DE19933212A1 - Methode und Vorrichtung zur Hochdurchsatzanalyse molekularer Interaktionen über Oberflächen Plasmonen Resonanz - Google Patents

Methode und Vorrichtung zur Hochdurchsatzanalyse molekularer Interaktionen über Oberflächen Plasmonen Resonanz

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Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren und Vorrichtung zur Hochdurchsatzanalyse molekularer Interaktionen über Oberflächen Plasmonen Resonanz mittels entsprechend modifizierter Detektionssysteme. DOLLAR A Die Erfindung ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse (HDA) von Bibliotheken, bestehende aus mehreren hunderten von tausenden kleiner Molekülbestandteile, auf Interaktion und/oder Bindung an potentielle Zielstrukturen für Medikamente. Eine weitere Anwendung dieser Erfindung besteht in der Untersuchung differentieller Protein Expression direkt aus Gewebeproben.

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren und Vorrichtung zur Hochdurchsatzanalyse molekularer Interaktionen über Oberflächen Plasmonen Resonanz.
Die Analyse einer großen Anzahl von Molekülen, wie zum Beispiel Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Oligosacchariden, Phagen, kleinerer synthetischer Moleküle, Antikörper oder von Enzymen, mit Hilfe anderer Moleküle über Oberflächen Plasmanen Resonanz (OPR) ist durch den derzeit möglichen Probendurchsatz von etwa 200 Proben/Tag begrenzt. Diese Begrenzung des Probendurchsatzes entsteht durch die aufwendigen Mechanismen konventioneller OPR-Systeme zur Versorgung mit Lösungsmitteln, kombiniert mit einem festen Anregungs- und Detektierungssystem, welches zur Realzeit-Messung von interagierenden Molekülen entworfen wurde. Der Durchsatz dieser konventionellen OPR-Systeme ist befriedigend geeignet zur sekundären oder tertiären Untersuchung einer kleinen Zahl bereits bekannter Interaktionspartner, bei welchen zum Beispiel respektive kinetische oder stöchiometrische Informationen zur Interaktion aus der Messung des OPR-Winkels gewonnen werden sollen.
OPR stellt ein hochsensitives Verfahren dar, welches im Prinzip geeignet wäre um auch eine primäre Analyse von Molekülinteraktionen durchzuführen. Dadurch wäre die Identifizierung von solchen Molekülen möglich, welche mit anderen Molekülen interagieren. Konventionelle Verfahren sind jedoch derzeit nicht in der Lage den hierfür notwendigen Durchsatz zu bewältigen.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und Vorrichtung zur Hochdurchsatzanalyse molekularer Interaktionen über Oberflächen Plasmonen Resonanz bereitzustellen.
Die Erfindung ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse (HDA) von Bibliotheken kleiner Molekülbestandteile auf Interaktion in Form von Kompetition, Inhibition und/oder Bindung an potentiellen Zielstrukturen. Interaktive Zielstrukturen und/oder identifizierte Interaktionen können Indikationen für eine Medikamentenentwicklung darstellen. Derartige Bibliotheken können aus mehreren hunderten von tausenden Bestandteilen bestehen.
Eine weitere Anwendung dieser Erfindung besteht in der Untersuchung differentieller Protein Expression direkt aus Gewebeproben.
Die Erfindung ermöglicht es eine durch eine modifizierten OPR-Detektions-Vorrichtung molekulare Wechselwirkungen mit einem wesentlich gesteigerten Durchsatz zu analysieren. Weiterhin werden Methoden beschrieben, bei welchen diese Vorrichtung eingesetzt werden kann.
Die in dieser Erfindung beschriebene Vorrichtung enthält:
  • - eine Vielzahl von Molekülen, welche analysiert werden sollen, welche als abgegrenzte Meßpunkte in regelmäßiger Anordnung direkt auf einen voraktivierten OPR-Chip (oder eine OPR-Oberfläche) aufgebracht wurden. Diese Vielzahl kann zwischen 1 und 10.000 abgegrenzten Meßpunkten pro cm2 liegen, wobei Methoden um eine derartige Anordnung herzustellen Stand der Technik darstellen. Die Entfernung zwischen den Meßpunkten immobilisierter Moleküle kann optimiert werden, um Signalinterferenzen zwischen einzelnen Meßpunkten zu minimieren oder zu vermeiden. Es ist vorteilhaft, mehrere Meßpunkte auf einem Chip als Kontroll-Punkte anzulegen, wobei diese Kontroll-Punkte das Hintergrundsignal, sowie positive und negative Kontrollmoleküle enthalten können. Mit Hilfe geeignet gewählter Kontrollpunkte ist es möglich eine Kalibrierung des Chips vorzunehmen. Daher kann bei Bedarf die Inkubation eines Chips unabhängig vom Detektionssystem durchgeführt werden. In einer minimalen Ausführungsform braucht ein derartiges Detektionssystem auch kein Flüssigkeitssystem enthalten.
  • - einen neuartigen OPR-Chip, welcher durch ein abgeändertes OPR- Detektionssystem ausgewertet wird, bei welchem der OPR-Winkel für jeden Meßpunkt einzeln gemessen wird. Dies kann zum Beispiel erreicht werden, indem der Chip systematisch mit Hilfe eines Präzisions-Koordinaten-Positions-Kontrollgerätes bewegt wird, so daß jeder einzelne Meßpunkt systematisch unterhalb des Detektionssystems positioniert wird. Genannte Präzisions-Koordinaten-Positions-Kontrollgeräte sind Stand der Technik und finden sich in Mikroskopen oder MALDI Massenspektrometern. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, kann der OPR-Winkel schnell mit Hilfe eines Laser-Scanning Systems, welches zum Beispiel in Laser-Scanning Mikroskopen verwendet wird, für jeden Meßpunkt einzeln detektiert werden.
  • - unter Verwendung eines integrierten Systems, welches aus einer Kombination von Detektions- und Flüssigkeitssystem besteht, ein Flüssigkeitssystem, welches eine Vielzahl zu untersuchender Moleküle mit derselben Flüssigkeit beschickt. In einer Ausführung der Erfindung wird ein einzelner Flüssigkeitskanal verwendet, welcher alle Molekülproben auf einem Chip parallel mit Flüssigkeit beschickt. In einer weiteren Ausführung der Erfindung werden bestimmte Kombinationen von Meßpunkten mit einer oder mehreren verschiedenen Flüssigkeiten beschickt, wobei die Steuerung der Beschickung durch mehrere Flüssigkeitskanäle erfolgen kann, welche wiederum über Ventile verbunden und kontrolliert sein können.
  • - In jeder einzelnen Ausführungsform dieser Erfindung wird die Sammlung der Daten, welche die gemessenen OPR-Winkel der einzelnen Meßpunkte enthält, in einer Computer lesbaren Form gespeichert, welche eine spätere Daten Analyse ermöglicht. Vorzugsweise wird diese genannte Sammlung von Daten als digitales Bild gespeichert, dargestellt und analysiert. Innerhalb dieses digitalen Bildes wird die relative Position der einzelnen Meßpunkte eines Chips durch ein vorbestimmtes Pixel innerhalb des Bildes repräsentiert und die Größenordnung des gemessenen OPR-Winkels eines Meßpunkts über einen Grauskala-Wert verdeutlicht.
Ein Verfahren bei der die beschriebene Vorrichtung verwendet werden kann ist die Identifizierung interagierender Moleküle, welches über folgende Schritte erreicht werden kann:
  • - Kalibrierung der Vorrichtung und des OPR-Chips durch die Verwendung des zuvor beschriebenen abgeänderten OPR-Detektionssystems, bei welchem der gesamte OPR-Chip (oder eine OPR-Oberfläche) gemessen wird, bevor Moleküle aufgebracht werden. Mit Hilfe dieses "Leer-Daten"-Satzes ist es möglich das System gelegentlich zu kalibrieren und/oder eine Qulitätskontrolle des OPR-Chips vor der Aufbringung der abgegrenzte Meßpunkte in regelmäßiger Anordnung durchzuführen.
  • - Nach Aufbringung der abgegrenzte Meßpunkte in regelmäßiger Anordnung auf dem OPR-Chip werden die Daten der gemessenen OPR-Winkel für jeden einzelnen Meßpunkt des Chips gesammelt und wie zuvor beschrieben gespeichert. Diese Daten steilen den "Referenzdatensatz" für jedes Einzelmolekül ohne mögliche Interaktionspartner dar.
  • - Während der sich genannte Chip noch innerhalb des abgeänderten OPR- Detektionssystem befindet kann er mit einem Aliquot der Flüssigkeit überspült und inkubiert werden, welche mögliche Interaktionspartner enthält. Unspezifisch gebundene Moleküle werden anschließend von der Chip-Oberfläche abgewaschen.
  • - Nach dem Waschschrittt werden die OPR-Winkel für jeden einzelnen Meßpunkt neu gemessen und die Daten wie zuvor beschrieben als "Experimentdatensatz 1" gespeichert. Dieser "Experimentdatensatz 1" speichert die OPR-Winkel, welche direkt proportional sind zu Größe und Menge interagierender Moleküle, welche an das immobilisierte Protein gebunden sind.
  • - Die Schritte Inkubation, Waschen, und die Messung können wahlweise auch mehrere Male wiederholt werden, um die Ausbidung von Interaktions-Komplexen zu erzeugen.
  • - Es kann vorteilhaft sein die Schritte Bindung, Inkubation und Waschen unabhängig von der Detektionsvorrichtung nach Sammlung des "Referenzdatensatzes" durchzuführen. Auf diese Art kann eine größere Anzahl von Chips und damit Proben pro OPR-Detektionssystem, speziell wenn es eine simplifizierte Flüssigkeitsversorgung enthält, vorbereitet werden. Es ist anzunehmen, daß eine relative Veränderung im OPR-Winkel der einzelnen Meßpunkte alleine durch die Verwendung unterschiedlicher Meßeinheiten oder durch die Entnahme und Rückführung innerhalb einer Meßeinheit entstehen kann. Aus diesem Grund muß ein normalisierter OPR-Winkel mit Hilfe des "Referenzdatensatzes" anhand der aufgebrachten oben erwähnten Kontrollpunkte kalkuliert werden.
  • - Die Veränderungen im OPR-Winkel werden für jeden Meßpunkt einzeln nach jeder Inkubationsrunde durch den Vergleich zwischen dem "Referenzdatensatz" und dem, wenn notwendig normalisierten, "Experimentdatensatz" bestimmt. Eine signifikante Änderung des OPR-Winkels für einen bestimmten Meßpunkt, identifiziert eine potentielle Wechselwirkung zwischen dem immobilisierten Molekül und einem Interaktionspartner.
  • - Nach einer derartigen effizienten Primäranalyse können solche Moleküle, welche eine signifikante Veränderung Ihres respektiven OPR-Winkels zeigen weiter mittels zum Beispiel konventioneller OPR-Analysen charakterisiert werden.
Eine weitere Methode bei der die beschriebene Vorrichtung verwendet werden kann ist die Untersuchung differentieller Protein Expression direkt aus Gewebeproben unter der Verwendung folgender Schritte:
  • - Ein OPR-Chip wird mit einer Vielzahl von Antikörpern in regelmäßiger Anordnung versehen. Zur nachfolgenden Datenauswertung ist es vorteilhaft Kontrollregionen mit Positivkontrollen, Negativkontrollen und/oder Kontrollantikörpernauf den Chip aufzubringen.
  • - Ein Proteinrohextrakt wird von der ersten zu analysierenden Gewebeprobe extrahiert und der Chip darin unter Bedingungen inkubiert, welche die Bindung von Proteinen an die fixierten Antikörper erlaubt. Nicht-spezifische Bindungen werden durch einen folgenden Waschschritt mittels einer Waschlösung minimiert oder entfernt.
  • - Der OPR-Winkel eines jeden Antikörper-Meßpunkts auf dem Chip wird danach gemessen und wie oben beschrieben gespeichert. Bei Bedarf wird der rohe "Experimentdatensatz", anhand der OPR-Winkel gewonnen aus den Kontrollpunkten, normalisiert. Der OPR-Winkel eines jeden gemessenen Punktes ist ein Maß für die Menge an Antikörper und Protein, welches aus der ersten Gewebeprobe an den Antikörper, auf dem respektiven Meßpunkt immobilisiert, gebunden hat.
  • - Nachdem die entsprechenden OPR-Daten zu der ersten Gewebeprobe eines jeden Antikörper-Meßpunkts gemessen und gespeichert sind, werden die gebundenen Proteine mittels bekannter Methoden vom Chip gelöst und der Chip regeneriert. Alternativ kann ein im wesentlichen identischer und/oder kalibrierter Chip als Ersatz eingesetzt werden.
  • - Ein Proteinrohextrakt einer zweiten Gewebeprobe wird dann extrahiert und der regenerierte oder Ersatz-Chip darin inkubiert, wodurch die respektiven Proteine der zweiten Probe an die angeordneten Antikörper binden können. Unspezifische Bindungen werden abgewaschen und der ORP-Winkel für jeden einzelnen Meßpunkt auf dem Chip wie oben beschrieben gesammelt, um daraus die Menge an Protein bestimmen zu können, welche durch die einzelnen Antikörper gebunden wurde.
  • - Bei Bedarf kann dieser Vorgang mit Hilfe eines regenerierten Chips oder Replikachips mit weiteren Gewebeproben wie oben beschrieben wiederholt werden.
  • - Veränderungen im OPR-Winkel werden für jeden einzelnen Antikörper- Meßpunkt durch den Vergleich zwischen den "Referenzdaten" und den "Eperimentdaten", oder bei mehreren Experimenten durch Vergleich zwischen den respektiven "Eperimentdaten" festgestellt. Eine signifikante Veränderung im OPR- Winkel-Vergleich eines definierten Antikörpers zwischen zwei Testreihen ist ein Indiz dafür, daß ein bestimmtes Protein, welches an diesen Antikörper binden kann, in den respektiven Proben unterschiedlich hoch exprimiert worden ist. Durch den Vergleich möglicher Abweichungen im OPR-Winkel-Muster oder verschiedener ausgewählter Antikörper-Meßpunkte, kann ein Protein-Expressionsmuster für ein bestimmtes Gewebe bestimmt werden.
Ein derartiges Verfahren mit einer Vielzahl von Antikörpern in regelmäßiger Anordnung ist zum Beispiel hilfreich zur Interpretation von Interaktionsmustern komplexer Mischungen von Molekülen. Standardisierte Chips mit regelmäßiger Anordnung können produziert werden und sind für eine begrenzte Zeit wiederverwendbar.
Weiterführende Analysen von interagierenden Molekülen können zum Beispiel mit Hilfe von Massenspektrometern erfolgen, welche entweder den unmodifizierten Chip verwenden oder den Chip nach selektivem Ablösen analysieren.

Claims (15)

1. Vorrichtung zur Detektion von molekularen Wechselwirkungen zwischen einzelnen Mitgliedern einer Vielzahl n unterschiedlicher molekularer Spezies Si(a) (1 ≦ a ≦ n) und einer weiteren Vielzahl m unterschiedlicher molekularer Spezies Sg(b) (1 ≦ b ≦ m), wobei die Si(a) an einer Phasengrenzfläche immobilisiert sind und die Sg(b), sich in einer nicht-festen Phase befinden, in der sie sich bewegen können, gekennzeichnet durch
  • a) eine Vielzahl von n + x Meßpunkten Mi(c, a) (1 ≦ c ≦ n + x), angeordnet an der Phasengrenzfläche, auf welchen Meßpunkten die Si(a), dergestalt immobilisiert sind, daß auf jedem Meßpunkt fast ausschließlich Moleküle einer Spezies Si(a) immobilisiert sind, und auf der überwiegenden Anzahl der Meßpunkte unterschiedliche Spezies immobilisiert sind, sowie
  • b) ein Detektionssystem, welches in der Lage ist, eine physikalische Eigenschaft einer Phasengrenzfläche an einem Punkt Mi(c, a) der Phasengrenzfläche, welche Eigenschaft sich mit dem Eintreten einer Wechselwirkung zwischen einer am Punkt Mi(c, a) immobilisierten Spezies Si(a) und mindestens einer Spezies Sg(b) ändert, für jeden Meßpunkt Mi(c, a) unabhängig zu bestimmen.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 besonders gekennzeichnet dadurch, daß jene Phase der die Phasengrenzfläche bildenden Phasen, die nicht die Sg(b) enthält, eine feste Phase ist.
3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 2 besonders gekennzeichnet dadurch, daß besagtes Detektionssystem eine Lichtquelle und einen Lichtdetektor umfaßt.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 besonders gekennzeichnet dadurch, daß besagte physikalische Eigenschaft der Brechungsindex an der durch die Phasengrenzfläche gebildeten optischen Oberfläche ist.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 besonders gekennzeichnet dadurch, daß die Anzahl n der an der Phasengrenzfläche immobilisierten Spezies Si(a) größer ist als 4, vorzugsweise größer ist als 10, besonders bevorzugt größer ist als 50, am vorteilhaftesten größer ist als 100.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 besonders gekennzeichnet dadurch, daß es möglich ist, die Wechselwirkung zwischen der auf Mi(c, a) immobilisierten Spezies Si(a) und mindestens einer Spezies Sg(b) an der Phasengrenzfläche räumlich und zeitlich unabhängig von der Detektionsvorrichtung und dem Detektionsvorgang durchzuführen.
7. Verfahren zur Detektion von molekularen Wechselwirkungen zwischen einzelnen Mitgliedern einer Vielzahl n unterschiedlicher molekularer Spezies Si(a) (1 ≦ a ≦ n) und einer weiteren Vielzahl m unterschiedlicher molekularer Spezies Sg(b) (1 ≦ b ≦ m), wobei die Si(a) an einer Phasengrenzfläche immobilisiert sind und die Sg(b), sich in einer nicht-festen Phase befinden, in der sie sich bewegen können, gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte
  • a) Immobilisierung der Si(a) an einer Vielzahl von n + x Meßpunkten Mi(c, a) (1 ≦ c ≦ n + x), angeordnet an der Phasengrenzfläche, dergestalt, daß auf jedem Meßpunkt fast ausschließlich Moleküle einer Spezies Si(a) immobilisiert sind, und auf der überwiegenden Anzahl der Meßpunkte unterschiedliche Spezies immobilisiert sind, sowie
  • b) Messung einer physikalischen Eigenschaft der Phasengrenzfläche an den Meßpunkten Mi(c, a) der Phasengrenzfläche, welche Eigenschaft sich mit dem Eintreten einer bindenden Wechselwirkung zwischen der auf Mi(c, a) immobilisierten Spezies Si(a) und mindestens einer Spezies Sg(b) ändert, für jeden Meßpunkt Mi(c, a) unabhängig, sowie
  • c) Herstellen eines Kontakts zwischen der Phasengrenzfläche und der Phase, welche die Sg(b) enthält, in einer Weise, die eine Wechselwirkung zwischen den Si(a) und den Sg(b) erlaubt, sowie
  • d) Messung der physikalischen Eigenschaft der Phasengrenzfläche am Punkt Mi(c, a) der Phasengrenzfläche, welche Eigenschaft sich mit dem Eintreten einer bindenden Wechselwirkung zwischen der auf Mi(c, a) immobilisierten Spezies Si(a) und mindestens einer Spezies Sg(b) ändert, für jeden Meßpunkt Mi(c, a) unabhängig, sowie
  • e) Detektion einer molekularen Wechselwirkung zwischen einer Spezies Si(a) und mindestens einer Spezies Sg(b) durch Vergleich der bei der Messung der besagten physikalischen Eigenschaft am Punkt Mi(c, a) in Schritt d. und Schritt f. erhaltenen Werte für besagte physikalische Eigenschaft, wobei eine Veränderung des erhaltenen Wertes von Schritt d. nach Schritt f. eine molekulare Wechselwirkung anzeigt.
8. Verfahren nach Anspruch 6 gekennzeichnet dadurch, daß jene Phase der die Phasengrenzfläche bildenden Phasen in Schritt e., die nicht die Sg(b) enthält, eine feste Phase ist.
9. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7 gekennzeichnet dadurch, daß die Messung der physikalischen Eigenschaft der Phasengrenzfläche in Schritt d. und Schritt f. unter Verwendung einer Lichtquelle und eines Lichtdetektors durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8 gekennzeichnet dadurch, daß besagte physikalische Eigenschaft der Brechungsindex an der durch die Phasengrenzfläche gebildeten optischen Oberfläche ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10 besonders gekennzeichnet dadurch, daß die Anzahl n der an der Phasengrenzfläche immobilisierten Spezies Si(a) größer ist als 4, vorzugsweise größer ist als 10, besonders bevorzugt größer ist als 50, am vorteilhaftesten größer ist als 100.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11 gekennzeichnet dadurch, daß Schritt d. und Schritt f. räumlich und zeitlich unabhängig von Schritt e. durchgeführt werden können.
13. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Identifikation von molekularen Spezies, die miteinander wechselwirken.
14. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 7 bis 12 zur Identifikation von molekularen Spezies, die miteinander wechselwirken.
15. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung gekennzeichnet dadurch, daß das Verfahren mindesten einen Verfahrensschritt enthält, in dem
  • a) unter Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, oder eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 7 bis 12, eine Wechselwirkung identifiziert wird, welche für einen besonders erwünschten oder besonders unerwünschten physischen Zustand Relevanz besitzt,
  • b) ein Agonist, Inhibitor oder Antagonist der in Schritt h. identifizierten Wechselwirkung identifiziert wird,
  • c) der Inhibitor in einer pharmazeutisch akzeptablen Form formuliert wird.
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