DE19955803A1

DE19955803A1 - Verwendung von Heparanase-Inhibitoren zur Behandlung von Hersinsuffizienz

Info

Publication number: DE19955803A1
Application number: DE19955803A
Authority: DE
Inventors: Dieter Herr; Alfred Hahn; Volker Laux
Original assignee: Knoll GmbH
Current assignee: Abbott GmbH and Co KG
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 1999-11-19
Publication date: 2001-05-23
Also published as: WO2001035967A1; AU1522101A; EP1229921A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Heparanase-Inhibitoren zur Behandlung von Herzinsuffizienz, insbesondere kongestiver Herzinsuffizienz, und damit zusammenhängenden Anzeichen, Symptomen und/oder Fehlfunktionen, wie peripheren Ödemen, Lungen- und Leberkongestion, Dyspnoe, Brust- und Bauchwassersucht.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung wenigstens ei nes Heparanase-Inhibitors zur Behandlung von Herzinsuffizienz und damit zusammenhängenden Anzeichen, Symptomen und/oder Fehlfunk tionen.

Proteoglykane sind polyanionische Substanzen hohen Molekularge wichts, in denen verschiedene Arten von Heteropolysaccharid-Ket ten kovalent an ein Polypeptidrückgrat gebunden sind. Die ehemals als Mucopolysaccharide bezeichneten Polysaccharidgruppen der Pro teoglykane werden neuerdings als Glycosaminoglykane bezeichnet. Eine Vielzahl von Enzymen ist an dem Auf-, Um- und Abbau dieser Proteoglykane beteiligt. Durch Proteolyse können Glycosaminogly kane freigesetzt werden, die wiederum unter der Einwirkung von Glycosaminoglykan-Endoglycosidasen in kleinere Fragmente zerlegt werden, während entsprechende Exoglycosidasen Monosaccharide von den nicht-reduzierenden Enden der Glycosaminoglykane freisetzen.

Heparansulfat (HS) und Heparansulfat-Proteoglykane (HSPG) kommen auf der extrazellulären Oberfläche und in der extrazellulären Ma trix vor. Die HS-Ketten werden im allgemeinen aus Clustern sulfa tierter Disaccharid-Einheiten, vornehmlich 1-4 an α-Iduronsäure- Reste gebundenes N-sulfatiertes Glucosamin, gebildet, die durch wenig oder nicht sulfatierte Regionen, vornehmlich 1-4 an β-D-Glucuronsäure gebundenes N-acetyliertes Glucosamin, voneinan der getrennt sind. Ihnen wird eine Hauptrolle in Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen zugeschrieben, die an verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt sind. Zu nennen sind hier beispielsweise die Adhäsion, Migration, Differenzierung und Proliferierung von Zellen. Berichten zufolge interagieren verschiedene Moleküle mit HS und/oder HSPG. Es han delt sich dabei entweder um Wachtstumsfaktoren (z. B. FGF, PDGF, VEGF), Cytokine (IL-2), extrazelluläre Matrixproteine (Fibronek tin, Collagen), an der Hämostase beteiligte Faktoren (Heparin-Co faktor II), oder um Moleküle anderer Natur, z. B. Lipoproteine, DNA-Topoisomerasen und β-Amyloidproteine (vgl. Hileman et al. (1998) BioEssays 20, 156-167; Stringer and Gallagher (1997) Int. J. Biochem Cell Biol 29, 709-714; Rapraeger (1993) Curr. Opin Cell. Biol. 5, 844-853; Bernfield et al. (1993) Development 1993 Suppl. 205-212; Kjellen and Lindahl. (1991) Annu. Rev. Biochem. 60, 443-475; Schlessinger et al. (1995), Cell 83, 367-360; Turnbull und Gallagher (1993) Biochem. Soc. Trans. 21, 477-482; Najjam et al (1997) Cytokine 9, 1013-1022; Ho et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 16838-16844; Pillarisetti et al (1997) J. Biol.

Chem. 272, 15753-15759; Kovalszky et al. (1998) Mol. Cell. Biol. 183, 11-23; Schulz et al. (1998) Eur. J. Neuroscience 10, 2085-2093).

Angesichts dieser vielfältigen Beteiligung ist HS/HSPG-modulie renden Enzymen besonderes Interesse entgegengebracht worden (Ernst et al. (1995) Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 30, 387-444).

Endoglycosidasen und insbesondere endo-β-Glucuronidase (im folgen den Heparanase genannt) fanden Beachtung, da sie mit der Metasta sierung von Tumoren, endzündlichen Prozessen und der Leukozyten wanderung in Verbindung gebracht wurden (Vlodavsky et al. (1999) Genbank Accession Nr. AF 144325; Hulett et al. (1999) Nature Medicine 5, 803-809; Toyoshima and Nakajima (1999) J. Bio. Chem 274, 24153-24160). Tatsächlich wurde Heparanase ursprünglich in murinen metastatischen Melanomzellen entdeckt. Heparanase spaltet HS in charakteristische Fragmente hohen Molekulargewichts und diese Aktivität wurde mit dem metastatischen Potential der Mela nomzellen korreliert (Nakajima et al. (1983) Science 220, 601-613; Nakajima et al. (1984) J. Biol. Chem. 259, 2283-2290). Infolge wurde eine erhöhte Heparanase-Aktivität in weiteren mobi len, invasiven Zellen aufgezeigt, beispielsweise in Zusammenhang mit Lymphomen, Mastocytomen, Adenocarzinomen, Leukämien und rheu matoiden Fibroblasten.

Gestützt auf diese Beobachtungen schlug man vor, Heparanase-In hibitoren zu verwenden, um das invasive Potential von Zellen in Zusammemhang mit pathologischen Zuständen günstig zu beeinflus sen. In diesem Sinne wird in der WO 99/43 830 vermutet, daß Inhi bitoren der Heparanase-Aktivität auch bei der Behandlung von Ar thritis, Asthma und anderen entzündlichen Erkrankungen, vaskulä rer Restenose, Atherosklerose, Tumorwachstum und -progression und fibroproliferativen Erkrankungen von Nutzen sein könnten, denn all diesen Zuständen liegt eine Einwanderung von Fremdzellen in das betroffene Gewebe bzw. Organ zugrunde.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue therapeutische Anwendungen für eine Modulation der Heparanase-Aktivität bereit zustellen.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Inhibition der Heparanase-Aktivität eine Behandlung von Herzsuffizienz ermög licht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung wenig stens eines Heparanase-Inhibitors zur Behandlung von Herzinsuffi zienz.

Unter Herzinsuffizienz (synonym: Myocardinsuffizienz, Herzmuskel schwäche, Insuffizienzia cordis) versteht man erfindungsgemäß ein Unvermögen des Herzens, die erforderliche Förderleistung zu er bringen. Der Begriff Herzinsuffizienz beschreibt den Zustand ei nes Herzes, in dem Kompensationsmechanismen wie Herzfrequenz, Kontraktivität, Schlagvolumen, Hypertonie, nicht zur Aufrechter haltung eines normalen Herzzeitvolumens ausreichen. Es handelt sich um eine Schwäche der Pumpenfunktion.

Dieser Zustand kann bei Belastung (Belastungsinsuffizienz) oder schon in Ruhe (Ruheinsuffizienz) auftreten. Je nach Schweregrad wird gemäß der New York Heart Association (NYHA) unterschieden zwischen Funktionsklassen I bis IV, d. h. einer völligen Beschwer defreiheit bei normaler körperlicher Belastung bis hin zu Insuf fizienzzeichen bei jeder körperlichen Tätigkeit, die häufig auch in Ruhe bestehen.

Die Herzinsuffizienz kann das gesamte Herz (globale Herzinsuffi zienz) oder Teile davon betreffen, beispielsweise Links- oder Rechtsherzinsuffizienz.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Behandlung von Myokardinsuffi zienzen, d. h. Herzinsuffizienzen, die auf eine Veränderung des Myokards zurückzuführen sind. Zu nennen sind in diesem Zusammen hang insbesondere Kardiomyopathien und vorzugsweise primäre Kar diomyopathien, beispielsweise durch Hypertrophie des Herzens, vor allem des Kammerseptums und des linken Ventrikels gekennzeichnete hypertrophe obstruktive oder nicht-obstruktive Kardiomyopathien und durch Hypertrophie und Dilatation des Herzens gekennzeichnete kongestive Kardiomyopathien (auch als dilatative kongestive Kar diomyopathien bezeichnet).

Den erfindungsgemäß bevorzugt behandelten Formen von Herzinsuffi zienz, insbesondere kongestiver Herzinsuffizienz, liegen eine oder mehrere der nachfolgend aufgezählten Veränderungen des Myo kards zugrunde: Hypertrophie einzelner oder aller Wandschichten, Abnahme der Muskeldehnbarkeit, Herzvergrößerung, insbesondere Ventrikelvergrößerung, insbesondere ohne Dickenzunahme der Ven trikelmuskulatur, Dickenabnahme der Ventrikelmuskulatur und fi brotische Veränderungen der Ventrikelmuskulatur.

Die erfindungsgemäß zu behandelnde Indikation Herzinsuffizienz ist in der Regel gekennzeichnet durch eine progressive Entwick lung, d. h. die vorstehend beschriebenen Zustände verändern sich im Laufe der Zeit, in der Regel nimmt der Schweregrad zu und ge gebenenfalls können Zustände ineinander übergehen oder weitere Zustände zu bereits bestehenden Zuständen hinzutreten.

In diesem Sinne werden erfindungsgemäß insbesondere Veränderungen des Myokards behandelt, die unter dem Begriff "remodelling" zu sammengefaßt werden; das sind Vorgänge, die Veränderungen in der Myokardiocyt-Struktur und/oder Veränderungen umgebenden Bindege webes mit sich bringen.

Durch die erfindungsgemäße Behandlung von Herzinsuffizienz bzw. den ihr zugrundeliegenden Zuständen lassen sich eine Reihe weite rer Anzeichen, Symptome und/oder Fehlfunktionen behandeln, die mit Herzinsuffizienz zusammenhängen, d. h. insbesondere die oben beschriebenen Erkrankungszustände begleiten. Hierzu gehören bei spielsweise Veränderungen des peripheren Kreislaufs, insbesondere Stauungserscheinungen im großen und/oder im kleinen Kreislauf, z. B. Lungen- und Leberkongestion, eine Verminderung der Blutver sorgung der Kreislaufperipherie, Störungen der Atmumg (Dyspnoe), der Nierenfunktion, z. B. Nykturie, und des Elektrolytstoffwech sels, z. B. periphere Ödeme, Brust- und Bauchwassersucht, etc. Diese Anzeichen, Symptome und/oder Fehlfunktionen bilden häufig Muster oder Gruppen, die als Syndrome bezeichnet werden, so daß sich erfindungsgemäß die Behandlung des Syndroms Herzinsuffienz ergibt.

Eine Behandlung im erfindungsgemäßen Sinne umfaßt nicht nur die Behandlung akuter oder chronischer Anzeichen, Symptomen und/oder Fehlfunktionen, sondern auch eine vorbeugende Behandlung (Präven tion).

Der Begriff "Heparanase-Inhibitor" beschreibt Substanzen, welche die enzymatische Aktivität von Haparanase oder deren Expression inhibieren. Unter Inhibition wird in diesem Zusammenhang eine Verminderung der Enzymaktivität, vor allem der Aktivität als En doglycosidase, Endoglucuronidase, β-Glucuronidase und insbesondere Endo-β-Glucuronidase, bzw. der Expression von Heparanase verstan den. Die Enzymaktivität von Heparanase führt beispielsweise zur Spaltung von Glycosaminoglykanen, gegebenenfalls als Teil von Proteoglykanen, insbesondere von Heparansulfat, bzw. den entspre chenden Proteoglykane. Vorzugsweise bewirken erfindungsgemäße He paranase-Inhibtioren eine Verringerung des HS- und HSPG-Abbaus durch Heparanase.

Erfindungsgemäß bevorzugt sind Inhibitoren von Säuger-Heparanase (EC 3.2.1) und insbesondere von humaner Heparanase und vor allem der durch die cDNA mit der SEQ ID NO: 1 kodierte Heparanase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2.

Erfindungsgemäße Inhibitoren binden in der Regel an Heparanase oder an Heparanase kodierende Nukleinsäuren, z. B. DNA oder mRNA. Unter Bindung versteht man jede molekulare Wechselwirkung zwi schen Inhibitor und Enzym bzw. Nukleinsäure, insbesondere unter physiologischen Bedingungen. Dies sind in der Regel klassische Wechselwirkungen, zu denen elektrostatische Kräfte, van-der- Waals-Kräfte, Wasserstoffbrücken-Bindungen, hydrophobe Bindungen, oder metallkomplexartige koordinative Bindungen gehören. Zusätz lich zu den vorstehend genannten, reversiblen molekularen Wech selwirkungen können auch irreversible Wechselwirkungen zwischen Inhibitor und Enzym in Betracht kommen, z. B. kovalente Bindungen.

In der Regel binden Enzym-Inhibitoren im Bereich der oder einer der aktiven Domänen von Heparanase und konkurrieren mit anderen Substraten um deren Bindungsstelle(n) (Kompetition). Dementspre chend versteht man unter kompetitiven Enzym-Inhibitoren diejeni gen, die mit einem Vergleichssubstrat, im vorliegenden Fall vor zugsweise Heparansulfat, um die Bindung an Heparanase konkurrie ren, d. h. die Bindung des einen behindert die Bindung des ande ren. Wegen dieser Bindung an Heparanase können kompetitive Enzym- Inhibitoren auch als Heparanase-Substrat bezeichnet werden. Vor zugsweise handelt es sich bei diesen Inhibitoren um Substrate, die im Vergleich zu dem oder den natürlichen Substraten der kata lytischen Aktivität von Heparanase nicht oder zumindest weniger zugänglich sind, d. h. sie werden nicht oder in vergleichsweise geringem Ausmaß durch Heparanase umgesetzt, insbesondere gespal ten. Ebenfalls brauchbar sind nicht-kompetive Inhibitoren, die beispielsweise im wesentlichen irreversibel an aktive Domänen, oder an anderer Stelle an die Heparanase binden und, beispiels weise über allosterische Effekte, Einfluß auf die Enzymaktivität nehmen.

Zumindest für den Fall der kompetitiven Inhibition gilt der Grundsatz, daß die Verdrängung eines Substrats durch einen Inhi bitor mit abnehmender Bindungsaffinität des Substrats bzw. zuneh mender Bindungsaffinität des Inhibitors zunimmt. Zweckmäßiger weise besitzen daher erfindungsgemäß brauchbare Inhibitoren eine hohe Bindungsaffinität für Heparanase. Eine derartig günstig aus fallende Bindungsaffinität gestattet eine wirksame Verdrängung natürlich vorkommender Enzymsubstrate, beispielsweise von Hepa ransulfaten und Heparansulfat-Proteoglykanen, wobei die erforder liche Konzentration an Inhibitor zur Bindung einer bestimmten Menge dieses Inhibitors an das Enzym bzw. zur Verdrängung einer bestimmten Menge eines Substrats mit zunehmender Bindungsaffini tät des Inhibitors abnimmt. Im Hinblick auf die medizinische An wendung werden daher Inhibitoren bevorzugt, deren Bindungsaffini tät so groß ist, daß diese als Wirkstoff im Rahmen einer wirksa men medizinischen Behandlung in vertretbaren Mengen verabreicht werden können. Erfindungsgemäße Inhibitoren werden daher vorzugs weise in Tagesdosen von etwa 0,01 bis 30 mg/kg Körpergewicht und insbesondere von etwa 0,1 bis 15 mg/kg Körpergewicht verabreicht.

Eine Möglichkeit, die Bindungsaffinität auszudrücken, bieten die oben angesprochenen Kompetitionsexperimente, mit denen man dieje nige Konzentration an Inhibitor ermittelt, die das Enzym im Hin blick auf die Umsetzung eines anderen Substrats zu 50% hemmt (IC₅₀-Werte). So läßt sich auch die kompetitive Hemmung der Bin dung von Heparanase-Inhibitoren dahingehend auswerten, daß erfin dungsgemäß bevorzugte Inhibitoren halbmaximale Hemmkonstanten IC₅₀ in vitro von weniger als 10^-3 M, vorzugsweise von weniger als 10^-4 M und insbesondere von weniger als 10^-5 M und bei nicht-kompetiver Hemmung von weniger als 10^-4 M, vorzugsweise von weniger als 10^-5 M und insbesondere von weniger als 10^-6 M aufweisen.

Bei den Expressionsinhibitoren handelt es sich insbesondere um Oligonukleotide, die beispielsweise im Sinne einer antisense-RNA oder -DNA, oder im Sinne der Triple-Helix-Technik wirken.

Eine Reihe von Heparanase-Inhibitoren sind bereits bekannt. Es handelt sich vielfach um Glycosaminoglykane mit struktureller Ähnlichkeit zu den natürlichen Substraten der Heparanase, insbe sondere Heparansulfate. Hierzu gehören Heparine, Heparinfraktio nen und Heparinfragmente, z. B. Heparine bestimmten Molekularge wichts, Heparinderivate, beispielsweise Heparine mit zumindest teilweise reduzierten Carboxylgruppen, zumindest partiell N-de sulfatierte, N-acetylierte Heparine, z. B. in EP 0 254 067 A2, WO 92/01 003 und US-A-5,206,223 beschriebenes N-desulfatiertes, N-acetyliertes Heparin, zumindest partiell N,O-desulfatierte, N-resulfatierte Heparine, z. B. die in WO 92/01 003 und US-A-5,206,223 beschriebenen Verbindungen, und O-acylierte Hepa rine, beispielsweise die in der EP 0 356 275 A1 beschriebenen Verbindungen.

Heparin wird vorzugsweise aus natürlichen Quellen, beispielsweise der intestinalen Mukosa von Rindern oder Schweinen, gewonnen. Eine Fragmentierung und/oder Fraktionierung kann auf die übliche Art und Weise erfolgen. Carboxylgruppen lassen sich beispiels weise mit NaBH₄ reduzieren. Sulfatgruppen können beispielsweise durch eine Behandlung mit wasser- oder methanolhaltigem DMSO ent fernt werden, wobei sich der Grad der Desulfatierung nach der Reaktionsdauer, der Reaktionstemperatur und dem Zusatz von Wasser oder Methanol richtet. Eine N-Acetylierung kann beispielsweise mit Essigsäureanhydrid unter alkalischen Bedingungen bewerkstel ligt werden und die Resulfatierung gelingt beispielsweise mit ei nem Triethylamin-Schwefeltrioxid-Komplex.

Anstatt Heparin können auch andere Glycosaminoglykane derivati siert werden, beispielsweise Hyaluronsäure, Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6-sulfat, Dermatansulfat, Keratansulfat und Heparan sulfat und deren Proteoglykane, wie am Beispiel der O-Acylierung in der EP 0 356 275 A1 beschrieben ist.

Geeignet sind auch sulfatierte Oligosaccharide, beispielsweise die in WO 96/33 726 beschriebenen, also insbesondere sulfatierte Mannopentaosephosphate, Maltohexaosesulfate und dergleichen, und sulfatierte Polysaccharide, beispielsweise die in WO 88/05 301 be schriebenen, also insbesondere Heparin, Fucoidan, Pentosansulfat, Dextransulfat und Carrageenan-Lambda. Auch die in WO 90/01938 ge nannten Phophozucker enthaltenden Oligo- und Polysaccharide sind brauchbar.

Ebenfalls geeignet sind glycomimetische Saccharopeptide, bei spielsweise die in WO 96/35700 beschriebenen der Formel

W (X)_n Y [(X)_n W (X)_n Y]_m (X)_n W

worin
die Reste W unabhängig voneinander für Fucose, 3-Amino-3-deoxyglucose, 4-Amino-4-deoxyglucose, Glucose, Galactose, Glucosamin, Galactosamin, Glucuronsäure, Galacturonsäure, Glucosaminuronsäure, Neuraminsäure, Maltose, Maltotriose, Iduronsäure, 2,5-Anhydromannitol, Mannose, Mannuronsäure, und Cellobiose stehen;
die Reste Y unabhängig voneinander für -NR³-C(O)- und -C(O)-NR³- stehen;
die Reste X unabhängig voneinander für eine difunktionelle oder polyfunktionelle Gruppe, insbesondere Ethylenglycol, Ethylenglycol-Oligomere, Niedrigalkyl, gegebenefalls substituiertes Alkyl, Aminosäuren und Peptide stehen;
n jeweils 0 oder 1 ist;
m jeweils 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 99 ist;
mit der Maßgabe, daß die Gesamtanzahl von Resten W 2 bis 100 be trägt;
und R³ für -H, Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und Aralkyl mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen steht.

Laminarin-Sulfate, auch Laminaran-Sulfate genannt, das sind li neare Polymere aus β-1,3-verknüpften Glucose-Resten mit gegebe nenfalls geringen Anteilen an β-(1,6)-Verknüpfungen und 2 bis 3% D-Mannitol-Endgruppen, insbesondere das Natriumsalz mit einem mo laren Verhältnis von wenigstens 1 : 1 Sulfatgruppen zu Monosaccha rid-Einheiten ist ebenfalls als Heparanse-Inhibitor brauchbar (vgl. WO 95/24 907).

Weitere Heparanase-Inhibitoren sind Suramin und Trachyspinsäure.

Geeignet sind auch die in dem US-Patent 5,817,800 beschriebenen Verbindungen der Formel I

worin
Y für -COOH, -PO₃H₂-P(O)(OR⁶)(OH), -P(O)R⁶(OH), Tetrazol oder -SO₃H steht, worin
R⁶ C₁-C₄-Alkyl ist,
X für NH, O oder S steht, und
R für ein Wasserstoffatom oder für -C(O)NHC₆(R⁷)₅ steht, worin C₆(R⁷)₅ vorzugsweise für gegegenenfalls einfach bis fünffach substituiertes Phenyl steht und die Substituenten R⁷ ausge wählt sind unter OH, Halogen, -COOH, -PO₃H₂ oder -SO₃H.

Auch die Salze dieser Verbindungen gehören dazu. Veranschauli chende Beispiele dieser Verbindungen sind (Z)-O-(D-Glukopyranuro nosyliden)amino-N-phenylcarbamat und (5R,Z)-O-(5-C-Phosphonato- D-xylopyranosyliden)amino-N-phenylcarbamat bzw. deren Natrium salze. Diese Verbindungen können in an sich bekannter Weise her gestellt werden, beispielsweise mit den in der EP 0 642 799 be schriebenen Verfahren.

Niedermolekulare Heparanase-Inhibitoren, meist synthetische Ver bindungen, sind in vielerlei Hinsicht vorteilhaft brauchbar.

Auch Aptamere, das sind Nukleinsäuren, in der Regel Oligonukleo tide, mit ausreichender Affinität zu Heparanase, können als Inhi bitoren Anwendung finden.

Auch Heparanase-spezifische Antikörper können als Heparanase-In hibitoren brauchbar sein. Es kann sich um polyklonale Antiseren, monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, wie F(ab), Fc, etc., chimäre und rekombinante Antikörper handeln. Die Herstellung sol cher Antikörper kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Als Im munogen kann man Heparanase als solche oder antigene Fragmente davon, die in der Regel an übliche Trägerproteine gekoppelt wer den, verwenden. In Beispiel 8 der WO 99/43 830 wird beispielsweise die Herstellung eines polyklonalen Antiserums gegen ausgesuchte Peptide humaner Heparanase beschrieben. In ähnlicher Weise wird in WO 95/04 158 die Herstellung ausgesuchter Heparanase-Peptide, insbesondere einer C-terminalen Sequenz, dort SEQ ID NO: 42 ge nannt, und die Erzeugung hiergegen gerichteter Antisera sowie de ren Brauchbarkeit als Heparanase-Inhibitoren beschrieben.

Die WO 96/08 559 beschreibt Phosphorthioat- oder Phosphordithioat- Antisense-Oligonukleotide mit vorzugsweise 7 bis 30 Nukleotiden, die im wesentlichen aus dG und/oder dT-Nukleotiden gebildet wer den. Konkret eignen sich zur Inhibition von Endoglycosidasen, insbesondere Heparanasen, beispielsweise die Oligonukleotide der dort beschriebenen Sequenzen SEQ ID NO: 2, 4, 6, 10.

Die erfindungsgemäße Anwendung ist nicht auf die vorstehend ge nannten Inhibitoren beschränkt. Vielmehr kann jede Substanz, in deren Gegenwart die Heparanase-Aktivität geringer ist als in de ren Abwesenheit, erfindungsgemäß als Heparanase-Inhibitor Anwen dung finden.

Zur Messung der Heparanase-Aktivität sind Testsysteme bekannt. Diese beruhen in der Regel auf dem Einsatz von markierten Hepa ransulfaten oder Heparansulfat-Proteoglykanen als Substrat, wobei die Umsetzung, d. h. die Spaltung dieses Substrats und die damit verbundene Freisetzung bestimmter Fragmente anhand der Markierung verfolgt werden kann. Beispielsweise kann man fluoreszenz-, z. B. FITC-, oder radio-, z. B. ³⁵SO₄-, ¹⁴C- oder ³H-markierte Heparansul fate oder Heparansulfat-Proteoglykane, insbesondere ³⁵SO₄-mar kierte Heparansulfat-Proteoglykane, ¹⁴C- oder ³H-acetylierte Hepa ransulfate, oder fluoreszenzmarkierte Substrate, beispielsweise 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid verwenden.

Die Substrate können auf biologischem Wege erhalten werden, bei spielsweise indem man Endothelialzellen in radiomarkiertem ³⁵SO₄ kultiviert oder tumorösen Versuchstieren radiomarkiertes Sulfat injiziert, und aus den Endothelial- bzw. Tumorzellen entsprechend markierte Heparansulfat-Proteoglykane gewinnt. Die Substrate kön nen aber auch auf chemischem Wege synthetisiert werden, bei spielsweise indem man Heparansulfat zunächst partiell deacety liert und anschließend reacetyliert. Durch reduktive Aminierung der freien Enden von Heparansulfat und anschließender Anfügung geeigneter Markierungen können beispielsweise fluoreszenzmar kierte Heparansulfate hergestellt werden. Es kann von Vorteil sein, solche Substrate an einen festen Träger zu koppeln, was den Nachweis freigesetzter Fragmente erleichtert. Zu diesem Zweck kann man die in diesem Bereich übliche Kopplungschemie anwenden, beispielsweise zunächst die reduzierenden Enden aminieren und dann derart modifizierte Glycosaminoglykane an geeignete Matri ces, beispielsweise Agarose, Sepharose und ähnliches koppeln. He paransulfat-Proteoglykane oder auch Heparansulfat-Peptide davon können beispielsweise an CNBr-aktivierter Sepharose gekoppelt werden. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Abtrennung der Degradationsprodukte durch Gelfiltration, Fällungsreaktionen, z. B. wie in Beispiel J der WO 96/35 700 beschrieben ist, und ähn lichem. Mittels HPLC, vorzugsweise der Auschluß-HPLC, lassen sich vorteilhafterweise Fluoreszenzmarkierungen detektieren. Gemäß dem in der WO 98/03 638 beschriebenen Testverfahren kann man auch HS bindende Proteine, z. B. histidinreiche Glycoproteine, vorzugs weise in immobilisierter Form verwenden, um nicht oder nur parti ell degradiertes Heparanase-Substrat von degradiertem Substrat zu trennen und dadurch dessen Nachweis zu ermöglichen.

Die in diesen Tests eingesetzte Heparanase kann natürlichen oder rekombinanten Ursprungs sein, so kann Heparanase aus einer Viel zahl von Geweben und Körperflüssigkeiten, Serum eingeschlossen, aufgereinigt werden. Die Expression menschlicher Heparanase kann mit den in WO 95/04 158 und WO 99/43 830 erwähnten Expressionssy stemen bewerkstelligt werden.

Die vorstehend beschriebenen und weitere in ähnlicher Weise geei gnete Testsysteme können die Grundlage bilden für in vitro-Scree ning-Verfahren, vorzugsweise zum primären Screening, mit denen man aus einer Vielzahl verschiedener Substanzen diejenigen ausle sen kann, die im Hinblick auf die erfindungsgemäße Anwendung brauchbar sind. Beispielsweise können mittels kombinatorischer Chemie umfangreiche Stoffbanken angelegt werden, die Myriaden po tentieller Wirkstoffe umfassen. Das Durchmustern kombinatorischer Substanzbibliotheken nach Stoffen mit gewünschter Aktivität ist automatisierbar. Screening-Roboter dienen der effizienten Auswer tung der vorzugsweise auf Mikrotiterplatten angeordneten Einzel assays.

Eine besonders effektive Technologie zur Durchführung derartiger Verfahren ist der im Bereich des Wirkstoffscreenings bekannte Scintillation Proximity Assay, kurz SPA genannt. Kits und Kompo nenten zur Durchführung dieses Assays können kommerziell bezogen werden, beispielweise bei Amersham Pharmacia Biotech. Für enzyma tische Testanwendungen werden im Prinzip solubilisierte oder membrangebundene Substrate auf Scintillationssubstanz enthalten den, kleinen Fluoromikrosphären immobilisiert. Je nach Art der zu testenden enzymatischen Aktivität ist das Substrat radioaktiv markiert und die Scintillationssubstanz wird solange zur Lichte mission angeregt, wie die räumliche Nähe zwischen Scintillations substanz und Radiomarkierung gegeben ist, oder es wird die radio aktive Markierung in das immobilisierte Substrat eben durch die zu messende Enzymaktivität eingefügt und als Folge die Scintillati onssubstanz wird solange zur Lichtemission angeregt. So ergeben sich Testformate, bei denen eine abnehmende bzw. zunehmende Si gnalintensität gemessen wird.

Eine weitere besonders effektive Technologie zur Durchführung derartiger Verfahren ist die im Bereich des Wirkstoffscreenings bekannte FlashPlate®-Technologie. Kits und Komponenten zur Durch führung dieses Assays können kommerziell bezogen werden, bei spielweise bei NEN® Life Science Products. Dieses Prinzip basiert ebenfalls auf Mikrotiterplatten (96er oder 384er), die mit Scin tillationssubstanz beschichtet sind.

Die erfindungsgemäße Verwendung von Heparanase-Inhibitoren bein haltet im Rahmen der Behandlung ein Verfahren. Dabei wird dem zu behandelnden Individuum, vorzugsweise einem Säuger, insbesondere einem Menschen, Nutz- oder Haustier, eine wirksame Menge eines oder mehrerer Heparanase-Inhibitoren, in der Regel der pharmazeu tischen und tierarzneilichen Praxis entsprechend formuliert, ver abreicht. Ob eine solche Behandlung angezeigt ist und in welcher Form sie zu erfolgen hat, hängt vom Einzelfall ab und unterliegt einer medizinischen Beurteilung (Diagnose), die vorhandene Anzei chen, Symptome und/oder Fehlfunktionen, Risiken, bestimmte Anzei chen, Symptome und/oder Fehlfunktionen zu entwickeln, und weitere Faktoren miteinbezieht.

Die erfindungsgemäße Lehre richtet sich vor allem auf die Her stellung pharmazeutischer Mittel zur Behandlung eines Indivi duums, vorzugsweise eines Säugers, insbesondere eines Menschen, Nutz- oder Haustieres. So werden die Inhibitoren gewöhnlich in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht, die ei nen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Inhibitor, gegebenfalls auch einem Gemisch meh rerer erfindungsgemäßer Inhibitoren, und gegebenenfalls weiteren Wirkstoffen umfassen. Diese Zusammensetzungen können beispiels weise auf oralem, rektalem, transdermalem, subkutanem, intravenö sem, intramuskulärem oder intranasalem Weg verabreicht werden.

Beispiele geeigneter pharmazeutischer Formulierungen sind feste Arzneiformen, wie Pulver, Puder, Granulate, Tabletten, Pastillen, Sachets, Cachets, Dragees, Kapseln wie Hart- und Weichgelatine kapseln, Suppositorien oder vaginale Arzneiformen, halbfeste Arz neiformen, wie Salben, Cremes, Hydrogele, Pasten oder Pflaster, sowie flüssige Arzneiformen, wie Lösungen, Emulsionen, insbeson dere Öl-in-wasser-Emulsionen, Suspensionen, beispielsweise Lotio nen, Injektions- und Infusionszubereitungen, Augen- und Ohren tropfen. Auch implantierte Abgabevorrichtungen können zur Verab reichung erfindungsgemäßer Inhibitoren verwendet werden. Ferner können auch Liposomen, Mikrosphären oder Polymermatrizes zur An wendung kommen.

Bei der Herstellung der Zusammensetzungen werden erfindungsgemäße Inhibitoren gewöhnlich mit einem Exzipienten vermischt oder ver dünnt. Exzipienten können feste, halbfeste oder flüssige Materia lien sein, die als Vehikel, Träger oder Medium für den Wirkstoff dienen.

Zu geeigneten Exzipienten gehören beispielsweise Lactose, Dex trose, Succrose, Sorbitol, Manitol, Stärken, Akaziengummi, Calci umphosphat, Alginate, Traganth, Gelantine, Calciumsilikat, mikro kristalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose, Wasser, Sirup und Methylcellulose. Ferner können die Formulierungen phar mazeutisch akzeptable Träger oder übliche Hilfsstoffe, wie Gleit mittel, beispielsweise Talg, Magnesiumstearat und Mineralöl; Netzmittel; emulgierende und suspendierende Mittel; konservie rende Mittel, wie Methyl- und Propylhydroxybenzoate; Antioxidan tien; Antireizstoffe; Chelatbildner; Dragierhilfsmittel; Emul sionsstabilisatoren Filmbildner; Gelbildner; Geruchsmaskierungs mittel; Geschmackskorrigentien; Harze; Hydrokolloide; Lösemittel; Lösungsvermittler; Neutralisierungsmittel; Permeationsbeschleuni ger; Pigmente; quaternäre Ammoniumverbindungen; Rückfettungs- und Überfettungsmittel; Salben-, Creme- oder Öl-Grundstoffe; Silikon- Derivate; Spreithilfsmittel; Stabilisatoren; Sterilanzien; Suppo sitoriengrundlagen; Tabletten-Hilfsstoffe, wie Bindemittel, Füll stoffe, Gleitmittel, Sprengmittel oder Überzüge; Treibmittel; Trocknungsmittel; Trübungsmittel; Verdickungsmittel; Wachse; Weichmacher; Weißöle umfassen. Eine diesbezügliche Ausgestaltung beruht auf fachmännischem Wissen, wie beispielsweise in Fiedler, H. P., Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angren zende Gebiete, 4. Auflage, Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996, dargestellt ist.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein.

Fig. 1 zeigt die gelelektrophoretische Auftrennung der nach RT- PCR gemäß Beispiel 1 erhaltenen Amplifikate parallel zu Moleku largewichtsstandards (MWM) und der Negativ-Kontrolle (negativ).

Beispiel 1 Heparanase-Expression in einem Ratten-Modell für kongestive Her zinsuffizienz

Das verwendete Tier-Modell wurde von Wiesener et al. in Circula tion 95, 1253-1259 (1997) beschrieben. So entwickelten fünf mit der Aortenklemmtechnik behandelte Ratten (Nr. 3, 15, 24, 25, 112) eine kongestive Herzinsuffizienz (Herzhypertrophie). Die Herzen wurden entnommen, und die mRNA wurde in üblicher Weise isoliert. Mittels RT-PCR konnte die Menge an exprimierter Heparanase-mRNA bestimmt werden, indem man als Sense-Primer das Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 und als Antisense-Primer das Oligonu kleotid mit der Sequenz SEQ ID NO: 4 verwendete. Parallel wurde die GADPH-Expression als Housekeeping-Gen gemessen. Die gleiche Untersuchung wurde an Kontrolltieren (Ratten Nr. 11, 17, 19, 32, 33) vorgenommen.

Die jeweiligen mittels RT-PCR erhaltenen Amplifikate wurden elek trophoretisch aufgetrennt, und ihre Menge wurde quantifiziert. Fig. 1 zeigt für die Tiere 11, 17, 19, 32 und 33 der Kontroll gruppe sowie die Tiere 3, 15, 24, 25 und 112 der Testgruppe die erhaltenen Amplifikate nach elektrophoretischer Auftrennung. Die Quantifizierung ergab folgende, jeweils auf die GAPDH-Expression bezogene Heparanase-mRNA-Spiegel:

Tabelle 1

Als Mittelwerte ergeben sich für die Kontrollgruppe 4,289 ± 0.75 und für die Testgruppe 4,153 ± 0,06. Diese Werte zeigen, daß der im Modell induzierte pathologische Zustand nicht mit einer Regu lation der Expression von Heparanase-mRNA verbunden ist, sondern die im Zusammenhang mit Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz auftretende intra- und extrazelluläre Ansäuerung die Heparanase- Aktivität moduliert (Schini-Kerth et al (1997) Circulation 96, 3888-3896; Shrode et al. (1997) J Bioenerg Biomembr 29, 393-399; Kraus and Wolf (1996) Tumor Biol 17, 133-154; Tamagaki et al. (1996) Atherosclerosis 123, 73-82; Brown and Breton (1996) J Exp Biol. 199, 2345-2358; Apkon et al. (1997) Am J Physiol 273, H434-445; Ito et al (1997) J. Clin Invest 99, 125-135; Tajima et al. (1998) Circulation 98, 2760-2764; Flores et al (1996) Kidney Int. Suppl 55, S. 122-125; Hisatome et al. (1997) Gen Pharmacol 29, 557-560; Russ et al. (1996) Pflugers Arch 433, 26-34).

SEQUENCE LISTING

Claims

1. Verwendung wenigstens eines Heparanase-Inhibitors zur Behand lung von Herzinsuffizienz und damit zusammenhängenden Anzei chen, Symptomen und/oder Fehlfunktionen.

2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Behandlung von kongestiver Herzinsuffizienz und damit zusammenhängenden Anzeichen, Symptomen und/oder Fehlfunktionen.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 zur Behandlung von periphe ren Ödemen, Lungen- und Leberkongestion, Dyspnoe, Brust- und Bauchwassersucht.

4. Verwendung nach einem der vorhergenden Ansprüche, wobei we nigstens ein Heparanase-Inhibitor ein Glycosaminoglykan ist.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Glycosaminoglykan aus gewählt ist unter Heparinen mit zumindest teilweise reduzier ten Carboxylgruppen, zumindest partiell N-desulfatierten, N-acetylierten Heparinen, zumindest partiell N,O-desulfatier ten, N-resulfatierten Heparinen, O-acylierten Heparinen, sul fatierten und/oder phosphorylierten Oligosacchariden, glyco mimetischen Saccharopeptiden, Laminarin-Sulfaten, Suramin und Trachyspinsäure.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei wenigstens ein Heparanase-Inhibitor eine niedermolekulare Verbindung ist.