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Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Probenaufgabe für planare,
miniaturisierte Analysensysteme.
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In
Bereichen wie der Lebensmittelanalytik, Umweltanalytik oder auch
der industriellen Qualitätskontrolle
besteht zunehmend Bedarf an Analysensystemen, die schnell und ohne
großen
apparativen Aufwand die genaue und quantitative Analyse komplexer
Gemische ermöglichen.
Neben Sensoren oder Schnelltests, die auf spezifischen chemischen
Reaktionen basieren und daher keine universellen Verfahren darstellen,
werden hauptsächlich
chromatographische und elektrophoretische Trennverfahren eingesetzt.
Im Gegensatz zu den meisten chromatographischen und elektrophoretischen
Verfahren bietet die Isotachophorese (ITP) die Möglichkeit, große Probenmengen
bei hoher Trennselektivität
ohne vorherige Aufarbeitung zu analysieren. Elektrophoretische Trennverfahren
wie die ITP eignen sich zudem auch zum Einsatz in miniaturisierten
Analysensystemen (MAS), so daß der
apparative Aufwand für
die Analysen stark reduziert werden kann. Ein wesentlicher Vorteil
des Einsatzes von MAS besteht darin, daß diese nach einer Kontaminierung
verworfen werden können.
Um diesen Vorteil zu realisieren, muß die Reproduzierbarkeit von
Analysen in der Serie und zwischen verschiedenen MAS gleichen Types
sichergestellt sein.
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US 5,644,395 offenbart ein
miniaturisiertes Analysensystem für die „Flow Injection" Analyse, in dem
kleine Probenmengen und Reagenzien in einem Kanalsystem gemischt
und umgesetzt sowie detektiert werden können.
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WO 98/52691 offenbart ein
mikrofluidisches System, mit dem in vitro Studien über die
Wirkungen verschiedener Substanzen auf Zellen durchgeführt werden
können.
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WO 98/05424 beschreibt ein
miniaturisiertes Analysensystem bestehend aus Basis-Einheit, Adapter
und Substrat. Durch den Adapter können verschiedene Substrate
mithilfe derselben Basis-Einheit betrieben werden.
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G.
Blankenstein und U.D. Larsen, Biosensors & Bioelectronics, Vol. 13, No. 3-4,
Seiten 427-438, 1998 stellen ein modulares mikrochemisches Analysensystem
vor, mit dem auch Partikel-haltige Proben bearbeitet werden können.
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WO 96/04547 offenbart ein
mikrofluidisches System für
chemische Analyse und Synthese. Die Analyten werden elektrokinetisch
aufgegeben und können
mittels Kapillarelektrophorese oder Elektrochromatographie aufgetrennt
werden.
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Neben
der Analysenvorrichtung selbst ist einer der wichtigsten Bestandteile
eines miniaturisierten Systems die Vorrichtung zur Probenaufgabe.
Da Verfahren wie beispielsweise die ITP bezüglich der Beschaffenheit und
der Menge der Probe sehr variabel sind, wird durch die Art der Probenaufgabe
bestimmt, welches Probenvolumen und welche Art von Probe analysiert
werden kann.
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In
makroskopischen Analysensystemen können ähnlich wie bei Geräten für die Hochdruckflüssigkeitschromatographie
oder Geräten
für die
Isotachophorese mechanische Aufgabevorrichtungen zur Aufgabe eines
definierten Probenvolumens verwendet werden. In 3 wird
beispielhaft eine derartige Aufgabevorrichtung aus dem Stand der
Technik näher
beschrieben. Die Vorrichtungen bestehen zumeist aus komplex aufgebauten
Hahnsystemen, teilweise mit integrierten Aufgabeschleifen. Auf miniaturisierte
Analysensysteme lassen sich diese Vorrichtungen nicht übertragen,
da drehbare Hähne
oder sonstige mechanische Vorrichtungen, wie beispielsweise verschließbare Ventile,
nicht entsprechend miniaturisiert werden können.
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Deswegen
finden sich bei miniaturiserten Analysenvorrichtungen auf Basis
von Kapillarelektrophorese (CE) oder ITP Vorrichtungen, bei denen
die Probenaufgabe elektrokinetisch unter Ausnutzung des elektroosmotischen
Flusses erfolgt. Dies wird im folgenden elektroosmotische Probenaufgabe
genannt. Ein schematischer Aufbau einer solchen Vorrichtung aus
dem Stand der Technik ist in 2 gezeigt.
Durch gekreuzte oder versetzt gekreuzte Kapillarstrukturen wird
ein Probenvolumen dadurch definiert, daß zunächst ein Kanal mit Probe befüllt wird. Dies
kann beispielsweise elektroosmotisch durch Anlegen einer Spannung
erfolgen. Anschließend
werden die Elektroden an dem befüllten
Kanal auf gleiches Potential geschaltet und eine Spannung an dem senkrecht
dazu liegenden Trennkanalsystem angelegt. Auf diese Weise wird das
Probenvolumen, das sich an der Schnittstelle der beiden Kanalsysteme befindet,
in das Trennkanalsystem transportiert. Das so erzeugte Probenvolumen
liegt im Bereich einiger Nanoliter oder weniger.
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Auf
diese Weise ist es zwar möglich,
ein durch die Schnittstelle der Kanäle definiertes Probenvolumen
aufzugeben, aber die Volumenelemente, in denen durch Diffusion Stoffaustausch
mit den Seitenkanälen
stattfindet, sind bezogen auf das durch das Schnittvolumen vorgegebene
Proben volumen sehr groß.
Somit ist das tatsächlich
eingebrachte Probenvolumen starken Schwankungen unterworfen. Da
nur sehr kleine Probenmengen untersucht werden können, sinkt zudem die Konzentration
bestimmter Analyte im Detektionsbereich schnell unter die Nachweisgrenze
oder das entnommene Probenvolumen kann nicht als repräsentativ
für die
Probengesamtheit angesehen werden.
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Weiterhin
kann die Probenaufgabe bei ausreichend großem Kanalquerschnitt durch
hydrodynamische Injektion aus einem Probengefäß erfolgen. Dabei wird ein
Teil der Probe durch zeitlich gesteuertes Anlegen eines Druckunterschiedes
aus dem externen Probengefäß an den
Anfang der Trennkapillare transportiert. Nachteil dieser Technik
ist eine starke Abhängigkeit
des Probenvolumnes von der Beschaffenheit der Probe (z.B. Viskosität), aber
auch von der erreichbaren Genauigkeit der Drucksteuerung. Schon
dadurch ist die Aufgabe eines exakt definiertes Probenvolumen nicht
möglich.
Zusätzlich bestehen
auch hier Probleme durch diffusiven bzw. konvektiven Stoffaustausch
an den Grenzflächen zwischen
Probevolumen und angrenzenden Volumeneinheiten. Bei kommerziellen,
nicht miniaturisierten Systemen ist die hydrodynamische Injektion Stand
der Technik, für
miniaturisierte Systeme bietet sie keine Vorteile gegenüber der
oben beschriebenen elektrokinetischen Injektion unter Ausnutzung des
elektroosmotischen Flusses.
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Eine
direkte, elektrophoretische Injektion aus einem externen Probengefäß (ohne
Ausnutzung des elektroosmotischen Flusses), wie sie ebenfalls in kommerziellen
Geräten
eingesetzt wird, ist schon vom Prinzip her nicht geeignet, definierte
Volumina aufzugeben, da hierbei in der Probelösung kein Volumenfluß erzeugt
wird, sondern nur Ionen elektrophoretisch in das Trennsystem überführt werden.
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Ein
weiterer grundsätzlicher
Nachteil aller elektroosmotischen Verfahren ergibt sich aus der
eingeschränkten
Materialauswahl. Da der Proben transport an das Auftreten eines elektroosmotischen
Flusses gebunden ist, muß eine
hohe Ladungsdichte an der Materialoberfläche vorhanden sein. Zudem erfolgt
schon während
der Aufgabe eine elektrophoretische Auftrennung der Probe, so daß ein inhomogenes
Injektionsprofil entsteht.
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Da
mittels ITP problemlos größere Probenvolumina
analysiert werden können,
wird die Analyseleistung der derzeitigen miniaturisierten Analysensysteme
größtenteils
durch die ungenügende
Möglichkeit
zur Aufgabe großer,
definierter Probenvolumina eingeschränkt.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung zur Probenaufgabe
zu entwickeln, die es ermöglicht,
definierte variable Probenvolumina zwischen 0,1 bis 100 μl in ein
miniaturisiertes Analysensystem einzubringen.
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Es
wurde gefunden, daß eine
Aufgabevorrichtung bestehend aus einem Kanalsystem sowie Fluidikanschlüssen zum
Flüssigkeitstransport
die Aufgabe großer
Probenvolumina in planaren Systemen ermöglicht. Durch Öffnen des
Systems am Ende eines Kanalabschnitts und gleichzeitiges Befüllen des
Kanalabschnitts mit der Probenlösung
am anderen Ende wird ein bestimmter Kanalabschnitt mit der Probenlösung gefüllt. Das
Volumen des Kanalabschnitts und somit das aufgegebene Probenvolumen ist
durch die Geometrie des Kanalabschnitts bestimmt, ansonsten aber
frei wählbar.
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Gegenstand
der Erfindung ist daher eine Vorrichtung zur Aufgabe definierter
Probenvolumina über
0,01 μl
für miniaturisierte
Analysensysteme, umfassend in der Hauptsache mindestens einen Kanalabschnitt,
an dessen Enden jeweils Fluidikanschlüsse vorhanden sind.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Vorrichtung können
Probenvolumina zwischen 0,05 und 30 μl aufgegeben werden.
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Bevorzugte
Ausführungsform
ist weiterhin eine Aufgabevorrichtung, die mindestens zwei hintereinanderliegende
Kanalabschnitte enthält,
die jeweils von Fluidikanschlüssen
begrenzt werden. Wenn beide Kanalabschnitte direkt aneinander grenzen,
so sind insgesamt drei Fluidikanschlüsse vorgesehen.
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Bevorzugte
Ausführungsform
ist auch eine Aufgabevorrichtung, die ein Kanalsystem mit mindestens
zwei parallelen Kanalabschnitten enthält, die unabhängig voneinander
von Fluidikanschlüssen
begrenzt werden.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
ist eine Vorrichtung, die als Fluidikanschlüsse Ventile und Mikropumpen
oder dichtschließende
Mikropumpen besitzt.
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1 zeigt
eine erfindungsgemäße Aufgabevorrichtung.
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2 zeigt
eine Aufgabevorrichtung für
miniaturisisierte Analysensysteme aus dem Stand der Technik.
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3 zeigt
eine Aufgabevorrichtung für makroskopische
Analysensysteme aus dem Stand der Technik.
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Im
Gegensatz zu anderen Aufgabemethoden wird bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung
das Kanalsystem während
der Probenaufgabe an zwei Stellen geöffnet. Eine Öffnung dient
zur Einleitung der Flüssigkeit,
d.h. beispielsweise der Probenlösung,
die andere Öffnung
ermöglicht
den Austritt der vorher im System befindlichen Flüssigkeit
oder Luft. Prinzip der erfindungsgemäßen Aufgabevorrichtung ist
demnach das Verdrängen
eines in einem bestimmten Kanalabschnitt befindlichen Flüssigkeits- oder
Gas-Volumens durch die Probenlösung.
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Durch
geeignete Wahl der Eintritts- und Austrittsöffnung wird lediglich die Flüssigkeit
in dem dazwischenliegenden Kanalabschnitt verdrängt bzw. der dazwischenliegende
Kanalabschnitt gefüllt.
Die Flüssigkeit
in eventuell vorhandenen angrenzenden Seitenkanälen wird nicht ausgetauscht,
da sich in den Seitenkanälen
keine geöffneten
Eintritts- oder Austrittsöffnungen
befinden und so die Flüssigkeit
in diesen Bereichen weder durch Druck noch durch Sog bewegt wird.
Verluste bzw. Verdünnungen
durch Flüssigkeitsströme an den
Kontaktflächen
zu Seitenkanälen
sind im Verhältnis
zum gesamten Probenvolumen, das typischerweise im μl-Bereich liegt, gering. Bei
geeigneter konstanter Dosiergeschwindigkeit kann die Probenaufgabe
sehr gut reproduzierbar erfolgen. Dies ist ein großer Vorteil
gegenüber
Methoden, bei denen sehr kleine Probenvolumina von wenigen Nanolitern
aufgegeben werden. Eine erfindungsgemäße Aufgabevorrichtung ist prinzipiell
auch für
Aufgabenvolumina von weniger als 50 nl geeignet. Jedoch sind dann
bezüglich
Präzision
und Genauigkeit Kompromisse notwendig.
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Der
Transport der Probenflüssigkeit
kann über
dicht angeschlossene Pumpen, Spritzen, Elektroosmose oder hydrostatischen
Druck erfolgen, bevorzugt über
Mikropumpen- und Ventile.
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Diese
Vorrichtungen können
bevorzugt außerhalb,
möglichst
dicht am Chip, angebracht werden.
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Die
austretende Flüssigkeit
muß nicht
zusätzlich
abgepumpt werden. Sie wird durch den Druck der injizierten Ersatzflüssigkeit
hinreichend effektiv verdrängt.
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Durch
diese Art des Befüllens
werden die Nachteile der elektroosmotischen Injektion vermieden,
d.h. die Befüllung
ist weitgehend unabhängig von
Probenzusammensetzung, pH-Wert und dem Material des Analysensystems.
Durch die vorhandenen Ventile oder dichtschließenden Pumpen wird jede störende Flüssigkeitsbewegung,
wie beispielsweise durch hydrostatische Druckdifferenzen oder Elektroosmose,
unterbunden.
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Erfindungsgemäß werden
alle Ventile, Pumpen bzw. Mikropumpen, dichtschließende Mikropumpen
oder sonstigen Anschlüsse
der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
die zum Befüllen
des Kanalsystems dienen, als Fluidikanschlüsse bezeichnet.
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Die
erfindungsgemäße Aufgabevorrichtung kann
für jede
Art von planarem miniaturisiertem Analysensystem eingesetzt werden.
Es kann sich dabei um Systeme für
die Analytik handeln oder auch um Systeme, die zusätzlich Trenn-
oder Derivatisierungseinheiten enthalten. Dem Fachmann sind entsprechende
miniaturisierte Systeme bekannt.
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Viskosität und Ionenstärke der
Probenlösung oder
der zu verdrängenden
Lösung,
d.h. z.B. eines Transportpuffers, haben nur geringen Einfluß auf die Dosierung
oder die Einfüllgeschwindigkeit.
Es ist möglich,
Suspensionen, Emulsionen, Partikel- und zellhaltige Flüssigkeiten
einzufüllen.
Genauso unterliegt die Wahl des Materials zum Aufbau der Analysenvorrichtung,
d.h. besonders die Beschaffenheit der Wände des Kanalsystems der erfindungsgemäßen Vorrichtung
zur Probenaufgabe keiner Einschränkung.
Auch Druckschwankungen, Pulsationen, Anlauf- oder Stopeffekte während des Einbringens der Probe
haben auf die Dosiergenauigkeit keinen Einfluß.
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Weiterhin
ist hat erfindungsgemäße Vorrichtung
bezüglich
des Aufgabevolumens systembedingt weite Grenzen. Das Volumen der
Probeflüssigkeit, die
injiziert werden kann, wird allein durch das Volumen des Kanalabschnitts
bestimmt, der sich zwischen den Öffnungen
befindet. Durch Variation der geometrischen Abmessungen dieses Abschnitts
bei dem Design des Kanalsystems der Analysevorrichtung lassen sich
vorab an das analytische Problem angepasste Probenvolumina festlegen.
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Genauso
ist es möglich,
verschieden große Abschnitte
parallel und/oder in Reihe zu implementieren, so daß das Volumen
des durch die Probenlösung
zu verdrängenden
Abschnitts variiert werden kann. Bevorzugterweise wird deshalb ein
Analysesystem zur Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit mehreren
Kanalabschnitten unterschiedlicher Dimension versehen, die über jeweils
unabhängige
Fluidikanschlüsse
für die
Probenaufgabe verwendet werden können.
Dadurch können
Probenvolumina zwischen 0,01 μl
und 100 μl,
bevorzugt zwischen 0,05 und 30 μl
in unterschiedlicher Abstufung je nach Bedarf injiziert werden.
Dabei werden üblicherweise
Variationskoeffizienten bei der Aufgabe von Probenvolumina ab 1 μl von etwa
5%, typischerweise unter 2% erreicht.
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Auf
diese Weise können
quantitativ reproduzierbare und leicht handhabbare repräsentative
Probenmengen eines flüssigen
Analyten in jedes mikrostrukturierte System eingebracht werden.
Besonders bevorzugt ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung
für die
ITP, da damit die Möglichkeit
gegeben ist, kleinste Mengen von Analyten aus großen Probenvomunina
anzureichern und zu separieren.
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1 zeigt
beispielhaft eine mögliche
Anordnung des Kanalsystems der erfindungsgemäßen Aufgabevorrichtung. Das
Kanalsystem ist in zwei Kanalabschnitte 1A und 1B mit
unterschiedlichem Volumen unterteilt. Daran angrenzend befindet
sich der Trennkanal 1C. Über die Fluidikanschlüsse 11, 12 und 13 kann
entweder der Kanalabschnitt 1A (Bei Öffnen der Anschlüsse 11 und 12)
oder der Kanalabschnitt 1B (Bei Befüllen über die Anschlüsse 12 und 13)
oder die beiden Kanalabschnitte zusammen (bei Befüllen über die
Anschlüsse 11 und 13)
mit der Probenlösung
gefüllt
werden. Nach Befüllen
der Aufgabeabschnitte wird durch Anlegen einer Spannung die Probe
in Abschnitt 1C aufgetrennt. Falls nur Abschnitt 1A mit
der Probe befüllt
wurde, kann auch Abschnitt 1B als Trennstrecke genutzt
werden, so daß die
Trennstrecke bei Bedarf verlängert
werden kann.
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2 zeigt
eine Möglichkeit
zur elektrokinetischen Probenaufgabe in miniaturisierten Analysensystemen
nach dem Stand der Technik. Die Bilder A, B, C und D zeigen die
einzelnen Schritte der Probenaufgabe. Bild A zeigt schematisch eine
gekreuzte Kanalstruktur. An den Enden der Kanäle befinden sich die Elektroden
E1 bis E4. Zunächst
wird, wie in Bild B verdeutlicht, durch Anlegen einer Spannung zwischen
Elektrode E1 (0 V) und E2 (+ 500 V) ein Kanal mit Probe befüllt. Anschließend werden,
wie in Bild C gezeigt, die Elektroden an dem befüllten Kanal auf gleiches Potential
geschaltet (z.B. E1 und E2 beide auf + 400 V) und eine Spannung
an dem senkrecht dazu liegenden Trennkanalsystem angelegt (E3 =
0 V und E4 = + 2,5 kV). Auf diese Weise wird das Probenvolumen,
das sich an der Schnittstelle der beiden Kanalsysteme befindet,
in das Trennkanalsystem transportiert (Bild D). Das so erzeugte
Probenvolumen liegt im Bereich einiger Nanoliter oder weniger.
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3 zeigt
eine Möglichkeit
zur Probenaufgabe in makroskopischen Analysensystemen, wie beispielsweise
dem Isotachophoresegerät
ItaChrom® EA
101 der Firma I + M, Analytische Meß- und Regeltechnik, Deutschland.
Die Bilder A1/A2, B1/B2 und C1/C2 zeigen die unterschiedlichen Stufen
der Probenaufgabe, wobei die Bilder A1, B1 und C1 eine Seitenansicht
der Aufgabevorrichtung zeigen, die Bilder A2, B2 und C2 eine Ansicht
von oben. Diese mechanische Vorrichtung zur Probenaufgabe besteht aus
einem Hahn K, der von einer Ummantelung U umgeben ist. Sowohl die
Ummantelung U, wie auch der Hahn K sind mehrfach von Kanälen durchbrochen.
Der Hahn K kann in der Ummantelung U derart gedreht werden, daß jeweils
bestimmte Kanäle
in Hahn und Ummantelung verbunden werden und so Flüssigkeiten
aus Vorratsgefäßen durch
die gezeigte Vorrichtung definiert in das angeschlossene Isotachophoresegerät gelangen.
Vorratsbehälter
und das ITP-Gerät
sind in der Abbildung nicht gezeigt, sondern lediglich durch Pfeile
angedeutet. In den Abbildungen A1/A2 ist der Hahn derart gedreht,
daß eine Verbindung
der Kanalstücke 3, 4 und 5,
sowie 2 und 6 besteht. Dadurch wird Kanalstück 5 im
inneren des Hahns mit Probelösung
aus einem Vorratsgefäß gefüllt, das
mit Kanal 3 verbunden ist. Außerdem wird über ein
Vorratsgefäß an Kanal 2 das
Kanalsystem des Isotachophoresegeräts mit einem der beiden für eine ITP
notwenigen Trennpuffer (Puffer 1) gefüllt.
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In
einem zweiten Schritt (Bild B1/B2) wird der Hahn K so gedreht, daß die in
Bild A1/A2 bestandenen Kanalverbindungen unterbrochen werden. Statt dessen
wird eine Verbindung der Kanalstücke 1 und 7 hergestellt.
Auf diese Weise wird das hinter der Aufgabevorrichtung liegende
Kanalsystem mit einem zweiten Puffer (Puffer 2) gefüllt. In
Bild C1/C2 wird schließlich
der Hahn K erneut gedreht, so daß eine Verbindung der Kanalstücke 1, 5 und 2 entsteht.
Kanal 2 ist mit Puffer 1 gefüllt, Kanal 5 mit der
Probenlösung
und Kanal 1 mit Puffer 2. Auf diese Weise ist ein
durch die Abmessungen von Kanal 5 definiertes Volumen der
Probenlösung
zwischen den für
die ITP notwendigen zwei Puffern eingebettet. Durch Anlegen einer
Spannung kann nun die Trennung begonnen werden.
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Auch
ohne weitere Ausführungen
wird davon ausgegangen, daß ein
Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann.
Die bevorzugten Ausführungsformen
und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als
in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.