, bei dem ein für MCP-1 codierender AAV-Expressionsvektor, der nicht für AAV-Rep- und -Cap-Proteine codiert, zusammen mit einem AAV-Plasmid verwendet wird, das für die beiden AAV-Proteine kodiert und daneben für die Ausbildung von AAV-Virus-Partikeln notwendige Helfervirus-Sequenzen aufweist. Der AAV-Expressionsvektor und das AAV-Plasmid werden in 293-Zellen mittels Cotransfektion eingeführt und nach etwa 48 h werden Virus-Partikel des erfindungsgemäßen AAV-Vektors erhalten. Diese Virus-Partikel sind frei von Helferviren. Es wird auf die nachstehenden Beispiele und das deutsche Patent 196 44 500 des Aasmelders verwiesen.To produce an AAV expression vector above usual procedures can be carried out. Should z. B. the Obtained AAV expression vector in the form of a virus particle there is a procedure in which a for MCP-1 coding AAV expression vector, which is not for AAV Rep and -Cap proteins encoded, along with an AAV plasmid is used, which codes for the two AAV proteins and also necessary for the formation of AAV virus particles Helper virus sequences. The AAV expression vector and the AAV plasmid is cotransfected into 293 cells introduced and after about 48 h virus particles of the AAV vector according to the invention obtained. These virus particles are free of helper viruses. It will refer to the following Examples and the German patent 196 44 500 des Aasmelders referred.

Mit einem vorstehenden AAV-Expressionsvektor kann eine Therapie von Tumoren durchgeführt werden, deren Entstehung ursächlich mit einer HPV-Infektion in Zusammenhang steht. Hierzu bietet es sich an, einem einen solchen Tumor tragenden Individuum den AAV-Expressionsvektor systemisch zu verabreichen. Auch kann der AAV-Expressionsvektor lokal verabreicht werden. In beiden Fällen kann der AAV- Expressionsvektor als DNA oder als Virus-Partikel vorliegen, wobei letzteres bevorzugt ist.With an AAV expression vector above, one Therapy of tumors are carried out, their emergence is causally related to HPV infection. For this purpose, it is advisable to carry such a tumor Individual systemically to the AAV expression vector administer. The AAV expression vector can also be local be administered. In both cases, the AAV Expression vector is present as DNA or as virus particles, the latter being preferred.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorstehende Erfindung einen AAV-Expressionsvektor, der mindestens folgende DNA-Sequenzen umfaßt: (a) die 5'ITR und 3'ITR eines adenoassoziierten Virus (AAV), (b) einen in Säugern aktiven konstitutiven oder induzierbaren Promotor; (c) eine mit dem Promotor von (b) funktionell verknüpfte, das Monocyten chemotaktische Protein 1 (MCP-1) codierende DNA-Sequenz, und (d) ein Polycodenylierungssignal.In another embodiment, the above relates Invention an AAV expression vector, the following at least DNA sequences include: (a) the 5'ITR and 3'ITR one adeno-associated virus (AAV), (b) an active in mammals constitutive or inducible promoter; (c) one with the Promoter of (b) functionally linked, the monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) coding DNA sequence, and (d) a polycodenylation signal.

Der Fachmann kann mittels üblicher Verfahren die vorstehend genannten Komponenten der AAV-Expressionsvektoren isolieren und so miteinander verknüpfen, daß ein AAV-Expressionsvektor mit den gewünschten Eigenschaften erhalten wird. Dabei umfaßt der Begriff "5'ITR" bzw. "3'ITR" alle "5'ITR"- bzw. "3'ITR"- Sequenzen, die dem Vektor die Integration in das Wirtsgenom erlauben. Diese können beispielsweise von den AAV Typen 1-6. Vorzugsweise stammen diese 5'ITR und/oder 3'ITR von einem AAV Typ 2 (AAV-2).The person skilled in the art can use conventional methods to do the above isolate said components of the AAV expression vectors and link together so that an AAV expression vector is obtained with the desired properties. Includes the term "5'ITR" or "3'ITR" all "5'ITR" - or "3'ITR" - Sequences that allow the vector to integrate into the host genome allow. These can be of the AAV types 1-6, for example. These 5'ITR and / or 3'ITR are preferably from an AAV Type 2 (AAV-2).

Der hier verwendete Ausdruck "ein in Säugern aktiver konstitutiver oder induzierbarer Promotor" umfaßt alle Promotoren, die in Säugern die Transkription der MCP-1 codierenden DNA-Sequenz erlauben, vor allem solche, die zu einer starken Expression führen, vorzugsweise heterologe Promotoren. Geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise konstitutive Promotoren, wie RSV (Rous Sarcoma Virus "late terminal repeat")-Promotor, SV40 (SV40 "early promoter/enhancer")-Promotor, und β-Actin Promotor, oder induzierbare Promotoren, wie Tet induzierbare Promotoren, Ecdyson induzierbare Promotoren, Lac Switch System und MMTV- Promotor. Zu solchen Promotoren zählen auch die in den nachstehenden Beispielen näher beschriebenen CMV- und Cytokeratin K14-Promotoren. Vorzugsweise erfolgt die Expression der MCP-1 codierenden DNA-Sequenz unter der Kontrolle eines Gewebe- oder Tumor-spezifischen Promotors, wie Cytokeratin 14 Promotor oder p4NS1p38 Kassette des autonomen Parvovirus H1.The term "an active in mammals." constitutive or inducible promoter "includes all Promoters that transcribe MCP-1 in mammals allow coding DNA sequence, especially those that strong expression, preferably heterologous Promoters. Suitable promoters are known to the person skilled in the art and include, for example, constitutive promoters such as RSV (Rous Sarcoma Virus "late terminal repeat") promoter, SV40 (SV40 "early promoter / enhancer") - promoter, and β-actin promoter, or inducible promoters, such as Tet inducible promoters, Ecdyson inducible promoters, Lac Switch System and MMTV Promoter. Such promoters also include those in the CMV and Cytokeratin K14 promoters. This is preferably done Expression of the MCP-1 coding DNA sequence under the Control of a tissue or tumor specific promoter, such as Cytokeratin 14 promoter or p4NS1p38 cassette of the autonomous Parvovirus H1.

Der hier verwendete Ausdruck "MCP-1 codierende DNA-Sequenz" betrifft sowohl die DNA-Sequenz, die das native, im Stand der Technik beschriebene Protein codiert, sowie jede DNA-Sequenz, die eine MCP-1-Variante codiert, die gegenüber der nativen Form Deletionen, Additionen oder Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäuren) aufweist oder veränderte Oligosaccharid seitenketten, jedoch noch biologisch aktiv ist, d. h. beispielsweise die in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Eigenschaften aufweist. Diese Varianten betreffen auch MCP-1-Varianten, die im Vergleich zu der ursprünglichen Form eine ähnliche oder bessere biologische Aktivität aufweisen. Diese biologische Aktivität kann mittels der in den nachstehenden Beispielen 2 bis 5 beschriebenen Verfahren untersucht werden.The term "MCP-1 coding DNA sequence" used here affects both the DNA sequence that the native, in the state of the Technically encoded protein encoded, as well as each DNA sequence, which encodes an MCP-1 variant, which is compared to the native Form deletions, additions or substitutions of one or several amino acids and / or (one) modified Amino acids) or modified oligosaccharide side chains, but is still biologically active, d. H. for example, those in the examples below described properties. These variants also affect MCP-1 variants, which are compared to the original form a similar or better biological Have activity. This biological activity can be controlled by that described in Examples 2 to 5 below Procedures are examined.

Der hier verwendete Ausdruck "MCP-1 codierende DNA-Sequenz" betrifft schließlich auch DNA-Sequenzen, die nur ein Fragment von MCP-1 codieren, wobei dieses Fragment noch die vorstehend diskutierten biologischen Eigenschaften aufweist.The term "MCP-1 coding DNA sequence" used here Finally, it also affects DNA sequences that are only one fragment of MCP-1, this fragment still encoding the above has discussed biological properties.

Die in dem erfindungsgemäßen AAV-Expressionsvektor funktionell mit dem in Säugern aktiven Promotor verknüpfte, MCP-1 codierende DNA-Sequenz kann hinter dem Promotor in "sense"- oder "antisense"-Orientierung vorliegen. Im ersteren Fall führt die Transkription zu einer mRNA, die in das biologisch aktive Protein translatiert werden kann, das dann die vorstehend und in den nachstehenden Beispielen näher beschriebene biologische Wirkung hinsichtlich der Tumorhemmung besitzt. Im letzteren Fall führt die Transkription nicht zu einer mRNA, deren Translation zu einem funktionellen Protein führt. Es kann jedoch davon ausgegangen werden, daß diese "antisense"-ENA, die auch nur einen Teil der zu der MCP-1 codierenden DNA-Sequenz komplementären RNA umfassen kann, in den Zellen zur Hemmung der Expression von MCP-1 führt, da sie an die MCP-1-mRNA bindet und auf verschiedene Weise die Expression des MCP-1 Proteins, z. B. durch Inhibition der Translation der MCP-1-mRNA, hemmt.The functional in the AAV expression vector according to the invention linked to the MCP-1 active promoter in mammals coding DNA sequence can "sense" - behind the promoter or "antisense" orientation. In the former case The transcription leads to an mRNA that is incorporated into the biological active protein can be translated, which then the above and in the examples below described biological effect with regard to tumor inhibition owns. In the latter case, the transcription does not lead to an mRNA, whose translation into a functional protein leads. However, it can be assumed that this "antisense" -ENA, which is only a part of the MCP-1 coding DNA sequence may comprise complementary RNA, in leads to the inhibition of the expression of MCP-1 because it binds to the MCP-1 mRNA and the Expression of the MCP-1 protein, e.g. B. by inhibition of Translation of the MCP-1 mRNA inhibited.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäßen AAV-Expressionsvektoren um pAV-CMV- MCP-1, pAV-K14-MCP-1, bzw. pAV-CMV-antiMCP-1. Diese AAV- Expressionsvektoren wurden bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellen) hinterlegt, pAV-CMV-MCP-1 am 9. August 1999 unter DSM 12990, pAV-K14-MCP-1 am 16. August 1999 unter DSM 13015 und pAV-CMV-antiMCP-1 am 9. August 1999 unter DSM 12991.In a particularly preferred embodiment, it is in the AAV expression vectors according to the invention by pAV-CMV- MCP-1, pAV-K14-MCP-1, or pAV-CMV-antiMCP-1. This AAV- Expression vectors were obtained from the DSMZ (German Collection of Microorganisms and cells) deposited, pAV-CMV-MCP-1 on 9. August 1999 under DSM 12990, pAV-K14-MCP-1 on August 16, 1999 under DSM 13015 and pAV-CMV-antiMCP-1 on August 9, 1999 under DSM 12991.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein AAV- Partikel, das den erfindungsgemäßen AAV-Expressionsvektor enthält.The present invention also relates to an AAV Particle containing the AAV expression vector according to the invention contains.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Arzneimittel, das den erfindungsgemäßen AAV-Expressionsvektor oder das AAV-Partikel enthält. Das Arzneimittel kann ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Art des Trägers hängt davon ab, wie der erfindungsgemäße AAV-Expressionsvektor bzw. das erfindungsgemäße AAV-Partikel verabreicht werden soll. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Schweregrad der Erkrankung, der Art der Verabreichung, etc.The present invention also relates to a Medicament containing the AAV expression vector according to the invention or that contains AAV particles. The medicine can also contain a pharmaceutically acceptable carrier. Suitable Carrier and the formulation of such drugs are the Known specialist. Suitable carriers include, for example Phosphate buffered saline, water, emulsions, for example oil / water emulsions, wetting agents, sterile Solutions etc. The type of carrier depends on how the AAV expression vector according to the invention or the AAV particles according to the invention are to be administered. The suitable dosage is determined by the attending physician and depends on various factors, such as the age, gender, weight of the patient, the Disease severity, route of administration, etc.

Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen AAV- Expressionsvektoren auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682). Der erfindungsgemäße AAV- Expressionsvektor kann ferner ein Gen enthalten, das für einen nachweisbaren phänotypischen Marker codiert, wodurch das erfolgreiche Einschleusen des AAV-Expressionsvektors in die Zielzelle nachgewiesen werden kann. Geeignete Markergene sind z. B. das Luciferase- oder das "green-fluorescent-protein" (GFP) kodierende Gen.For the purposes of gene therapy, the AAV Expression vectors also in the form of colloidal dispersions be transported to the target cells. These include for example liposomes or lipoplexes (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682). The AAV according to the invention Expression vector may also contain a gene that is responsible for a detectable phenotypic markers encoding the successful introduction of the AAV expression vector into the Target cell can be detected. Suitable marker genes are e.g. B. the luciferase or the "green fluorescent protein" (GFP) coding gene.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine den vorstehend beschriebenen AAV-Expressionsvektor enthaltende Wirtszelle, die beispielsweise zur Vermehrung des AAV-Vektors dienen kann. Beispiele solcher Wirtszellen sind Säugerzellen, vorzugsweise 293 oder Hela-Zellen. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten etc. sind dem Fachmann bekannt.Another object of the present invention is a containing the AAV expression vector described above Host cell used, for example, to multiply the AAV vector can serve. Examples of such host cells are mammalian cells, preferably 293 or Hela cells. Procedure for Transformation of these host cells to phenotypic Selection of transformants etc. are known to the person skilled in the art.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungsgemäßen AAV-Expressionsvektors oder des erfindungsgemäßen AAV-Partikels zur Tumortherapie, vorzugsweise zur Therapie von HPV-induzierten Tumoren. Besonders bevorzugt ist die Verwendung zur Therapie des Zervixkarzinoms. Darüber hinaus kann der erfindungsgemäße AAV- Expressionsvektor oder das erfindungsgemäße AAV-Partikel auch zur Förderung oder Induktion der Angiogenese verwendet werden. Bezüglich des Wirkens von MCP-1 auf angiogenetische Vorgänge wird z. B. auf Arras et al., J. clin. Investigations 101, 1998, 40-50 verwiesen.The present invention also relates to the use of the AAV expression vector according to the invention or AAV particle according to the invention for tumor therapy, preferably for the therapy of HPV-induced tumors. The use for the therapy of the Cervical cancer. In addition, the AAV Expression vector or the AAV particle according to the invention also used to promote or induce angiogenesis. Regarding the effect of MCP-1 on angiogenic processes z. B. Arras et al., J. clin. Investigations 101, 1998, 40-50 referenced.

Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen AAV-Expressionsvektoren bzw. AAV- Partikel, bei denen die MCP-1 codierende DNA-Sequenz in "antisense"-Orientierung inseriert ist, zur Behandlung von Entzündungsprozessen. Bezüglich der Wirkung von "antisense" MCP-1 codierenden DNA-Sequenzen auf Entzündungsprozesse wird z. B. auf New England Journal of Medicine 338, 1998, 436-445 verwiesen.Furthermore, the present invention relates to the use of the AAV expression vectors or AAV Particles in which the MCP-1 coding DNA sequence in "antisense" orientation is advertised for the treatment of Inflammatory processes. Regarding the effect of "antisense" MCP-1 coding DNA sequences on inflammatory processes e.g. B. New England Journal of Medicine 338, 1998, 436-445 referred.

Kurze Beschreibung der FigurenBrief description of the figures Fig. 1 Fig. 1 Konstruktion von AAV-vektorplasmiden zur Expression von Fremd-DNAConstruction of AAV vector plasmids for expression of foreign DNA

Die "Shuttle"-Plasmide pAV-CMV und pAV-K14 enthalten das Plasmidrückgrat und die beiden invertierten terminalen Wiederholungseinheiten (ITR) von AAV aus dem Plasmid psub201(+). Die beiden poly(A)-Signale und die Mehrfachclonierungsstelle stammen von pGL-2 (Promega) und diese wurden zwischen die beiden ITR von AAV-2 wie in Beispiel 1 beschrieben inseriert. Danach wurden entweder der menschliche CMV-IE-Promotor (HincII/AvaII-Fragment; 877 bp) zusammen mit einem FspI/EcoRI-Fragment der menschlichen poly(ADP-Ribose)-Polymerase als "Spacer"-Fragment oder das AvaI-Fragment (1946 bp) des Cytokeratin K14-Promotors zwischen die beiden poly(A)-Signale in die KpnI-Stelle cloniert; die KpnI-Stelle wird beibehalten. So wurden die Plasmide pAV-CMV bzw. pAV-K14 erhalten. Bei beiden Plasmiden ist die Mehrfachclonierungsstelle mit Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme eingerahmt dargestellt.The "Shuttle" plasmids pAV-CMV and pAV-K14 contain this Plasmid backbone and the two inverted terminal Repeat units (ITR) of AAV from the plasmid psub201 (+). The two poly (A) signals and the Multiple cloning site are from pGL-2 (Promega) and these were between the two ITRs of AAV-2 as in example 1 advertised. Then either human CMV-IE promoter (HincII / AvaII fragment; 877 bp) together with an FspI / EcoRI fragment of the human poly (ADP-ribose) polymerase as a "spacer" fragment or that AvaI fragment (1946 bp) of the cytokeratin K14 promoter between the two poly (A) signals cloned into the KpnI site; the KpnI position will be retained. So the plasmids were pAV-CMV or pAV-K14 obtained. In both plasmids the Multiple cloning site with recognition sites for Restriction enzymes are shown in a frame.

Fig. 2 Fig. 2 MCP-1 exprimierende AAV-2-Vektor-PlasmideMCP-1 expressing AAV-2 vector plasmids

Struktur der Vektorplasmide pAV-CMV-MCP-1 und pAV-K14-MCP-1, die das Monocyten-chemotaktische Protein 1 (MCP-1) exprimieren. Die von psub201(+) stammenden terminalen Wiederholungseinheiten (TR), das poly(A)-Signal (pA1) von pGL- 2, das "Spacer"-Fragment von poly(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP), der "immediate early"-Promotor CMV (PCMV), der Cytokeratin K14-Promotor (PK14) und das Polyadenylierungssignal von SV40 (pA2) sind angegeben. Die für das menschliche Monocyten-chemotaktische Protein 1 (MCP-1/JE) codierende cDNA wurde in ein ThoI-Fragment (740 bp) hinter den CMV-Promotor bzw. den Cytokeratin 14-Promotor cloniert.Structure of the vector plasmids pAV-CMV-MCP-1 and pAV-K14-MCP-1, which is the monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) express. The terminals derived from psub201 (+) Repeat units (TR), the poly (A) signal (pA1) from pGL- 2, the "spacer" fragment of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), the "immediate early" promoter CMV (PCMV), the Cytokeratin K14 promoter (PK14) and that Polyadenylation signal of SV40 (pA2) are given. The for the human monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1 / JE) cDNA coding was inserted into a ThoI fragment (740 bp) behind the CMV promoter or the cytokeratin 14 promoter cloned.

Die Expression des JE-Gens wurde über eine transiente Transfektion der Vektorkonstrukte in HeLa-Zellen und anschließende Northern-Blot-Analyse getestet. Die Expression von MCP-1 in den benignen HeLa-Fibroblasten-Hybriden 444 diente als positive Kontrolle. Es wurden zwei unterschiedliche pAV-CMV-MCP-1-Clone getestet (9-CMV, 4-CMV). Von den AAV- Expressionskonstrukten stammende MCP-1-mRNA wanderte wegen eines längeren poly(A)-Signals im Vergleich zu der mRNA der Kontrollkonstrukte langsamer im Gel.Expression of the JE gene was transient Transfection of the vector constructs in HeLa cells and subsequent Northern blot analysis tested. The expression of MCP-1 in the benign HeLa fibroblast hybrids 444 served as a positive control. There were two different ones pAV-CMV-MCP-1 clone tested (9-CMV, 4-CMV). From the AAV Expression constructs derived MCP-1 mRNA migrated because of a longer poly (A) signal compared to the mRNA of the Control constructs slower in the gel.

MCP-1 wurde in einem ELISA nachgewiesen. Dazu wurden Überstände von HeLa-Zellen verwendet, die mit pAV-CMV-MCP-1- Konstrukten (9-CMV, 4-CMV) oder pAV-K14-MCP-1-Konstrukten (14- K14) transient transfiziert waren. Als Kontrolle wurden Überstände von 444-Zellen und HeLa-Zellen untersucht. Die Konzentration des MCP-1-Proteins in den Überständen ist als ng/ml angegeben.MCP-1 was detected in an ELISA. To do this Supernatants from HeLa cells used with pAV-CMV-MCP-1- Constructs (9-CMV, 4-CMV) or pAV-K14-MCP-1 constructs (14- K14) were transiently transfected. As a control Supernatants from 444 cells and HeLa cells were examined. The Concentration of the MCP-1 protein in the supernatants is as ng / ml.

Fig. 3 Fig. 3 Expression des lacZ-Gens nach rAAV-vermitteltem Gentransfer in SiHa-ZellenExpression of the lacZ gene after rAAV-mediated Gene transfer in SiHa cells

5 × 10³ SiHa-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen gezüchtet und 18 Stunden bei 37°C entweder mit Medium (A) als Kontrolle oder mit rAAV-lacZ bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 1 (B) oder 10 (C) in D-MEM inkubiert, das mit 2% FCS supplementiert worden war. Die Platten wurden gewaschen und die Zellen mittels 0,25% Glutaraldehyd 10 min. auf Eis fixiert und mit X-Gal gefärbt.5 × 10 ³ SiHa cells were grown in 96-well plates and 18 hours at 37 ° C with either medium (A) as a control or rAAV-lacZ at an infection multiplicity (MOI) of 1 (B) or 10 (C) incubated in D-MEM supplemented with 2% FCS. The plates were washed and the cells using 0.25% glutaraldehyde for 10 min. fixed on ice and stained with X-Gal.

Fig. 4 Fig. 4 Produktion von MCP-1 in mit MCP-1 exprimierenden rAAV infizierten SiHa-ZellenProduction of MCP-1 in MCP-1 expressing rAAV infected SiHa cells

SiHa-Zellen wurden mit rekombinanten AAV-2-Partikeln infiziert, die MCP-1 unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimieren. Die gewählten Infektionsmultiplizitäten (MOI) sind in der Figur angegeben. Das Inokulum wurde 16 Stunden später entfernt und gegen frisches D-MEM-Medium ausgetauscht, das mit 2% FCS supplementiert worden war. Die Überstände wurden nach 2, 2 oder 5 Tagen gesammelt und die MCP-1- Konzentration wurde mittels eines MCP-1-ELISA (A) oder des Chemotaxis-Assays (B) wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Die Chemotaxis-Aktivität ist als % der Standard-Chemotaxis- Aktivität in 1% menschlichem Serum angegeben.SiHa cells were made with recombinant AAV-2 particles infected, the MCP-1 under the control of the CMV promoter express. The selected multiplicities of infection (MOI) are indicated in the figure. The inoculum was 16 hours later removed and replaced with fresh D-MEM medium, that had been supplemented with 2% FCS. The supernatants were collected after 2, 2 or 5 days and the MCP-1 Concentration was determined using an MCP-1 ELISA (A) or the Chemotaxis assays (B) determined as described in Example 1. Chemotaxis activity is as% of the standard chemotaxis Activity reported in 1% human serum.

Fig. 5 Fig. 5 Auswirkung der Vorbehandlung von HeLa-Zellen und SiLa-Zellen mit rekombinanten AAV-2 auf die Induktion der Tumorbildung in NacktmäusenEffect of pretreatment of HeLa cells and SiLa cells with recombinant AAV-2 on the Induction of tumor formation in nude mice

Induktion der Tumorbildung von mit rAAV ex vivo behandelten HeLa-Zellen. HeLa-Zellen wurden 8 Stunden mit gereinigten rekombinanten AAV-Partikeln, die MCP-1 oder β-Galactosidase exprimierten, in D-MEM (supplementiert mit 2% FCS) mit einer MOI von 2 infiziert. Danach wurde das Medium gegen frisches D- MEM (supplementiert mit 10% FCS) ausgetauscht und die Zellen über Nacht inkubiert. Unbehandelte und rAAV-infizierte Zellen wurden Mäusen injiziert (2 × 10⁶ Zellen/Maus). Das Tumorvolumen wurde bis zu 25 Tage nach der Injektion bestimmt. Die Kurven stellen von 5 Tieren stammende Mittelwerte dar.Induction of tumor formation from HeLa cells treated with rAAV ex vivo. HeLa cells were infected for 8 hours with purified recombinant AAV particles expressing MCP-1 or β-galactosidase in D-MEM (supplemented with 2% FCS) with an MOI of 2. The medium was then exchanged for fresh D-MEM (supplemented with 10% FCS) and the cells were incubated overnight. Untreated and rAAV-infected cells were injected into mice (2 × 10 ⁶ cells / mouse). The tumor volume was determined up to 25 days after the injection. The curves represent mean values from 5 animals.

(B, C) Induktion der Tumorbildung von mit rAAV ex vivo behandelten SiHa-Zellen. SiHa-Zellen wurden in Schalen (Durchmesser: 10 cm) mit gereinigten rekombinanten AAV- Partikeln in D-MEM (supplementiert mit 2% FCS) 8 Stunden infiziert, die β-Galactosidase, antisense-E6/E7, eine Kombination aus antisense-E6/E7 und MCP-1 oder antinsense-MCP- 1 exprimierten. Die MOI-Werte sind in den Figuren angegeben. Danach wurde das Medium gegen frisches D-MEM (supplementiert mit 10% FCS) ausgetauscht und die Zellen über Nacht inkubiert. Schein-infizierte und behandelte Zellen wurden in die Lende von Nacktmäusen mit einer Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen/Maus injiziert. Das Tumorvolumen wurde bis zu 61 Tage (B) oder 60 Tage (C) nach Injektion bestimmt. Die Kurven stellen Mittelwerte der Tumorvolumina von 5 (B), 10 (β-Galactosidase und MCP-1) oder 5 Tieren (antisense-MCP-1) dar.(B, C) Induction of tumor formation from SiHa cells treated with rAAV ex vivo. SiHa cells were infected in dishes (diameter: 10 cm) with purified recombinant AAV particles in D-MEM (supplemented with 2% FCS) for 8 hours, the β-galactosidase, antisense-E6 / E7, a combination of antisense-E6 / E7 and MCP-1 or antinsense-MCP-1 expressed. The MOI values are given in the figures. The medium was then exchanged for fresh D-MEM (supplemented with 10% FCS) and the cells were incubated overnight. Mock-infected and treated cells were injected into the loin of nude mice at a concentration of 5 x 10 ⁶ cells / mouse. Tumor volume was determined up to 61 days (B) or 60 days (C) after injection. The curves represent mean values of the tumor volumes of 5 (B), 10 (β-galactosidase and MCP-1) or 5 animals (antisense-MCP-1).

Beispiel 1example 1 Allgemeine VerfahrenGeneral procedures

ZELLINIEN UND ZUCHTBEDINGUNGEN: Die menschliche Zervixkarzinom-Zellinien, SiHa, und HeLa wurden in "Dulbecco's Modified Eagle's" Medium (D-MEM) (BRL) gehalten, dem 10% fötales Kälberserum (FCS), 1% Penicillin und 1% Streptomycin zugesetzt waren.CELL LINES AND BREEDING CONDITIONS: The human Cervical carcinoma cell lines, SiHa, and HeLa were described in "Dulbecco's Modified Eagle's "Medium (D-MEM) (BRL), which holds 10% fetal calf serum (FCS), 1% penicillin and 1% streptomycin were clogged.

REKOMBINANTE AAV-2 PLASMIDE: Die Vektorplasmide pAV-CMV und pAV-K14, die die zwei invertierten terminalen Wiederholungseinheiten (ITR) des adonassoziierten Virus Typ 2 (AAV-2) und den menschlichen CMV-Promotor bzw. Cytokeratin K14 Promotor enthielten, stammten von psub201(+) (Samulski et al., J. Virol. 61, 1987, 3096-3101. Zur Konstruktion dieser Plasmide wurden zum Erhalt des Plasmids pAV zuerst ein DraIII/BamHI-Fragment mit einem poly(A)-Signal sowie das SV40- poly(A)-Signal und die Spleißstelle von pGL-2 (Promega, Mannheim, Deutschland) mit glatten Enden versehen und in psub201(+) inseriert, das mit XbaI geschnitten und danach mit glatten Enden versehen worden war. Vorher war das auf pGL-2 vorhandene Luciferase-Gen durch Spaltung von pGL-2 mit HindIII und EcoRI und anschließender Religation des verbleibenden Plasmidfragments mit glatten Enden entfernt worden. Danach wurden ein HincII/AvaII-Fragment (877 bp), das den menschlichen CMV-IE-Promotor (Lehner et al., J. clin. Microbiol. 29, 1991, 2494-2502) enthält, und ein FspI/EcoRI- Fragment (1460 bp) von dem menschlichen poly(ADP-Ribose)- Polymerase Gen mit glatten Enden versehen und in die nur einmal vorhandene, zwischen den beiden poly(A)-Signalen von pAV gelegene KpnI-Stelle (die mit glatten Enden versehen worden war) cloniert, wodurch das Plasmid pAV-CMV erhalten wurde (Fig. 1). Zur Konstruktion von pAV-K14 wurde der Cytokeratin K14-Promotor (Leask et al., Genes Dev. 4, 1990, 1985-1998) als ein AvaI-Fragment (1964 bp) in die KpnI-Stelle von pAV inseriert (wobei beide DNA-Fragmente mit glatten Enden versehen worden waren). Sowohl pAV-CMV als auch pAV-K14 enthalten die Mehrfachclonierungsstelle von pGL-2, was die einfache Insertion von gewünschten Genen erlaubt (Fig. 1).RECOMBINANT AAV-2 PLASMIDES: The vector plasmids pAV-CMV and pAV-K14, which contained the two inverted terminal repeat units (ITR) of the adon-associated virus type 2 (AAV-2) and the human CMV promoter or cytokeratin K14 promoter, were derived from psub201 (+) (Samulski et al., J. Virol. 61, 1987, 3096-3101. To construct these plasmids, a DraIII / BamHI fragment with a poly (A) signal and the SV40 were first obtained to obtain the plasmid pAV - The poly (A) signal and the splice of pGL-2 (Promega, Mannheim, Germany) were blunt-ended and inserted into psub201 (+), which had been cut with XbaI and then blunt-ended The pGL-2 existing luciferase gene was removed by digesting pGL-2 with HindIII and EcoRI and then religation of the remaining blunt-ended plasmid fragment, followed by a HincII / AvaII fragment (877 bp) that contained the human CMV-IE promoter (Lehner et al., J. clin. Microbiol. 29, 1991, 2494-2502), and an FspI / EcoRI fragment (1460 bp) from the human poly (ADP-ribose) polymerase gene with blunt ends and inserted into the unique, between the two poly (A ) Signals from pAV-located KpnI site (which had been blunt-ended), whereby the plasmid pAV-CMV was obtained ( Fig. 1). To construct pAV-K14, the cytokeratin K14 promoter (Leask et al., Genes Dev. 4, 1990, 1985-1998) was inserted as an AvaI fragment (1964 bp) into the KpnI site of pAV (both DNA Fragments with smooth ends). Both pAV-CMV and pAV-K14 contain the multiple cloning site of pGL-2, which allows easy insertion of desired genes ( Fig. 1).

NORTHERN-BLOT ANALYSEN: Zelluläre Gesamt-RNA von 5 × 10⁶ Zellen wurde mittels der üblichen Guanidin/Isothiocyanat-Lysemethode (Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162, 1987, 156-159) extrahiert. Gleiche RNA-Mengen, die mittels der Messung der optischen Dichte bei 260 nm bestimmt worden waren, wurden auf einem 1% Agarose/Formaldehyd-Gel (50 mM HEPES, pH-Wert 7,8, 1 mM EDTA) aufgetrennt und über Nacht in 25 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 6,8, ("Kapillar-Blotting") auf eine Nylonmembran übertragen (GeneScreen Plus, Du Pont NEN). Zum Nachweis von MCP-1 Transkripten wurden die Nylonfilter 2 Stunden bei 42°C vorhybridisiert und danach mit einer für MCP-1 spezifischen Sonde (Xhol-Fragment von pGEM-hJE34 mit 740 bp, markiert mit ³²p über Zufalls-Priming) bei 42°C über Nacht in Hybridisierungslösung (7% SDS, 0,125 M Natriumphosphat-Puffer, pH-Wert 7,2, 0,25 M NaCl, 1 mM EDTA, 45% Formamid) hybridisiert. Der Filter wurde bei 42°C viermal jeweils 5 min. in 2xSSC (1xSSC = 0, 15 mM NaCl, 15 mM Natriumzitrat)/0,1% SDS und danach zweimal bei 68°C jeweils 30 min. mit 0,2xSSC/0,1% SDS gewaschen. Der Filter wurde an der Luft getrocknet und dann mit Kodak X-Omat XAR-5 Film eine Autoradiographie erstellt.NORTHERN BLOT ANALYZES: Total cellular RNA from 5 × 10 ⁶ cells was extracted using the usual guanidine / isothiocyanate lysis method (Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162, 1987, 156-159). Equal amounts of RNA, which had been determined by measuring the optical density at 260 nm, were separated on a 1% agarose / formaldehyde gel (50 mM HEPES, pH 7.8, 1 mM EDTA) and in overnight Transfer 25 mM phosphate buffer, pH 6.8, ("capillary blotting") to a nylon membrane (GeneScreen Plus, Du Pont NEN). To detect MCP-1 transcripts, the nylon filters were prehybridized for 2 hours at 42 ° C and then with a probe specific for MCP-1 (Xhol fragment of pGEM-hJE34 with 740 bp, labeled with ³² p via random priming) at 42 ° C hybridized overnight in hybridization solution (7% SDS, 0.125 M sodium phosphate buffer, pH 7.2, 0.25 M NaCl, 1 mM EDTA, 45% formamide). The filter was four times at 42 ° C for 5 min. in 2xSSC (1xSSC = 0.15 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) / 0.1% SDS and then twice at 68 ° C for 30 min each. washed with 0.2xSSC / 0.1% SDS. The filter was air dried and then autoradiography was performed using Kodak X-Omat XAR-5 film.

HERSTELLUNG VON rAAV-PARTIKELN: AAV-2 Partikel wurden über Cotransfektion von 293-Zellen mit einem der Vektorkonstrukte und dem "Verpackungsplasmid" pDG, wie kürzlich beschrieben hergestellt (Grimm et al., Hum. Gene Ther. 9, 1998, 2745-2760). Die Zellen wurden 48 Stunden nach Transfektion geerntet, mehrmals eingefroren und aufgetaut und danach zur Entfernung von Zelldebris 10 min. bei 5000 × g zentrifugiert. Typische rAAV-Titer in dem geklärten Überstand waren 106 bis 10⁷ infektiöse Einheiten/ml, was über Replikationsassays (Grimm et al., supra) bestimmt wurde.PREPARATION OF rAAV PARTICLES: AAV-2 particles were prepared by cotransfecting 293 cells with one of the vector constructs and the "packaging plasmid" pDG as described recently (Grimm et al., Hum. Gene Ther. 9, 1998, 2745-2760 ). The cells were harvested 48 hours after transfection, frozen and thawed several times and then 10 minutes to remove cell debris. Centrifuged at 5000 × g. Typical rAAV titers in the clarified supernatant were 106 to 10 ⁷ infectious units / ml, which was determined by replication assays (Grimm et al., Supra).

KONZENTRIERUNG DER VEKTORPARTIKEL: Die Konzentrierung der rAAV Partikel erfolgte über Säulenchromatographie mit sulfonierter Zellulose (Cellufinsulfat) als Matrix (Tamayose et al., Hum. Gene Ther. 7, 1996, 507-513). Der geklärte Überstand von insgesamt 10 Schalen (Durchmesser: 14 cm) wurde über Nacht langsam auf die Säule aufgetragen (2 ml Säulenvolumen; Amicon, Witten, Deutschland). Nach Waschen mit PBS wurden die AAV-2 Vektorpartikel mit 10 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,2, der 1 M NaCl enthielt, eluiert. 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt, wobei die meisten Partikel in den beiden ersten Fraktionen enthalten waren. Zur weiteren Aufreinigung und Konzentrierung wurden alle Vektorpartikel enthaltenden Fraktionen vereinigt und durch ein Saccharosekissen zentrifugiert. Dieses Saccharosekissen wurde durch Unterschichtung von 450 µl 30% Saccharose in TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH-Wert 7,6) mit 500 µl 50% Saccharose in TE hergestellt. Die vereinigten Fraktionen mit den eluierten Partikeln (in 1 M NaCl, etwa 3 ml) wurden auf das Saccharosekissen aufgetragen und 2,5 Stunden bei 4°C unter Verwendung eines SW 60-Rotors (Kontron, Neufahrn, Deutschland) bei 45.000 UpM (273.000 × g) zentrifugiert. Die pelletierten Partikel würden in 0,5 ml OPTI-MEM (BRL, Karlsruhe, Deutschland) resuspendiert, das mit 1% Penicillin und 1% Streptomycin supplementiert worden war.CONCENTRATION OF THE VECTOR PARTICLES: The concentration of the rAAV Particles took place via column chromatography with sulfonated Cellulose (Cellufinsulfat) as matrix (Tamayose et al., Hum. Gene Ther. 7, 1996, 507-513). The cleared supernatant from a total of 10 bowls (diameter: 14 cm) were left overnight slowly applied to the column (2 ml column volume; Amicon, Witten, Germany). After washing with PBS, the AAV-2 Vector particles with 10 mM phosphate buffer, pH 7.2, the 1 M NaCl contained, eluted. 2 ml fractions were collected with most of the particles in the first two fractions were included. For further purification and concentration all fractions containing vector particles were pooled and centrifuged through a sucrose cushion. This Sucrose pillow was 30% by layering 450 µl Sucrose in TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.6) with 500 µl 50% sucrose made in TE. The United Fractions with the eluted particles (in 1 M NaCl, about 3 ml) were applied to the sucrose cushion and 2.5 Hours at 4 ° C using a SW 60 rotor (Kontron, Neufahrn, Germany) at 45,000 rpm (273,000 × g) centrifuged. The pelleted particles would be in 0.5 ml OPTI-MEM (BRL, Karlsruhe, Germany) resuspended with 1% penicillin and 1% streptomycin had been supplemented.

ASSAY BEZÜGLICH TUMORERZEUGUNG: SiHa- oder HeLa-Zellen wurden mit gereinigten rekombinanten Viren bei einer MOI von 2, 10 oder 25 in mit 2% FCS supplementiertem D-MEM infiziert. Acht Stunden nach Infektion wurde das Inokulum entfernt und gegen frisches, mit 10% FCS supplementiertes D-MEM ausgetauscht. Am nächsten Tag wurden die infizierten Zellen mittels Trypsinisierung geerntet, zweimal mit PBS gespült und in "Hank's"-Puffer resuspendiert. Für jede Injektion wurden 2 × 10⁶ HeLa-Zellen oder 5 × 10⁶ SiHa-Zellen in 0,15 ml "Hank's"- Puffer subcutan in eine weibliche Nacktmaus (nu/nu; Alter: 5 bis 6 Wochen) injiziert. Die Tumore wurden über einen Zeitraum von 25 Tagen (für von HeLa-Zellen stammende Tumore) oder über einen Zeitraum von 60 Tagen (für von SiHa-Zellen stammende Tumore) hinsichtlich ihrer Durchmesser zweimal wöchentlich bestimmt. Das Tumorvolumen wurde entsprechend der Formel 1/6π a × b × c bewertet, wobei a, b und c die senkrecht aufeinanderstehenden Durchmesser des Tumors darstellen.TUMOR GENERATION ASSAY: SiHa or HeLa cells were infected with purified recombinant viruses at an MOI of 2, 10 or 25 in D-MEM supplemented with 2% FCS. The inoculum was removed eight hours after infection and replaced with fresh D-MEM supplemented with 10% FCS. The next day the infected cells were harvested by trypsinization, rinsed twice with PBS and resuspended in "Hank's" buffer. For each injection, 2 × 10 ⁶ HeLa cells or 5 × 10 ⁶ SiHa cells in 0.15 ml "Hank's" buffer were injected subcutaneously into a female nude mouse (nu / nu; age: 5 to 6 weeks). The tumors were measured twice a week for a period of 25 days (for tumors derived from HeLa cells) or for a period of 60 days (for tumors derived from SiHa cells). The tumor volume was evaluated according to the formula 1 / 6π a × b × c, where a, b and c represent the perpendicular diameters of the tumor.

ELISA-TESTS UND CHEMOTAXIS-ASSAYS: SIHA-Zellen (5 × 10³) wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und mit gereinigten rekombinanten AAV-2 MCP-1 Viruspartikeln bei einer MOI von 20, 50, 100 oder 400 in D-MEM, das mit 2% FCS supplementiert war, infiziert. Die Zellüberstände wurden 1,2 oder 5 Tage später gesammelt und hinsichtlich der Gegenwart von MCP-1 getestet, wobei ein kommerziell erhältlicher ELISA verwendet wurde (R, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland). Die chemotaktische Aktivität von MCP-1 wurde mittels des Chemotaxis-Assays gemessen. Menschliche Monocyten wurden mittels Elution in einem JE-6 Rotor (Beckmann) wie in Sanderson et al., J. Immunol. 118, 1977, 1409-1414) beschrieben isoliert. Die Monocyten wurden zu einer Dichte von 1 × 10⁶ pro ml resuspendiert und der Chemotaxis-Assay wurde unter Verwendung einer Migrationskammer (48 Vertiefungen) mit einer 5 µm Membran durchgeführt (Nucleopore). Die Chemotaxis- Kammer wurde 90 min. in einem Zellinkubator mit befeuchteter Luft inkubiert. Gewanderte Zellen wurden mittels eines "Hematocolor"-Sets (Merck, Darmstadt, Deutschland) angefärbt und bei einer 320fachen Vergrößerung gezählt. 1% menschliches Serum wurde als Chemotaxis-positive Kontrolle verwendet (Kreuzer et al., J. Artheriosclerosis 90, 1991, 203-209). Pro Experiment wurden mindestens 3 Vertiefungen verwendet. Pro Vertiefungen wurden fünf "Highpower"-Felder ausgezählt. Alle Experimente wurden in dreifacher oder vierfacher Ausfertigung durchgeführt. Die Ergebnisse sind als die durchschnittliche Anzahl von gewanderten Zellen in Prozent der Wanderungsreaktion von Kontrollzellen angegeben.ELISA TESTS AND CHEMOTAXIS ASSAYS: SIHA cells (5 × 10 ³ ) were plated in 96-well plates and with purified recombinant AAV-2 MCP-1 virus particles at an MOI of 20, 50, 100 or 400 in D-MEM that was supplemented with 2% FCS. The cell supernatants were collected 1, 2 or 5 days later and tested for the presence of MCP-1 using a commercially available ELISA (R, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany). The chemotactic activity of MCP-1 was measured using the chemotaxis assay. Human monocytes were eluted in a JE-6 rotor (Beckmann) as described in Sanderson et al., J. Immunol. 118, 1977, 1409-1414). The monocytes were resuspended to a density of 1 x 10 ⁶ per ml and the chemotaxis assay was performed using a migration chamber (48 wells) with a 5 µm membrane (nucleopore). The chemotaxis chamber was 90 min. incubated with humidified air in a cell incubator. Migrated cells were stained using a "Hematocolor" set (Merck, Darmstadt, Germany) and counted at 320 times magnification. 1% human serum was used as a chemotaxis-positive control (Kreuzer et al., J. Artheriosclerosis 90, 1991, 203-209). At least 3 wells were used per experiment. Five "high power" fields were counted per well. All experiments were carried out in triplicate or quadruple. The results are reported as the average number of cells migrated as a percentage of the migration response of control cells.

Beispiel 2Example 2 Herstellung von MCP-1 exprimierenden AAV-2 VektorplasmidenProduction of MCP-1 expressing AAV-2 vector plasmids

Die Herstellung der Ausgangsplasmide pAV-CMV und pAV-K14 wurde bereits in Beispiel 1 beschrieben. Bei deren Herstellung wurde zur Erzielung der für die optimale Verpackung der AAV-2 Vektoren erforderlichen Mindestgröße ein 1,46 kb-Fragment der poly(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP) vor die Expressionskassette und ein zweites poly(A)-Signal hinter die 5'ITR von AAV-2 cloniert, die die mögliche Expression des PARP-Fragments durch eine mögliche kryptische Promotoraktivität in der 5'ITR verhindern sollte. In die mit XhoI linearisierten Plasmide pAV-CMV und pAV-K14 wurde ein XhoI-Fragment von pGEM-hJE34 mit einer Länge von 740 bp cloniert. Die erhaltenen AAV-2 Vektorkonstrukte erhielten die Bezeichnungen pAV-CMV-MCP-1 und pAV-K14-MCP-1 (Fig. 2A). Die Expression von MCP-1 nach Transfer der Vektorplasmide in HeLa-Zellen wurde mittels Northern Blotting und einem MCP-1 ELISA analysiert (Fig. 2B, 2C). In Northern Blots mit RNA von HeLa-Zellen, die sowohl mit dem CMV-gesteuerten als auch dem K14-gesteuerten Expressionskonstrukt transfiziert waren, wurde ein spezifisches Transkript nachgewiesen, das wegen des längeren 3'-untranslatierten Anteils des JE-Gens in den Vektorkonstrukten im Vergleich zu dem Transkript des endogenen Gens in 444-Zellen eine geringere Mobilität zeigte (Kleine et al., Mol. Carcinog. 14, 1995, 179-189). Wie aus den Northern- Analysen und den ELISA-Daten ersichtlich ist, erzeugten zwei unterschiedliche Clone der CMV-gesteuerten Expressionskonstrukte eine 10 bis 30fach höhere Menge an MCP-1 im Vergleich zu dem K14-gesteuerten Konstrukt.The preparation of the starting plasmids pAV-CMV and pAV-K14 has already been described in Example 1. In order to achieve the minimum size required for the optimal packaging of the AAV-2 vectors, a 1.46 kb fragment of the poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) was placed in front of the expression cassette and a second poly (A) signal behind in order to achieve the minimum size cloned the 5'ITR of AAV-2, which should prevent the possible expression of the PARP fragment by a possible cryptic promoter activity in the 5'ITR. An XhoI fragment of pGEM-hJE34 with a length of 740 bp was cloned into the plasmids pAV-CMV and pAV-K14 linearized with XhoI. The AAV-2 vector constructs obtained were given the names pAV-CMV-MCP-1 and pAV-K14-MCP-1 ( FIG. 2A). The expression of MCP-1 after transfer of the vector plasmids in HeLa cells was analyzed by Northern blotting and an MCP-1 ELISA ( Fig. 2B, 2C). In Northern blots with RNA from HeLa cells, which were transfected with both the CMV-controlled and the K14-controlled expression construct, a specific transcript was detected which, because of the longer 3'-untranslated portion of the JE gene in the vector constructs in the Compared to the transcript of the endogenous gene in 444 cells showed less mobility (Kleine et al., Mol. Carcinog. 14, 1995, 179-189). As can be seen from the Northern analyzes and the ELISA data, two different clones of the CMV-controlled expression constructs produced a 10 to 30-fold higher amount of MCP-1 compared to the K14-controlled construct.

Beispiel 3Example 3 Infektion von Zervixkarzinom-Zellen mit rekombinantem AAV-2 und Expression von MCP-1Infection of cervical cancer cells with recombinant AAV-2 and expression of MCP-1

Zur Etablierung von definierten Infektionsbedingungen für Zervixkarzinom-Zellen mit rekombinantem AAV-2 wurden HeLa- und SiHa-Zellen mit einem rAAV infiziert, das das lacZ-Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimiert (Grimm et al., supra) und die transduzierten Gene wurden mittels histochemischer Anfärbung untersucht. Bereits bei einer MOI von 1 wurden einige SiHa-Zellen transduziert, bei einer MOI von 5 etwa 35% der Zellen und bei einer MOI von 10 50% (Fig. 3). Nach Infektion von HeLa-Zellen wurden ähnliche Werte erhalten. Nach Infektion von SiHa-Zellen mit ansteigenden MOIs an AAV-2, die MCP-1 unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimierten, wurde eine MCP-1 Expression induziert, die Werte bis zu 4 µg/ml Medium erreichte. Die Expression hielt über 5 Tage an (Fig. 4A). Die Analyse der chemotaktischen Aktivität des sezernierten MCP-1 zeigte ebenfalls ein MOI-abhängiges Ansteigen und ein verlängertes Fortbestehen der chemotaktischen Aktivität. Mit dem Überstand von Zellen, die mit niedrigeren MOIs infiziert worden waren, wurde allerdings eine hohe Variabilität der Ergebnisse auf Grund der geringeren Empfindlichkeit dieses Assays beobachtet (Fig. 4B). In order to establish defined conditions of infection for cervical carcinoma cells with recombinant AAV-2, HeLa and SiHa cells were infected with an rAAV which expresses the lacZ gene under the control of the CMV promoter (Grimm et al., Supra) and which transduced Genes were examined using histochemical staining. Some SiHa cells were already transduced at an MOI of 1, about 35% of the cells at an MOI of 5 and 10 50% at an MOI ( FIG. 3). Similar values were obtained after infection of HeLa cells. After infection of SiHa cells with increasing MOIs on AAV-2, which expressed MCP-1 under the control of the CMV promoter, an MCP-1 expression was induced which reached values up to 4 µg / ml medium. Expression continued for 5 days ( Fig. 4A). Analysis of the chemotactic activity of the secreted MCP-1 also showed an MOI-dependent increase and a prolonged persistence of the chemotactic activity. With the supernatant of cells infected with lower MOIs, however, a high variability of the results was observed due to the lower sensitivity of this assay ( FIG. 4B).

Beispiel 4Example 4 Auswirkungen von MCP-1 exprimierenden rAAV auf das Tumorwachstum in NacktmäusenEffects of MCP-1 expressing rAAV on the Tumor growth in nude mice

Während AAV-2 Konstrukte, bei denen die Expression der beiden frühen Gene E6 und E7 des menschlichen Papillomavirus (HPV) durch die Expression von antisense-E6/E7-RNA bzw. entsprechenden Ribozymen unterdrückt wurde, zu keiner signifikanten Hemmung der Tumorbildung von implantierten SiHa- Zellen führten, konnte nach Transfer und Expression der in den Beispielen 2 und 3 beschriebenen, MCP-1 exprimierenden Konstrukte eine deutliche Hemmung des Tumorwachstums beobachtet werden. Für die Experimente hinsichtlich des Einflusses des MCP-1 Gens auf das Tumorwachstum in Nacktmäusen wurde der Vektor gewählt, bei dem die Expression unter der Kontrolle des CMV-Promotors steht. Die Experimente wurden zuerst durch ex vivo-Infektion von HeLa-Zellen 8 Stunden mit einer MOI von 2 bzw. SiHa-Zellen mit einer MOI von 10 oder 25 und die Implantation der Tumorzellen in Nacktmäuse durchgeführt. Das Tumorvolumen wurde für von HeLa-Zellen stammende Tumore bis zum 25. Tag und für von SiHa-Zellen stammende Tumore bis zum 60. Tag gemessen. Kontrolltieren wurden HeLa-Zellen bzw. SiHa-Zellen implantiert, die mit rAAV infiziert waren, die das lacZ-Gen oder antisense-MCP-1 exprimierten. Ein signifikanter Effekt auf das Tumorwachstum konnte jedoch nur bei den Tieren beobachtet werden, denen HeLa-Zellen bzw. SiHa-Zellen implantiert worden waren, die mit MCP-1 exprimierenden rAAV infiziert worden waren: Das Tumorvolumen von implantierten HeLa-Zellen wurde signifikant verringert (Fig. 5A) und bei von SiHa-Zellen stammenden Tumoren wurden sowohl das Wachstum der Tumore als auch das Tumorvolumen verringert (Fig. 5B, 5C). Die Injektion von 5 × 10⁶ infektiösen Einheiten von MCP-1 exprimierenden rekombinanten AAV-2 in etablierte Tumore in zwei Serien mit jeweils 8 Tieren führte zu einer Verringerung der Geschwindigkeit des Tumorwachstums. Die histochemische Analyse der Verteilung der Makrophagen im Tumor, in der Tumorzellenkapsel und im an das nekrotische Gebiet angrenzenden Bereich mittels Mac-3 Antikörpern ergab allgemein eine geringe oder mäßige Anhäufung von Makrophagen im Tumor und im an das nekrotische Gebiet angrenzenden Bereich. Allerdings konnte in der Kapsel in mit rAAV-MCP-1 behandelten Tumoren innerhalb der ersten beiden Wochen eine erhöhte Makrophagenkonzentration nachgewiesen werden, die dann während der folgenden 12 Wochen abnahm. Die direkte Injektion der rAAV-MCP-1-Konstrukte in den Tumor führte zu einer mäßigen Anhäufung von Makrophagen im Tumor bzw. einer hohen Anhäufung im an das nekrotische Gebiet angrenzenden Bereich.While AAV-2 constructs, in which the expression of the two early genes E6 and E7 of the human papillomavirus (HPV) was suppressed by the expression of antisense-E6 / E7-RNA or corresponding ribozymes, did not significantly inhibit the tumor formation of implanted SiHa - Cells, a clear inhibition of tumor growth was observed after transfer and expression of the constructs expressing MCP-1 described in Examples 2 and 3. For the experiments regarding the influence of the MCP-1 gene on tumor growth in nude mice, the vector was chosen in which the expression is under the control of the CMV promoter. The experiments were first carried out by ex vivo infection of HeLa cells with an MOI of 2 or SiHa cells with an MOI of 10 or 25 for 8 hours and the implantation of the tumor cells in nude mice. The tumor volume was measured up to the 25th day for tumors derived from HeLa cells and up to the 60th day for tumors derived from SiHa cells. Control animals were implanted with HeLa cells and SiHa cells, respectively, which were infected with rAAV and which expressed the lacZ gene or antisense MCP-1. However, a significant effect on tumor growth could only be observed in the animals that had been implanted with HeLa cells or SiHa cells that had been infected with MCP-1-expressing rAAV: The tumor volume of implanted HeLa cells was significantly reduced ( both the growth of the tumors Fig. 5A) and of SiHa cell-derived tumors as well as the tumor volume decreased (Fig. 5B, 5C). The injection of 5 × 10 ⁶ infectious units of MCP-1 expressing recombinant AAV-2 into established tumors in two series with 8 animals each resulted in a reduction in the rate of tumor growth. The histochemical analysis of the distribution of the macrophages in the tumor, in the tumor cell capsule and in the area adjacent to the necrotic area using Mac-3 antibodies generally showed a slight or moderate accumulation of macrophages in the tumor and in the area adjacent to the necrotic area. However, an increased macrophage concentration was detected in the capsule in tumors treated with rAAV-MCP-1 within the first two weeks, which then decreased during the following 12 weeks. The direct injection of the rAAV-MCP-1 constructs into the tumor led to a moderate accumulation of macrophages in the tumor or a high accumulation in the area adjacent to the necrotic area.

Claims

1. AAV-Expressionsvektor, mit einer das Monocyten chemotaktische Protein 1 (MCP-1) codierenden DNA-Sequenz.1. AAV expression vector, with one the monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) coding DNA sequence.

2. AAV-Expressionsvektor nach Anspruch 1, umfassend folgende DNA-Sequenzen:

a) die 5'ITR und 3'ITR eines adenoassoziierten Virus (AAV)
b) einen in Säugern aktiven konstitutiven oder induzierbaren Promotor;
c) eine mit dem Promotor von (b) funktionell verknüpfte, das Monocyten-chemotaktische Protein 1 (MCP-1) codierende DNA-Sequenz; und
d) ein Polyadenylierungssignal.

2. AAV expression vector according to claim 1, comprising the following DNA sequences:

a) the 5'ITR and 3'ITR of an adeno-associated virus (AAV)
b) a constitutive or inducible promoter active in mammals;
c) a DNA sequence which is functionally linked to the promoter of (b) and encodes the monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1); and
d) a polyadenylation signal.

3. AAV-Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die 5'ITR und/oder 3'ITR von AAV-2 stammen.3. AAV expression vector according to claim 1 or 2, wherein the 5'ITR and / or 3'ITR come from AAV-2.

4. AAV-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Promotor ein Gewebe- und/oder Tumor spezifischer Promotor ist.4. AAV expression vector according to one of claims 1 to 3, wherein the promoter is a tissue and / or tumor is a specific promoter.

5. AAV-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Promotor ein CMV-Promotor oder ein Cytokeratin K14-Promotor ist.5. AAV expression vector according to one of claims 1 to 3, the promoter being a CMV promoter or a cytokeratin Is K14 promoter.

6. AAV-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die MCP-1 codierende DNA-Sequenz gegenüber dem Promotor in "sense"-Orientierung vorliegt.6. AAV expression vector according to one of claims 1 to 5, the MCP-1 coding DNA sequence compared to the Promoter in "sense" orientation is present.

7. AAV-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die MCP-1 codierende DNA-Sequenz gegenüber dem Promotor in "antisense"-Orientierung vorliegt.7. AAV expression vector according to one of claims 1 to 5, the MCP-1 coding DNA sequence compared to the Promoter in "antisense" orientation is present.

8. AAV-Expressionsvektor nach Anspruch 6, der pAV-CMV-MCP-1 (DSM 12920 oder pAV-K14-MCP-1 (DSM 13015).8. AAV expression vector according to claim 6, the pAV-CMV-MCP-1 (DSM 12920 or pAV-K14-MCP-1 (DSM 13015).

9. AAV-Expressionsvektor nach Anspruch 7, der pAV-CMV-anti MCP-1 (DSM 12991) ist.9. AAV expression vector according to claim 7, the pAV-CMV-anti MCP-1 (DSM 12991).

10. AAV-Partikel, enthaltend den AAV-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 8.10. AAV particles containing the AAV expression vector after one of claims 1 to 6 or 8.

11. AAV-Partikel, enthaltend den AAV-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 7 oder 9.11. AAV particles containing the AAV expression vector after one of claims 1 to 5, 7 or 9.

12. Arzneimittel, enthaltend den AAV-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder das AAV-Partikel nach Anspruch 10 oder 11 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.12. Medicament containing the AAV expression vector after one of claims 1 to 9 or the AAV particle Claim 10 or 11 and a pharmaceutical compatible carrier.

13. Zelle, enthaltend den AAV-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder das AAV-Partikel nach Anspruch 10 oder 11.13. Cell containing the AAV expression vector after one of claims 1 to 9 or the AAV particle according to claim 10 or 11.

14. Zelle nach Anspruch 13, die eine Säugerzelle ist.14. The cell of claim 13 which is a mammalian cell.

15. Zelle nach Anspruch 14, die eine 293-Zelle ist.15. The cell of claim 14 which is a 293 cell.

16. Verwendung des AAV-Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 8 oder des AAV-Partikels nach Anspruch 10 zur Therapie von HPV-induzierten Tumoren.16. Use of the AAV expression vector according to one of the Claims 1 to 6 or 8 or of the AAV particle according to Claim 10 for the therapy of HPV-induced tumors.

17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Tumortherapie die Therapie des Zervixkarzinoms ist.17. Use according to claim 16, wherein the tumor therapy Therapy of cervical cancer is.

18. Verwendung des AAV-Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 8 oder des AAV-Partikels nach Anspruch 10 zur Förderung oder Induktion der Angiogenese.18. Use of the AAV expression vector according to one of the Claims 1 to 6 or 8 or of the AAV particle according to Claim 10 for the promotion or induction of angiogenesis.

19. Verwendung des AAV-Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 7 oder 9 oder des AAV-Partikels nach Anspruch 11 zur Behandlung von Entzündungsprozessen.19. Use of the AAV expression vector according to one of the Claims 1 to 5, 7 or 9 or of the AAV particle according to Claim 11 for the treatment of inflammatory processes.