DE19925448A1 - Multiplex-PCR with fluorescence-optical product detection through the use of primers with "primer-integrated reporter sequences" (PIRS) - Google Patents

Abstract

The invention relates to methods for detecting products of a nucleic acid amplification reaction, whereby novel primers containing a primer-integrated reporter sequence and specific probes therefor enable a highly sensitive, quantitative determination of the amplification products. The invention also relates to reagent kits and nucleic acids which are suitable as PIRS primers.

Description

Fluoreszenzoptische Verfahren zur Detektion von Produkten der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) ermöglichen eine hochempfindliche quantitative Bestimmung von Molekülen einer DNA-Zielsequenz.Fluorescence optical methods for the detection of polymerase products Chain reaction (PCR) enable a highly sensitive quantitative Determination of molecules of a target DNA sequence.

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) stellt ein Verfahren zur exponentiellen Vermehrung von spezifischen DNA-Abschnitten dar.The polymerase chain reaction (PCR) represents a method of exponential Propagation of specific DNA segments.

Zur Automatisierung der Detektion von Produkten einer Polymerase- Kettenreaktion wurden zwei Verfahren entwickelt, die eine fluoreszenzoptische Detektion der Reaktionsprodukte während der laufenden Reaktion in quantitativer Hinsicht ermöglichen und so die Anzahl von Molekülen der Zielsequenz, die im PCR-Ansatz vor Beginn der Reaktion vorhanden waren zu ermitteln helfen. Das erste Verfahren betrifft die TaqMan™-Technologie der Firma Applied Biosystems/Perkin Elmer, die das ABI-PRISM™-Sequenzdetektionssystem einschließt. Das TaqMan-System nutzt die 5'-Nuklease-Aktivität der Taq-DNA-Polymerase, wobei ein Oligonukleotid verwendet wird, das am 5'-Ende mit einem Fluoreszenzmolekül und am 3'-Ende mit einem Quenchermolekül markiert ist, wobei die Taq-DNA-Polymerase durch ihre 5'-Exonukleaseaktivität das Fluoreszenzmolekül freisetzt, dessen Signal im ABI-PRISM- Sequenzdetektionssystem nachgewiesen wird. Als Fluoreszenzfarbstoffe stehen die drei Moleküle FAM, JOE und VIC zur Verfügung, die mit dem Quenchermoleküle TAMRA kombiniert werden können. Die Synthese von TaqMan™-Sonden wird von verschiedenen Herstellern angeboten. To automate the detection of products from a polymerase Chain reaction, two methods have been developed, one fluorescence-optical detection of the reaction products during operation Enable reaction in quantitative terms and so the number of Molecules of the target sequence used in the PCR approach before the start of the reaction help identify were present. The first procedure concerns the Applied Biosystems / Perkin Elmer's TaqMan ™ technology that ABI-PRISM ™ sequence detection system. The TaqMan system uses the 5'-nuclease activity of Taq DNA polymerase, where a Oligonucleotide is used, which at the 5 'end with a Fluorescence molecule and labeled at the 3 'end with a quencher molecule , the Taq DNA polymerase due to its 5'-exonuclease activity Releases fluorescence molecule whose signal in the ABI-PRISM- Sequence detection system is detected. As fluorescent dyes the three molecules FAM, JOE and VIC are available Quench molecules TAMRA can be combined. The synthesis of TaqMan ™ probes are available from various manufacturers.  

Das zweite System betrifft das Light-Cycler™-System der Firmen Boehringer Mannheim/Hoffmann La Roche. Hierbei sind die Fluoreszenzfarbstoffe auf zwei verschiedene Oligonukleotide verteilt. Am 3'-Ende des ersten Oligonukleotids befindet sich der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein, während das sich stromabwärts vom ersten Oligonukleotid anlagernde zweite Oligonukleotid an seinem 5'-Ende den Fluoreszenzfarbstoff LC Red 640 aufweist. Das Fluorescein wird von einer LED als Lichtquelle angeregt und emittiert Licht, das über Fluoreszenzresonanzenergietransfer das zweite Fluoreszenzmolekül (LC Red 640 oder LC Red 705) anregt. Das von dem zweiten Farbstoff emittierte Licht wird über einen entsprechenden Filter detektiert. Eine Anregung des zweiten Farbstoffs kann nur dann erfolgen, wenn sich durch die Anlagerung der beiden Oligonukleotide an ihren Komplementärstrang die beiden Farbstoffmoleküle in räumlicher Nähe (Distanz von 1 bis 5 Nukleotiden) befinden, erfolgen. Das Prinzip des Systems beruht also auf der sekundären Anregung eines zweiten Fluoreszenzfarbstoffs, die erst durch die Generation von PCR-Produkt ermöglicht wird. Beim bereits beschriebenen TaqMan™-System dagegen wird vom Fluoreszenzfarbstoffmolekül emittiertes Licht vom Quenchermolekül absorbiert, weswegen erst nach der Hydrolyse des Fluoreszenzfarbstoffmoleküls vom Oligonukleotid durch die 5'-3'- Exonukleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase die Quencherwirkung aufgehoben und emittiertes Licht gemessen werden kann.The second system concerns the Light Cycler ™ system from Boehringer Mannheim / Hoffmann La Roche. Here the fluorescent dyes are on two different oligonucleotides distributed. At the 3 'end of the first While the oligonucleotide is the fluorescent dye, fluorescein the second downstream of the first oligonucleotide Oligonucleotide at its 5 'end the fluorescent dye LC Red 640 having. The fluorescein is excited by an LED as a light source and emits light, the second via fluorescence resonance energy transfer Fluorescence molecule (LC Red 640 or LC Red 705) excites. That from that second dye emitted light is through an appropriate filter detected. The second dye can only be excited if if the attachment of the two oligonucleotides to their Complementary strand the two dye molecules in close proximity (Distance of 1 to 5 nucleotides). The principle of Systems is based on the secondary excitation of a second Fluorescent dye that only through the generation of PCR product is made possible. In contrast, with the TaqMan ™ system already described is emitted light from the fluorescent dye molecule Quench molecule is absorbed, which is why only after the hydrolysis of the Fluorescent dye molecule from the oligonucleotide through the 5'-3'- Exonuclease activity of Taq DNA polymerase the quencher effect can be canceled and emitted light can be measured.

Die durch beide Systeme ermöglichte hochempfindliche quantitative Bestimmung von Molekülen einer DNA-Zielsequenz macht eine aufwendige Produktanalyse, wie z. B. durch gelelektrophoretische Auftrennung nach der eigentlichen PCR-Reaktion überflüssig. Für jede zu erfassende Zielsequenz wird jedoch eine spezifische Sonde benötigt, entweder ein an beiden Enden fluoreszenzmarkiertes Oligonukleotid wie beim TaqMan™-System oder zwei einfach fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide wie beim Light-Cycler™- System. Die genannten Systeme sind grundsätzlich einsetzbar für Multiplexanwendungen, d. h. es können mehrere Zielsequenzen hierbei gleichzeitig amplifiziert werden. Ein Nachteil dieser Anwendungsart bei diesen bekannten Verfahren ist, dass zur Detektion für jede einzelne Zielsequenz eine eigene Sonde bzw. ein eigenes Sondenpaar benötigt wird, die/das spezifisch an einen internen Bereich der durch die Amplifikation entstandenen Zielsequenz binden muss. Sollen viele verschiedene Zielsequenzen nebeneinander nachgewiesen werden, so wird der Reaktionsansatz wegen der steigenden Anzahl verschiedener Detektionssonden relativ teuer und die zunehmende Zahl der Sonden kann die RCR-Amplifikation beeinträchtigen. Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht somit darin, durch geeignete Veränderungen der Primer-Strukturen sowohl bei Anwendung des TaqMan™- wie des Light Cycler™-Systems eine Möglichkeit zu finden, den teuren Einsatz jeweils spezifischer Sondenoligonukleotide zu umgehen. Hierbei sollte die Multiplex-Anwendung, die für die heutige Diagnostik immer wichtiger wird, nicht beeinträchtigt werden.The highly sensitive quantitative enabled by both systems Determining molecules of a DNA target sequence makes a complex one Product analysis, such as B. by gel electrophoretic separation after the actual PCR reaction superfluous. For each target sequence to be recorded however, a specific probe is required, either one at both ends fluorescence-labeled oligonucleotide like the TaqMan ™ system or two simply fluorescence-labeled oligonucleotides like the Light-Cycler ™ - System. The systems mentioned can basically be used for Multiplexing applications, i. H. there can be several target sequences  be amplified simultaneously. A disadvantage of this type of application this known method is that for detection for each individual Target sequence a separate probe or a separate pair of probes is required, which is specific to an internal area of the amplification bind the resulting target sequence. Should be many different Target sequences are detected side by side, so the Approach due to the increasing number of different Detection probes are relatively expensive and the increasing number of probes can affect the RCR amplification. The present invention underlying task is therefore by appropriate Changes to the primer structures both when using the TaqMan ™ - like the Light Cycler ™ system, a way to find the expensive one To avoid using specific probe oligonucleotides. Here should always be the multiplex application that is used for today's diagnostics more important, will not be affected.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Detektion von Produkten einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion mittels mindestens zweier Primer, dadurch gekennzeichnet, dass
According to the invention, this object is achieved by a method for the detection of products of a nucleic acid amplification reaction using at least two primers, characterized in that

• a) einer der für die Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'-Homo-Tail- Sequenz, eine Sondenbindungssequenz, die als primer­ integrierte Reportersequenz (PIRS) bezeichnet ist, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz,a) one of the primers used for the amplification reaction in 5'-3 'direction includes the following elements: a 5'-homo-tail Sequence, a probe binding sequence that acts as a primer integrated reporter sequence (PIRS), and one for the nucleic acid specific sequence to be amplified,
• b) ein anderer der für die Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'- Homo-Tail-Sequenz, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz, undb) another one used for the amplification reaction Primer in the 5'-3 'direction comprises the following elements: a 5'- Homo-tail sequence, and one for the one to be amplified Nucleic acid specific sequence, and
• c) die zur Detektion eingesetzten Sonden mit dem Komplementärstrang der Sondenbindungssequenz des einen der beiden Amplifikationsprimer wechselwirken können, und die eingesetzten Sonden detektierbare Markierungsgruppen tragen.c) the probes used for detection with the Complementary strand of the probe binding sequence of one the two amplification primers can interact, and  the probes used detectable marker groups wear.

Die Erfindung basiert auf einem neuartigen Primer-Design, das in einem ersten Aspekt der Erfindung Primer mit primer-integrierten Reportersequenzen ("PIRS-Primer") vorsieht. Die PIRS-Primer (mit integrierter Sondenbindungssequenz/Reportersequenz) haben dabei folgenden allgemeinen Aufbau:
5'-Homo-Tail - Sondenbindungssequenz/PIRS - Spezifische Sequenz-3'.The invention is based on a novel primer design which, in a first aspect of the invention, provides primers with primer-integrated reporter sequences (“PIRS primers”). The PIRS primers (with integrated probe binding sequence / reporter sequence) have the following general structure:
5'-Homo-Tail - Probe Binding Sequence / PIRS - Specific Sequence-3 '.

Der in der PCR zu verwendende zweite Primer mit entgegengesetzter Polarität enthält keine PIRS und hat den folgenden schematischen Aufbau:
5'- Homo-Tail - Spezifische Sequenz - 3'.The second primer with opposite polarity to be used in the PCR contains no PIRS and has the following schematic structure:
5'- Homo-Tail - Specific Sequence - 3 '.

Ein weiteres wesentliches Merkmal der Erfindung ist, dass beide PCR-Primer an ihrem 5'-Ende eine als "5'-Homo-Tail" bezeichnete zusätzlich angefügte Sequenz aufweisen. Diese "5'-Homo-Tail"-Sequenz kann frei gewählt werden, sie muss jedoch auch bei einer Kombination mehrerer Primersätze zu einer Multiplex-PCR bei allen Primern identisch sein und sollte in ihrer Schmelztemperatur etwas höher liegen als der die "spezifische Sequenz" definierende Primerabschnitt. Das zugrundeliegende Prinzip entspricht der "HANDS"-PCR-Technologie (Homo-Tag-Assisted-Non-Dimer-System) (Brownie et al.; EP-0 731 177, EP-0 332 435). Durch die Verwendung des "HANDS"-PCR-Prinzips wird die unerwünschte Bildung von Primer-Dimeren während der PCR-Reaktion um mehrere Zehnerpotenzen verringert. Die beschriebenen Primer stellen daher einen weiteren Gegenstand der Erfindung dar.Another essential feature of the invention is that both PCR primers at its 5 'end an additional one, referred to as a "5' homo tail" Have sequence. This "5'-homo-tail" sequence can be chosen freely , but must also be used when combining several primer sets to a multiplex PCR for all primers and should be identical in their Melting temperature are slightly higher than the "specific sequence" defining primer section. The underlying principle corresponds to that "HANDS" -PCR technology (Homo-Tag-Assisted-Non-Dimer-System) (Brownie et al .; EP-0 731 177, EP-0 332 435). By using the "HANDS" -PCR principle eliminates the unwanted formation of primer dimers decreased by several powers of ten during the PCR reaction. The The primers described therefore constitute a further subject of the invention represents.

In einer erfindungsgemäßen Multiplex-PCR mit PIRS-Primern lassen sich mit den oben beschriebenen Verfahren mehrere Primersätze kombinieren, die aufgrund unterschiedlicher "spezifischer Sequenzen" am 3'-Ende des ersten Primertyps die Detektion mehrerer Zielsequenzen in einem einzigen Reaktionsansatz erlauben. Bei der Bildung von PCR-Produkten entsteht eine zur Sondenbindungsstelle/Reportersequenz komplementäre Sequenz, mit der die Sondenoligonukleotide hybridisieren müssen. Durch den Einsatz mehrerer Sonden mit entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffmolekülen nach dem TaqMan™-System lassen sich verschiedene Gruppen von Zielsequenzen unterscheiden. Dies wird anhand der unten dargestellten Beispiele 1 bis 4 verdeutlicht.In a multiplex PCR according to the invention with PIRS primers, combine several primer sets using the methods described above due to different "specific sequences" at the 3 'end of the first  Primer types the detection of multiple target sequences in a single Allow reaction approach. When PCR products are formed, a sequence complementary to the probe binding site / reporter sequence with which the probe oligonucleotides must hybridize. Because of the engagement several probes with corresponding fluorescent dye molecules The TaqMan ™ system allows different groups of target sequences differentiate. This is illustrated by Examples 1 to 4 below clarifies.

Der Einsatz der erfindungsgemäßen PIRS-Primer in Kombination mit den beschriebenen Maßnahmen zur Vermeidung der unerwünschten Bildung von Primer-Dimeren (HANDS-PCR), erlaubt es mit Hilfe der fluoreszenzoptischen Detektionssysteme TaqMan™ und Light Cycler™ mit einer einzelnen Sonde bzw. einem Sondenpaar, die/das mit einem der zur Verfügung stehenden Fluoreszenzfarbstoffe markiert ist, eine große Zahl verschiedener Zielsequenzen in einem Reaktionsansatz zu detektieren. Zusätzlich können alle zur Verfügung stehenden Fluoreszenzfarbstoffe parallel mit Hilfe spezifischer Sonden eingesetzt werden. Somit ist es möglich, verschiedene Gruppen von Zielsequenzen einer Sonde bzw. einer dazugehörenden Fluoreszenzfarbe, zuzuordnen. Die Zielsequenzen der einzelnen Gruppen können in einer einzigen PCR-Reaktion parallel detektiert werden und in ihrer Gruppenzugehörigkeit anhand der zugeordneten Farbe der eingesetzten Sonde identifiziert werden, wodurch ein sehr hoher Automatisierungsgrad der PCR-Diagnose erreicht wird.The use of the PIRS primers according to the invention in combination with the measures described to avoid the undesirable formation of Primer dimers (HANDS-PCR), allows it with the help of fluorescence optical Detection systems TaqMan ™ and Light Cycler ™ with a single probe or a pair of probes that are compatible with one of the available Fluorescent dyes are marked, a large number of different ones Detect target sequences in a reaction batch. In addition, you can all available fluorescent dyes in parallel with the help specific probes can be used. So it is possible to have different Groups of target sequences of a probe or an associated one Assign fluorescent color. The target sequences of the individual groups can be detected in parallel in a single PCR reaction and in their Group membership based on the assigned color of the used Probe can be identified, creating a very high level of automation the PCR diagnosis is achieved.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzienkit, der die erfindungsgemäßen PIRS-Primer enthält und zum Einsatz in der Diagnose von
Another object of the invention is a reagent kit which contains the PIRS primers according to the invention and for use in the diagnosis of

• 1. Leukämien,1. leukaemias,
• 2. Meningitis oder Enzephalitis und2. meningitis or encephalitis and
• 3. Zytokin-Antworten3. Cytokine responses

geeignet ist, wie in den Beispielen 1, 3 und 4 verdeutlicht wird. is suitable, as is illustrated in Examples 1, 3 and 4.  

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Reagenzienkits erzeugter 50 µl-Reaktionsansatz:
2 µl der zu untersuchenden Probe
5 µl 10 × PCR-Puffer
4 µl 25 nM MgCl₂
2 µl dNTP-Mix (jeweils dATP, dCTP, dGTP und TTP)
5 µl "Homo-Tail"-Primer (500 nM Endkonzentration)
0,125 µl thermostabile DNA-Polymerase
0,5 µl PIRS-Primer und Rückprimer (10 nM Endkonzentration)
5 µl Sondenoligonukleotid A mit Fluoreszenzfarbstoff 1 (200 nM Endkonzentration)
5 µl Sondenoligonukleotid B mit Fluoreszenzfarbstoff 2 (200 nM Endkonzentration)
steriles Aqua bidest. ad 50 µl.In a preferred embodiment, a 50 .mu.l reaction mixture produced using a reagent kit according to the invention contains:
2 µl of the sample to be examined
5 µl 10 × PCR buffer
4 µl 25 nM MgCl ₂
2 µl dNTP mix (each dATP, dCTP, dGTP and TTP)
5 µl "Homo-Tail" primer (500 nM final concentration)
0.125 ul thermostable DNA polymerase
0.5 µl PIRS primer and back primer (10 nM final concentration)
5 µl probe oligonucleotide A with fluorescent dye 1 (200 nM final concentration)
5 µl probe oligonucleotide B with fluorescent dye 2 (200 nM final concentration)
sterile aqua bidest. ad 50 µl.

Der erfindungsgemäße Reagenzienkit umfasst mindestens eine Nukleinsäure zum Einsatz als Primer in Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen, dadurch gekennzeichnet, dass sie in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'-Homo-Tail- Sequenz, eine Sondenbindungssequenz, die als primer-integrierte Reportersequenz (PIRS) bezeichnet ist und mit deren Komplementärstrang mindestens eine Sonde mit detektierbaren Markierungsgruppen wechselwirken kann, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz.The reagent kit according to the invention comprises at least one nucleic acid for use as a primer in nucleic acid amplification reactions, characterized, that it comprises the following elements in the 5'-3 'direction: a 5'-homo-tail Sequence, a probe binding sequence that acts as a primer-integrated Reporter sequence (PIRS) is designated and with its complementary strand at least one probe with detectable labeling groups can interact, and one for the nucleic acid to be amplified specific sequence.

Die folgenden erfindungsgemäßen PIRS-Primer sind Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Ausführungsform der beanspruchten Reagenzienkits, deren Durchführung in den Beispielen 1, 3 und 4 beschrieben wird. Ihre Sequenzen sind im Sequenzprotokoll wiedergegeben.
SEQ ID No. 1: ABL intern Hands NPY antisense,
SEQ ID No. 2: TEL intern Hands HNNO sense,
SEQ 1D No. 3: ETO intern Hands HNNO antisense,
SEQ ID No. 4: HSV1 intern Hands HNNO sense,
SEQ ID No. 5: HSV2 intern Hands HNNO sense,
SEQ ID No. 6: Men intern Hands NPY Rec sense,
SEQ ID No. 7: Hae intern Hands NPY Rec sense,
SEQ ID No. 8: Pneu intern Hands NPY Rec sense,
SEQ ID No. 9: IL-2 intern Hands HNNP sense,
SEQ ID No. 10: IF-g intern Hands HNNO sense,
SEQ ID No. 1 l: IL-4 intern Hands NPY Rec sense,
SEa ID No. 12: IL-5 intern Hands NPY Rec sense,
SEQ ID No. 13: IL-10 intern Hands NPY Rec sense.The following PIRS primers according to the invention are the basis of the method according to the invention in the embodiment of the claimed reagent kits, the implementation of which is described in Examples 1, 3 and 4. Their sequences are shown in the sequence listing.
SEQ ID No. 1: ABL internal hands NPY antisense,
SEQ ID No. 2: TEL internal Hands ENT sense,
SEQ 1 D No. 3: ETO internal hands ENT antisense,
SEQ ID No. 4: HSV1 internal hands ENT sense,
SEQ ID No. 5: HSV2 internal hands ENT sense,
SEQ ID No. 6: Men intern Hands NPY Rec sense,
SEQ ID No. 7: Hae intern Hands NPY Rec sense,
SEQ ID No. 8: Pneu internal Hands NPY Rec sense,
SEQ ID No. 9: IL-2 internal hands HNNP sense,
SEQ ID No. 10: IF-g internal hands ENT sens,
SEQ ID No. 1 l: IL-4 internal Hands NPY Rec sense,
SEa ID No. 12: IL-5 internal hands NPY Rec sense,
SEQ ID No. 13: IL-10 internal hands NPY Rec sense.

Die Zeichnung besteht aus den Fig. 1 und 2, die das Ergebnis der Durchführung von Beispiel 1 zeigen.The drawing consists of FIGS. 1 and 2, which show the result of the implementation of Example 1.

Fig. 1 ist das Ergebnis einer Multiplex-PCR unter Einsatz von PIRS-Primern mit dem TaqMan™-Verfahren. Das Ergebnis ist so dargestellt, wie es vom ABI-PRIS™ Sequence Detection System erhalten wird. Auf der X-Achse ist die Zahl der abgelaufenen PCR-Zyklen (0-35) dargestellt. Die Y-Achse gibt die zugehörigen in den jeweiligen Zyklen gemessenen Fluoreszenzintensitäten an. Die schwarze Linie parallel zur X-Achse gibt den Grenzwert an, unter dem das Fluoreszenzsignal als negativ bezeichnet wird (Threshold). Er wird mathematisch vom Gerät ermittelt. In Abb. 1 werden nur die FAM-Signale sichtbar. Die Proben (samples) sind wie folgt bezeichnet:
A4 = m-BRC (Bady), A5 = M-BCR (Bady), A6 = TEL/AML (Goody),
A7 = AML/ETO (Goody); B4-B7 = vier gleiche Negativkontrollen (mRNA der Zelllinie HL60 ohne Translokation); C4 = Wasserkontrolle der PCR (ohne Template). Fig. 1 is the result of multiplex PCR using primers PIRS with the TaqMan ™ procedure. The result is shown as it is obtained from the ABI-PRIS ™ Sequence Detection System. The number of completed PCR cycles (0-35) is shown on the X axis. The Y axis indicates the associated fluorescence intensities measured in the respective cycles. The black line parallel to the X axis indicates the limit below which the fluorescence signal is referred to as negative (threshold). It is determined mathematically by the device. In Fig. 1 only the FAM signals are visible. The samples are labeled as follows:
A4 = m-BRC (Bady), A5 = M-BCR (Bady), A6 = TEL / AML (Goody),
A7 = AML / ETO (Goody); B4-B7 = four identical negative controls (mRNA of the HL60 cell line without translocation); C4 = water control of the PCR (without template).

Fig. 2 ist das Ergebnis einer Multiplex-PCR unter Einsatz von PIRS-Primern mit dem TaqMan™-Verfahren. Das Ergebnis ist so dargestellt, wie es vom ABI-PRISM™ Sequence Detection System erhalten wird. Auf der X-Achse ist die Zahl der abgelaufenen PCR-Zyklen (0-35) dargestellt. Die Y-Achse gibt die zugehörigen in den jeweiligen Zyklen gemessenen Fluoreszenzintensitäten an. Die schwarze Linie parallel zur X-Achse gibt den Grenzwert an, unter dem das Fluoreszenzsignal als negativ bezeichnet wird (Threshold). Er wird mathematisch vom Gerät ermittelt. In Abb. 2 werden nur die VIC-Signale sichtbar. Die Proben (samples) sind wie folgt bezeichnet:
A4 = m-BRC (Bady), A5 = M-BCR (Bady), A6 = TEL/AML (Goody),
A7 = AML/ETO (Goody); B4-B7 = vier gleiche Negativkontrollen (mRNA der Zelllinie HL60 ohne Translokation); C4 = Wasserkontrolle der PCR (ohne Template). Fig. 2 is the result of a multiplex PCR using PIRS primers with the TaqMan ™ method. The result is shown as it is obtained from the ABI-PRISM ™ Sequence Detection System. The number of completed PCR cycles (0-35) is shown on the X axis. The Y axis indicates the associated fluorescence intensities measured in the respective cycles. The black line parallel to the X axis indicates the limit below which the fluorescence signal is referred to as negative (threshold). It is determined mathematically by the device. In Fig. 2 only the VIC signals are visible. The samples are labeled as follows:
A4 = m-BRC (Bady), A5 = M-BCR (Bady), A6 = TEL / AML (Goody),
A7 = AML / ETO (Goody); B4-B7 = four identical negative controls (mRNA of the HL60 cell line without translocation); C4 = water control of the PCR (without template).

BeispieleExamples Beispiel 1example 1

Unter Einsatz von PIRS-Primern wurde ein Verfahren entwickelt, das es mit einer einzigen PCR-Reaktion ermöglicht, in Leukämiezellen zwischen mehreren genetischen Markern zu unterscheiden, die mit einer besonders guten oder schlechten Prognose der Erkrankung verbunden sind. Die Ergebnisse eines solchen Tests können direkt zur Therapiefestlegung verwendet werden. Als Marker mit schlechter Prognose (im Weiteren bezeichnet als "Badies") wurden zwei Splicingvarianten des BCR/ABL- Rearrangements (als m-BCR bzw. M-BCR bezeichnet) einbezogen, das zytogenetisch der Translokation t(9; 22) entspricht, die auch als Philadelphia- Chromosom bekannt ist. Die entsprechende TaqMan™-Sonde wurde 5'- VICITAMRA-3' markiert. Als chromosomale Translokation mit guter Prognose bei Leukämien des Kindesalters wurden die chromosomalen Translokationen t(12; 21) und t(8; 21) einbezogen. Die hierdurch entstehenden chimären mRNAs werden als "TEL/AML"- bzw. als "AML/ETO"-Fusionsgene bezeichnet. Die entsprechende Sonde wurde 5'- FAM/TAMRA-3' markiert. Using PIRS primers, a method was developed that can be used with allows a single PCR reaction to cross between leukemia cells distinguish between several genetic markers, those with a particular one good or bad prognosis of the disease. The Results of such a test can be used directly to determine therapy be used. As a marker with a poor prognosis (hereinafter referred to as "badies"), two splicing variants of the BCR / ABL- Rearrangements (referred to as m-BCR or M-BCR) included that cytogenetically corresponds to the translocation t (9; 22), which is also known as the Philadelphia Chromosome is known. The corresponding TaqMan ™ probe was 5'- VICITAMRA-3 'marked. As a chromosomal translocation with good The prognosis in childhood leukemia was the chromosomal Translocations t (12; 21) and t (8; 21) included. The hereby The resulting chimeric mRNAs are called "TEL / AML" or "AML / ETO" fusion genes. The corresponding probe was 5'- FAM / TAMRA-3 'marked.  

Als Ausgangsmaterial wurde RNA aus Leukämiezelllinien verwendet, die jeweils eine der zu detektierenden chromosomalen Translokationen aufweisen, bzw. als Negativkontrolle eine Zeillinie (HL60), die keine solche genetische Veränderung besitzt. Da chimäre mRNA-Moleküle nachgewiesen werden sollen (diese resultieren aus einer Fusion von zwei unterschiedlichen Genfragmenten, die durch die chromosomale Translokation hervorgerufen wurde), muss vor der eigentlichen PCR die RNA nach üblichen Verfahren in cDNA (komplementäre DNA) umgeschrieben werden. Zur Steigerung der Empfindlichkeit wurde noch ein normaler PCR-Lauf vorgeschaltet, bevor die eigentliche PCR-Reaktion unter fluoreszenzoptischer Produktdetektion angeschlossen wurde. Die entscheidende PCR-Reaktion im TaqMan™- Verfahren wurde als zweiter Lauf einer nested-PCR durchgeführt. Die nested-PCR (ursprünglich von Chamberlain et al. beschrieben) stellt ein bekanntes und breit angewandtes Verfahren zur Erhöhung der PCR- Sensitivität und -Spezifität dar. Im ersten Lauf der nested-PCR werden die Zielsequenzen voramplifiziert. In der Regel wird ein Mikroliter des Reaktionsprodukts des ersten Laufs als Ausgangsmaterial für den zweiten Lauf der nested-PCR übertragen. Die im zweiten Lauf eingesetzten Primer binden innerhalb der voramplifizierten DNA Abschnitte. Die Durchführung einer nested-PCR ist bei dem vorgeschlagenen Verfahren mit PIRS-Primern grundsätzlich nicht erforderlich. Es sollte nur demonstriert werden, dass das Verfahren auch in einer nested-PCR eingesetzt werden kann. Alle im ersten Lauf der nested-PCR eingesetzten Primer entsprechen ihrer Struktur nach ganz normalen PCR-Primern ohne jegliche Zusatzsequenzen. Sie sind alle mit einem Pfeil (→) vor dem Bezeichnungskürzel versehen.RNA from leukemia cell lines was used as the starting material one each of the chromosomal translocations to be detected or a negative line (HL60) that does not have one possesses genetic modification. Because chimeric mRNA molecules detected (they result from a fusion of two different ones Gene fragments caused by the chromosomal translocation ), the RNA must be inserted into the RNA using the usual methods before the actual PCR cDNA (complementary DNA) can be rewritten. To increase the Sensitivity was preceded by a normal PCR run before the actual PCR reaction with fluorescence-optical product detection was connected. The crucial PCR reaction in TaqMan ™ - The method was carried out as the second run of a nested PCR. The nested PCR (originally described by Chamberlain et al.) known and widely used method for increasing the PCR Sensitivity and specificity. In the first run of the nested PCR the Target sequences pre-amplified. Usually a microliter of the Reaction product of the first run as a starting material for the second Transfer the run of the nested PCR. The primers used in the second run bind within the pre-amplified DNA sections. The implementation A nested PCR is in the proposed method with PIRS primers basically not necessary. It should only be demonstrated that that The method can also be used in a nested PCR. All in the first The structure of the nested PCR primers used corresponds to their structure completely normal PCR primers without any additional sequences. You are all with an arrow (→) in front of the abbreviation.

Externe Primer für vorgeschalteten Lauf einer Nested-PCR:
External primer for upstream run of a nested PCR:

Im folgenden Abschnitt sind die genauen Sequenzen der verwendeten PCR- Primer aufgeführt: (5'-Homo-Tail = kursiv; Sondenbindungsstelle (PIRS) = fett gedruckt; Spezifische Sequenz = unterstrichen).
The following section lists the exact sequences of the PCR primers used: (5'-homo-tail = italic; probe binding site (PIRS) = printed in bold; specific sequence = underlined).

PCR-Bedingungen für diesen AnsatzPCR conditions for this approach

Ein 50 µl Reaktionsansatz enthält folgende Komponenten:
5 µl 10 × PCR-Puffer
4 µl 25 nM MgCl₂
2 µl dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP und TTP)
5 µl "Homo-Tail"-Primer (500 nM Endkonzentration)
5 µl FAM-Sonde HNNO (200 nM Endkonzentration)
5 µl VIC-Sonde NPY-Rec (200 nM Endkonzentration)
0,25 µl UNG (Substanz zur Eliminierung von Kontaminationen)
0,125 µl AmpliTaq Gold Polymerase
0,5 µl von jedem spezifischen Primer (PIRS-Primer und jeweilige Gegenprimer, 10 nM Endkonzentration)
2 µl der zu untersuchenden Probe
steriles Aqua bidest. ad 50 µl.A 50 µl reaction mixture contains the following components:
5 µl 10 × PCR buffer
4 µl 25 nM MgCl ₂
2 µl dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP and TTP)
5 µl "Homo-Tail" primer (500 nM final concentration)
5 µl FAM probe HNNO (200 nM final concentration)
5 µl VIC probe NPY-Rec (200 nM final concentration)
0.25 µl UNG (substance to eliminate contamination)
0.125 µl AmpliTaq Gold Polymerase
0.5 µl of each specific primer (PIRS primer and respective counter primer, 10 nM final concentration)
2 µl of the sample to be examined
sterile aqua bidest. ad 50 µl.

PCR-Cycler BedingungenPCR cycler conditions

50°C - 2 min (Kontaminationsinaktivierung durch UNG)
95°C - 10 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq Gold Polymerase = Hot Start)
danach 5 Zyklen zu 95°C - 15 s → 60°C - 1 min → 72°C- 1 min
danach 35 Zyklen zu 95°C - 15 s → 68°C- 1 min → 72°C- 1 min.50 ° C - 2 min (contamination inactivation by UNG)
95 ° C - 10 min (denaturation and activation of the AmpliTaq Gold Polymerase = Hot Start)
then 5 cycles at 95 ° C - 15 s → 60 ° C - 1 min → 72 ° C - 1 min
then 35 cycles at 95 ° C - 15 s → 68 ° C - 1 min → 72 ° C - 1 min.

Die Resultate des Anwendungsbeispiels sind in den Fig. 1 und 2 gezeigt. The results of the application example are shown in FIGS. 1 and 2.

Man sieht, dass nur die "Badies" ein positives VIC-Signal aufweisen, während nur die "Goodies" ein positives FAM-Signal zeigen. Alle anderen Proben sind negativ. Es liegen somit keine falsch positiven Resultate vor.You can see that only the "badies" have a positive VIC signal, while only the "goodies" show a positive FAM signal. All other Samples are negative. There are therefore no false positive results.

Beispiel 2Example 2

Eine Multiplex-PCR mit PIRS-Primern kann genutzt werden, um mehrere genetisch heterogene Erkrankungen gleichzeitig nachzuweisen. Für jede zu berücksichtigende Erkrankung wird eine Sondenfarbe reserviert. Die einzelnen PCR-Primer erhalten aufgrund unterschiedlicher 3'-Enden die Spezifität für eine einzige Punktmutation. Aufgrund identischer PIRS können die entsprechenden Gruppen von Primern jeweils einer in Frage kommenden Erkrankung zugeordnet werden. So könnte zur Ursachenklärung bei Kindern mit einer Lungenerkrankung eine Fluoreszenzfarbe für den Nachweis verschiedener Punktmutationen im CFTR-Gen reserviert werden, um eine Mukoviszidose zu erkennen. Eine zweite PIRS könnte bei einem PCR- Primersatz eingebaut werden, um in der gleichen PCR-Reaktion Mutationen im PIZ-Gen zu detektieren, die beim alpha-1-Antitrypsinmangel vorliegen.A multiplex PCR with PIRS primers can be used for several to detect genetically heterogeneous diseases at the same time. For everyone too a color of the probe is reserved for the disease taking into account. The individual PCR primers receive the due to different 3 'ends Specificity for a single point mutation. Due to identical PIRS can the corresponding groups of primers each one in question Disease. This could help clarify the causes in children with a lung disease a fluorescent color for detection different point mutations in the CFTR gene are reserved to one To recognize cystic fibrosis. A second PIRS could be used for a PCR Primer sets can be built in to mutations in the same PCR reaction to be detected in the PIZ gene which are present in the alpha-1-antitrypsin deficiency.

Beispiel 3Example 3

Eine Multiplex-PCR mit PIRS-Primern kann auch eingesetzt werden, um verschiedene Gruppen von Infektionserregern in einem einzigen PCR-Ansatz nachzuweisen. Für klinische Fragestellungen kann dies besonders hilfreich sein, wenn die einzelnen Gruppen ein unterschiedliches therapeutisches Vorgehen erfordern. So können bei Patienten mit klinischem Verdacht auf eine Meningitis oder Enzephalitis in einer einzigen Multiplex-PCR sowohl bakterielle als auch virale Erkrankungen nachgewiesen werden. Wird eine Sondenfarbe für alle bakteriellen - und eine andere Sondenfarbe für alle viralen Erreger reserviert, so ließe sich anhand des PCR-Ergebnisses sofort die notwendige Therapie ableiten: Breitspektrumantibiotika (z. B. Cefotaxim) bei bakteriellen Erregern oder Virostatika (z. B. Acyclovir) bei Herpesvirusinfektionen. Im ersten Lauf der nested-PCR werden nur zwei Primersätze eingesetzt. Einer detektiert beide Typen des Herpes simplex Virus. (Die Primersequenzen sind der folgenden Arbeit entnommen: Casas et al. Detection of both Herpes simplex and Varicella-Zoster Viruses in cerebrospinal fluid from patients with encephalitits, J. Med. Virol. Vol. 50: 82-92, 1996). Der zweite bindet an hochkonservierte bakterielle DNA- Regionen, die für Abschnitte der 16S rRNA von Bakterien (Eubacteriae) codieren. Mit ihm können die entsprechenden Genombereiche einer Vielzahl von Bakterien detektiert und amplifiziert werden (siehe Radström et al., J. Clin. Microbiology, Vol. 32: 2738-2744, 1994). Die Abgrenzung der klinisch relevanten pathogenen Bakterien (Meningokokken, Hämophilus influenza und Pneumokokken) erfolgt erst im zweiten Lauf der nested-PCR unter Verwendung spezifischer Primersätze mit PIRS-Primern auf einem fluoreszenzoptischen System zur Detektion der PCR-Produkte. Die bakterienspezifischen Primersequenzen sind der Arbeit von Radström et al. entnommen (s. o.); die herpesvirusspezifischen Primersequenzen stammen aus der Arbeit von Casas et al. (s. o.). Eine weitere Besonderheit ist die Ausführung des bakterienspezifischen Primersatzes als "semi-nested-PCR". Der universelle Antisense-Primer zum Nachweis von Bakterien wird auch im zweiten Lauf als Gegenprimer zu den Bakterienspezies-spezifischen PIRS- Primern eingesetzt. Die Speziesspezifität wird alleine durch die Sense-Primer erreicht. Aus diesem Grund muss der Primer bereits im ersten Lauf die "HANDS-Sequenz" 5'-wärts von dem zielsequenzspezifischen Abschnitt tragen. Hätte der Primer im ersten Lauf noch nicht die "HANDS-Sequenz", so würden im zweiten Lauf Primer mit und Primer ohne "HANDS-Sequenz" miteinander kompetieren, was bei der geringen Konzentration der zielsequenzspezifischen Primer im entscheidenden zweiten Lauf der nested- PCR zu einem ineffizienten Einbau der "HANDS-Sequenz" führen könnte, mit der Folge einer deutlich beeinträchtigen Sensitivität.Multiplex PCR with PIRS primers can also be used to different groups of infectious agents in a single PCR approach to prove. This can be particularly helpful for clinical questions be if the individual groups have a different therapeutic Action required. So, in patients with clinical suspicion a meningitis or encephalitis in a single multiplex PCR both bacterial and viral diseases are detected. Will one Probe color for all bacterial - and a different probe color for all reserved viral pathogen, the PCR result would immediately derive the necessary therapy: broad-spectrum antibiotics (e.g. cefotaxime) for bacterial pathogens or antivirals (e.g. acyclovir) Herpes virus infections. In the first run of the nested PCR, only two are Primer sets used. One detects both types of herpes simplex  Virus. (The primer sequences are taken from the following work: Casas et al. Detection of both herpes simplex and varicella-zoster viruses in cerebrospinal fluid from patients with encephalitits, J. Med. Virol. Vol. 50: 82-92, 1996). The second binds to highly conserved bacterial DNA Regions responsible for sections of 16S rRNA from bacteria (Eubacteriae) encode. With it, the corresponding genome areas of a variety detected and amplified by bacteria (see Radström et al., J. Clin. Microbiology, Vol. 32: 2738-2744, 1994). The delimitation of the clinically relevant pathogenic bacteria (meningococcal, hemophilus influenza and pneumococci) is only carried out in the second run of the nested PCR Use of specific primer sets with PIRS primers on one fluorescence optical system for the detection of PCR products. The bacteria-specific primer sequences are the work of Radström et al. taken (see above); the herpes virus-specific primer sequences originate from the work of Casas et al. (see above). Another specialty is that Execution of the bacteria-specific primer set as "semi-nested PCR". The universal antisense primer for the detection of bacteria is also used in second run as a counterprimer to the bacterial species-specific PIRS- Primers used. The species specificity is determined solely by the sense primer reached. For this reason, the primer must be in the first run "HANDS sequence" 5'-wards the target sequence specific section wear. If the primer did not have the "HANDS sequence" in the first run, in the second run, primers with and primers without "HANDS sequence" compete with each other, what with the low concentration of target sequence specific primer in the decisive second run of the nested PCR could lead to an inefficient incorporation of the "HANDS sequence" with the consequence of a significantly impaired sensitivity.

PrimersequenzenPrimer sequences

Außer dem Primer "Eubac-exdo" bzw. "Eubac-Hands-antisense", wie oben erwähnt, entsprechen alle im ersten Lauf der nested-PCR eingesetzten Primer ihrer Struktur nach normalen PCR-Primern ohne jegliche Zusatzsequenzen. Sie sind alle mit einem Pfeil (→) vor dem Bezeichnungskürzel versehen.Except for the primer "Eubac-exdo" or "Eubac-Hands-antisense", as above mentioned, all correspond to those used in the first run of the nested PCR  Primer structure according to normal PCR primers without any Additional sequences. They are all with an arrow (→) in front of the Provide abbreviations.

Externe Primer für vorgeschalteten Lauf einer Nested-PCR:
External primer for upstream run of a nested PCR:

Im folgenden Abschnitt sind die genauen Sequenzen der verwendeten PCR- Primer aufgeführt: (5'-Homo-Tail = kursiv, Sondenbindungsstelle (PIRS) = fett gedruckt; Spezifische Sequenz = unterstrichen).
The following section lists the exact sequences of the PCR primers used: (5'-homo-tail = italics, probe binding site (PIRS) = printed in bold; specific sequence = underlined).

PCR-ReaktionsbedingungenPCR reaction conditions

(Im Vergleich zu den im vorherigen Anwendungsbeispiel beschriebenen PCR-Bedingungen ergeben sich keine Unterschiede außer einer von 60 auf 55°C reduzierten Annealingtemperatur in den ersten fünf Zyklen der multiplex-PCR mit PIRS-Primern).(Compared to those described in the previous application example PCR conditions reveal no differences other than one in 60 55 ° C reduced annealing temperature in the first five cycles of multiplex PCR with PIRS primers).

Ein 50 µl Reaktionsansatz enthält folgende Komponenten:
5 µl 10 × PCR-Puffer
4 µl 25 nM MgCl₂
2 µl dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP und TTP)
5 µl "Homo-Tail"-Primer (500 nM Endkonzentration)
5 µl FAM-Sonde HNNO (200 nM Endkonzentration)
5 µl VIC-Sonde NPY-Rec (200 nM Endkonzentration)
0,25 µl UNG (Substanz zur Eliminierung von Kontaminationen)
0,125 µl AmpliTaq Gold Polymerase
0,5 µl von jedem spezifischen Primer (PIRS-Primer und jeweilige Gegenprimer, 10 nM Endkonzentration)
2 µl der zu untersuchenden Probe
steriles Aqua bidest. ad 50 µl.A 50 µl reaction mixture contains the following components:
5 µl 10 × PCR buffer
4 µl 25 nM MgCl ₂
2 µl dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP and TTP)
5 µl "Homo-Tail" primer (500 nM final concentration)
5 µl FAM probe HNNO (200 nM final concentration)
5 µl VIC probe NPY-Rec (200 nM final concentration)
0.25 µl UNG (substance to eliminate contamination)
0.125 µl AmpliTaq Gold Polymerase
0.5 µl of each specific primer (PIRS primer and respective counter primer, 10 nM final concentration)
2 µl of the sample to be examined
sterile aqua bidest. ad 50 µl.

PCR-Cycler BedingungenPCR cycler conditions

50°C - 2 min (Kontaminationsinaktivierung durch UNG)
95°C - 10 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq Gold
Polymerase = Hot Start)
danach 5 Zyklen zu 95°C - 15 s → 55°C - 1 min-72°C → 1 min
danach 35 Zyklen zu 95°C - 15 s → 68°C - 1 min → 72°C - 1 min.50 ° C - 2 min (contamination inactivation by UNG)
95 ° C - 10 min (denaturation and activation of the AmpliTaq Gold
Polymerase = hot start)
then 5 cycles at 95 ° C - 15 s → 55 ° C - 1 min-72 ° C → 1 min
then 35 cycles at 95 ° C - 15 s → 68 ° C - 1 min → 72 ° C - 1 min.

Beispiel 4Example 4

In einer Multiplex-PCR mit PIRS-Primern lässt sich auch die Fähigkeit zur quantitativen Erfassung der PGR-Produktmenge nutzen, die die oben beschriebenen fluoreszenzoptischen Detektionssysteme besitzen. Die jeweilige Gesamtmenge mehrere Gruppen von Nukleinsäure-Zielsequenzen kann so mit einer einzigen PCR-Reaktion ermittelt werden. So ist es möglich, verschiedene Gruppen von Zytokin-mRNAs jeweils einer Sonde zuzuordnen, um dann mit einer einzigen PCR-Reaktion zu ermitteln, ob z. B. in einer bestimmen Probe ein T_H1- oder T_H2-Zytokinantwort überwiegt. Viele infektiöse Agentien oder Allergene polarisieren zu einem der beiden Zytokinmuster T_H1 und T_H2, was zum Schutz des Organismus vor dem entsprechenden Agens oder aber zu einem immunpathologischen Prozess führen kann (siehe Arbeit von Lanzavecchia, Identifying strategies for immune intervention, Science Vol. 260: 937-944, 1993).A multiplex PCR with PIRS primers can also use the ability for quantitative detection of the amount of PGR product that the fluorescence-optical detection systems described above possess. The respective total amount of several groups of nucleic acid target sequences can thus be determined with a single PCR reaction. It is thus possible to assign different groups of cytokine mRNAs to one probe each, in order to then determine with a single PCR reaction whether e.g. B. A T _H1 or T _H2 cytokine response predominates in a particular sample. Many infectious agents or allergens polarize to one of the two cytokine patterns T _H1 and T _H2 , which can lead to the protection of the organism from the corresponding agent or to an immunopathological process (see work by Lanzavecchia, Identifying strategies for immune intervention, Science Vol. 260 : 937-944, 1993).

Eine PIRS wurde zum Nachweis der Zytokine Interleukin-2 und Interferon­ gamma eingesetzt. Die entsprechende Sonde trägt das Fluoreszenzsignal FAM. Die Intensität des FAM-Signals ist somit proportional zu der Summe der beiden Zielsequenzen Interleukin-2 und Interferongamma als Marker einer T_H1-Antwort. Die zweite PIRS generiert die Bindungsstelle für eine VIC- markierte Sonde. Die PIRS-PCR-Primersätze dienen dem Nachweis von Interleukin-4, Interleukin-5 und Interleukin-10 als Repräsentanten einer T_H2- Antwort. A PIRS was used to detect the cytokines interleukin-2 and interferon gamma. The corresponding probe carries the fluorescence signal FAM. The intensity of the FAM signal is therefore proportional to the sum of the two target sequences interleukin-2 and interferon gamma as markers of a T _H1 response. The second PIRS generates the binding site for a VIC-labeled probe. The PIRS-PCR primer sets are used to detect interleukin-4, interleukin-5 and interleukin-10 as representatives of a T _H2 response.

Wie bei dem oben beschriebenen Verfahren zum Nachweis prognostisch relevanter chromosomaler Translokationen in Leukämiezellen wird zur Steigerung der Empfindlichkeit eine nested-PCR durchgeführt.As with the detection method described above, prognostically relevant chromosomal translocations in leukemia cells is used To increase sensitivity, a nested PCR was performed.

Alle im ersten Lauf der nested-PCR eingesetzten Primer entsprechen ihrer Struktur nach normalen PCR-Primern ohne jegliche Zusatzsequenzen. Sie sind alle mit einem Pfeil (→) vor dem Bezeichnungskürzel versehen.All primers used in the first run of the nested PCR correspond to theirs Structure according to normal PCR primers without any additional sequences. she are all marked with an arrow (→) in front of the abbreviation.

Externe Primer für vorgeschalteten Lauf einer Nested-PCRExternal primer for upstream run of a nested PCR

Im folgenden Abschnitt sind die genauen Sequenzen der verwendeten PCR- Primer aufgeführt: (5'-Homo-Tail = kursiv; Sondenbindungsstelle (PIRS) = fett gedruckt; Spezifische Sequenz = unterstrichen).
The following section lists the exact sequences of the PCR primers used: (5'-homo-tail = italic; probe binding site (PIRS) = printed in bold; specific sequence = underlined).

PCR-BedingungenPCR conditions

Ein 50 µl Reaktionsansatz enthält folgende Komponenten:
5 µl 10 × PCR-Puffer
4 µl 25 nM MgCl₂
2 µl dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP und TTP)
5 µl "Homo-Trail"-Primer (500 nM Endkonzentration)
5 µl FAM-Sonde HNNO (200 nM Endkonzentration)
5 µl VIC-Sonde NPY-Rec (200 nM Endkonzentration)
0,25 µl UNG (Substanz zur Eliminierung von Kontaminationen)
0,125 µl AmpliTaq Gold Polymerase
0,5 µl von jedem spezifischen Primer (PIRS-Primer und jeweilige Gegenprimer, 10 nM Endkonzentration)
2 µl der zu untersuchenden Probe
steriles Aqua bidest. ad 50 µl.A 50 µl reaction mixture contains the following components:
5 µl 10 × PCR buffer
4 µl 25 nM MgCl ₂
2 µl dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP and TTP)
5 µl "Homo-Trail" primer (500 nM final concentration)
5 µl FAM probe HNNO (200 nM final concentration)
5 µl VIC probe NPY-Rec (200 nM final concentration)
0.25 µl UNG (substance to eliminate contamination)
0.125 µl AmpliTaq Gold Polymerase
0.5 µl of each specific primer (PIRS primer and respective counter primer, 10 nM final concentration)
2 µl of the sample to be examined
sterile aqua bidest. ad 50 µl.

PCR-Cycler BedingungenPCR cycler conditions

50°C - 2 min (Kontaminationsinaktivierung durch UNG)
95°C - 10 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq Gold Polymerase = Hot Start)
danach 5 Zyklen zu 95°C - 15 s → 60°C - 1 min → 72°C - 1 min
danach 35 Zyklen zu 95°C - 15 s → 68°C - 1 min → 72°C - 1 min. 50 ° C - 2 min (contamination inactivation by UNG)
95 ° C - 10 min (denaturation and activation of the AmpliTaq Gold Polymerase = Hot Start)
then 5 cycles at 95 ° C - 15 s → 60 ° C - 1 min → 72 ° C - 1 min
then 35 cycles at 95 ° C - 15 s → 68 ° C - 1 min → 72 ° C - 1 min.

SEQUENZPROTOKOLLSEQUENCE LOG

Claims (19)

1. Verfahren zur Detektion von Produkten einer Nukleinsäure- Amplifikationsreaktion mittels mindestens zweier Primer, dadurch gekennzeichnet, dass

• a) einer der für die Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'-Homo-Tail- Sequenz, eine Sondenbindungssequenz, die als primer- integrierte Reportersequenz (PIRS) bezeichnet ist, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz,
• b) ein anderer der für die Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'- Homo-Tail-Sequenz, und eine für die zu amplifizierende 5 Nukleinsäure spezifische Sequenz, und
• c) die zur Detektion eingesetzten Sonden mit dem Komplementärstrang der Sondenbindungssequenz des einen der beiden Amplifikationsprimer wechselwirken können, und die eingesetzten Sonden detektierbare Markierungsgruppen tragen.

1. A method for the detection of products of a nucleic acid amplification reaction using at least two primers, characterized in that

• a) one of the primers used for the amplification reaction in the 5'-3 'direction comprises the following elements: a 5'-homo-tail sequence, a probe binding sequence which is referred to as a primer-integrated reporter sequence (PIRS), and one for which nucleic acid specific sequence to be amplified,
• b) another of the primers used for the amplification reaction in the 5'-3 'direction comprises the following elements: a 5'-homo-tail sequence, and a sequence specific for the 5 nucleic acid to be amplified, and
• c) the probes used for detection can interact with the complementary strand of the probe binding sequence of one of the two amplification primers, and the probes used carry detectable marker groups.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten Sonden fluoreszenzoptisch detektierbare Markierungsgruppen tragen.2. The method according to claim 1, characterized, that the probes used are detectable by fluorescence optics Wear marker groups. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten Sonden an ihren 5'-Enden mit Fluoreszenzfarbstoffmolekülen und an ihren 3'-Enden mit Quenchermolekülen markiert sind, wobei die 3'-Enden so modifiziert sind, dass eine Extension durch Polymerasen nicht möglich ist. 3. The method according to claim 2, characterized, that the probes used have at their 5 'ends Fluorescent dye molecules and at their 3 'ends with Quencher molecules are marked, the 3 'ends being modified in this way are that an extension by polymerases is not possible.   4. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzfarbstoffmoleküle FAM, JOE oder VIC sind und dass das Quenchermolekül TAMRA ist.4. The method according to claims 2 and 3, characterized, that the fluorescent dye molecules are FAM, JOE or VIC and that the quencher molecule is TAMRA. 5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass zwei verschiedene Sonden mit der Sondenbindungssequenz wechselwirken.5. The method according to claim 2, characterized, that two different probes with the probe binding sequence interact. 6. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine der beiden Sonden an ihrem 3'-Ende einen ersten Fluoreszenzfarbstoff und die andere der beiden Sonden an ihrem 5'- Ende einen zweiten Fluoreszenzfarbstoff trägt und Licht, das vom ersten Fluoreszenzfarbstoff absorbiert und remittiert wird, vom zweiten, nach Bindung der beiden Sonden an den Komplementärstrang der Sondenbindungssequenz dem ersten Farbstoff räumlich nahen Fluoreszenzfarbstoff erneut absorbiert und remittiert wird.6. The method according to claims 2 and 5, characterized, that one of the two probes has a first at its 3 'end Fluorescent dye and the other of the two probes on their 5'- End carries a second fluorescent dye and light emitted by the first fluorescent dye is absorbed and remitted by second, after binding of the two probes to the Complementary strand of the probe binding sequence to the first Dye resorbed and fluorescent dye near is remitted. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein und der zweite Fluoreszenzfarbstoff LC Red 640 oder LC Red 705 ist.7. The method according to claim 6, characterized, that the first fluorescent dye is fluorescein and the second Fluorescent dye LC Red 640 or LC Red 705. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikationsreaktion eine Multiplex-PCR ist.8. The method according to claim 1, characterized, that the amplification reaction is a multiplex PCR. 9. Nukleinsäure zum Einsatz als Primer in Nukleinsäure- Amplifikationsreaktionen, dadurch gekennzeichnet, dass sie in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'-Homo- Tail-Sequenz, eine Sondenbindungssequenz, die als primer-integrierte Reportersequenz (PIRS) bezeichnet ist und mit deren Komplementärstrang mindestens eine Sonde mit detektierbaren Markierungsgruppen wechselwirken kann, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz.9. Nucleic acid for use as a primer in nucleic acid Amplification reactions,  characterized, that it comprises the following elements in the 5'-3 'direction: a 5'-homo- Tail sequence, a probe binding sequence that acts as a primer-integrated Reporter sequence (PIRS) is designated and with their Complementary strand at least one probe with detectable Marker groups can interact, and one for those too amplifying nucleic acid specific sequence. 10. Reagenzienkit zum Nachweis von Nukleinsäuren, umfassend:

• a) mindestens eine Nukleinsäure, die als Primer eingesetzt wird, und die in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'- Homo-Tail-Sequenz, eine Sondenbindungsequenz, die als primer-integrierte Reportersequenz bezeichnet ist, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz,
• b) mindestens eine Nukleinsäure, die als Primer eingesetzt wird, und die in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'- Homo-Tail-Sequenz, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz,
• c) mindestens eine Sonde, die aufgrund von Markierungsgruppen detektierbar ist, und die für den Komplementärstrang der Nukleinsäure gemäß a) spezifisch ist,
• d) Desoxyribonukleotide,
• e) ein zur Extension der Nukleinsäure-Primer nach a) und b) geeignetes Enzym, und
• f) einen geeigneten Puffer und gegebenenfalls weitere Hilfsstoffe.

10. Reagent kit for the detection of nucleic acids, comprising:

• a) at least one nucleic acid which is used as a primer and which comprises the following elements in the 5'-3 'direction: a 5'-homo-tail sequence, a probe binding sequence which is referred to as a primer-integrated reporter sequence, and one specific sequence for the nucleic acid to be amplified,
• b) at least one nucleic acid which is used as a primer and which comprises the following elements in the 5'-3 'direction: a 5'-homo-tail sequence, and a sequence specific for the nucleic acid to be amplified,
• c) at least one probe which can be detected on the basis of labeling groups and which is specific for the complementary strand of the nucleic acid according to a),
• d) deoxyribonucleotides,
• e) an enzyme suitable for extending the nucleic acid primers according to a) and b), and
• f) a suitable buffer and optionally other auxiliary substances.

11. Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine thermostabile DNA-Polymerase ist, die eine 5'-3'-Exonukleaseaktivität aufweist. 11. Kit according to claim 10, characterized, that the enzyme is a thermostable DNA polymerase, the one 5'-3'-exonuclease activity.   12. Kit nach den Ansprüchen 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde als detektierbare Markierungsgruppen an ihrem 5'- Ende die Farbstoffmoleküle FAM, JOE oder VIC und an ihrem 3'-Ende das Quenchermolekül TAMRA trägt.12. Kit according to claims 10 and 11, characterized, that the probe as detectable marker groups on its 5'- End the dye molecules FAM, JOE or VIC and at their 3 'end the quencher molecule carries TAMRA. 13. Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass drei verschiedene Sonden mit dem Komplementärstrang der Sondenbindungssequenz wechselwirken und dass die erste der drei Sonden an ihrem 3'-Ende das Farbstoffmolekül Fluorescein trägt, die zweite der drei Sonden trägt an ihrem 5'-Ende das Farbstoffmolekül LC Red 640 und die dritte Sonde an ihrem 5'-Ende das Farbstoffmolekül LC Red 705.13. Kit according to claim 10, characterized, that three different probes with the complementary strand of Probe binding sequence interact and that the first of the three Probes carries the dye molecule fluorescein at their 3 'end the second of the three probes carries the dye molecule at its 5 'end LC Red 640 and the third probe at its 5 'end LC Red 705 dye molecule. 14. Kit nach den Ansprüchen 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zu der Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer und PIRS- Primer mit m-BCR-cDNA oder/und M-BCR-cDNA oder/und TEL/AML- cDNA oder/und AML/ETO-cDNA hybridisieren.14. Kit according to claims 10 and 11, characterized, that the primers and PIRS used for the amplification reaction Primer with m-BCR-cDNA or / and M-BCR-cDNA or / and TEL / AML- Hybridize cDNA or / and AML / ETO cDNA. 15. Kit nach den Ansprüchen 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zu der Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer und PIRS- Primer mit genomischer Herpesvirus-DNA oder/und mit für die 16S rRNA codierender genomischer DNA aus Haemophilus influenzae oder/und Neisseria meningitidis oder/und Streptococcus pneumoniae hybridisieren.15. Kit according to claims 10 and 11, characterized, that the primers and PIRS used for the amplification reaction Primer with genomic herpes virus DNA and / or with for the 16S Genemic DNA encoding rRNA from Haemophilus influenzae or / and Neisseria meningitidis or / and Streptococcus pneumoniae hybridize. 16. Kit nach den Ansprüchen 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zu der Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer und PIRS- Primer mit Interleukin-2-cDNA oder/und Interleukin-4-cDNA oder/und Interleukin-5-cDNA oder/und Interleukin-10-cDNA oder/und Interferon-y-cDNA hybridisieren.16. Kit according to claims 10 and 11, characterized,  that the primers and PIRS used for the amplification reaction Primer with interleukin-2 cDNA or / and interleukin-4 cDNA or / and Interleukin-5 cDNA or / and Interleukin-10 cDNA or / and Hybridize interferon-y cDNA. 17. Nukleinsäuren zum Einsatz als PIRS-Primer in einem Kit nach Anspruch 14, mit den in SEQ ID No. 1, No. 2 und No. 3 wiedergegebenen Sequenzen.17. Nucleic acids for use as PIRS primers in a kit Claim 14, with the in SEQ ID No. 1, No. 2 and No. 3rd reproduced sequences. 18. Nukleinsäuren zum Einsatz als PIRS-Primer in einem Kit nach Anspruch 15, mit den in SEQ ID No. 4, No. 5, No. 6, No. 7 und No. 8 wiedergegebenen Sequenzen.18. Nucleic acids for use as PIRS primers in a kit Claim 15, with the in SEQ ID No. 4, No. 5, No. 6, No. 7 and No. 8th reproduced sequences. 19. Nukleinsäuren zum Einsatz als PIRS-Primer in einem Kit nach Anspruch 16, mit den in SEQ ID No. 9, No. 10, No. 11, No. 12 und No. 13 wiedergegebenen Sequenzen.19. Nucleic acids for use as PIRS primers in a kit Claim 16, with the in SEQ ID No. 9, No. 10, No. 11, No. 12 and No. 13 reproduced sequences.