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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduktion von Hydroxyketocarbonsäuren oder
deren Estern zu Hydroxyverbindungen.
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Optisch
aktive Hydroxyverbindungen sind wertvolle chirale Bausteine. So
sind chirale Diole wichtige Grundstoffe für eine Vielzahl von Wirkstoffen
in der Pharmazie und im Pflanzenschutz sowie für Katalysatoren.
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Zur
Herstellung von chiralen Verbindungen können biotechnologische Verfahren
angewendet werden, die entweder unter Verwendung ganzer Mikroorganismen-Zellen oder mittels
isolierter Enzyme arbeiten.
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Geeignete
Enzyme zur Synthese von Alkoholen sind u.a. Oxidoreduktasen, die
in der
EP 0456107 A2 (gewonnen
aus Lactobacillus kefir), der
EP 0796914 A2 und der PCT/DE 99/00848 (aus
Lactobacillus brevis) beschrieben sind. Die Synthesen erfordern
allerdings die Zugänglichkeit
zu den geeigneten Enzymen, den Zusatz eines löslichen Coenzyms (NADH, NADPH)
und ein Coenzym-Regenerierungssystem.
Ebenso wird in der WO 97/00968 der Einsatz von Reduktasen für die Reduktion
von Ketogruppen beschrieben.
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Ferner
wird in der
US-PS 5,342,767 ein
Verfahren beschrieben, bei dem unter Einsatz von Alkohol-Dehydrogenase
aus Lactobacillus kefir eine Reduktion durchgeführt wird.
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In
der
DE 196 10 984
A1 wird ebenfalls ein Verfahren beschrieben, bei dem eine
Alkohol-Dehydrogenase zum Einsatz kommt. Neben den gereinigten Enzymen
können
auch ganze Zellen verwendet werden. Gegenstand dieser Erfindung
ist jedoch nicht die Umsetzung von Verbindungen mit zwei oder mehr
Ketogruppen. Ebenso betrifft das Verfahren nicht die Umsetzung von
Keto-Carbonsäuren
und. deren Estern.
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Mikroorganismen
stellen eine kostengünstige
Alternative zu Enzymen dar. Allerdings ergeben diese Verfahren häufig niedrige
Ausbeuten (F. Aragazzini et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1986)
24, 175–177).
Außerdem
treten häufig
ausbeutemindernde Nebenreaktionen auf und die Produkte besitzen
nicht immer eine ausreichende Enantiomerenreinheit. Die Produktausbeute
und -qualität
hängen
stark vom verwendeten Stamm und den Anzuchtbedingungen ab.
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Aus
der
EP 0569 998 A2 ist
schließlich
ein Verfahren bekannt, bei dem verschiedene Mikroorganismen zur
Reduktion von Ethergruppen enthaltenden Diketoestern eingesetzt
werden. Zu den nach der Beschreibung dieser Erfindung einsetzbaren
Mikroorganismen zählen
zahlreiche Hefen und Bakterien, jedoch nicht Lactobacillus-Arten.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Reduktion
von Hydroxyketocarbonsäuren
oder deren Estern, das die geschilderten Nachteile nicht mehr aufweist.
Unter Hydroxygruppen sind hier auch mit Schutzgruppen maskierte
Hydroxygruppen zu verstehen.
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Die
Erfindung ist gekennzeichnet durch ein Verfahren zur Reduktion von
Hydroxyketocarbonsäuren oder
deren Estern bei dem in Gegenwart von Lactobacillus-Arten die Ketogruppe
zu einer Hydroxygruppe umgesetzt wird.
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Das
Verfahren nach der vorliegenden Erfindung beinhaltet insbesondere
die katalytische Reduktion der prochiralen 3,5-Dioxocarbonsäurenderivate
gemäß Formel
1:
A, B = C=O oder CHOΣ, wobei A ≠ B und Σ = H oder
Schutzgruppe für
die Hydroxyfunktion.
R
1, R
2 = H oder eine Komponente aus der Gruppe
Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkylalkyl,
wobei die Komponenten auch einfach oder mehrfach mit den Heteroatomen
Si, N, P, O, S, F, Cl, Br oder I substituiert oder vollständig durch
Heteroatome ersetzt sein können.
R
3 = H, Metallkationen oder eine Komponente
aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl,
Aralkyl, Cycloalkylalkyl, wobei die Komponenten auch einfach oder
mehrfach mit den Heteroatomen Si, N, P, O, S, F, Cl, Br oder I substituiert
sein können.
Y
= eine Komponente aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl,
Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkylalkyl, wobei die Komponenten
auch einfach oder mehrfach mit den Heteroatomen Si, N, P, O, S,
F, Cl, Br oder I substituiert sein können. Ausgeschlossen wird X-CH
2-O-CH
2-, wobei X
= Alkyl, Aryl, Cycloalkyl, Aralkyl oder Cycloalkylalkyl sein kann.
Unter den Halogenen sind Fluor und Chlor besonders bevorzugt.
n
= 0-10.
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Unter
Alkyl sind sowohl geradkettige als auch verzweigte gesättigte Kohlenstoff
Ketten zu verstehen. Beispielhaft können Methyl, Ethyl, n-Propyl,
i-Propyl, t-Butyl, Pentyl, i-Pentyl, n-Hexyl, i-Hexyl genannt werden.
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Mit
Alkenyl sind geradkettige und verzweigte ungesättigte Kohlenwasserstoffe bezeichnet,
für die
beispielhaft Vinyl, 1-Propenyl, Allyl, Butenyl, i-Butenyl genannt
werden können.
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Mit
Alkinyl sind geradkettige und verzweigte ungesättigte Kohlenwasserstoffe bezeichnet,
die wenigstens eine -C≡C-
Bindung enthalten, wie beispielsweise Ethinyl oder Propinyl.
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Von
dem Begriff Cycloalkyl werden gesättigte, ringförmige Kohlenwasserstoffketten
umfaßt,
die aus drei, vier, fünf,
sechs oder sieben Kohlenwasserstoffatomen bestehen.
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Cycloalkenyl
bezeichnet ungesättigte,
ringförmige
Kohlenwasserstoffe, mit fünf,
sechs, sieben oder acht Kohlenstoffatomen. Unter Aryl sind aromatische
Systeme, eingeschlossen Heteroaromaten und substituierte aromatische
Systeme, wie z. B. Phenyl, p-Methylphenyl oder Furanyl zu verstehen.
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Unter
Aralkyl sind Arylreste zu verstehen, die über Alkylgruppen angebunden
sind, z. B. ein Benzylrest.
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Unter
den Begriff Cycloalkylalkyl fallen Cycloalkylreste, die über Alkylgruppen
gebunden sind.
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Ebenso
sind Reaktionen der Verbindungen gemäß der Formeln 2 und 3 möglich.
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Hierbei
haben R1, R2, R3 und Y dieselbe Bedeutung wie in Formel
1.
Σ =
H oder Schutzgruppen für
die Hydroxyfunktionen.
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Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren
können
demgemäß insbesondere
3,5-Dihydroxycarbonsäurederivate
der im folgenden dargestellten Formel 4 erzeugt werden:
Hierbei haben R
1,
R
2, R
3 und Y dieselbe
Bedeutung wie in Formel 1.
Σ =
H oder Schutzgruppe für
die Hydroxyfunktion.
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Insbesondere
können
mit den erfindungsgemäßen Verfahren,
im Gegensatz zum Stand der Technik, Verbindungen gemäß den Formeln
2 und 3 als Substrate umgesetzt werden.
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Je
nach Konfiguration an den Stereozentren C-3 und C-5 können die
erfindungsgemäß hergestellten 3,5-Dihydroxycarbonsäurederivate
der Formel 4 zielgerichtet bei der Synthese chiraler Naturstoffe,
Pharma- und Agrowirkstoffe, Katalysatoren und Hemmstoffen eingesetzt
werden. Beispiele hierfür
sind HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren
des Mevinsäure-Typs
und Lipase-Hemmer des Lipstatin-Typs.
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Andere
Natur- oder Wirkstoffe verlangen andere Konfigurationen der stereogenen
Zentren in Position C-3 und C-5. Auch dies ist mit der vorliegenden
Erfindung möglich.
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Vor
der Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann eine Reduktion von 3,5-Dioxocarbonsäurederivaten durch regioselektive
Einführung
einer Hydroxygruppe in Position C-3 oder C-5 erfolgen, wobei ein
Produkt mit r-Konfiguration
erhalten wird. Zu dem Begriff r-Konfiguration sei beispielhaft an
Formel 2 folgendes ausgeführt:
In
der Formel 2 tritt die OΣ-Gruppe
in 5-Position aus der Papierebene hervor, während Y und die Kohlenstoffatome
des Kohlenstoffgrundgerüstes
in der Papierebene liegen:
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Diese
Konfiguration wird im folgenden unabhängig von Y als r-Konfiguration
bezeichnet.
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Bei
der Reduktion von 3,5-Dioxocarbonsäurederivaten ist eine gezielte
Festlegung der Stereozentren in den Position C-2 und C-4 möglich. Dies
gilt insbesondere für
den Fall, daß R1 und R2 von H verschieden
sind und R1 beispielsweise eine Methylgruppe
darstellt. Sowohl die Enantiomerenreinheit als auch die Diastereomerenreinheit
sind hierbei sehr hoch (> 95%).
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Erfindungsgemäß können mit
dem Reduktionsverfahren auch Gemische hergestellt werden, die Verbindungen
mit unterschiedlichen Hydroxygruppen-Gehalten aufweisen. Beispiele hierfür sind Gemische,
die aus Verbindungen der Formeln 2, 3 und 4 bestehen, wobei R1, R2 = H; Y = -CH3 oder -CH2Cl und
R3 = C(CH3)3. Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit Lactobacillus-Arten
durchgeführt.
In Betracht kommen grundsätzlich
alle Lactobacillus-Arten. Besonders bevorzugt ist jedoch die Verwendung
von Lactobacillus kefir und Lactobacillus brevis.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann unter üblichen
Fermentationsbedingungen und in den üblichen Reaktoren durchgeführt werden.
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Als
Cosubstrat kann ein leicht metabolisierbares Kohlenstoff-haltiges
Substrat, z.B. Glukose verwendet werden. Dadurch werden die bei
der Umsetzung verbrauchten Reduktionsäquivalente nachgeliefert.
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Die
Reaktionen werden erfindungsgemäß bei Temperaturen
von 10 bis 50°C,
bevorzugt von 15 bis 40°C
durchgeführt.
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Der
pH-Wert liegt bei 2 bis 10, bevorzugt zwischen 4 und 8. Zur Sicherstellung
eines geeigneten pH-Wertes kann jede in der Fermentationstechnik übliche Puffersubstanz
eingesetzt werden. Dies sind z. B. Triethanolamin, Phosphat-Puffer, Phosphat-Citrat-Puffer,
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol-Puffer, 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure-Puffer
(MES) oder Tris-Puffer. Die Konzentrationsbereiche für die Puffer
liegen vorteilhafterweise zwischen 50 und 500 mmol/l.
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Als
Reaktoren können
ebenfalls alle bekannten Reaktortypen Verwendung finden. So können sowohl herkömmliche
Rührreaktoren
als auch Festbettreaktoren eingesetzt werden.
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Bei
Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
entfallen vor allem kostenintensive und umweltbelastende Racemat-,
oder Diastereomerentrennungen. Die in einer diastereoselektiven
Synthese erforderliche Anbindung und Abspaltung einer stöchiometrischen
Menge einer homochiralen Hilfsgruppe wird vermieden. Weiterhin ist
das Kohlenstoffgerüst
der Dihydroxycarbonsäureester
in den Ausgangsverbindungen bereits komplett, das heißt, die
Stereozentren werden erst zu einem späteren Zeitpunkt in die Gesamtsynthesesequenz
eingeführt.
Dadurch wird der Verlust an homochiralem Material niedrig gehalten.
Gleichzeitig werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sehr hohe Stereoselektivitäten erzielt.
Durch die Verwendung ganzer Zellen entfällt außerdem die Notwendigkeit, zusätzlich kostenintensive
Coenzyme und Coenzym-Regenerierungssysteme in die Reaktionen einzusetzen.
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Die
erfindungsgemäß hergestellten
Verbindungen gemäß Formel
4 können
insbesondere zur Herstellung von chiralen Naturstoffen, Pharma-
und Agrowirkstoffen, Katalysatoren und Hemmstoffen eingesetzt werden.
Beispiele hierfür
sind HMG-CoA-Reduktase Inhibitoren des Mevinsäure-Typs und Lipase-Hemmer des Lipstatin-Typs.
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Im
folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher beschrieben:
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Beispiel 1: Herstellung
von Lactobacillus-Zellen (Lactobacillus kefir)
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Zellen
für die
Reduktion können
erhalten werden, indem eine Stammkultur von Lactobacillus kefir
(z.B. DSM 20587) in folgendem Medium vermehrt wird:
Pro 1 L:
10 g Caseinpepton, tryptisch verdaut; 10 g Fleischextrakt; 5 g Hefeextrakt,
20 g Glucose; 1 g Tween 80; 2 g K2HPO4; 5 g Na-acetat; 2 g Diammoniumcitrat; 0,2
g MgSO4 × 7 H2O;
0,05 g MnSO4 × H2O;
pH = 6,2–6,5.
Nach 24 Std. Wachstum werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet.
Sie können
durch Einfrieren gelagert werden.
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Das
folgende Beispiel 2 zeigt die Herstellung von 3,5-Dihydroxycarbonsäurederivaten
IV durch das erfindungsgemäße Verfahren
mit der Möglichkeit
einer vorgeschalteten Reduktion (nicht erfindungsgemäß) von 3,5-Diketocarbonsäurederivaten
mit Lactobacillus kefir.
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Beispiel 2:
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Synthese der sekundären Alkohole
(S)-II, (R)-III und (3R, 5S)-IV (Formelschema I)
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Die
im folgenden beschriebene Ganzzelltransformationen wird bei Raumtemperatur
mit Zellen von Lactobacillus kefir durchgeführt, die wie unter Beispiel
1 beschrieben erhalten werden. Diketoverbindung I wird dargestellt
wie beschrieben in M. Wolberg, W. Hummel, M. Müller,
DE 19847302 A , 1998.
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Durchführung der mikrobiellen Reduktion
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In
einem 50 ml Becherglas werden 0.61 g Feuchtzellmasse in 0.5 ml Phosphat-Citrat-Puffer (250
mM, pH 5.5) unter Rühren
suspendiert. Von dieser Zellsuspendion werden 0.9 ml mit 1 ml Glucose-Lösung (5
M, autoklaviert), 8 ml Phosphat-Citrat-Puffer (250 mM, pH 5.5) und
50 μl 6-Chlor-3,5-dioxo-hexansäuretert-Butylester
(I) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird mit einem Magnetrührer gerührt.
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Reaktionskontrolle
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Nach
1 h, 2 h, 6.5 h und 10.5 h werden Proben gezogen. Dazu gibt man
40 μl der
Reaktionslösung
zu 200 μl
Essigsäureethylester,
schüttelt
aus und analysiert die organische Phase gaschromatographisch, wobei ein
Quadrupol- Massenspektrometer
mit Elektronenstoßionisation
(70 eV) als Detektor zum Einsatz kommt (GC-MS-Kopplung).
GC-Kapillarsäule: HP-5MS
(5% Phenyl-Methyl-Siloxan; 30.0 m × 250 μm × 0.25 μm nominal)
Temperaturprogramm:
1 min 60°C,
dann auf 280°C
(15°C/min)
Gasfluß: 1.0 ml/min
Helium
Injektion: split 50 : 1 Retentionszeiten:
I: | 8.21
min |
(S)-II: | 8.10
und 8.84 min (s. u.) |
(R)-III: | 9.06
min |
(3R,5S)-IV: | 9.26
min |
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Die
Diketoverbindung I wird als Furanon nachgewiesen, ebenso der Hydroxyketoester
(R)III (HCl-Abspaltung im Injektor, siehe auch Formelschema IV).
Der Hydroxyketoester (S)-II erzeugt durch partielle thermische Lactonbildung
im GC-Injektor zwei Signale.
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Anhand
der Chromatogramme kann der Verlauf der mikrobiellen Reduktion verfolgt
werden: In den ersten beiden Proben lassen sich wachsende Anteile
der Hydroxyketone (S)-II und (R)-III erkennen, während in den zu späteren Zeitpunkten
entnommenen Proben das Signal für
die Dihydroxyverbindung (3R,5S)-IV an Intensität gewinnt. Da gleichzeitig
die Signale für
die Hydroxyketone (S)-II und (R)-III wieder an Intensität verlieren,
kann davon ausgegangen werden, daß die Dihydroxyverbindung (3R,5S)-IV
durch mikrobielle Reduktion der intermediär auftretenden Hydroxyketone
(S)-II und (R)-III gebildet wird.
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Aufarbeitung:
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Nach
12.5 h wird die Reaktion durch Abzentrifugieren der Zellen abgebrochen.
Die Zellpellets und der Zentrifugationsüberstand werden getrennt voneinander
je zweimal mit Essigsäureethylester
extrahiert. Nach Trocknen der vereinigten organischen Phasen mit
Natriumsulfat und Einengen am Rotationsverdampfer werden 44 mg Rohprodukt
erhalten.
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Produktanalytik
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a) Bestimmung der Anteile
der Reaktionsprodukte im Rohprodukt
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Für eine zerfallsfreie
gaschromatographische Analyse (GC-MS, Methode s. o.) werden in einem
1.5 ml GC-Glasvial 1.5 mg des Rohproduktes der mikrobiellen Reduktion
in 0.5 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 10 μl Trifluoressigsäureanhydrid
(TFAA) und 10 μl
Pyridin versetzt. Anschließend
wird das Glasvial mit einem Septum verschlossen und 30 min bei 40°C aufbewahrt
(Wasserbad).
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Die
nachfolgende GC-MS-Analyse ergibt vier Hauptsignale, die anhand
der zugehörigen
Massenspektren den Derivatisierungsprodukten (3R,5S)-V, (S)-VI,
(S)-VII, und VIII zugeordnet werden können (Formelschema II).
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Derivat
(3R,5S)-V wird aus dem mikrobiellen Reduktionsprodukt (3R,5S)-IV
gebildet, während
das Hydroxyketon (S)-II zu den zwei stereoisomeren Bisacylierungsprodukten
(S)-VI und (S)-VII reagiert. Das cyclische Derivat VIII bildet sich
aus dem Furanon IX, dessen Formierung aus der Diketoverbindung I
während
der mikrobiellen Reaktion bekannt ist (Nebenprodukt durch intramolekulare
Alkylierung, siehe M. Wolberg, W. Hummel, M. Müller,
DE 19857302 A , 1998). Ein
Derivat des Hydroxyketoesters (R)-III kann im Rohprodukt nicht gefunden
werden. Diese intermediär
auftretende Verbindung wird bei der hier gewählten Reaktionsführung (Abbruch
der Reaktion nach 12.5 h) komplett zur Dihydroxyverbindung (3R,5S)-IV
umgesetzt.
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Die
Integration der vier Hauptsingnale im Gaschromatogramm ergibt folgende
relative Intensitäten ((S)-VI
und (S)-VII zusammengefaßt,
Retentionszeiten in Klammern):
(3R,5S)-V: | 34%
(8.14 min) |
(S)-VI/(S)-VII: | 61%
(8.30/7.84 min) |
VIII: | 5%
(6.85 min) |
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Bei
der hier beschriebenen Reaktionsführung der mikrobiellen Reduktion
erhält
man somit ein Rohprodukt, das hauptsächlich aus dem Hydroxyketon
(S)-II besteht. Dieses Ergebnis wird durch NMR-Spektroskopie bestätigt (s.
u.).
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Es
ist zweifellos möglich
durch Variationen der Reaktionsführung
die Zusammensetzung des Rohproduktes zu beeinflussen.
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Die
soeben beschriebene Derivatisierung und GC-MS-Analyse wurde mit
dem racemischen Hydroxyketoester rac-II und dem Diastereomerengemisch
der Dihydroxyverbindungen syn-/anti-IV, welche durch eine unabhängige Synthese
erhalten wurden (Formelschema III), überprüft.
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Die
Retentionszeiten und Massenspektren dieser racemischen Proben stimmen
mit den Retentionszeiten und Massenspektren der Produkte der mikrobiellen
Reduktion überein.
Gleiches gilt für
die jeweiligen TFA-Derivate (Formelschema II).
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Das
Furanon IX wurde ebenfalls in einer unabhängigen Synthese dargestellt
(Formelschema IV).
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Auch
hier stimmen die Retentionszeiten und Massenspektren mit den analogen
Signalen in den Spektren des Rohproduktes der mikrobiellen Reduktion überein.
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b) Bestimmung des Diastereomerenverhältnisses
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Die
Diastereomere syn-IV und anti-IV werden mit der verwendeten gaschromatographischen
Methode nicht getrennt. Eine Grundlinientrennung kann allerdings
nach Derivatisierung mit TFAA/Pyridin erreicht werden (Formelschema
V).
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Das
polarere Isomer anti-V weist gegenüber dem syn-Isomer eine längere Retentionszeit
auf. Beide Signale zeigen identische Massenspektren.
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Angewendet
auf das Rohprodukt der mikrobiellen Reduktion ergibt diese Methode
für die
Diastereomere syn-V und anti-V ein Verhältnis von 135 : 1. Die mikrobielle
Reduktion liefert somit das syn-Isomer in sehr hohem Überschuß. Dieses
Ergebnis wird durch NMR-Spektroskopie bestätigt (s. u.). Für die TFA-Derivate
der Produkte der nahezu unselektiven NaBH4-Reduktion
(Formelschem III) ergibt die Integration der GC-Signale ein Verhältnis von
1.4 : 1.0.
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c) NMR-Spektroskopie
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Die
NMR-Spektren des Rohprodukts der mikrobiellen Reduktion bestätigen die
Ergebnisse der GC-MS-Analysen. Das 1H-NMR-Spektrum
zeigt eine Überlagerung
der einzelnen Spektren der Verbindungen (S)-II, (3R,5S)-IV- und
IX, wobei die Signale des Hydroxyketons (S)-II eindeutig dominieren,
während
die Signale des Furanons IX nur schwach zu sehen sind.
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Hydroxyketoester (S)-II:
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1H-NMR (300 MHz, CDCl3,
22°C, es
werden nur die Signale der Ketoform angegeben) δ: 4.31 (m, 1H, CHOH), 3.6 (m,
Feinstruktur nicht erkennbar durch Überlagerung mit Multiplett
von Verbindung (3R,5S)-IV; 2 × H6),
3.41 (s, 2H, H2), 2.90 (dd, J = 17.5, 5.0 Hz, 1H, H4), 2.83 (dd,
J = 17.5, 7.3 Hz, 1H, H4), 1.46 (s, 3 × CH3, Überlagerung
mit analogem Signal der Verbindungen (3R,5S)-IV und IX). Keto: Enol
= ca. 95:5. 13C-NMR (75.5 MHz, CDCl3, es werden nur die Signale der Ketoform
angegeben) δ:
28.13 (OC(CH3)3),
46.57, 48.43, (C4, C6), 51.31 (C2), 67.58 (C5), 82.73 (OC(CH3)3), 166.22 (COOtBu),
202.93 (C3).
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Dihydroxyverbindung (3R,5S)-IV:
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1H-NMR (300 MHz, CDCl3,
22°C) δ: 4.22 (m,
1H, H5), 4.05 (m, 1H, H3), 3.6 (m, Feinstruktur nicht erkennbar
durch Überlagerung
mit Multiplett von Verbindung (S)-II; 2 × H6), 2.43 (d, J = 6.3 Hz,
2H, H2), 1.70 (m, 2H, H4), 1.46 (s, 3 × CH3, Überlagerung
mit analogem Signal der Verbindungen (S)-II und IX). 13C-NMR (75.5
MHz, CDCl3) δ: 28.27 (OC(CH3)3), 39.45, 42.47 (C2, C4), 49.17 (C6), 68.35
(C3), 71.57 (C5), 81.90 (OC(CH3)3), 172.21 (COOtBu).
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Furanon IX:
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1H-NMR (300 MHz, CDCl3,
22°C) δ: 5.69 (s,
1H, H3), 4.54 (s, 2H, H5), 3.48 (s. 2H, H6), 1.47 (s, 3 × CH3, Überlagerung
mit analogem Signal der Verbindungen (S)-II und (3R,5S)-IV).
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Die
angegebenen Verschiebungen beziehen sich auf CHCl3 in
CDCl3 (1H-NMR: δ = 7.27; 13C-NMR: δ= 77.23)
und stimmen mit den Daten der auf unabhängigem Wege synthetisierten
Vergleichsverbindungen rac-II, syn/anti-IV und IX (Formelschema
III) überein.
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Die
Signale der Dihydroxyverbindung anti-IV, die sich von denen der
stereoisomeren Verbindung syn-IV unterscheiden, können im 13C-NMR-Spektrum des Rohproduktes der mikrobiellen
Reduktion nicht beobachtet werden. Dies ist ein weiterer Beweis
für den
sehr hohen Anteil des syn-Isomers (s.o.).
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Dihydroxyverbindung
anti-IV (aus unabhängiger
Synthese, siehe Formelschem III): 13C-NMR
(75.5 MHz, CDCl3) δ: 28.27 (OC(CH3)3), 39.33, 42.22 (C2, C4), 49.60 (C6), 65.46
(C3), 68.94 (C5), 81.87 (OC(CH3)3), 172.54 (COOtBu).
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Die
Zuordnung der Signalsätze
im 13C-NMR-Spektrum des Isomerengemisches
syn-/anti-IV zu den Diastereomeren erfolgt anhand der charakteristischen
chemischen Verschiebung der Kohlenstoffatome C-3 und C-5 (Formelschema
VI).
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Bei
der vorliegenden Verbindungsklasse (1,3-Diole) weisen die Signale
der hydroxyltragenden Kohlenstoffatome des syn-Isomers relativ zu
den analogen Signalen des anti-Isomers für gewöhnlich eine Tieffeldverschiebung
auf. Vergleiche hierzu:
- a) F. G. Kathawala
et al., Helv. Chim. Acta 1986, 69, 803–805
- b) K.-M. Chen et al., Tetrahedron Lett. 1987, 28, 155–158
- c) C. Bonini et al., Gazz. Chem. Ital. 1991, 121, 75–80
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Das 13C-NMR-Spektrum des Rohproduktes belegt
demnach, daß in
der hier beschriebenen mikrobiellen Reduktion das syn-Isomer gebildet
wird.
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d) Bestimmung der absoluten
Konfiguration und der Enantiomerenreinheit
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Da
die Konfiguration des Stereozentrums C-3 relativ zum Stereozentrum
C-5 bereits durch die 13C-NMR-Spektroskopie
aufgeklärt
ist, beschränkt
sich die weitere Analytik auf die Ermittlung der Konfiguration des
Stereozentrums C-5. Hierfür
wird das Rohprodukt der mikrobiellen Reduktion in das cyclische
Derivat (S)-X überführt (Formelschema
VII).
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Das
racemische Derivat rac-X (Formelschema VIII), welches mit der gleichen
Methode aus dem Hydroxyketoester rac-II erhalten wird, läßt sich
durch HPLC mit chiraler stationärer
Phase trennen.
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HPLC-Bedingungen:
Chiracel OB (DAISO); 25°C;
1 ml/min i-Hexan/i-Propanol (80 20); Detektion bei 210 nm. Retentionszeiten:
(S)-X: | 24.7
min |
(R)-X: | 21.5
min |
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Die
Zuordnung der absoluten Konfiguration der getrennten Enantiomere
erfolgt durch Vergleich mit der Retentionszeit einer authentischen
Probe des Lactons (S)-X,
das analog zum racemischen Derivat rac-X aus dem Hydroxyketon (S)-II
(>99% ee) hergestellt
wird (Formelschema VIII). Das enantiomerenreine Hydroxyketon (S)-II
wird nach einer bekannten Vorschrift erhalten (M. Wolberg, W. Hummel,
M. Müller,
DE 19857302 A , 1998).
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Durch
Integration der Signale des Derivats (S)-X, welches aus dem Rohprodukt
der mikrobiellen Reduktion hergestellt wurde (Formelschema VII),
berechnet sich ein Enantiomerenüberschuß von 99.4%.