DE19936035C2

DE19936035C2 - Lymphozytenproliferationstestkit

Info

Publication number: DE19936035C2
Application number: DE1999136035
Authority: DE
Inventors: Thomas Arendt
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 1999-07-30
Filing date: 1999-07-30
Publication date: 2002-11-21
Anticipated expiration: 2019-07-31
Also published as: DE19936035A1

Abstract

Es wird ermöglicht, auf Lymphozyten vor und nach einer Stimulation mit PHA und/oder Protein A und/oder NGF den Zelloberflächenmarker CD69 zu erkennen und einen Stimulationsindex zu bestimmen. DOLLAR A Die ermittelten Daten sind geeignet, Rückschlüsse auf das Vorliegen der Alzheimerschen Krankheit zu ermöglichen.It is possible to recognize the cell surface marker CD69 on lymphocytes before and after stimulation with PHA and / or protein A and / or NGF and to determine a stimulation index. DOLLAR A The data obtained are suitable for drawing conclusions about the presence of Alzheimer's disease.

Description

Der Lymphozytenproliferationstestkit wird zur Diagnose der Alzheimerschen Erkran kung eingesetzt. Er dient der Erfassung präklinischer Erkrankungsphasen und der differentialdiagnostischen Abgrenzung der Alzheimerschen Erkrankung gegenüber anderen Demenzen.The lymphocyte proliferation test kit is used to diagnose Alzheimer's disease kung used. It is used to record preclinical phases of illness and the differential diagnosis of Alzheimer's disease other dementias.

Die Diagnose der Alzheimerschen Erkrankung ist mit klinischen Mitteln sowie den zur Verfügung stehenden paraklinischen und apparativ-technischen Methoden allein nicht mit letzter Sicherheit zu stellen und bedarf daher stets der autoptischen Verifi zierung. Insbesondere in Erkrankungsfrühstadien ist die differentialdiagnostische Abgrenzung anderer Demenzursachen oft schwierig. Gerade in diesen frühen Pha sen der Erkrankung ist jedoch eine sichere Stellung der Diagnose aus zweierlei Gründen wichtig. Sie erlaubt zum einen die diagnostische Abgrenzung potentiell be handelbarer Demenzformen und kann diese damit einer effektiven Therapie zufüh ren, zum anderen ist sie Voraussetzung für jegliche Form der therapeutischen Inter vention in den Prozeß der Neurodegeneration der Alzheimerschen Erkrankung, der nur in diesen Frühstadien erfolgreich sein kann. Eine derartige diagnostische Si cherheit kann nur durch Biomarker der Alzheimerschen Erkrankung, d. h. durch leicht zu bestimmende biologische Veränderungen mit einer für die Erkrankung hin reichenden Sensitivität und Spezifität, geleistet werden.The diagnosis of Alzheimer's disease is by clinical means as well available paraclinic and technical equipment alone not to be put with ultimate certainty and therefore always requires the autopic verifi financing. The differential diagnosis is particularly important in the early stages of the disease Differentiation from other causes of dementia is often difficult. Especially in this early Pha However, the diagnosis of the disease is based on two things Important reasons. On the one hand, it allows potential diagnostic delimitation tradable forms of dementia and can thus lead to effective therapy on the other hand, it is a prerequisite for any form of therapeutic inter vention in the process of neurodegeneration of Alzheimer's disease, the can only be successful in these early stages. Such a diagnostic Si Safety can only be achieved through biomarkers of Alzheimer's disease, i.e. H. by easily identifiable biological changes with one for the disease sufficient sensitivity and specificity.

Biomarker der Alzheimerschen Erkrankung haben damit zum einen diagnostischen Wert, und sollen hierbei insbesondere helfen, Risikogruppen bzw. Patienten in präk linischen Stadien und frühen klinischen Stadien sicher zu identifizieren. Zum ande ren dienen Biomarker der Verlaufskontrolle und damit der Prognostik sowie der Kontrolle der Ansprechbarkeit auf kausaltherapeutische Interventionen. Ideale Bio marker sollten bestimmten theoretischen und praktischen Anforderungen genügen. Hierzu gehören insbesondere eine hohe Spezifität und Sensitivität, die Fähigkeit, präklinische Stadien zu identifizieren, sowie ein hoher positiver und negativer Vor hersagewert. Die Bestimmung der Biomarker sollte möglichst nichtinvasiv sein und den Patienten nicht ängstigen. Die Analysen sollten einfach durchführbar und preis wert sein. On the one hand, biomarkers of Alzheimer's disease have diagnostic ones Value, and should help in particular to identify risk groups or patients in prec linear stages and early clinical stages. To the other Biomarkers are used for monitoring progress and thus for forecasting and Checking responsiveness to causal interventions. Ideal organic markers should meet certain theoretical and practical requirements. This includes in particular a high level of specificity and sensitivity, the ability to identify preclinical stages, as well as a high positive and negative pre hersagewert. The determination of the biomarkers should be as non-invasive as possible and do not frighten the patient. The analyzes should be easy to perform and inexpensive be worth.

In der Datenbank CAPLUS bei STN; AN 1997, 388 105 CAPLUS zu: Rapid expression of the CD69 antigen on T cells and natural killer cells upon antigenic stimulation of peripheral blood mononuclear cell suspensions. Werfel, T. et al. Allergy (Copenhagen) (1997), 52(4), 465-469 ist beschrieben, dass das CD69-Oberflächenantigen der früheste Aktivierungsmarker cytogen- und mitogen-aktivierter Lymphozyten ist. In der zitierten Arbeit wird die Expression von CD69 unter Verwendung spezifischer Antikör per bestimmt. Auslöser der Expression sind Allergica, deshalb wird vorgeschlagen, dass Zellen mit entsprechend exprimiertem CD69-Oberflächenantigen als Frühindika toren in Kulturen mit antigen- oder allergen-stimulierten Zellen dienen können.In the CAPLUS database at STN; AN 1997, 388 105 CAPLUS on: Rapid expression of the CD69 antigen on T cells and natural killer cells upon antigenic stimulation of peripheral blood mononuclear cell suspensions. Werfel, T. et al. Allergy (Copenhagen) (1997), 52 (4), 465-469 describe that the CD69 surface antigen of earliest activation marker is cytogen and mitogen activated lymphocytes. In the cited work is the expression of CD69 using specific antibody per determined. Expression is triggered by allergies, which is why it is suggested that cells with appropriately expressed CD69 surface antigen are early indicators can serve in cultures with antigen or allergen-stimulated cells.

In DE 129 821 060 A1 wird ein FITC-markierter CD69-spezifischer Antikörper in Ausführungsbeispiel 3.5 zum Nachweis des Aktivierungsmarkers CD69 eingesetzt, methodisch in der Durchflußzytometrie.DE 129 821 060 A1 describes a FITC-labeled CD69-specific antibody in Example 3.5 used to detect the activation marker CD69, methodical in flow cytometry.

Ähnlich wird in CAPLUS BEI STN; AN 1996: 292751 CAPLUS zu Trifluoperazine reduces the expression of CD69 in phytohemagglutininactivated lymphocytes, Pires, V. et al., Braz. J. Med. Biol. Res (1996), 29(4), 479-483 referiert. Gezeigt wird, daß TFP die CD69-Exprimierung verlangsamt und zwar deutlich mehr als im Fall des CD25. Die Vergleichsmessungen erfolgen durchflußzytometrisch.CAPLUS BEI STN; AN 1996: 292751 CAPLUS to trifluoperazine reduces the expression of CD69 in phytohemagglutininactivated lymphocytes, pires, V. et al., Braz. J. Med. Biol. Res (1996), 29 (4), 479-483. It is shown that TFP CD69 expression slows significantly more than in the case of the CD25. The Comparative measurements are made by flow cytometry.

Schließlich offenbart die Datenbank CAPLUS bei STN; AN 1990: 70840 CAPLUS zu Nerve growth factor induces growth and differentiation of human B lymphozytes. Otten, U. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1989), 86(24), 10059-63, dass die Zell- Proliferationsrate durch Messung von ³H-Thymidin in die DNA erfolgen kann.Finally, the CAPLUS database at STN reveals; AN 1990: 70840 CAPLUS on Nerve growth factor induces growth and differentiation of human B lymphocytes. Otten, U. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989), 86 (24), 10059-63 that the cell proliferation rate can take place by measuring ³ H-thymidine in the DNA.

Die vorliegende Erfindung wird durch den geschilderten nächstliegenden Stand der Technik nicht beeinflußt. Die Bestimmung der CD69-Präsentation auf Lymphozyten ist als Methode nicht Gegenstand der Erfindung. Auch die Stimulierung der Expression ist nur Mittel zum Zweck. Gefragt wird nach einem Biomarker zur Diagnose der Alzheim erschen Erkrankung. The present invention is illustrated by the closest prior art Technology not affected. The determination of CD69 presentation on lymphocytes is as a method not the subject of the invention. The stimulation of expression is also only means to an end. A biomarker for diagnosing Alzheimer's is asked ashes disease.

Keiner der derzeit bekannten Biomarker der Alzheimerschen Erkrankung genügt den o. a. Anforderungen. Insbesondere aufgrund der geringen Sensitivität und Spezifität der bekannten Biomarker sind diese als diagnostisches Hilfsmittel ungeeignet.None of the currently known biomarkers of Alzheimer's disease is sufficient o. a. Conditions. In particular due to the low sensitivity and specificity of the known biomarkers, these are unsuitable as diagnostic aids.

Es ist Aufgabe der Erfindung, einen Biomarker der Alzheimerschen Erkrankung mit ausreichender Sensitivität und Spezifität anzugeben und damit ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches die Diagnose der Alzheimerschen Erkrankung, die Erfassung von präklinischen Erkrankungsphasen sowie die differentialdiagnostische Abgrenzung der Alzheimerschen Erkrankung gegen andere Demenzen erlaubt.It is an object of the invention to have a biomarker of Alzheimer's disease sufficient sensitivity and specificity and thus a procedure for To provide the diagnosis of Alzheimer's disease Acquisition of preclinical disease phases as well as the differential diagnostic Differentiation of Alzheimer's disease from other dementias allowed.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch Bestimmung der CD69 Präsentation an der Oberfläche von Lymphozyten des Patienten sowie durch Bestimmung der Pro liferationsrate dieser Lymphozyten nach mitogener Stimulation gelöst. Diese Merk male zeigen erkrankungsspezifische Abweichungen vom Normbefund.According to the invention, this task is accomplished by determining the CD69 presentation the surface of the patient's lymphocytes and by determining the pro The rate of diffusion of these lymphocytes was resolved after mitogenic stimulation. This note Males show disease-specific deviations from the standard finding.

Die Erfindung beschreibt ein Merkmal (Biomarker) der Alzheimerschen Erkrankung, durch dessen Bestimmung Patienten mit dieser Erkrankung zu identifizieren sind. Damit wird ein Verfahren angegeben, welches die Diagnose der Alzheimerschen Erkrankung, die Erfassung von präklinischen Erkrankungsphasen sowie die diffe rentialdiagnostische Abgrenzung der Alzheimerschen Erkrankung gegen andere Demenzen erlaubt.The invention describes a characteristic (biomarker) of Alzheimer's disease, by identifying patients with this disease. This specifies a method that diagnoses Alzheimer's Disease, the recording of preclinical phases of the disease and the diffe Diagnostic differentiation of Alzheimer's disease from others Dementia allowed.

Bisher bekannte Merkmale der Alzheimerschen Erkrankung, die sich am lebenden Patienten bestimmen lassen (Biomarker) zeigen nur eine ungenügende Sensitivität und Spezifität und sind als diagnostische Hilfsmittel daher ungeeignet. Mit klinischen Mitteln beträgt die diagnostische Sicherheit nur 80% bis 90% und bereitet insbeson dere in Erkrankungsfrühphasen differentialdiagnostische Schwierigkeiten. Die Er kennung von präklinischen Erkrankungsphasen ist aufgrund des Fehlens eines ge eigneten Biomarkers derzeit nicht möglich.Previously known features of Alzheimer's disease that are alive Allowing patients to be determined (biomarkers) shows only insufficient sensitivity and specificity and are therefore unsuitable as diagnostic aids. With clinical The diagnostic certainty is only 80% to 90% and prepares in particular differential diagnostic difficulties in the early stages of the disease. The he Identification of preclinical phases of illness is due to the lack of a ge suitable biomarkers are currently not possible.

Den neurodegenerativen Veränderungen liegen bei der Alzheimerschen Erkrankung gestörte Prozesse der intrazellulären Vermittlung trophischer und mitogener Signale zugrunde. Diese Störungen der intrazellulären Signaltransduktion sind nicht auf das Nervensystem beschränkt.The neurodegenerative changes are due to Alzheimer's disease disturbed processes of intracellular mediation of trophic and mitogenic signals based. These disorders of intracellular signal transduction are not due to that Limited nervous system.

Sie lassen sich in ähnlicher Weise auch an Lymphozyten des peripheren Blutes die ser Patienten finden. Aufgrund ihrer Erkrankungsspezifität besitzt diese Verände rung diagnostischen Wert und eignet sich als Biomarker.They can be found in a similar way on peripheral blood lymphocytes find this patient. Because of their disease specificity, this has changes diagnostic value and is suitable as a biomarker.

Die Ermittlung, ob die für die Alzheimersche Erkrankung typische Störung der intra zellulären Vermittlung trophischer und mitogener Signale vorliegt, erfolgt durch Be stimmung der CD69 Präsentation auf Lymphozyten vor und nach mitogener Stimula tion. Hierfür werden Lymphozyten aus den durch Venenpunktion gewonnenen Blut proben der Patienten über einen Ficoll-Gradienten präpariert und für die weiteren Stimulationsexperimente eingesetzt.The determination of whether the intra cellular mediation of trophic and mitogenic signals is carried out by Be mood of the CD69 presentation on lymphocytes before and after mitogenic stimula tion. For this, lymphocytes are made from the blood obtained by venipuncture samples of the patients prepared via a Ficoll gradient and for the others Stimulation experiments used.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden diese Stimulationsexperi mente direkt am Zitrat-Blut durchgeführt, ohne vorher Lymphozyten präparatorisch abzutrennen.In a further embodiment of the invention, these stimulation experts Mentally performed directly on the citrate blood, without preparatory lymphocytes separate.

Für die Stimulationsexperimente werden Phytohaemagglutinin (PHA), Protein A und Nervenwachstumsfaktor (NGF) jeweils einzeln oder in unterschiedlichen Kombina tionen eingesetzt.For the stimulation experiments, phytohaemagglutinin (PHA), protein A and Nerve growth factor (NGF) individually or in different combinations used.

Die Bestimmung des Zelloberflächenmarkers CD69 erfolgt nach Bindung von fluo reszenzfarbstoffmarkierten Antikörpern mittels FACS (Fluorescence activated cell sorting). Der simultane Einsatz von fluoreszenzfarbstoffmarkierten zellspezifischen Antikörpern erlaubt die getrennte Identifikation von Leukozyten, B-Lymphozyten, T- Lymphozyten, T-Helferzellen, zytotoxische und T-Suppressor-Zellen.The cell surface marker CD69 is determined after binding of fluo Antibody labeled with stain dye using FACS (Fluorescence activated cell sorting). The simultaneous use of fluorescent dye-labeled cell-specific Antibodies allow the separate identification of leukocytes, B-lymphocytes, T- Lymphocytes, helper T cells, cytotoxic and T suppressor cells.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Proliferation von Lympho zyten direkt bestimmt. Dies ist durch den Nachweis des Einbaues von radioaktiv- oder nichtradioaktiv markierten Komponenten bzw. deren Analoga in die Lympho zyten DNA sowie durch den Nachweis anderer mit Proliferation einhergehender biologischer Phänomene möglich. In a further embodiment of the invention, the proliferation of lympho Cytes determined directly. This is due to the proof of the installation of radioactive or non-radioactive labeled components or their analogs in the lymph cytic DNA as well as by the detection of others associated with proliferation biological phenomena possible.

Die Erfindung wird durch folgende eingehende Beschreibung deutlicher.The invention will be more apparent from the following detailed description.

1. Gewinnung von venösem Blut durch Venenpunktion und Stabilisierung durch Zu gabe von Natrium citricum oder anderen geeigneten Stoffen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden aus diesen Blutproben über einen Ficoll- Gradienten Lymphozyten durch Zentrifugation präparativ abgetrennt.1. Collection of venous blood by venipuncture and stabilization by Zu administration of sodium citricum or other suitable substances. In another Embodiments of the invention are made from these blood samples via a Ficoll Gradiently separated lymphocytes by centrifugation.
2. Stimulation der Lymphozyten im Zitrat-Blut oder der präparativ isolierten Lympho zyten durch einzelne oder kombinierte Zugabe von Phytohaemagglutinin (PHA), Protein A, und Nervenwachstumsfaktor (NGF) oder andere trophisch oder mito gen wirksamer Substanzen.2. Stimulation of the lymphocytes in the citrate blood or the preparatively isolated lympho Cytes by single or combined addition of phytohaemagglutinin (PHA), Protein A, and nerve growth factor (NGF) or other trophic or mito effective substances.
3. Ermittlung der CD69 Präsentation durch Bestimmung von Antikörperbindung mit tels FACS (Fluorescence activated cell sorting) oder durch eine andere geeignete Methode vor sowie nach Stimulation.3. Determine the CD69 presentation by determining antibody binding with FACS (Fluorescence activated cell sorting) or another suitable one Method before and after stimulation.
4. Simultane Identifikation unterschiedlicher Zelltypen durch Einsatz zelltypspezifi scher Antikörper und Bestimmung deren Bindung mittels FACS (Fluorescence ac tivated cell sorting) oder durch eine andere geeignete Methode.4. Simultaneous identification of different cell types by using cell type-specific Antibodies and determination of their binding using FACS (Fluorescence ac tivated cell sorting) or by another suitable method.
5. Rechnerische Ermittlung des Verhältnisses (Stimulationsindex) der CD69 Prä sentation auf T-Helferzellen vor und nach Stimulation sowie auf B-Lymphozyten vor und nach Stimulation mit PHA.5. Calculation of the ratio (stimulation index) of the CD69 pre sentation on T helper cells before and after stimulation and on B lymphocytes before and after stimulation with PHA.
6. Rechnerische Ermittlung des Verhältnisses der Stimulationsindices von T- Helferzellen und B-Lymphozyten.6. Computational determination of the ratio of the stimulation indices of T- Helper cells and B lymphocytes.
7. In weiteren Ausführungsformen der Erfindung werden jeweils die Präsentation von CD69 an anderen Zelltypen zugrunde gelegt und es werden jeweils alternative Rechenoperationen (Division, Substraktion, Addition, Multiplikation) ausgeführt. 7. In further embodiments of the invention, the presentation of CD69 based on other cell types and there are alternative Arithmetic operations (division, subtraction, addition, multiplication) performed.
8. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Veränderung der intra zellulären Signaltransduktion und des zellulären Proliferationsverhaltens durch den Nachweis des Einbaues von radioaktiv- oder nichtradioaktiv markierten Kom ponenten bzw. deren Analoga in die Lymphozyten DNA sowie durch den Nach weis anderer mit Proliferation eingehender biologischer Phänomene bestimmt.8. In a further embodiment of the invention, the change in intra cellular signal transduction and cellular proliferation behavior proof of the installation of radioactive or non-radioactive labeled com components or their analogues in the lymphocyte DNA and through the night of other biological phenomena involved in proliferation.

Ausführungsbeispielembodiment

1. Gewinnung von venösem Blut durch Venenpunktion und Stabilisierung durch Zugabe von Natrium citricum oder Heparin oder anderen geeigneten Stoffen. [In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden aus diesen Blutproben über einen Ficoll-Gradienten Lymphozyten durch Zentrifugation präparativ ab getrennt.]1. Collection of venous blood by venipuncture and stabilization by Add sodium citricum or heparin or other suitable substances. [In a further embodiment of the invention, these blood samples Preparatively remove lymphocytes via a Ficoll gradient by centrifugation Cut.]
2. Zugabe von Phytohaemagglutinin (PHA), [Protein A, und Nerven wachstumsfaktor (NGF) oder anderer trophisch oder mitogen wirksamer Sub stanzen.] zu dem Zitrat-Blut oder den präparativ isolierten Lymphozyten. Hier durch werden die Lymphozyten stimuliert und gehen in die Proliferation über, deren frühes Kennzeichen die Präsentation von CD69 auf der Zelloberfläche ist. Ein Teil der Blutprobe [oder der präparativ isolierten Lymphozyten] wird vor der Stimulation abgetrennt und dient in den weiteren Messungen als unstimulierter Bezugswert.2. Addition of phytohaemagglutinin (PHA), [Protein A, and nerves growth factor (NGF) or other trophic or mitogenic sub punch.] to the citrate blood or the preparatively isolated lymphocytes. here the lymphocytes are stimulated and proliferate, the early feature of which is the presentation of CD69 on the cell surface. Part of the blood sample [or the preparatively isolated lymphocytes] is taken before the Stimulation is separated and serves as an unstimulated one in the further measurements Reference value.
3. Markierung der CD69 Präsentation durch fluoreszenzfarbstoffmarkierte Antikör per, die spezifisch CD69 erkennen. Quantifizierung der Intensität der Fluores zenzmarkierung bzw. der Anzahl fluoreszenzmarkierter Zellen z. B. mittels FACS (Fluorescence activated cell sorting).
Der simultane Einsatz zelltypspezifischer Antikörper erlaubt gleichzeitig die Identifikation unterschiedlicher Zelltypen und damit die differenzielle Erfassung der CD69-Markierung unterschiedlicher Zelltypen
Gleichzeitig erfolgt die Quantifizierung der CD69 Präsentation an der unstimu lierten Probe zur Bestimmung des Bezugswertes.3. Labeling of the CD69 presentation by fluorescent dye-labeled antibodies that specifically recognize CD69. Quantification of the intensity of the fluorescent label or the number of fluorescence-labeled cells z. B. using FACS (Fluorescence activated cell sorting).
The simultaneous use of cell-type-specific antibodies allows the identification of different cell types and thus the differential detection of the CD69 label of different cell types
At the same time, the CD69 presentation is quantified on the unstimulated sample to determine the reference value.
4. Rechnerische Ermittlung des Verhältnisses (Stimulationsindex) der CD69 Prä sentation auf T-Helferzellen vor und nach Stimulation sowie auf B-Lymphozyten vor und nach Stimulation mit PHA (siehe Abbildung).4. Calculation of the ratio (stimulation index) of the CD69 pre sentation on T helper cells before and after stimulation and on B lymphocytes before and after stimulation with PHA (see figure).

Da die Meßwerte der klinisch gesunden Kontrollprobanden als auch der Patienten mit Alzheimerscher Erkrankung auf Grund individueller Abweichungen um einen be stimmten Wert streuen, macht sich für die diagnostische Beurteilung der Meßergeb nisse die Definition von Grenzwerten notwendig. Die exakte Lage dieser Grenzwerte unterliegt dem wissenschaftlichen Fortschritt. In der unten dargestellten Abbildung ist eine Möglichkeit der Interpretation der Meßwerte dargestellt. Die Stimulationsin dices von T- und B-Zellen werden im Koordinatensystem auf unterschiedlichen Ach sen aufgetragen. Diese Art der zweidimensionalen Darstellung erhöht die Trenn schärfe zwischen dem pathologischen und dem normalen Wertebereich, die in vor liegender Darstellung durch eine Diagonale gekennzeichnet ist. Der Hinweis auf das Vorliegen oder Nichtvorliegen einer Alzheimerschen Erkrankung ergibt aus dem Be reich, in dem der individuelle Meßwert liegt. Bei den unten dargestellten Meßwerten von 19 Patienten mit Alzheimerscher Erkrankung und 24 klinisch gesunden Normal probanden ergibt sich für die Alzheimersche Erkrankung eine diagnostische Sensiti vität von 89,5% und eine diagnostische Spezifität von 79,2%. Because the measured values of the clinically healthy control subjects as well as the patients with Alzheimer's disease due to individual deviations by one scatter the agreed value, makes itself for the diagnostic assessment of the measurement results The definition of limit values is necessary. The exact location of these limit values is subject to scientific progress. In the illustration below one way of interpreting the measured values is shown. The stimulation dices of T and B cells are in the coordinate system on different axes applied. This type of two-dimensional representation increases the separation sharpness between the pathological and the normal range of values given in horizontal representation is characterized by a diagonal. The reference to that The presence or absence of an Alzheimer's disease results from the Be rich in which the individual measured value lies. With the measured values shown below of 19 patients with Alzheimer's disease and 24 clinically healthy normal test subjects have a diagnostic sensitivity for Alzheimer's disease vity of 89.5% and a diagnostic specificity of 79.2%.

Legenden zu den AbbildungenLegends for the illustrations Abb. 1 Fig. 1

Rechnerische Ermittlung des Verhältnisses (Stimulationsindex) der CD69 Präsentation auf T-Helferzellen vor und nach Stimulation sowie auf B-Lymphozyten vor und nach Stimulation mit PHA
Links: Patient mit Alzheimerscher Erkrankung (AD)
Rechts: klinisch gesunder KontrollprobandComputational determination of the ratio (stimulation index) of the CD69 presentation on T helper cells before and after stimulation and on B lymphocytes before and after stimulation with PHA
Left: patient with Alzheimer's disease (AD)
Right: clinically healthy control subject

Abb. 2 Fig. 2

Diagnostische Sensitivität für die Alzheimersche ErkrankungDiagnostic sensitivity for Alzheimer's disease

Claims

1. Lymphozytenproliferationstestkit zur Verwendung in der Diagnose der Alzheim erschen Erkrankung, bestehend aus
koagulationshemmenden Adjuvantien,
Stimulierungsmitteln mit mitogener und trophischer Wirkung
einem Antikörper mit CD69-Spezifität.1. Lymphocyte proliferation test kit for use in the diagnosis of Alzheimer's disease, consisting of
anti-coagulation adjuvants,
Stimulants with mitogenic and trophic effects
an antibody with CD69 specificity.

2. Verwendung des Testkits nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
venöses Blut durch Zugabe von Natriumcitrat stabilisiert wird,
die Lymphozyten stimuliert werden durch einzelne oder kombinierte Zugabe von Stimulierungsmitteln wie Phytohaemagglutinin (PHA), Protein A, Nervenwachstums faktor (NGF) oder andere trophisch oder mitogen wirkende Substanzen,
die CD69-Präsentation auf den Lymphozyten durch Zugabe eines spezifischen Anti körpers fixiert und vermessen wird,
wobei dies vor und nach der Stimulation der Lymphozyten erfolgt,
die Antikörperbindung mittels FACS vermessen wird,
der Stimulationsindex als Verhältnis der CD69-Präsentation vor und nach der Sti mulation bestimmt wird,
das Verhältnis der Stimulationsindices von T-Helferzellen und B-Lymphozyten er rechnet wird und aus diesem Verhältnis auf das Vorliegen der Alzheimerkrankheit geschlossen wird, indem die Stimulationsindices in einem Koordinatensystem jeweils auf der x- und der y-Achse gegeneinander aufgetragen werden und mit den Indices gesunder Probanden verglichen werden oder dies jeweils für die Stimulationsindices von B-Lymphozyten und T-Lymphozyten getan wird.2. Use of the test kit according to claim 1, characterized in that
venous blood is stabilized by adding sodium citrate,
the lymphocytes are stimulated by single or combined addition of stimulating agents such as phytohaemagglutinin (PHA), protein A, nerve growth factor (NGF) or other trophic or mitogenic substances,
the CD69 presentation is fixed and measured on the lymphocytes by adding a specific antibody,
this being done before and after stimulation of the lymphocytes,
the antibody binding is measured using FACS,
the stimulation index is determined as the ratio of the CD69 presentation before and after stimulation,
the ratio of the stimulation indices of T helper cells and B lymphocytes is calculated and the existence of Alzheimer's disease is deduced from this ratio by plotting the stimulation indices against one another in a coordinate system on the x and y axes and with the indices healthy subjects are compared or this is done for the stimulation indices of B lymphocytes and T lymphocytes, respectively.

3. Verwendung des Testkits nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Lymphozyten über einen Ficoll-Gradienten durch Zentrifugieren präpariert werden. 3. Use of the test kit according to claim 2, characterized in that the lymphocytes are prepared via a Ficoll gradient by centrifugation.

4. Verwendung des Testkits nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Zelltypen Lymphozyten, T-Helferzellen, zytotoxische und T-Supressor-Zellen ver wendet werden.4. Use of the test kit according to claim 2, characterized in that as cell types ver. lymphocytes, T helper cells, cytotoxic and T suppressor cells be applied.

5. Verwendung des Testkits nach Anspruch 2 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung des Zelloberflächenmarkers CD69 simultan durch Verwendung fluoreszenzfarbstoff-markierter zellspezifischer Antikörper erfolgt.5. Use of the test kit according to claim 2 and 4, characterized in that the determination of the CD69 cell surface marker simultaneously by use fluorescent dye-labeled cell-specific antibody is carried out.

6. Verwendung des Testkits nach Anspruch 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass monoklonale Antikörper eingesetzt werden.6. Use of the test kit according to claim 1 and 5, characterized in that monoclonal antibodies are used.

7. Verwendung des Testkits nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als trophisch wirkende Substanzen Nervenwachstumsfaktor und andere Neurotrophine eingesetzt werden.7. Use of the test kit according to claim 1, characterized in that as trophic substances, nerve growth factor and other neurotrophins be used.

8. Verwendung des Testkits nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als mitogen wirkende Substanzen Protein A, Phytohaemagglutinin eingesetzt werden.8. Use of the test kit according to claim 1, characterized in that Protein A, phytohaemagglutinin can be used as mitogenic substances.

9. Verwendung des Testkits nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass andere, in die Lymphozyten DNA eingebaute, leicht nachweisbare Komponenten vor und nach der Stimulation bestimmt werden.9. Use of the test kit according to claim 1, characterized in that other, easily detectable components built into the lymphocyte DNA and determined after stimulation.

10. Verwendung des Testkits nach Anspruch 1 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass die leicht nachweisbare Komponente eine radioaktiv markierte DNA ist. 10. Use of the test kit according to claim 1 and 9, characterized in that the easily detectable component is a radiolabelled DNA.

11. Lymphozytenproliferationstestkit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als koagulationshemmende Substanzen Natriumcitrat und Heparin verwendet werden.11. Lymphocyte proliferation test kit according to claim 1, characterized in that sodium citrate and heparin can be used as anti-coagulation substances.

12. Lymphozytenproliferationstestkit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Stimulierungsmittel Phytohaemagglutinin (PHA), Protein A, Nervenwachstumsfaktor NGF eingesetzt werden.12. Lymphocyte proliferation test kit according to claim 1, characterized in that as stimulant phytohaemagglutinin (PHA), protein A, nerve growth factor NGF can be used.